JPS6231300B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血清の如き液体試料中の血清たん白
質未結合被験物質例えばホルモンの存在およびそ
の濃度を測定することに係わる。更に詳しくは、
本発明は、遊離被験物質、結合性血清たん白質お
よび或る濃度の被験物質―血清たん白質複合体を
含有する試料において血清たん白質と可逆的に結
合しうるタイプの遊離被験物質を検出するのによ
く適合した方法に係わる。 然るに、診断のため各種の生物学的活性物質の
濃度を測定する「競合検定」法は今日十分に確立
されている。この方法は、測定しようとする被験
物質に対して特異的な抗体が試験試料および該試
料の標識を付した類似体のアリコートとともにイ
ンキユベートされる反応系を含む。天然被験物質
とその類似体は抗体の結合箇所に結合すべく競合
する。この抗体を反応系の残りのものから分離し
たのち、該抗体ないし上澄液を類似体について検
定することができる。抗体に関連せる類似体の量
は試料中の被験物質の濃度の逆関数である。 かかる競合検定を行うための通常の方法として
「液相放射免疫検定」と「固相放射免疫検定」の
二つが知られている。而して、各系において、抗
体上の標識類似体の量を測定するために、抗体に
結合した免疫原物質（immunogenic
substance）を結合していない免疫原物質から取
り出さねばならない。この測定からは、試料中の
免疫原物質の量が測定される。 「液相」放射免疫検定系では、測定しようとす
る抗体、標識類似体および免疫原物質を溶液状態
でインキユベートする。而して、いくつかの抗体
結合箇所が有効であり、反応は迅速である。複合
体未形成の免疫原物質から抗体複合化免疫原物質
を分離するために、抗体免疫原複合体を沈殿さ
せ、遠心処理し、上澄液をデカンテーシヨンす
る。 「固相」放射免疫検定系では沈殿工程が排除さ
れる。抗体はガラスチツプないしチユーブの内面
に結合する。而して、ガラスチツプを遠心処理し
或は被覆されたチユーブをデカンテーシヨンする
ことによつて、抗体複合化免疫原物質を複合体未
形成の免疫原物質から分離する。しかしながら、
抗体上のいくつかの有効な活性箇所がチツプ又は
チユーブによつてブロツキングされているので、
反応は比較的緩徐である。 甲状腺、精巣、卵巣、副腎皮質および哺乳動物
の他の腺から排泄される如きホルモンはしばしば
ホルモン結合性血清たん白質ないしグロブリンと
結合して循環系内を輸送される。この血清たん白
質に結合したホルモン又は全ホルモンに対立され
る遊離ホルモンの存在および濃度を量定すること
ができるなら、それはしばしば診断上有益であ
る。例えば、血流中のチロキシンT₄は、輸送血
清たん白質（チロキシン結合性グロブリン、アル
ブミン又はプレアルブミン）に結合した被験物質
としては動的平衡で存在し、また血清たん白質未
結合物質（「遊離」又は未結合T₄）としては少部
分（可能な値は0.1％又はそれ以下）で存在す
る。遊離T₄は甲状腺ホルモン系の活性被験物質
であると考えられる。あいにくなことに、遊離
T₄検定方法学はだらだらと長く且つ複雑で、コ
スト高につき、しかも誤差の入りやすいものであ
つた。なぜなら、物質の標準化が困難であり、ま
た血清たん白質に比較的ゆるく結合したホルモン
が血清たん白質未結合ホルモンの微少な量に比し
て圧倒的に多く、血清たん白質未結合ホルモンの
微少量を測定することがむづかしいからである。
依つて、上記の競合検定法によつて遊離被験物質
の濃度を測定することができない。 遊離T₄および、生体内で血清たん白質複合体
として存在する他のホルモンを測定する方法のう
ち透析膜法が高い精度を示す。この方法では、既
知量の被検血清と標識ホルモンの入つた透析バツ
グを緩衝液中に懸吊する。標識ホルモンはそれ自
体、血清ホルモンとして遊離状態と結合状態との
間を同じ割合で分布する。添加される標識ホルモ
ンの量は、系をひどくかき乱すことのないように
極度に少なくなければならないが、それでもなお
少量の検出が可能となるように計数（カウント）
率は高くなければならない。放射性標識の場合、
これは、比放射能が非常に高い標識ホルモンを用
いることを必要とする。適当な時間（約24時間）
経過後、血清たん白質に結合してない標識および
天然ホルモンは半透性透析バツグを通つて拡散す
るが、血清たん白質（分子量＞20000）に結合し
たホルモンは透析バツグ内に留まる。血清中に存
在する遊離ホルモンの量を測定するには、緩衝液
のアリコートを標識ホルモンについて検定する。
検定の結果、緩衝液内に入つた標識ホルモンの分
率を算出し得、また推論される遊離状態で存在す
る全ホルモンの分率を算出することができる。而
して、この分率を遊離ホルモンの質量単位（例え
ばng／dl）に換算するには、その試料に関して全
ホルモン検定を実施せねばならない。 この系は、遊離T₄と他の遊離ホルモン検定に
おいて有意な結果を示しうるが、しかしそれは日
常的にはきわめて適さない。先ず、二つの試験が
実施されねばならない。而して、最終結果の精度
は、二つの方法によつて折衷されうる。また、一
つの試験に対してかなり多量の放射能を用いねば
ならない。標識ホルモン中の障害となる不純物は
特別の問題を惹起し得、しかもインキユベーシヨ
ンの所要時間は長い。単に血清だけを用いること
ができるが、それはきわめて新しいものでなけれ
ばならない。更に、検定に必要な物質全ての補正
および標準化は日常的なこと（routine matter）
でない。かくして、この方法の適用は、それがコ
スト高であり多大の労力と高い熟練度を要するこ
とから制約がある。 遊離ホルモン検定の別の方法は反応動力学を伴
うもので、二つの別個の試験を必要とする。各試
験において、抗体がホルモン例えばT₄を、チロ
キシン結合性グロブリンの如き主要結合剤の対抗
引力から引き離していかに早く捕獲するかに係わ
る動力学的曲線が測定される。 かかる検定系では、いくつかの病理学的条件か
ら不正確が生ずる。もし血清たん白質結合性箇所
が通常より多く存在するなら、ホルモンに対する
グロブリンの有効けん引力は高まり、抗体への結
合割合は減少する。而して、チロキシン分析の場
合、これは、実際には多量のT₄があるとしても
試料中にはT₄がほとんどなく全て結合された外
観を呈する。 本発明を概記するに、それは、血清たん白質未
結合ホルモンおよび他の類似被験物質を直接検定
するための方法、試薬および試験セツトに係わ
る。この検定は、血清たん白質および血清たん白
質結合ホルモンの存在で実施することができる。 本発明に従えば、被検ホルモン又は他の被験物
質に対し相補的な抗体を内蔵する半透過性マイク
ロカプセルを、該ホルモンの標識を付した類似体
および試験試料とともにインキユベートする。こ
のインキユベーシヨンに先立ち、類似体は、抗体
がホルモン結合性箇所において飽和されるような
量でマイクロカプセル内に導入されうる。マイク
ロカプセル壁は試験試料を抗体から分離する膜よ
りなり、而してその膜は、遊離被験物質およびそ
の類似体の通過を許容するのに十分なしかし抗
体、天然血清たん白質又は血清たん白質結合ホル
モンの通過を許容するには不十分な多孔率を有す
る。このマイクロカプセルのアリコートに試験試
料を添加するとき、遊離ホルモンは膜を通つて拡
散し、抗体上の結合箇所に関してその類似体と競
合する。かくして、抗体と反応系の残りのものと
の間の類似体の分布は、試料中に当初存在する遊
離ホルモン量の指標となる。この方法は、在来の
液相放射免疫検定に固有の精度と固相系の簡素さ
および便利さとを兼備している。 次いで、抗体をその結合ホルモン（および結合
類似体）と一緒に、遊離被験物質から分離し、抗
体又は反応系の残部を類似体について検定する。
分離は、浸透圧の変化を誘発させてカプセルがし
ぼむと抗体未結合ホルモンがカプセル外に移動す
るようにすることによつて実施されうる。これ
は、例えば、血清アルブミン又はポリエチレンイ
ミンを系に加えてカプセル内液の流出を促進する
ことにより遂行することができる。別法として、
マイクロカプセルから遊離被験物質を簡単な洗浄
によつて取り出すことができる。結果は、類似体
含量の検定を標準例えば遊離ホルモン濃度対放射
能カウント、螢光強度又は、類似体の存在を示す
のに用いられる他のマーカー特性の曲線に比較す
ることによつて解釈される。 本検定は、遊離チロキシン、トリヨードチロニ
ン、新産チロキシン、テストステロン、コルチソ
ル、他のステロイドホルモン並びに、血清たん白
質と可逆的に結合する他の物質の存在および（又
は）濃度を調べるのに用いることができる。本検
定はまた、血清たん白質に有意に結合しない被験
物質例えばジゴキシンの如き薬剤を検定するのに
も用いることができる。而して、相補的な結合性
物質ないし被検物質の標識を付した類似体が入手
し得或は製造されうる限り、本質上いかなる如上
物質も検定することができる。 本検定は、類似体、抗体標準物質を内蔵するマ
イクロカプセルおよび、所定濃度の被検物質を含
有するブランクよりなる試験セツトと、インキユ
ベーシヨン終了後カプセルから抗体未結合被験物
質および類似体を取り出す試薬とを用いて日常的
に行うことができる。品質管理のため、マイクロ
カプセル内の液を着色してもよい。これらカプセ
ルが遠心処理により沈降し或は析出したあとの着
色せる上澄液はマイクロカプセルの破断ないし抗
体の可能な漏出を表わす。本検出は、在来の検出
とは異り、血清たん白質、ホルモンおよび干渉物
質の広い濃度範囲にわたつて、診断される状態と
の臨床的相互関係の喪失を排除する。 本発明の目的は、液体試料中の血清たん白質に
結合していない被験物質の存在および濃度を調べ
るための迅速、簡単且つ再現しうる検定法、かか
る検定に有用な試薬並びに、該検定を迅速且つ手
軽に行うのに適した試験セツトを提供することで
ある。本発明の別の目的は、ヒト血液から抽出さ
れる血清たん白質結合T₄含有試料中の遊離T₄を
測定する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、固有放射免疫検定系の利
点と液相放射免疫検定系の利点とを兼備した、免
疫原物質を測定するための競合法を提供すること
である。本発明の更に別の目的は、血清中のジゴ
キシン量を測定するための信頼度高い方法を提供
することである。本発明の如上および他の目的な
いし特徴は以下の説明から明らかとなろう。 好ましい具体化 本発明の方法では、被検物質を含有する試料
を、該物質に対して相補的な抗体（又は該物質と
可逆的に結合することのできる他の物質）および
該物質の標識を付した類似体とともにインキユベ
ートし、また試料および抗体を、高分子量である
たん白質の通過を排除する単数ないし複数の半透
膜によつて分離することが必要とされる。 選定された被験物質に対する抗体は、実験室動
物にホルモンを、場合によつては補助薬とともに
注射し次いで産生した抗体を抽出、精製すること
を包含する既知技法に従つて製造することができ
る。而してかかる抗体の多くは市販されている。
また、本発明の方法によつて検出することのでき
る被験物質の標識を付した類似体の多くも市販さ
れており、或は既知技法を用いて製造することが
できる。本明細書で用語「標識を付した類似体」
を用いるとき、それは、検出しようとする被験物
質に類似の好ましくは該物質に同じ抗体結合特性
を有する分子にして、被験物質の濃度の測定が容
易に行える特性を特徴とする分子を意味する。好
ましい類似体は、放射性原子で標識された被験物
質の試料よりなる。例えば、甲状腺ホルモンは、
¹²⁵で好都合に標識し得、次いでガンマ放射線
を測定することによつて量を知ることができる。
しかしながら、他物質の類似体も、それが分子量
を有しまた生ずる寸法が天然たん白質および使用
抗体を十分に下回る限り使用しうることが企図さ
れる。かくして、被検物質の試料を比較的低分子
量の酵素、けい光部分又は、物理的ないし化学的
手段によつて類似体濃度の定量を可能にする他の
部分で標識することにより、類似体を製造するこ
とができる。 検定を実施するには、抗体および天然たん白質
（これは一様に、20000ダルトンを越える分子量を
有する）の通過を阻止するのに十分なしかし被検
物質およびその類似体の自由通過を許容するのに
十分な透過性を有する単数ないし複数の膜によつ
て、抗体および類似体を試料から分離しなければ
ならない。本発明の好ましい具体化では、この膜
は、抗体および類似体を内蔵する半透過性マイク
ロカプセルの形をなす。 用いられる半透過性マイクロカプセルが、既述
の透析膜に似た透過性を有することは注目すべき
である。しかしながら、半透過性マイクロカプセ
ル壁は慣用の透析膜の数百分の１と薄く、またそ
の単位重量当りの有効表面積は透析膜より大き
い。遊離T₄又は他の遊離ホルモンはマイクロカ
プセルに自由に入り、その濃度に比例して、T₄
抗体からの標識T₄にとつて代る。かくして、イ
ンキユベーシヨンの間にカプセル内部は遊離T₄
と標識T₄との平衡状態に近づく。 上記の透過特性を有する膜内に生物学的物質を
封入する適当な方法については、F.Lim等の米国
特許出願606166（1975年８月20日）、同931177
（1978年８月４日）および同30847（1979年４月17
日）並びにF.Limの米国特許出願24600（1979年
３月28日）に詳しく開示されている。このような
膜の今日好ましいとされる製造方法では、界面重
縮合技法によつて半透過性ポリアミド膜が製造さ
れる。先ず互いに混和しない溶剤又は溶剤系例え
ば水とシクロヘキサンを基剤とする溶剤とを選択
する。而して、共重合体を構成する相補的対の単
量体１種を、封入させようとする物質と一緒に水
に溶解し、次いでこの被封入物質を含有する水性
溶剤を他の溶剤内に乳化させて、ばらばらに離散
せる液滴多数を形成する。次いで、このエマルジ
ヨンの連続相に別の相補的単量体（コモノマー）
を添加して、相境界での滴液周囲において重合を
開始させる。重合体析出物の膜透過性および均一
性は、重合過程でエマルジヨン連続相の、封入さ
れた単量体に対する親和性を変えることにより、
また反応する単量体の濃度および重合時間を調節
することによつて制御される。 一つの方策では、最初エマルジヨンの連続相
を、封入された単量体に対し比較的高い親和性を
有する溶剤又は溶剤系とし、それによつて、液滴
周囲に比較的厚い重合体網状構造が重合の第一段
階で生成するようにする。そのあと、連続相の上
記（第一）単量体に対する親和性が、例えば該相
を別の溶剤で稀釈し或は該相を新たな溶剤で置換
えることにより低下せしめられるように、連続相
を変える。第二の単量体を添加すると、後重合
が、先に析出した重合体網状構造の内部に選択的
に生じてマクロな孔の空隙部分を埋め、それによ
つて特定の分子量より小さな溶質の拡散を許容す
る一様なカプセル膜がもたらされる。 別の方策では、最初、連続相を、それが被封入
単量体に対する低い親和性を有するように而して
重合の第一段階で薄い比較的密な膜が形成するよ
うに選択する。そのあと、連続相の被封入単量体
に対する親和性を高めて、膜から追量の単量体を
引出し、不溶性重合体の別の外層を沈着せしめ
る。 不連続な水性液滴相が、抗体の如き不安定な生
物学的物質に適した環境を示すように緩衝剤を含
むとき、封入は、不安定な物質の生物学的活性の
大部分を保全する態様で実施することができる。
封入された物質の作動性も亦、重合期間にわたつ
てエマルジヨンの連続相の第二の単量体をインク
レメントに加えその濃度がどの所定時でも比較的
低くなるようにまた抗体が可能的に破断性の物質
の高い濃度にさらされないようにすることによつ
て保全される。 好ましい反応系では、シクロヘキサン連続相
に、ジアミン、高分子量充填材および抗体を含有
する水性液滴が形成される。而して、この連続相
の、液滴相に溶解した単量体に対する親和性は、
クロロホルムを稀釈剤として加えることにより変
性される。ジ酸ハロゲン化物を系に加えると、半
透過性ポリアミドマイクロカプセルが生成する。
このマイクロカプセル形成法は、透過性の上限を
2000〜30000ダルトン分子量範囲に有する膜を形
成するのに有効である。かくして、カプセルは、
多くのホルモンの拡散を許容するように容易に設
計することができる。 検定を行うために、試験試料と上記タイプのマ
イクロカプセルを混合し、そして、好ましくは約
37℃でインキユベートする。インキユベーシヨン
に先立ち、検出しうる程の量の類似体濃度を抗体
に負荷するのに十分な濃度の類似体溶液にカプセ
ルを懸濁させることができる。しかしながら、検
定は、反応系に類似体を、血清とのインキユベー
シヨン時又はインキユベーシヨン後添加すること
によつて実施されうる。試料中の血清たん白質お
よび血清たん白質―被験物質複合体はマイクロカ
プセルの壁を通過し得ない。 次いで、抗体を反応系の残りのもの（随意マイ
クロカプセルを排除）から分離し、抗体又は系の
残部を類似体について検定する。この分離を行う
好ましい方法ではポリエチレンイミン又は血清ア
ルブミンの溶液の如き高分子量親水性物質がカプ
セル外容量（extracapsular volume）に添加さ
れる。これは浸透圧重量モル濃度（osmolality）
の増加を誘発し、それによつてマイクロカプセル
がしぼみ、またカプセル内抗体未結合ホルモンと
その抗体未結合類似体が上澄液に移行する。その
結果、抗体が封入されている充填ペレツトが得ら
れ、そしてこのものは、随意遠心処理したのち上
澄液をアスピレートし或はデカンテーシヨンする
ことによつて分離することができる。別法とし
て、洗浄により、遊離被験物質および類似体をカ
プセルから分離することができる。 遊離T₄抗体、類似体としての¹²⁵標識チロキ
シンおよび既知濃度の遊離T₄溶液を用いて遊離
T₄の存在を検定すべく設計した本発明を具体化
せる検定の結果を表１および表２並びにそれに相
応する第１図および第２図に開示する。このデー
タを集めるために用いた方法と併行に実施せる未
知試料の試験は、標準曲線を参照することによつ
て解釈することができる。

【表】

【表】

【表】 本発明は下記の例により更によく理解されよ
う。しかしそれに制限されない。 マイクロカプセルの製造 １，６―ヘキサンジアミン17.7mlと水32mlとを
混合し、この溶液にCO₂を約１時間或はPH値が
8.5±0.1になるまでバブルさせることによつてか
かるPHレベルのヘキサンジアミンカーボネート溶
液を調製する。シクロヘキサン４部とクロロホル
ム１部とからなる有機溶剤200ml中塩化テレフタ
ロイル（TCl）20ｇを加えることによつて、TCl
溶液を調製する。この際、TClは激しくかき混ぜ
ることによつて溶解する。得られた溶液を
2600rpmで10分間遠心処理する。沈殿物は全て廃
棄する。 電磁撹拌棒を備えた２ミキサー内で、シクロ
ヘキサン750mlとスパン85（乳化剤、脂肪酸エス
テルないしソルビタン）とを混合する。このシク
ロヘキサンに、チロキシンに対する抗血清（りん
酸塩緩衝剤入り塩水中４％、テキサス州ヒユース
トン所在のR.F.ラボラトリーズ又はカリフオル
ニア州カーソン所在のレイデイオアツセイ・シス
テムズ・ラボラトリーズより入手）１ml、ポリビ
ニルピロリドン―４％ウシ血清アルブミン25mlお
よびヘキサンジアミンカーボネート溶液30mlより
つくつた混合液を撹拌下で添加する。所望大の液
滴が生成したとき、TCl溶液70mlを加える。30秒
後、TCl37.5mlを添加する。60秒後、クロロホル
ム25mlを添加する。更にクロロホルムの25mlアリ
コート三つを夫々30秒の間隔をおいて添加する。 ２相の反応系を遠心処理し、上澄液をデカンテ
ーシヨンし、そしてマイクロカプセルとトウイー
ン（Tween）20（ソルビトール無水物の脂肪酸
部分エステルのポリオキシエチレン誘導体―
NaHCO₃緩衝剤入り乳化剤）およびりん酸塩緩衝
剤入り塩水と混合することによつて、カプセルを
回収する。カプセルはポリビニルピロリドン、ウ
シ血清アルブミン充填剤およびチロキシン抗体を
保留する。 類似体による抗体の飽和 上記手順に従つて製造したマイクロカプセルに
¹²⁵標識チロキシン（マサチユーセツツ州ビレ
リカ所在のケンブリツジ・ニユークリア・コーポ
レーシヨンより入手）を次の工程によつて充填さ
せることができる。 １ 標準試験管100個の各々に、マイクロカプセ
ル懸濁液0.5mlおよびT₄（¹²⁵）（５〜6000μ
Ci／μｇの高い比放射能）1.0μCiを加え、37
℃で少くとも30分間インキユベートする。 ２ マイクロカプセルをその容量の２倍のりん酸
塩緩衝剤入り塩水（NaCl 0.15M、PH＝7.5、り
ん酸塩緩衝剤0.015M）で洗浄する。 ３ 2000×Ｇで15分間遠心処理し、上澄液をデカ
ンテーシヨンする。 ４ 工程２よび３を２回繰返す。 ５ マイクロカプセル懸濁液をその容量の1.6倍
の上記りん酸塩緩衝剤入り塩水で稀釈する。全
容量は80mlに等しい。試験１回につき0.8mlの
マイクロカプセル懸濁液を用いる。かくして、
全カプセルに対し100の試験を行うことができ
る。 試験方法 １ 25mlの試験試料および既知遊離T₄濃度試料
五つを別個の試験管に入れる。表１の標準曲線
では、濃度0.5、1.3、3.0、5.0および7.7ng％の
遊離T₄を用いたが、どの遊離T₄濃度シリーズ
もよく知られた実験技法に従つて適応しうる。
また、検定精度に対する別の検査として塩水５
μの入つた対照試験管を包含させてもよい。 ２ T₄（¹²⁵）予備飽和せるマイクロカプセル
（そのまゝの市販品）を800μピペツトで各試
験管に入れる。 ３ 各試験管を旋回させ、37℃で120分間インキ
ユベートする。 ４ インキユベーシヨンのあと、りん酸塩緩衝剤
入り塩水中2.0％のポリエチレンイミン（分子
量４〜５万）1.0mlを各試験後に添加する。 ５ 更に20分間インキユベートする。 ６ 上澄液をデカンテーシヨンする。 ７ 各試験管をガンマ計数管で１分間カウントす
る。 結果の算定 １ 単数若しくは複数の試料の未知遊離T₄濃度
を測定すべく検定を行うごとに、標準曲線作成
のため標準物質を実験すべきである。 ２ 検定し終えたとき、未知試料と同時に検定し
た標準試料より取得せる値を用いて第２図又は
第３図に示す如き標準曲線を作成する。 ３ ２サイクル片対数グラフ用紙のｘ軸（対数目
盛）の遊離T₄濃度（ng％）に対してｙ軸に各
値のカウント数／min（cpm）をプロツトする
ことができる。 cpmを遊離T₄濃度にプロツトする代りの方法
は抗体結合（相対）％を遊離T₄濃度にプロツト
するとである。これは、各標準、対照又は未知試
料の抗体結合（相対）％を算定し、これらの値
を、cpmに関して述したと同様のやり方で２サイ
クル片対数グラフ用紙にプロツトすることによつ
て遂行しうる。抗体結合（相対）％は次のように
して算出される：抗体結合（相対）％＝抗体結合
opm／最低遊離T₄濃度の標準の抗体結合平均
cpm。 第４図は、試験試料約200に関する遊離T₄濃度
（ng％）のグラフである。而して、各々の試料
は、本発明による方法と透析方法とによつて検定
した。図示する如く、二つの試験方法の間には高
度の相関性がある。 第５図は、上記方法に従つて検定した試験試料
約200に基づく遊離T₄濃度対所定の遊離T₄濃度の
頻度グラフである。 第６図は、試験試料約100に関する遊離T₄濃度
のグラフである。各々の試料は本発明の方法と動
（力学的）放射免疫技法とによつて検定した。図
示する如く、この二つの試験法には高い相関性が
ある。 表３は検定内結果の一貫性を示す：

【表】 表４は、検定間の結果における一貫性を示して
いる：

【表】 ジゴキシン検定 ジゴキシンに特異な抗体を封入する方法を以下
に示す。 先ず、使用試薬とその供給元を次に掲げる： 炭酸水素ナトリウム シクロヘキサン クロロホルム 全て（フイツシヤー・ケミカル
製） 塩化ナトリウム 一塩基性りん酸ナトリウム 二塩基性りん酸ナトリウム １，６―ヘキサンジアミン スパン85 トウイーン20 ラガー・ケミカル（Ruger
Chemical）（ニユージヤージー州） 抗ジゴキシンウサギ抗血清アーネル・プロダク
ツ（Arnel Prodncts）（ニユーヨーク州ブルツ
クリン） ウシ血清アルブミン コマシエ（Comassie） シグマ・ケミカル
（Sigma Chemical）ブリリアントブルーＲ ポリビニルピロリドン40 アルドリツチ・ケミ
カル（Aldrich Chemical） 塩化テレフタロイル イーストマン・コダツク 各成分の量は以下の如くである： １，６―ヘキサンジアミンカーボネート 30ml りん酸塩緩衝剤入り塩水 40ml ポリビニルピロリドン40／コマシエブルー 25ml 抗ジゴキシンウサギ抗血清 ５ml シクロヘキサン、ACS 750ml スパン85 125ml 塩化テレフタロイル溶液 107.5ml クロロホルム 100ml トウイーン20洗液Q.S. 200ml りん酸塩緩衝剤入り塩水Q.S. ８ 手順：全てのガラス製品を使用前蒸留水でゆす
ぐ。 １ ２のガラスミキサーを電磁撹拌機上のフー
ド内に入れる。 ２ フードに隣接する卓上に顕微鏡を置く。 ３ 250mlのガラスメスシリンダーでスパン85を
125ml注意して量る。 ４ フード内のガラスミキサーに秤量したスパン
85を注ぎ入れる。 ５ 1000mlのガラスメスシリンダーでシクロヘキ
サン750mlを秤量する。これをフード内のガラ
スミキサーに注ぎ入れる。 ６ ミキサーにおおいをする。 ７ 電磁撹拌機を付勢する。 ８ ヘキサンジアミンカーボネート30ml、PBS
30ml、15％PVP／コマシエブルー／４％BSA
25ml、抗体５mlを量り、また50mlのメスシリン
ダー内でPBS 40mlを抗体５mlを混合する。 ９ スピンリングのついた２インチ撹拌棒を400
mlのビーカーに入れる。電磁撹拌機上に置く。 10 ビーカーにヘキサンジアミン30mlを入れる。
電磁撹拌機を始動させる。 11 ビーカー内のヘキサンジアミンに15％PVP／
コマシエブルー／４％BSAを25ml次いでPBS／
抗体溶液を35ml添加する。２分間混合する。溶
液を３分間混合する。 12 溶液を混合しながら、TClの70ml部分と37.5
ml部分を別個の100mlガラスメスシリンダーで
量る。時計皿でおおい、フード内に置く。クロ
ロホルムの25ml部分を四つ、別個の25mlガラス
メスシリンダーで量る。時計皿でおおい、フー
ド内に置く。 13 バイアルのサイドアームを通して、400mlビ
ーカーの内容物をフード内のガラスミキサーに
加える。 14 できるだけ迅速に該ミキサー内の溶液試料
を、ガラス製の使い棄て１mlピペツトで採取
し、これを顕微鏡のスライドに載せる。液滴が
受容しうる大きさ（10〜80ミクロン径）のもの
かどうかを調べる。 15 液滴が受容しうる大きさのものであるとき
（Ｔ＝０）、秤量した70mlのTClをミキサーのサ
イドアームを通して加える。Ｔ＝30正確に30秒
後、TClの別（第二）の37.5ml部分をサイドア
ームを通してミキサーに加える。厳密に60秒間
混合せしめる。 16 60秒で（Ｔ＝90）、クロロホルムの最初の25
ml部分を加える。30秒間混合（Ｔ＝120）。クロ
ロホルムの第二の25ml秤量分を加え、30秒間混
合（Ｔ＝150）。クロロホルムの第三の25ml秤量
分を加え、30秒間混合（Ｔ＝180）。クロロホル
ムの第四の25ml秤量分を加え、厳密に30秒間混
合（Ｔ＝210秒）。ミキサーを停止。 17 予め蒸留水の中で３回ゆすいでおいたプラス
チツク製の１遠心機びん二つにミキサーの内
容物を注ぎ入れる。500rpmで３分間遠心処理
する。 18 上溶液を注意してデカンテーシヨンする。 19 各びんに、トウイーン20の溶液約50ml（すな
わちカプセルとほゞ同容量のトウイーン20）を
添加する。約５分間撹拌棒レトリーバーでよく
混合する。 20 各びんにPBSを約10〜15ml添加し、よく撹拌
する。 21 工程20を４〜５回反復する。 22 PBSを400ml添加し、十分にかき混ぜる。 23 二つのびんを釣合わせ、3000rpmで20分間遠
心処理する。上澄液をアスピレートする。各び
んにPBSを約800ml添加し、よくかき混ぜ、そ
してキヤツプする。 24 工程23を10回反復する。最終回のアスピレー
シヨン後、各びんにPBSを100ml加え、二つの
びんの内容物を一緒にし、よく振とうする。
500mlのガラスメスシリンダーに注ぎ入れ、500
mlになるまでPBSを十分量加える。 25 １のガラス試薬びん中４℃で貯蔵する。ト
ウイーン20洗液は次のようにして調製する。 但し、使用前日に調製してもよい。 手順： １ 三かん天秤上で炭酸水素ナトリウム6.06ｇを
秤量する。 ２ 撹拌棒を備えた250mlメスフラスコにこの炭
酸水素ナトリウム6.06ｇを注意して入れる。 ３ 精製水を約200ml加え、電磁撹拌機上で、炭
酸水素ナトリウムが溶解するまでかき混ぜる。 ４ 撹拌棒を取除き、250mlになるまでの精製水
を十分量加える。 ５ 撹拌棒を備えた500mlエルレンマイヤーフラ
スコに注意して注ぎ入れる。 ６ 250mlのメスシリンダーでトウイーン20を250
ml注意して量る。 ７ 炭酸水素ナトリウムの入つたエルレンマイヤ
ーフラスコに添加する。 ８ 完全に混ざるまで（約１時間）電磁撹拌機上
で混合する。 ９ ねじふた付きの１ポリエチレンびんに入
れ、しつかり密封して約25℃で貯蔵する。 塩化テレフタロイル溶液は次のようにして調製
する。但し、使用当日に調製すべきであつて、冷
凍してはならない。 １ 塩化テレフタロイル（TCl）の重量をTClの
入つたびんに記録する。TClの重量（ｇ）に10
を乗じてTClに加えるシクロヘキサン／クロロ
ホルム溶液の溶量（ml）を算出する。 計算法： シクロヘキサン／クロロホルムの総容量（ml） ＝TClの重量（ｇ）×10 而して、この総容量が以下行う工程に十分なこ
とを確かめる。 ２ シクロヘキサン／クロロホルム溶液はシクロ
ヘキサン４部とクロロホルム１部よりなる。シ
クロヘキサン／クロロホルム溶液の総容量（上
記工程１）を５で除してクロロホルムの容量を
算出する。このクロロホルムの容量に４を乗じ
てシクロヘキサンの容量を決定する。 計算法： (a) クロロホルムの容量（ml） ＝シクロヘキサン／クロロホルムの総容量
（ml）÷５ (b) シクロヘキサンの容量（ml） ＝クロロホルムの容量（ml）×４ ３ メスシリンダーで算出容量のシクロヘキサン
よびクロロホルムを注意して量る。エルレンマ
イヤーフラスコに入れて一緒にする。静かに旋
回させて混合する。時計皿でおおい、ヒユーム
フード内に置く。 ４ 電磁撹拌機をヒユームフード内に置く。 ５ TClを含有するびんを電磁撹拌機上に置く。
びんのふたをとり、電磁撹拌機棒とシクロヘキ
サン／クロロホルム溶液とをできるだけ早く添
加する。びんにふたをする。 ６ TClが全て溶解するまで電磁撹拌機上でかき
混ぜる。びんの上方内壁に付着せるTClを溶か
すためにびんを傾ける必要があるかもしれな
い。 ７ 200mlのガラス遠心機びんをTCl溶液で必要
なだけ多くしかもできるだけ早く満たし、ふた
をする。2600rpmで10分間室温での遠心処理に
付す。 ８ 上澄液を500mlのこはく色びんに注ぎ入れ、
よく密封する。 ９ しつかり密封した状態で約25℃で貯蔵する。 BSA4％を含む15％のPVP40／コマシエブルー
を調製する手順は次の如くである。但し、使用当
日に調製すること。冷凍不用。 手順： １ 三かん天秤でポリビニルピロリドン40を7.5
ｇ、BSAを２ｇそしてコマシエブルーを0.1ｇ
（100mg）正確に秤量する。 ２ 撹拌棒を備えた50mlのガラスビーカーにポリ
ビニルピロリドン40を入れ。 ３ PBSを約20ml加える。ビーカーの上にガラス
カバープレートを載せる。 ４ 溶けるまで電磁撹拌機上でかき混ぜる。 ５ 別の80mlガラスビーカーにコマシエブルー
0.1ｇとBSA2ｇを入れる。 ６ PBSを約20ml加える。ビーカーにガラスカバ
ープレートを載せる。 ７ 加熱装置を２にセツトした電磁熱板／撹拌機
＃10を用いてわずかに加熱しながらかき混ぜ
る。溶解するまで（約10分間）撹拌する。 ８ ポリビニルピロリドン40の溶液を入れたビー
カーとコマシエブルー溶液を入れたビーカーの
内容物を全て、撹拌棒を備えた50mlガラスメス
フラスコの注意して加える。 ９ 一緒にした溶液を10分間電磁撹拌機で混合す
る。撹拌棒を除去する。 10 50mlになるまでPBSを十分量加える。 11 1N水酸化ナトリウムでPH＝7.5±0.5に調節す
る。元のPH−最終PH−1NNaOHの使用量− 12 使い棄て膜Nalgeneフイルターユニツト
（0.45μ）を用いて溶液を過する。 13 ねじふた付きの60mlポリエチレンびん内に密
封し約25℃で貯蔵する。 りん酸塩緩衝剤入り塩水を調製する手順は次の
如くである。なお、使用前日に調製してもよい。 手順： １ 1000mlのガラスメスシリンダーでりん酸塩緩
衝剤入り塩水を1000ml注意して量る。 ２ これを20の大型ポリエチレンびんに注ぎ入
れる。 ３ 脱イオン水9000mlを1000mlのガラスメスシリ
ンダーで量つて、りん酸塩緩衝剤入り塩水の入
つて大型ポリエチレンびんに添加する。 ４ 電磁撹拌棒レトリーバーを用いてかき混ぜ
る。 ５ PHを調べ、必要に応じて7.5±0.05にPH調節
する。最終PHＨ＝− ６ りん酸塩緩衝剤入り塩水を、しつかり密封し
た20mlの大型ポリエチレンびん内で使用時まで
約25℃で貯蔵する。 １，６―ヘキサンジアミンカーボネートの製造
手順は次の如くである。なお、使用前日に製造し
てもよい。 手順： １ １，６―ヘキサンジアミンのびんを３ビー
カーに入れる。びんの中のヘキサンジアミンの
レベルにまで十分量の水道水をビーカーに入れ
る。 ２ ヘキサンジアミンのびんのふたをゆるめる。 ３ ヒーターを２セツトした電磁撹拌機／熱板上
にビーカーご載せて、ヘキサンジアミンを完全
に溶融せしめる。 ４ 25mlのガラスメスシリンダーでヘキサンジア
ミン17.7mlを正確に量る。500mlのこはく色び
んに注意して注ぎ入れる。 ５ 50mlのガラスメスシリンダーで精製水32mlを
正確に量る。こはく色びんに入れたヘキサンジ
アミンに加える。 ６ PHが8.5±0.1になるまで約１時間、溶液に
CO₂をバブルする。最終PH−。 ７ こはく色びんを密封し、約25℃で貯蔵する。 マイクロカプセルとその作動原理を略図的に第
９図に示す。この図に示すように、ジゴキシンに
特異な抗体９はマイクロカプセル１２の壁１０内
部に止められている。しかしながら、マイクロカ
プセル１２の壁１０は、ジゴキシンの自由通過を
許容するのに十分小さな開口を有している。かく
して、試料からのジゴキシン１６と標識ジゴキシ
ン１８はマイクロカプセル壁を自由に通り、抗体
９の結合箇所に関して互いに競合する。抗体未
結・合のジゴキシン１６又は１８はいずれもイン
キユベーシヨン終了後洗去されうる。 上述の如く、ジゴキシンの或るものは標識され
ている。而して、ジゴキシンに特異な抗体の結合
箇所に関して試料からの未標識ジゴキシンと競合
するのは標識ジゴキシンである。好ましい標識ジ
ゴキシンは（¹²⁵）ジゴキシンで、これはマサ
チユーセツツ州ビレリカ所在のニユー・イングラ
ンド・ニユークリア・コーポレーシヨンから入手
するこができる。 試験方法 １ 試験しようとする血清試剤を斯界に周知の方
法で得る。本例では、対照を用いる。 ２ 既述の如く調製したジゴキシン抗体マイクロ
カプセル懸濁物0.5mlを入れた各試験管に、標
準、対照又は未知の患者血清試料を夫々0.1ml
（100μ）ピペツトに取つて加え、これら試験
管に、相当するラベルを付す。 ３ ¹²⁵標識ジゴキシン（りん酸塩緩衝剤入り
塩水中）0.5ml（500μ）をピペツトに取つて
各試験管に入れる。最低３〜４秒間旋回させ
る。 ４ 反応管を全て水浴（37℃）中で最低15分間イ
ンキユベートする。〔別法として、反応管を全
て室温（20〜25℃）で最低３分間インキユベー
トする〕。 ５ 洗液0.5ml（500μ）を各管に加え最低３〜
４秒の間旋回させる。 ６ 反応管を全て室温（20〜25℃）で５分間イン
キユベートする。 ７ 管を全て最低1600×Ｇで10分間室温（20〜25
℃）で遠心処理し、上澄液を適当な容器内にデ
カンテーシヨンし、最後の一滴を吸取紙に吸取
らせる。 ８ 全ての管を、¹²⁵用に調整したガンマー計
数管で夫１分間カウントする。 ９ 既知量のジゴキシンをcpmに対してプロツト
し、標準曲線を作成したのち、この曲線からジ
ゴキシンの未知量を読み取る。 使用試薬 既述の如く調製したりん酸塩緩衝剤入り塩水に
懸濁せる半透過性ナイロンマイクロカプセルにジ
ゴキシン―抗体を封入する。品質管理のため、抗
体マイクロカプセルに青の染料（コマシエブルー
R₂₅₀）を含ませる。マイクロカプセルを遠心処理
によつて沈降させ或は析出させたあとの青い上澄
液はマイクロカプセルの破断ないし可能な抗体漏
出を表わす。¹²⁵ I標識ジゴキシン 溶液各１mlに4.2μCi未満の¹²⁵Iジゴキシン10μ
ｇが含まれる。 緩衝剤溶液 塩化ナトリウム0.15M、ウシ血清アルブミン
（BSA）0.5％およびナトリウムアジド0.1％を含
むPH7.5のりん酸塩緩衝剤0.015M。 洗 液 塩化ナトリウム0.15Mを含有するPH8.9のバル
ビタール緩衝剤0.5M中20％のポリエチレングリ
コール6000溶液。 結果の算定 代表的試験である本試験の結果を表５に示し、
またこれを略図的に第７図および第８図に示す。 第７図では、２サイクル片対数グラフ用終のｙ
軸上にcpmを取り、またｘ軸（対数目盛）上にジ
ゴキシン濃度（ｎｇ／ml）を取る。ジゴキシン濃
度に対してcpmをプロツトする代りに抗体結合
（相対）％をプロツトしたのが第８図である。こ
れは、標準、対照又は未知試料の各々について抗
体結合（相対）％を算出し、またこれらの値を、
cpmに関し記したと同様のやり方で２サイクル片
対数用紙上にプロツトすることにより作成され
る。抗体結合（相対）％は次の如く算出される： 抗体結合（相対）％＝（ジゴキシン標準0nｇ／
mlの抗体結合平均cpm）×100

【表】 本発明方法の検定系はきわめて正確なことがわ
かつた。検定内変動は７％未満であり、検定間変
動は９％未満である。 検定内変動 一つの実験で対照試料二つに関し各々25回検定
したときの変動率CVは次の如くであるとわかつ
た： 平均ジゴキシンｎｇ／ml CV 対照１ 1.54 4.9％ 対照２ 2.95 6.2％ 検定間変動 対照試料二つに関し、別個の実験18において
各々３回検定したときの変動率は次の如くである
とわかつた。 平均ジゴキシンｎｇ／ml CV 対照１ 1.50 7.3％ 対照２ 3.04 8.8％ 表６は、このジゴキシンについてまた他の見込
まれる干渉物質の排除に対しきわめて高い特異性
を示す。

【表】 定量的回収 本発明方法は、添加試料ジゴキシンの96％以上
が回収されたことから非常に定量的であることが
わかつた。

【表】 特に本発明方法の結果と他の検定方法によるジ
ゴキシン測定値との高い相関性に注目することは
重要である。 表８は、本発明方法によつて得た試験結果と他
の検定結果との比較を表わす。 系Ａおよび系Ｃは沈降試薬分離による液体検定
系を表わし、系Ｂは固相分離を用いる。表に示す
如く、相関係数は、0.97〜0.98である。

【表】 上表から、被験物質およびその標識を付した類
似体に特異結合することのできる相補的物質が入
手しうる限り、どんな遊離被験物質の有無および
濃度を測定するのにも本発明に開示した検定法を
用いうることは明らかである。なお、もう一つの
要件は、これら物質の拡散を選択的に許容し而し
て天然たん白質の如き高分子量物質の通過を阻止
するマイクロカプセル膜を供与することができる
ように種およびその類似体の分子量が十分低いと
いうとである。幸いなことに、ステロイドホルモ
ン、甲状腺ホルモン、多くの薬剤および臨床的に
重要な他の物質類は、天然たん白質よりもはるか
に小さな分子寸法によつて特徴づけられる。 本発明は、その精神ないし本質的特徴から逸脱
することなく他の特定態様で具体化することがで
きる。それ故、上記の具体化および実施例は全て
の面において本発明を例示するにすぎず、これを
限定するものと見なすべきでない。本発明の範囲
は上記説明よりもむしろ前出「特許請求の範囲」
によつて示される。従つて、「特許請求の範囲」
の意味および均等性の範囲内に入る全ての変更は
本発明に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法に従つて作成した標準
曲線で、ｘ軸（対数目盛）の遊離T₄濃度（ｎ
ｇ／dl）に対してｙ軸にカウント数／min
（cpm）（×10³）をプロツトしたグラフである（前
出表１参照）。第２図は、本発明の遊離T₄検定に
関する別の標準曲線を例示する。この図のデータ
ーは前出表２に見出される。第３図は、遊離T₄
の標準溶液に浸漬した半透性マイクロカプセル内
に含まれるT₄抗体に結合したT₄（¹²⁵）からの
cpm対時間のグラフである。血清T⁴がT₄抗体結
合性箇所でT₄（¹²⁵）を置換わるにつれ、その
抗体に関連した残存cpmは減少する。注目すべき
は、置換わる速度が37℃でのインキユベーシヨン
２時間まではおおかた比例的であるということで
ある。第４図は、透析検定法と本発明のマイクロ
カプセル化法の結果における相関性を図で例示す
る。第５図は、マイクロカプセル化検定系によつ
て確立した遊離T₄の標準範囲を図で例示する。
第６図は動放射免疫検定と本発明のマイクロカプ
セル化タイプ検定系との相関性を図で例示する。
第７図は、２サイクル片対数のｘ軸（対数目盛）
上のジゴキシン（ｎｇ／ml）に対しｙ軸上にプロ
ツトした抗体結合ジゴキシン（cpm）の標準曲線
（表５のデーター）を示す。第８図は、ジゴキシ
ンの抗体結合（相対）％対ジゴキシン濃度を示
す。抗体結合（相対）％は、抗体結合（相対）％
＝平均抗体結合opm／0nｇ／dlジゴキシン標準の
平均抗体結合cpm×100（表３のデーター）とし
て算出される。第９図は、本発明に従つて形成し
たマイクロカプセルでの抗体の保留および免疫原
物質の自由通過を示す図である。 図中、主要な部分を表わす符号の説明は以下の
通りである：９：抗体、１２：マイクロカプセル
（１０：壁）、１６：試料からのジゴキシン、１
８：標識ジゴキシン。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血清たん白質含有試料中血清たん白質に結合
   していない被験物質の存在を測定する方法であつ
   て、 試料を、該たん白質未結合被験物質に対し相補
   的な抗体および該被験物質の、標識を付した類似
   体と一緒にインキユベートし、而してこれらの試
   料および抗体は、血清たん白質未結合被験物質お
   よびその、標識を付した類似体の通過を許容する
   のに十分なしかし試料中に存在する抗体又は血清
   たん白質結合被験物質の通過を許容するには不十
   分な多孔率を有する少くとも一つの膜によつて分
   離され、該抗体および標識を付した類似体が、該
   膜よりなるマイクロカプセルに内蔵されているも
   のとし、 試料中の血清たん白質未結合被験物質を前記膜
   に通過させ且つこれを、前記抗体上の結合箇所に
   関して該被験物質の標識を付した類似体と競合さ
   せ、 該マイクロカプセルから抗体未結合被験物質お
   よび類似体を、該マイクロカプセルの外の浸透圧
   を高くすることにより取出し、該マイクロカプセ
   ルを反応系の残りのものから分離せしめ、そして 前記抗体に結合した前記標識を付した類似体の
   量を測定し、而してこの量が試料中の血清たん白
   質未結合被験物質の量を表示するものとする、諸
   工程を包含する方法。 ２ 標識を付した類似体が放射性原子で標識され
   た被験物質よりなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３ 被験物質がＬ―チロキシンである特許請求の
   範囲第１または２項記載の方法。 ４ 被験物質がＬ―３，５，3′―トリヨードチロ
   ニンである特許請求の範囲第１または第２項記載
   の方法。 ５ 被験物質がコルチソル、テストステロンおよ
   び新生児のチロキシンよりなる群から選ばれる特
   許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ６ 分離工程が、抗体未結合被験物質および抗体
   結合類似体をマイクロカプセルから洗去すること
   によつて遂行される特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ７ 被験物質がジゴキシンである特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ８ 液体試料中血清たん白質未結合被験物質の量
   を測定するのに用いられる試験セツトであつて、
   該セツトが、 前記被験物質の標識を付けた類似体、 前記物質に対し相補的な抗体を含有する複数個
   のマイクロカプセルにして、前記物質およびその
   標識を付けた類似体の通過を許容するのに十分な
   しかし前記抗体又は天然たん白質の通過を許容す
   るには不十分な透過性を有する膜から構成され
   る、前記試料からの血清蛋白質未結合被験物質吸
   収のためのマイクロカプセル、 該カプセルの外の浸透圧を上昇せしめることに
   よつて抗体未結合被験物質とその、標識を付けた
   抗体未結合類似体を前記マイクロカプセルから取
   出すことのできる試薬、並びに 前記被験物質の所定量を含有する、試料との比
   較用標準物質 を組合せてなるところの試験セツト。 ９ 被験物質がチロキシンであり、標識を付けた
   類似体が放射性原子で標識されたチロキシンであ
   り、そして標準物質が、既知量の遊離チロキシン
   を含有する物質のアリコートよりなるもので、該
   物質を試料と平行で試験するときは標準曲線の作
   成を行うことができる、特許請求の範囲第８項記
   載の試験セツト。 １０ 試薬が、血清アルブミンおよびポリエチレ
   ンイミンよりなる群から選ばれる要素よりなる特
   許請求の範囲第９項記載の試験セツト。 １１ マイクロカプセルがジゴキシンに対する抗
   体を含み、標識を付けた類似体が¹²⁵標識ジゴ
   キシンである特許請求の範囲第８項記載の試験セ
   ツト。 １２ 液体試料中の血清たん白質未結合被験物質
   にして、抗体を形成することができ且つ試料中の
   血清たん白質と可逆的に結合することのできる前
   記未結合被験物質を量定する際に用いられる試薬
   であつて、該物質に対し相補的な抗体と該被験物
   質の標識を付けた類似体を含有する複数個のマイ
   クロカプセルよりなり、しかも該マイクロカプセ
   ルが前記被験物質およびその標識を付けた類似体
   の通過を許容するのに十分なしかし前記抗体およ
   び天然たん白質の通過を許容するには不十分な透
   過性を有する膜からなるようにした前記試薬。 １３ 抗体がチロキシンに対し相補性であり、標
   識を付けた類似体が放射性原子で標識されたチロ
   キシンである特許請求の範囲第１２項記載の試
   薬。