JPS6230758B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、５−置換ヒダントイン類を、不斉的
に加水分解して光学活性のＤ−Ｎ−カルバモイル
−α−アミノ酸類を生成する能力を有する、微生
物由来の酵素であるヒダントイナーゼを有利に製
造し、この微生物酵素系での反応により、５−置
換ヒダントイン類よりＤ−Ｎ−カルバモイル−α
−アミノ酸を有利に製造する方法に関するもので
ある。 多種の種属の微生物の培養液、菌体、菌体処理
物または菌体から抽出した酵素を５−置換ヒダン
トイン類に作用させて、光学活性のＤ−Ｎ−カル
バモイル−α−アミノ酸類が生成することは特願
昭51−11575（特開昭53−44690）、特願昭51−
145748（特開昭53−69884）、特開昭51−157713
（特開昭53−91189）、特願昭52−48717（特開昭53
−133688）、特願昭52−148556（特開昭54−
84086）および特願昭53−30062（特開昭55−
7001）等に記述されている。 これらのＤ−カルバモイル−α−アミノ酸類は
夫々対応する光学活性のＤ−α−アミノ酸類に変
換することができ、光学活性Ｄ−α−アミノ酸類
は医薬中間体として重要な化合物である。 特に半合成ペニシリン、半合成セフアロスポリ
ンの製造中間体としての、Ｄ−フエニルグリシン
やＤ−（４−ヒドロキシフエニル）グリシン等が
工業的に有用な化合物として挙げられる。 ５−置換ヒダントイン類を立体特異的に開裂加
水分解して、光学活性のＤ−Ｎ−カルバモイル−
α−アミノ酸類に変換する微生物酵素について
は、特願昭52−148556においてその諸性質が明ら
かにされていて、ヒダントイナーゼと表示されて
いる。このヒダントイナーゼを利用して、Ｄ−Ｎ
−カルバモイル−α−アミノ酸類を製造する際
に、微生物の菌体を含む培養液をそのまま使用し
たり、菌体または菌体処理物を培養液から取得し
て使用するが、いづれにしても、微生物の培養時
にヒダントイナーゼの蓄積量を増加させることが
工業的実施に際して重要なことである。 本発明者らは、ヒダントイナーゼ活性を有する
微生物の培養方法につき、種々検討をおこなつた
結果、ヒダントイナーゼを多量に蓄積させること
が可能な微生物の新規な培養方法を見出し、工業
的に有利なＤ−α−アミノ酸類の製造方法を完成
させた。すなわち、本発明は、５−置換ヒダント
イン類に、ピリミジン系代謝産物またはその類縁
体を誘導基質として含有する培地で、場合によつ
ては更に金属イオンを含有する培地で、培養し
た、ヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する
能力を有する微生物の培養液、菌体、菌体処理物
または菌体から抽出した酵素を作用させて、Ｄ−
Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸類に変換させる
ことを特徴とするＤ−α−アミノ酸類の製造方法
である。 本発明者らは、培養培地中に誘導基質としてピ
リミジン系代謝産物、またはその類縁体を存在さ
せることにより、高いヒダントイナーゼ活性を有
する微生物が得られることを見出し、さらにこれ
らの誘導基質と共に培養培地中に金属イオンを共
存させることによつて、菌体中のヒダントイナー
ゼの蓄積が一層増加することを見出して本発明に
至つた。 本発明における誘導基質のピリミジン系代謝産
物とは、ウラシル、シトシン、チミン、ジヒドロ
ウラシル、ジヒドロチミン等のピリミジン系核酸
塩基およびそれらの誘導体が生化学的に代謝され
て生成する産物を意味する。具体的には、ピリミ
ジン系代謝産物として、β−アラニン、β−ウレ
イドプロピオン酸、β−アミノ−イソ酪酸および
β−ウレイド−イソ酪酸などが挙げられる。また
ピリミジン系代謝産物の類縁体としては、β−ア
ミノ−ノルマル酪酸およびβ−メルカプトプロピ
オン酸などが挙げられる。これらの誘導基質のう
ち、β−アラニンは安価に工業薬品として入手で
き、工業的な使用に当つては特に実用的である。
これらの誘導基質の培地中の濃度は0.05〜1.0重
量％の範囲から選ばれ、特に0.1〜0.5重量％の使
用量が適当である。添加方法としては、最初から
培地に添加する方法や、培養中に分割または連続
添加する方法が採用できる。これらの誘導基質を
使用することによつて、工業的に実用可能な高ヒ
ダントイナーゼ活性を有する微生物を得ることが
できるが、さらに培地中に金属塩を共存させるこ
とによつて、ヒダントイナーゼの蓄積量の増加は
一段と顕著になる。 培養培地中に添加する金属イオンとしては、マ
ンガン、コバルト、ニツケル、銅、マグネシウ
ム、鉄などの２価の金属イオン、および３価のア
ルミニウムイオン、６価のモリブデンイオンがヒ
ダントイナーゼの蓄積量の増加に有効であり、特
に好ましくは、２価のマンガンイオンの添加が用
いられる。通常はこれらの金属の塩酸塩、硫酸塩
のような無機塩、あるいは酢酸塩のような有機酸
塩などの、溶解して金属イオンを発生しうる化合
物を培地に添加する方法が用いられる。培地に添
加される金属イオンの濃度は0.2〜100ppm程度で
あるが、1ppm以上が特に適当である。 微生物の培養は通常液体培地で行われるが、固
体表面培養によつても行うことができる。培地に
は通常資化しうる炭素源、窒素源および各微生物
の生育に必要な栄養素を含有させるが、この他に
ピリミジン系代謝産物またはその類縁体を誘導基
質として含有させる。場合によつては、さらに誘
導基質とと共に、前記の金属イオンを倍地に含有
させる。培養条件は、使用する微生物の至適生育
条件に応じて、温度20〜85℃、PH４〜11の範囲が
用いられるが、一般的には温度20〜40℃、PH５〜
９において10〜75時間培養する。培養中には通
気、撹拌を行なつて、微生物の生育を促進させる
こともできる。このようにして培養の経過と共
に、菌体中にヒダントイナーゼが生成蓄積され
る。 本発明で用いられる微生物は、自然界に存在す
る野性株、公的な微生物保存機関に保存されてい
る菌株、あるいはそれから人工的に変異誘導した
微生物などから、ヒダントイナーゼ活性の有無を
調べることによつて選択されるものである。この
活性の検定方法としては、例えば次のような方法
が用いられる。微生物の培養液を４ml採取し、５
℃にて6000rpm10分間遠心する。この遠心菌体
を、４mlの30ｍＭ濃度のDL−５−（４−ヒドロキ
シフエニル）ヒダントインの炭酸バツフアー
（0.05MのNaHCO₃−Na₂CO₃、PH8.7）基質液中に
分散させて、37℃で30分間反応させる。ついで、
20％トリクロル酢酸２mlを添加して反応を停止さ
せる。反応停止液中に10％のパラジメチルアミノ
ベンズアルデヒドの濃塩酸溶液１mlを添加し、
6000rpmで10分間遠心して上清を得る。このよう
にして、カルバモイル基の発色により、440nｍ
にて、生成したＮ−カルバミル−（４−ヒドロキ
シフエニル）グリシンを比色定量する。 上記のようにして、ヒダントイン環を開裂加水
分解する能力、すなわちヒダントイナーゼ活性を
有すると認められた菌体を本発明で使用する微生
物として採用する。この検定方法において、他の
５−置換ヒダントイン、たとえば、５−（２−メ
チルチオエチル）ヒダントインや５−ベンジルヒ
ダントインを基質として、活性を検定すること
も、勿論可能である。 本発明で用いられる微生物は、細菌、放線菌、
かび、酵母および不完全菌の中から前記の検定に
合格するものが選ばれるが、既に特願昭51−
11575（特開昭53−44690）、特願昭51−157713
（特願昭53−91189）、特願昭51−145748（特開昭
53−69884）、特願昭52−48717（特開昭53−
133688）および特願昭52−148556（特開昭54−
84086）に記載されているように、極めて広範囲
の種属の中に見出すことができる。例えば、細菌
に属するものとしてはアクロモバクター属
（Achromobactor）、アエロバクター属
（Aerobacter）、アエロモナス属（Aeromonas）、
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アル
カリゲネス属（Alcaligenes）、アルスロバクター
属（Arthrobacter）、バチルス属（Bacillus）、ブ
レビバクテリウム属（Brevibacterium）、コリネ
バクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロ
バクター属（Enterobacter）、エルウイニア属
（Erwinia）、エシエリヒア属（Escherichia）、ク
レブシーラ属（Klebsiella）、ミクロバクテリウ
ム属（Microbacterium）、ミクロコツカス属
（Micrococcus）、プロタミノバクター属
（Protaminobacter）、プロテウス属（Proteus）、
シユードモナス属（Pseudomonas）、サルシナ属
（Sarcina）、セラチア属（Serratia）、キサントモ
ナス属（Xanthomonas）など、放線菌に属する
ものとしてはアクチノミセス属
（Actinomyces）、アクチノプラネス属
（Actinoplanes）、ミコバクテリウム属
（Mycobacterium）、ノカルデイア属
（Nocardia）、ストレプトミセス属
（Streptomyces）など、かびに属するものとして
はアスペルギルス属（Aspergillus）、パエシロミ
セス属（Paecillomyces）、ペニシリウム属
（Pericillium）など、酵母に属するものとしては
キヤンデイダ属（Candida）、ピヒア属
（Pichia）、ロードトルラ属（Rhodotorula）、トル
ロプシス属（Torulopsis）などがある。 また上記の微生物の中で、ヒダントイナーゼ活
性が比較的高く実用性の優れた菌株を具体的に示
すればアエロバクター・クロアカエ
（Aerobacter cloacae）IAM 1221、アルスロバク
ター・シンプレツクス（Arthrobacter
simplex）IFO 12069、アグロバクテリウム・リ
ゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）IFO
13258、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）
IFO 12333、バチルス・バデイウス（Bacillus
badius）IAM 11059、バチルス・スフアエリカス
（Bacillus sphaericus）IFO 3525、ブレビバクテ
リウム・インサータル（Brvibacterium
incertum）IFO 12145、コリネバクテリウム・エ
リスロゲネス（Corynebacterium
erythrogenes））IFO 12974、サルシナ・マルジ
ナータ（Sarcina marginata）IFO 3066、ミクロ
バクテリウム・フラバム（Microbacterium
flavum）ATCC 10340、ミクロコツカス・ロゼ
ウス（Micrococcus roseus）IFO 3764、プロテ
ウス・モルガニイー（Proteus morganii）IFO
3848、シユードモナス・クロロラフイス
（Pseudomonas chlororaphis）IFO 3904、シユ
ードモナス・ストリアタ（Pseudomonas
striata）IFO 12996、アクチノプラネス・フイリ
ピエンシス（Actinoplanes phillippiensis）IAM
0120、ミコバクテリウム・スメグマテイス
（Mycobacterium smegmatis）ATCC607、ノカ
ルデイア・コラリナ（Nocardia corallina）IFO
3338、ストレプトミセス・フラベオラス
（Streptomyces flaveolus）IFO 3241などがあ
る。 本発明の方法で製造されるヒダントイナーゼの
使用法としては、ヒダントイナーゼを含有する微
生物の培養液、菌体、菌体処理場、菌体抽出物、
粗製酵素、精製酵素の形で使用することができ
る。菌体としては生菌体の他、凍結乾燥、アセト
ン乾燥などによる各種乾燥菌体があり、菌体処理
物としては、菌体破砕物や界面活性剤等で処理し
た菌体などが挙げられる。また、固定化菌体、固
定化酵素等の固定化物も本発明におけるヒダント
イナーゼの使用法に含まれる。 本発明の方法によつて得られるヒダントイナー
ゼは、既に特願昭51−011575、（特開昭53−
44690）、特願昭51−145748（特開昭53−69884）、
特願昭51−157713（特開昭53−91189）および特
願昭52−48717（特開昭53−133688）において、
あきらかにされているように、PH７〜10の水性媒
体中で各種のDL−５−置換ヒダントイン類に作
用して、Ｄ型のＮ−カルバモイルーα−アミノ酸
類を生成するので、医薬中間体として重要な各種
Ｄ型α−アミノ酸類の製造に利用することができ
る。 本発明の第一の方法は、次の反応式によつて示
される。 式 １ 即ち、式１中の一般式（）｛式中、Ｒはアル
キル基、基換アルキル基、アラルキル基、置換ア
ラルキル基、式

【式】（式中、R₁、 R₂、R₃およびR₄は夫々水素原子、ハロゲン原
子、水酸基、低級アルコキシル基またはメチル基
を示す。）で表わされるフエニルまたは置換フエ
ニル基、またはチエニル基を示す。｝で表わされ
る５−置換ビダントイン類に、前述の方法で培養
した微生物由来のヒダントイナーゼを作用させ
て、式１中の一般式（）で表わされるＤ−Ｎ−
カルバモイル−α−アミノ酸を製造する方法であ
る。 ５−置換ヒダントイン類の５−位のアルキル基
またはアラルキル基は、炭素数１〜12の範囲から
選ばれ、置換アルキル基および置換アラルキル基
の置換基としては、ハロゲン原子、アルキルメル
カプト基、スルフヒドリル基、アルコキシル基、
シアノ基、アミノ基、アシル化アミノ基、インド
リル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル
基、ヒドロキシ基などがある。 ヒダントインの５−位の水素原子がアルキル
基、置換アルキル基、アラルキル基および置換ア
ラルキル基で置換された化合物を具体的に例示す
ると、５−メチルヒダントイン、５−エチルヒダ
ントイン、５−ｎ−プロピルヒダントイン、５−
イソプロピルヒダントイン、５−ｎ−ブチルヒダ
ントイン、５−（ｔーブチル）ヒダントイン、５
−イソブチルヒダントイン、５−（２−メチルチ
オエチル）ヒダントイン、５−（ヒドロキシメチ
ル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダント
イン、５−（２−ヒドロキシエチル）ヒダントイ
ン、５−（１−ヒドロキシエチル）ヒダントイ
ン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒド
ロキシベンジル）ヒダントイン、５−（３−アミ
ノプロピル）ヒダントイン、５−（２−シアノエ
チル）ヒダントイン、５−（４−アミノブチル）
ヒダントレン、５−（３−シアノプロピル）ヒダ
ントイン、５−（４−ベンゾイルアミノブチル）
ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイ
ン、５−カルボキシメチルヒダントイン、５−
（２−カルボキシエチル）ヒダントイン、５−（２
−メトキシカルボニルエチル）ヒダントイン、５
−クロロメチルヒダントイン、５−フルオロメチ
ルヒダントイン、などがある。 ヒダントインの５−位の水素原子がフエニルお
よび置換フエニル基によつて置換された５−置換
ヒダントイン類を具体的に例示すると以下のよう
になる。５−フエニルヒダントイン、５−（４−
ヒドロキシフエニル）−ビダントイン、５−（４−
メトキシフエニル）ヒダントイン、５−（２−ク
ロロフエニル）ヒダントイン、５−（３−クロロ
フエニル）ヒダントイン、５−（４−クロロフエ
ニル）ヒダントイン、５−（２−フルオロフエニ
ル）ヒダントイン、５−（３−フルオロフエニ
ル）ヒダントイン、５−（４−フルオロフエニ
ル）ヒダントイン、５−（２−ヨードフエニル）
ヒダントイン、５−（３−ヨードフエニル）ヒダ
ントイン、５−（４−ヨードフエニル）ヒダント
イン、５−（２−ヒドロキシフエニル）ヒダント
イン、５−（３−ヒドロキシフエニル）ヒダント
イン、５−（２−メトキシフエニル）ヒダントイ
ン、５−（３−メトキシフエニル）ヒダントイ
ン、５−（２−メチルフエニル）ヒダントイン、
５−（３−メチルフエニル）ヒダントイン、５−
（４−メチルフエニル）ヒダントイン、５−（２・
４−ジクロロフエニル）ヒダントイン、５−
（３・４−ジクロロフエニル）ヒダントイン、５
−（３・５−ジクロロフエニル）ヒダントイン、
５−（２・４−ジヒドロキシフエニル）ヒダント
イン、５−（２・５−ジヒドロキシフエニル）ヒ
ダントイン、５−（３・４−ジヒドロキシフエニ
ル）ヒダントイン、５−（２・４−ジメトキシフ
エニル）ヒダントイン、５−（２・５−ジメトキ
シフエニル）ヒダントイン、５−（３・４−ジメ
トキシフエニル）ヒダントイン、５−（３・５−
ジメトキシフエニル）ヒダントイン、５−（３−
クロロ−４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイ
ン、５−（３−クロロ−４−メトキシフエニル）
ヒダントイン、５−（２−ヒドロキシ−４−メト
キシフエニル）ヒダントイン、５−（２−ヒドロ
キシ−５−メトキシフエニル）ヒダントイン、５
−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフエニル）ヒ
ダントイン、５−（４−ヒドロキシ−３−エトキ
シフエニル）ヒダントイン、５−（４−ヒドロキ
シ−２−メチルフエニル）ヒダントイン、５−
（４−ヒドロキシ−３−メチルフエニル）ヒダン
トイン、５−（３・５−ジクロロ−２−ヒドロキ
シフエニル）ヒダントイン、５−（３・５−ジク
ロロ−４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイン、
５−（３・５−ジメチル−４−メトキシフエニ
ル）ヒダントインなどがある。 ５−置換ヒダントイン類に微生物の培養液、菌
体または菌体処理物を作用させるには、通常、水
性媒体中で両者を混合する方法が用いられる。反
応基質の反応液中の濃度は0.1％から30％程度の
高濃度まで用いることができる。反応中のPHが７
〜10の範囲が好ましい理由は、本発明で利用され
るヒダントイナーゼの至適PHが８〜９付近にある
こと、PHが増すにつれて基質の溶解度が増すこ
と、ならびにヒダントイン環のラセミ体反応がア
ルカリ性において効果的に促進されることなどに
よつて、結果的にDL体またはＬ体の５−置換ヒ
ダントイン類からＤ体のＮ−カルバモイル−α−
アミノ酸類への変換速度が顕著に増大することに
ある。即ち、基質のＤ−特異的加水分解反応とラ
セミ化反応が同時に進行するので、基質の５−置
換ヒダントイン類は、Ｄ型を使用する必要はな
く、DL型またはＬ型のヒダントイン類が使用で
きるのである。反応の進行に伴なつて媒体のPHは
低下するので、反応中にアンモニア、苛性ソー
ダ、苛性カリ、炭酸ソーダなどの中和剤の添加に
よつて至適PHに保持することが望ましい。 反応温度は使用する微生物のヒダントイナーゼ
に適した温度が採用されるが、通常20〜85℃の範
囲にある。 上記の如く、種々の５−置換ヒダントイン類を
微生物由来のヒダントイナーゼで酵素的に加水分
解して、生成した、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−
アミノ酸類を、反応混合物から単離するには、PH
調整やイオン交換樹脂処理などの方法を用いる。
たとえば、Ｄ−Ｎ−カルバモイルフエニルグリシ
ン、Ｄ−Ｎ−カルバモイルメチオニンやＤ−Ｎ−
カルバモイルフエニルアラニンなどのように比較
的疎水性である場合には、反応混合物のPHを５〜
６に調整して遠心分離を行うと、未反応の基質や
菌体等の不溶物が除かれ、ついで、PHを２〜４に
調整すると、目的物が沈殿として析出する。また
Ｄ−Ｎ−カルバモイルセリンや、Ｄ−Ｎ−カルバ
モイルアラニンなどのように比較的親水性である
合には、イオン交換樹脂により目的物を吸着さ
せ、これを希塩酸等で溶出し、ついで中和し減圧
濃縮することによつて目的物を取得することがで
きる。 酵素的加水分解反応によつて生成したＤ−Ｎ−
カルバモイル−α−アミノ酸を、式２に示すよう
に、脱カルバモイル化させて、Ｄ−α−アミノ酸
に交換することができる。 式 ２ （式中、Ｒは式１のＲと同じ。） 即ち、式１中の化合物（）で示される５−置
換ヒダントイン類に、ピリミジン系代謝産物また
はその類縁体を誘導基質として含有する培地で、
場合によつては更に金属イオンを含有する培地で
培養したヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解
する能力を有する微生物の培養液、菌体、菌体処
理物または菌体から抽出した酵素を作用させてＤ
−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸類を製造し、
ついで、このもののカルバモイル基を除去するこ
とによつて、有利に、式２に示されるようにＤ−
α−アミノ酸類を製造できるのである。 このカルバモイル基の除去は、水性媒体中で酸
酸性下、Ｄ−Ｎ−カルバモルイ−α−アミノ酸に
亜硝酸を反応させて、達成することができ、その
際の光学活性はＤ型が保持されてＤ−ａ−アミノ
酸を得ることができる。この化学的な脱カルバモ
イル反応の好ましい条件としては、0.4規定以上
の塩酸や硫酸などの強鉱酸が存在する水性媒質中
（水溶媒または水−酢酸混合溶媒など）で、ほゞ
当量の亜硝酸をＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミ
ノ酸に作用させることにより、高収率で実施でき
る。亜硝酸、亜硝酸ナトリウムや亜硝酸カリウム
のような亜硝酸の水溶性塩を、媒質中の酸と反応
させて、反応液内で発生させるのが便利である。
この脱カルバモイル反応は、多量の発熱とガスの
発生を伴うので、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−ア
ミノ酸と触媒の強鉱酸の存在する媒質に撹拌下、
亜硝酸水溶液を徐々に添加する方法が採用され
る。反応温度は、通常０〜40℃の範囲が用いられ
るが、気化による亜硝酸の損失を少くするため
と、副反応を抑制させるために、低温で反応させ
る方が好ましい。 以上、前述したように、微生物由来のヒダント
イナーゼを、金属イオンおよびピリミジン系代謝
化合物、またはその類縁体を含有する培地で高濃
度に蓄積させることにより、５−置換−ヒダント
イン類から容易に高収率で、Ｄ−Ｎ−カルバモイ
ル−α−アミノ酸類が取得でき、ついで、化学的
に、もしくは、脱カルバモイル活性を有する微生
物酵素反応によつて、Ｄ−α−アミノ酸類が容易
に取得できるので、本発明は、Ｄ−α−アミノ酸
類の製造に際し、極めて有利な方法を提供するも
のである。 以下実施例によつて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例のみに限定されるもので
はない。 実施例 １ DL−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイ
ンを0.1％含有するブイヨン寒天スラント上で表
１に示した各種の菌株を33℃で24時間培養した。
別に肉エキス2.0％、ペプトン0.5％、イーストエ
キス0.5％、NaCl0.3％および表１に示した誘導基
質を含有するPH7.0の培地を調製し500mlの肩付振
盪フラスコに100mlずつ分注し、120℃で15分間蒸
気殺菌をおこなつた。この培地に前記の培養菌体
を接種し、33℃で24時間振盪培養した。得られた
培養液のヒダントイナーゼ活性を以下の方法で測
定した。培養液４mlを採取し、５℃にて
6000rpm、10分間の条件で遠心分離した。この遠
心により取得した菌体を４mlの30ｍＭ濃度のDL
−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイン
の炭酸バツフアー（0.05MのNaHCO₃−Na₂CO₃、
PH8.7）基質溶液中に分散さえて、37℃で下で30
分間反応させた。反応後、20％トリクロル酢酸２
mlを添加して反応を停止させ、10％のパラジメチ
ルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液１mlを添
加して発色させた。 発色液を6000rpmで10分間遠心分離して、菌体
を除き、上清中の生成したＮ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンを440nｍに
て、比色定量した。 表１にその結果を示す。ヒダントイナーゼ活性
は、使用した培養液１ml当り、30分間の反応で生
成したＮ−カルバモイル−（４−ヒドロキシフエ
ニル）グリシンのμmole数で表示した。表、お
よび以後の実施例における菌体の記号は、夫々次
の微生物保存機関の保存株であることを示す。 IAM：東京大学応用微生物研究所 IFO：財団法人 発酵研究所 ATCC：アメリカン・タイプ・カルチユア・コレ
クシヨン

【表】 実施例 ２ DL−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイ
ンを0.1％含有するブイヨン寒天スラント上で、
表２に示した各種の菌株を33℃で24時間培養し
た。別に、肉エキス2.0％、ペプトン0.5％、イー
ストエキス0.5％、NaCl0.3％、β−アラニン0.2
％および表１に示した金属塩を含有するPH7.0の
培地を調製し、500mlの肩付振盪フラスコに100ml
ずつ分注し、120℃で15分間蒸気殺菌をおこなつ
た。この培地に前記の培養菌体を接種し、33℃で
24時間振盪培養した。この培養液のヒダントイナ
ーゼ活性をDL−５−（４−ヒドロキシフエニル）
ヒダントインを基質とする実施例１の方法で測定
した。結果を表２に示す。

【表】 実施例 ３ DL−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイ
ンを0.1％含有するブイヨン寒天スラント上で表
３に示した各種の菌株を夫々33℃で、24時間培養
した。別に、肉エキス2.0％、ペプトン0.5％、イ
ーストエキス0.5％、NaCl0.3％、MnCl₂・
4H₂O10ppmおよび表３に示した各種の誘導基質
を含むPH7.0の培地を調製し、500mlの肩付振盪フ
ラスコに170ml宛分注して、120℃で15分間蒸気殺
菌をおこなつた。 この培地に前記の培養菌体を接種し、33℃で24
時間振盪培養した。この培養液のヒダントイナー
ゼ活性をDL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒ
ダントインを基質とする実施例１の方法で測定し
た。結果を表３に示す。

【表】 実施例 ４ DL−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイ
ンを0.1％含有するブイヨン寒天スラント上で、
表４に示した菌株を夫々、33℃で24時間培養し
た。別に、肉エキス２％、ペプトン0.5％、イー
ストエキス0.5％、NaCl0.3％、β−アラニン0.2
％を有するPH7.0の培地（培地Ａ）と、肉エキス
２％、ペプトン0.5％、イーストエキス0.5％、
NaCl0.3％、β−アラニン0.2％、MnCl₂・
4H₂O10ppmを含有するPH7.0の培地（培地Ｂ）を
調製し、500mlの肩付振盪フラスコに、100ml宛分
注して120℃で15分間蒸気殺菌をおこなつた。こ
の培地に前記の培養菌体を接種、33℃で24時間振
盪した。この培養液のヒダントイナーゼ活性を、
DL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイ
ンを基質とする実施例１の方法で測定した。結果
を表４に示す。一方、培地Ａからβ−アラニンを
除いた対照培地で培養した場合、いづれの微生物
も0.1μmole Ｃ−HPG／30min／mlbroth以下で
あつた。

【表】 実施例 ５ グルコース2.0％、ソイビーン・ミール1.0％、
酵母エキス0.25％、硫安0.1％、炭酸カルシウム
0.5％、燐酸カリ0.4％、β−アラニン0.3％および
MnCl₂・4H₂O20ppmを含有するPH7.0の培地を調
製し、500mlの肩付振盪フラスコに100mlずつ分注
し、120℃で15分間蒸気殺菌を行なつた。 ストレプトミセス・フラベオラスIFO 3241と
アクチノプラネス・フイリピエンシスIAM 0120
を前記の培地に接種し、30℃でストレプトミセ
ス・フラベオラスは45時間、アクチノプラネス・
フイリピエンシスは64時間振盪培養した。この培
養液のヒダントイナーゼ活性を、DL−５−（４−
ヒドロキシフエニル）ヒダントイ養を基質とする
実施例１の方法で測定した。結果を第５に示す。

【表】 一方、MnCl₂・4H₂Oを培地に添加しないでス
トレプトミセス・フラベオラスを培養した培養液
の活性は1.6であつた。またβ−アラニンおよび
MnCl₂・4H₂を添加しない培地と、MnCl₂・4H₂O
のみ添加しない培地を用いて培養したストレプト
ミセス・フラベオラスの培養液の活性は、それぞ
れ0.2と1.6であつた。 実施例 ６ 肉エキス3.0％、グルコール1.0％、β−アラニ
ン0.3％、MnCl₂・4H₂O20ppmを含むPH7.5の培地
を調整し、500mlの肩付振盪フラスコに100ml宛分
注し、120℃で15分間蒸気殺菌を行なつた。この
培地に、DL−５−（２−メチルチオエチル）ヒダ
ントインを0.1％含有するブイヨン寒天スラント
上で、33℃で24時間培養したバチルス・ブレビス
IFO12333を接種し、33℃で20時間振盪培養し
た。この培養液をPH8.7に調整保持しつつ、DL−
５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイン2.0
ｇを添加し、37℃で窒素気流下24時間撹拌した。
反応中は、苛性ソーダで反応液のPHを8.7に保持
した。反応液の反応液を遠心分離し、上清部の生
成Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキシフエ
ニル）グリシンの比色定量を、エールリツヒ試薬
による発色で行つたところ2.0ｇのＤ−Ｎ−カル
バモイル−（４−ヒドロキシフエニル）グリシン
が生成していた。 変換収率：91.4％。 この反応で得た反応液を、PH５に塩酸で調整
し、遠心分離によつて得た上清部の半量を、約20
ml迄濃縮し、ついで塩酸でPH２に調節して冷蔵下
保存で析出した沈殿を取した。水−エタノール
より再結晶し、670mgのＤ−Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンを得た。融
点176〜177℃、 〔α〕^２０ _Ｄ＝−177.0゜（Ｃ＝0.5、５％エタノール）
。 実施例 ７ 実施例６と全く同様にバチルス・ブレビス由来
のヒダントイナーゼを使用して実施した菌体反応
液100ml〔含有Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（４−ヒド
ロキシフエニル）グリシン1.9ｇ〕に、35％塩酸
20ｇを添加し、10℃に冷却下、撹拌しつつ、定量
ポンプを用いて、亜硝酸ナトリウムの10％の水溶
液6.2ｇを30分で送入すた。ついで２時間、10℃
で撹拌を続け、反応液を高速液体クロマトグラフ
イーで分析したところ、1.4ｇのＤ−（４−ヒドロ
キシフエニル）グリシンの生成が認められた。収
率：92.7％。脱カルバモイル反応液を過後、50
℃以下で減圧濃縮し、ついで苛性ソーダでPH4.5
に調節後、さらに35mlの容量迄濃縮し析出沈殿を
取した。取得沈殿を温水70mlに溶解し、活性炭
処理、過をおこない、液を濃縮して白色のＤ
−（４−ヒドロキシフエニル）グリシン810mgを得
た。〔α〕^２０ _Ｄ＝−161.0゜（Ｃ＝0.5、1N−HCl） 実施例 ８ DL−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイ
ン0.1％を含有するブイヨン寒天スラント上で、
表６に示した菌株を33℃、24時間の条件で培養
し、生理食塩水で、スラント１本分の菌体を懸濁
し、この懸濁液を肉エキス2.0％、ペプトン0.5
％、イーストエキス0.5％、NaCl0.3％、MnCl₂・
4H₂O10ppmおよびβ−アラニン0.2％を含むPH
7.0の蒸気殺菌した培地250mlに加え、２の坂口
フラスコで、33℃、24時間振盪培養した。この培
養液を、５℃で6000rpmの条件で遠心分離し、集
菌し、30ｍＭ濃度の表５に示した各種５−置換ヒ
ダントイン類の炭酸バツフアー（0.05Mの
NaHCO₃−Na₂CO₃、PH8.7）基質溶液500mlに分
散させ、37℃で、24時間反応させた。反応は窒素
気流下、PH8.7にPHを保持し撹拌下行つた。反応
後、反応液を遠心分離し、上清部の生成したＤ−
Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の比色定量をエ
ールリツヒ試薬による発色で行つた。結果を表６
にモル変換収率で示す。

【表】 表６に示した５−置換ヒダントイン類の酵素的
加水分解反応において、バチルス・ブレビスの菌
体を使用して実施した反応液から夫々のＤ−Ｎ−
カルバモイル−α−アミノ酸を単離し、Ｄ−体で
あることを確認した。単離の際には、Ｄ−Ｎ−カ
ルバモイルメチオニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイルセ
リン、Ｄ−Ｎ−カルバモイルアラニンについては
反応液のPHを5.0に調節後、遠心分離し、この上
清を減圧濃縮乾固後、エタノールで抽出した。エ
タノール溜出後、陰イオン交換樹脂（IRA 400、
酢酸型）を用いて、酢酸で溶出した画分を真空乾
燥して得た。Ｄ−Ｎ−カルバモイルフエニルアラ
ニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイルロイシン、Ｄ−Ｎ−
カルバモイルフエニルグリシン、Ｄ−Ｎ−カルバ
モイル−（４−ヒドロキシフエニル）グリシンお
よびＤ−Ｎ−カルバモイル−（２−チエニル）グ
リシンについては、反応液をPH5.0に調節後、遠
心分離し、この上清を減圧濃縮し、ついでPH2.0
調節して析出した沈殿を取し、水−エタノール
で再結晶して得た。 取得した各々のＤ−Ｎ−カルバモイル−α−ア
ミノ酸の取得量と比旋光度を表７に示す。

【表】 (注) 〓α〓^２０ _Ｄ
参考例 １ 実施例８と同様の方法で得た各種Ｄ−Ｎ−カル
バモイル−α−アミノ酸15ミリモルを100mlの水
に添加し、さらに35％塩酸25ｇを添加し、10℃に
冷却下、撹拌しつつ、定量ポンプを用いて、亜硝
酸ナトリウムの15％水溶液7.2ｇを30分で送入し
た。さらに４時間10℃で撹拌を続け、反応液を高
速液体クロマトグラフイー、またはトリニトロベ
ンゼンスルホン酸ソーダによるアミノ基の比色定
量によつて、生成したＤ−ａ−アミノ酸を定量し
た。表８に各々のＤ−Ｎ−カルバモイル−α−ア
ミノ酸から生成したＤ−α−アミノ酸のモル比率
と、単離精製したＤ−α−アミノ酸の比旋光度を
示す。 Ｄ−アラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−セリンお
よびＤ−（２−チエニル）グリシンの単離は陽イ
オン交換樹脂（IR−120B、Na型）に反応液を通
過せしめ、単着したアミノ酸をアンモニア水で溶
出させ、有効画分を濃縮し、等電点中和により離
離し、水−エタノールより再結した。Ｄ−ロイシ
ン、Ｄ−フエニルアラニン、Ｄ−フエニルグリシ
ンおよびＤ−（４−ヒドロキシフエニル）グリシ
ンの単離は、反応液を減圧濃縮後、等電点中和
し、析出したα−アミノ酸の沈殿を取し、さら
に水−エタノールから再結晶させた。

【表】 実施例 ９ 肉エキス2.0％、グルコース1.0％、β−アラニ
ン0.2％、MnCl₂・4H₂O10ppmを含むPH7.0の培地
を調整し、500mlの肩付振盪フラスコに100mlずつ
分注し、120℃で15分間蒸気殺菌を行なつた。こ
の培地にDL−５−（２−メチルチオエチル）−ヒ
ダントインを0.1％含有するブイヨン寒天スラン
ト上で、33℃で24時間培養したシユードモナス・
ストリアタIFO 12996を接種し、33℃で24時間振
盪培養した。この培養液にDL−５−（３−クロロ
フエニル）ヒダントインまたは、DL−５−（４−
メトキシフエニル）ヒダントイン2.0ｇを添加
し、PH8.7に反応系を調整保持しつつ、37℃で窒
素気流下、24時間撹拌した。反応後、反応液中の
生成したＤ−Ｎ−カルバモイル−（３−クロロフ
エニル）グリシン、または、Ｄ−Ｎ−カルバモイ
ル−（４−メトキシフエニル）グリシンをエール
リツヒ試薬により比色定量した。生成収率と反応
液より単離精製したカルバモイルアミノ酸の比旋
光度を表９に示す。 Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の単離は、反
応液をPH5.0に調節し遠心分離を行い、この上清
部を減圧濃縮し、ついでPHを3.0に調節して沈殿
析出したＮ−カルバモイル−α−アミノ酸を取
し、エタノールから再結晶した。

【表】

【表】 参考例 ２ 実施例10と同様の方法で取得したＤ−Ｎ−カル
バモイル−（３−クロロフエニル）グリシン、ま
たは、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（４−メトキシフ
エニル）グリシン20ミリモルを水100mlに懸濁さ
せて、35％塩酸25ｇを添加し、100℃に冷却下、
撹拌しつつ、定量ポンプを用いて、亜硝酸ナトリ
ウムの15％水溶液9.2ｇを30分で送入した。つい
で２時間、10℃で撹拌を続け、反応液を高速液体
クロマトグラフイーで分析して、生成Ｄ−α−ア
ミノ酸を定量した。表10に脱カルバモイル収率
と、単離精製したＤ−α−アミノ酸の比旋光度を
示す。

【表】 単離は、脱カルバモイル反応液を過し、液
を減圧濃縮して、ついでPHを5.0〜6.0に調節し
て、析出沈殿を取し、水から再結晶した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 〔式中、Ｒはアルキル基、置換アルキル基、アラ
   ルキル基、置換アラルキル基、式【式】 （式中、R₁、R₂、R₃およびR₄は、夫々、水素原
   子、ハロゲン原子、水酸基、低級アルコキシル
   基、またはメチル基を示す） で表わされるフエニルまたは置換フエニル基、ま
   たはチエニル基を示す。〕 で表わされる５−置換ヒダントイン類に、これら
   ５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解す
   る能力を有し、アクロモバクター属、アエロバク
   ター属、アエロモナス属、アグロバクテリウム
   属、アルカリゲネス属、アルスロバクター属、バ
   チルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ
   リウム属、エンテロバクター属、エルウイニア
   属、エシエリヒア属、クレブシエラ属、ミクロバ
   クテリウム属、ミクロコカス属、プロタミノバク
   ター属、プロテウス属、シユードモナス属、サル
   シナ属、セラチア属、キサントモナス属、アクチ
   ノミセス属、アクチノプラネス属、ミコバクテリ
   ウム属、ノカルジア属、ストレプトミセス属、ア
   スペルギルス層、パエシロミセス属、ペニシリウ
   ム属、キヤンデイダ属、ピヒア属、ロードトルラ
   属、またはトルロプシス属に属する微生物の培養
   液、菌体、菌体処理物または菌体から抽出した酵
   素を作用させ、一般式 【式】（式中、Ｒは上記と同じ） で表わされるＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ
   酸類製造する方法において、当該微生物をピリミ
   ジン系代謝産物またはその類縁体を含有する培地
   で培養することを特徴とするＤ−Ｎ−カルバモイ
   ル−α−アミノ酸類の製造方法。 ２ ヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する
   能力を有する微生物が、アエロバクター属、アル
   スロバクター属、アグロバクテリウム属、バチル
   ス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウ
   ム属、サルシナ属、ミクロバクテリウム属、ミク
   ロコツカス属、プロテウス層、シユードモナス
   属、アクチノプラネス属、ミコバクテリウム属、
   ノカルデイア属、またはストレプトミセス属に属
   するものである特許請求の範囲第１項記載の製造
   方法。 ３ ピリミジン系代謝産物またはその類縁体が、
   β−アラニン、β−ウレイドプロピオン酸、β−
   アミノ−イソ酪酸、β−ウレイド−イソ酪酸、β
   −アミノ−ノルマル酪酸、またはβ−メルカプト
   プロピオン酸である特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の製造方法。 ４ ピリミジン系代謝産物またはその類縁体の培
   地中の濃度が0.05〜1.0％である特許請求の範囲
   第１項、第２項、または第３項記載の製造方法。 ５ ピリミジン系代謝産物またはその類縁体を誘
   導基質として含有する培地に金属イオンを添加す
   る特許請求の範囲第１項、第２項、または第３項
   記載の製造方法。 ６ 金属イオンが、２価のマンガン、コバルト、
   ニツケル、銅、マグネシウムまたは鉄イオン、３
   価のアルミニウムイオン、または６価のモリブデ
   ンイオンである特許請求の範囲第５項記載の製造
   方法。 ７ 金属イオンの培地中の濃度が0.2〜100ppmで
   ある特許請求の範囲第５項または第６項記載の製
   造方法。 ８ ５−置換ヒダントイン類がDLまたはＬ体で
   ある特許請求の範囲第１項、第２項または第５項
   記載の製造方法。