JPS6231914B2 - - Google Patents
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- JPS6231914B2 JPS6231914B2 JP54124010A JP12401079A JPS6231914B2 JP S6231914 B2 JPS6231914 B2 JP S6231914B2 JP 54124010 A JP54124010 A JP 54124010A JP 12401079 A JP12401079 A JP 12401079A JP S6231914 B2 JPS6231914 B2 JP S6231914B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- acrylonitrile
- acrylamide
- meth
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はアクリロニトリルまたはメタアクリロ
ニトリル〔以下、単に（メタ）アクリロニトリル
という〕を水和しうる酵素を（メタ）アクリロニ
トリルに作用せしめて特異的にアクリルアミドま
たはメタアクリルアミド〔以下、単に（メタ）ア
クリルアミドという〕を生成させることにかゝわ
る（メタ）アクリルアミドの製造法に関する。 アクリルアミドは高分子凝集剤、紙力増強剤、
その他の重合体原料として多くの用途を有する
が、その製造法は、従来、例えばアクリロニトリ
ルを還元状態の銅を触媒として水と反応させて製
造する方法が公知である。しかしながら、この方
法は触媒調製の煩雑さ、再生の困難さ、および生
成アクリルアミドの分離、精製の煩雑さ等によ
り、さらに新規で工業的に有利な方法の開発が望
まれている。 本発明者らは、このような欠点がなく、かつ、
アクリルアミドのように分子内に不飽和結合を有
する重合しやすい化合物の製造に好ましい温和な
条件ですみやかに反応が行える方法を開発すべく
種々検討を重ねた結果、効果の顕著な本発明に到
達した。 すなわち、本発明は（メタ）アクリロニトリル
を水和しうる酵素を産生するコリネバクテリウム
（Corynebacterium）属またはノカルジア
（Nocardia）属に属する微生物から該酵素を取り
出し、該酵素を（メタ）アクリロニトリルに作用
せしめて（メタ）アクリルアミドを生成せしめる
ことを特徴とする酵素による（メタ）アクリルア
ミドの製造法に関するものである。 本発明で使用される（メタ）アクリロニトリル
を水和しうる酵素は、本発明者らによつて発見さ
れた新規な酵素であつて（メタ）アクリロニトリ
ルを水和して（メタ）アクリルアミドを生成する
作用を有しており、後述するような酵素的性質を
有する。そして、その起源としては例えば、本発
明者らが土壤中より分離した特公昭56−17918号
公報記載のコリネバクテリウム属に属するＮ−
771菌株（微工研菌寄第4445号）、コリネバクテリ
ウム属に属するＮ−774菌株（微工研菌寄第4446
号）およびノカルジア属に属するＮ−775菌株
（微工研寄第4447号）等を好適なものとしてあげ
ることが出来る。また、酵素の使用形式は特に限
定されるものではなく菌体抽出液、粗酵素、精製
酵素もしくは固定化酵素等を用いることが出来
る。 上記菌株の菌学的性質は以下に示す通りであ
る。
ニトリル〔以下、単に（メタ）アクリロニトリル
という〕を水和しうる酵素を（メタ）アクリロニ
トリルに作用せしめて特異的にアクリルアミドま
たはメタアクリルアミド〔以下、単に（メタ）ア
クリルアミドという〕を生成させることにかゝわ
る（メタ）アクリルアミドの製造法に関する。 アクリルアミドは高分子凝集剤、紙力増強剤、
その他の重合体原料として多くの用途を有する
が、その製造法は、従来、例えばアクリロニトリ
ルを還元状態の銅を触媒として水と反応させて製
造する方法が公知である。しかしながら、この方
法は触媒調製の煩雑さ、再生の困難さ、および生
成アクリルアミドの分離、精製の煩雑さ等によ
り、さらに新規で工業的に有利な方法の開発が望
まれている。 本発明者らは、このような欠点がなく、かつ、
アクリルアミドのように分子内に不飽和結合を有
する重合しやすい化合物の製造に好ましい温和な
条件ですみやかに反応が行える方法を開発すべく
種々検討を重ねた結果、効果の顕著な本発明に到
達した。 すなわち、本発明は（メタ）アクリロニトリル
を水和しうる酵素を産生するコリネバクテリウム
（Corynebacterium）属またはノカルジア
（Nocardia）属に属する微生物から該酵素を取り
出し、該酵素を（メタ）アクリロニトリルに作用
せしめて（メタ）アクリルアミドを生成せしめる
ことを特徴とする酵素による（メタ）アクリルア
ミドの製造法に関するものである。 本発明で使用される（メタ）アクリロニトリル
を水和しうる酵素は、本発明者らによつて発見さ
れた新規な酵素であつて（メタ）アクリロニトリ
ルを水和して（メタ）アクリルアミドを生成する
作用を有しており、後述するような酵素的性質を
有する。そして、その起源としては例えば、本発
明者らが土壤中より分離した特公昭56−17918号
公報記載のコリネバクテリウム属に属するＮ−
771菌株（微工研菌寄第4445号）、コリネバクテリ
ウム属に属するＮ−774菌株（微工研菌寄第4446
号）およびノカルジア属に属するＮ−775菌株
（微工研寄第4447号）等を好適なものとしてあげ
ることが出来る。また、酵素の使用形式は特に限
定されるものではなく菌体抽出液、粗酵素、精製
酵素もしくは固定化酵素等を用いることが出来
る。 上記菌株の菌学的性質は以下に示す通りであ
る。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
以上の菌学的性質をバージーの細菌分類書
（Bergy´s Manual of Determinative
Becteriology）第７版（1957）および第８版
（1974）に基づいて分類すると、Ｎ−771菌株およ
びＮ−774菌株は好気性、グラム陽性、非抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌で
あり鞭毛を着生しない。また、発育の初期過程で
長桿菌状でフイラメントを呈さずジグザグに折れ
た（Snapping）発育を示すが、枝分け
（Branching）は伴わず、後に球ないし短桿菌状
に断裂することからコリネ型細菌に属することは
明らかである。さらに、同書記載のコリネ型細菌
の各属を比較してみるに、(1)セルロース分解力を
もたないことによりセルロモナス属、(2)グラム染
色がバリアブルでないことよりアルスロバクター
属、(3)10％スキムミルク中、72℃、15分間の耐熱
性がないことによりミクロバリテリウム属および
(4)鞭毛を着生しないことによりクルチア属がそれ
ぞれ否定される。従つて、本菌はコリネバクテリ
ウム属に属するものと認められる。 Ｎ−775菌株は好気性、グラム陽性、弱抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌で
あり、鞭毛を着出しない。また、発育の初期過程
で長桿菌状で菌糸状を呈し、枝分れ
（Branching）を伴つた発育を示し、後に球ない
し短桿菌状に断裂することからノカルジア属に属
するものと認められる。 （メタ）アクリロニトリルを水和し得る酵素は
これら細菌のうちの一種を培養することによつて
得られる。 培養にさいしては、グルコース、マルトース、
サツカロース等の炭素源、アンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等の窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、
ペプトン、肉エキス等の有機栄養源およびリン酸
塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガ
ン等の無機栄養源等を適宜含有する通常の培地が
用いられる。培地のPH６〜９とし、温度は20〜35
℃、好ましくは25〜30℃で１〜５日間好気的に培
養を行う。培養に伴つて（メタ）アクリロニトリ
ルを水和し得る酵素は菌体内に蓄積される。 培養終了後の培養液から酵素を抽出、精製する
には次のような通常の方法が用いられる。すなわ
ち、培養終了後の培養液を遠心分離にかけて菌体
を集得し、これを水洗後、酵素の安定領域のPHの
緩衝液（PH7.7の0.05Mリン酸塩緩衝液）に懸濁
し、低温下にフレンチプレスまたは超音波処理等
により菌体を破砕する。次いで遠心分離によつて
菌体抽出液（粗抽出液）と菌体破片とを分離す
る。粗抽出液は常法によつて硫安分画し、透析し
て粗酵素液を得る。この粗酵素液は、さらに、
DEAE−セルロース、セフアデツクスＧ−200等
のカラムクロマトグラフにかけて活性区分を集め
部分精製酵素とすることが出来る。 本酵素の酵素的性質を示すと以下の通りであ
る。（第１図、第２図および第３図参照）。
（Bergy´s Manual of Determinative
Becteriology）第７版（1957）および第８版
（1974）に基づいて分類すると、Ｎ−771菌株およ
びＮ−774菌株は好気性、グラム陽性、非抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌で
あり鞭毛を着生しない。また、発育の初期過程で
長桿菌状でフイラメントを呈さずジグザグに折れ
た（Snapping）発育を示すが、枝分け
（Branching）は伴わず、後に球ないし短桿菌状
に断裂することからコリネ型細菌に属することは
明らかである。さらに、同書記載のコリネ型細菌
の各属を比較してみるに、(1)セルロース分解力を
もたないことによりセルロモナス属、(2)グラム染
色がバリアブルでないことよりアルスロバクター
属、(3)10％スキムミルク中、72℃、15分間の耐熱
性がないことによりミクロバリテリウム属および
(4)鞭毛を着生しないことによりクルチア属がそれ
ぞれ否定される。従つて、本菌はコリネバクテリ
ウム属に属するものと認められる。 Ｎ−775菌株は好気性、グラム陽性、弱抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌で
あり、鞭毛を着出しない。また、発育の初期過程
で長桿菌状で菌糸状を呈し、枝分れ
（Branching）を伴つた発育を示し、後に球ない
し短桿菌状に断裂することからノカルジア属に属
するものと認められる。 （メタ）アクリロニトリルを水和し得る酵素は
これら細菌のうちの一種を培養することによつて
得られる。 培養にさいしては、グルコース、マルトース、
サツカロース等の炭素源、アンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等の窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、
ペプトン、肉エキス等の有機栄養源およびリン酸
塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガ
ン等の無機栄養源等を適宜含有する通常の培地が
用いられる。培地のPH６〜９とし、温度は20〜35
℃、好ましくは25〜30℃で１〜５日間好気的に培
養を行う。培養に伴つて（メタ）アクリロニトリ
ルを水和し得る酵素は菌体内に蓄積される。 培養終了後の培養液から酵素を抽出、精製する
には次のような通常の方法が用いられる。すなわ
ち、培養終了後の培養液を遠心分離にかけて菌体
を集得し、これを水洗後、酵素の安定領域のPHの
緩衝液（PH7.7の0.05Mリン酸塩緩衝液）に懸濁
し、低温下にフレンチプレスまたは超音波処理等
により菌体を破砕する。次いで遠心分離によつて
菌体抽出液（粗抽出液）と菌体破片とを分離す
る。粗抽出液は常法によつて硫安分画し、透析し
て粗酵素液を得る。この粗酵素液は、さらに、
DEAE−セルロース、セフアデツクスＧ−200等
のカラムクロマトグラフにかけて活性区分を集め
部分精製酵素とすることが出来る。 本酵素の酵素的性質を示すと以下の通りであ
る。（第１図、第２図および第３図参照）。
【表】
【表】
次に、本発明による反応方法の１例について記
す。 アクリルアミドの生成反応を行うには、アクリ
ロニトリルの水溶液または懸濁液に酵素標品を添
加し、温度25〜30℃、PH７〜９で0.5〜10時間ゆ
るやかに撹拌しつつ反応させる。反応開始時のア
クリロニトリルの濃度は５重量％以下が好ましい
が勿論これに限定されるものではない。反応の進
行に応じて、系内のアクリロニトリル濃度を２重
量％以下に保ちつつ、さらにアクリロニトリルを
逐次添加すれば、アクリルアミド濃度を25％程度
にまで高めることも出来る。また、酵素標品とし
ては、精製酵素、粗酵素液、菌体抽出液および固
定化酵素等から適当に選ぶことが出来る。 反応液からのアクリルアミドの採取は公知の方
法で行うことが出来る。すなわち、反応液または
それから菌体を遠心分離して除いた液を活性
炭、イオン交換処理等にかけ着色物質、不純物等
を除去した後、減圧濃縮してアクリルアミドの濃
縮液または結晶を得ることが出来る。 次に、実施例により本発明を説明する。なお、
下記実施例中の部および％は重量に関する。ま
た、アクリルアミドおよびアクリロニトリルの分
析定量はガスクロマトグラフイーにより行つた。 実施例 １ グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％からなる培地（PH7.2）に
より好気的に培養して調製したＮ−774菌株の休
止菌体（含水率75％）10部に0.05Mリン酸塩緩衝
液（PH7.7）40部を加えて菌体懸濁液とする。こ
れを４℃以下に保ちつつ20kc／ｓ、20分間超音
波処理をして菌体細胞を破壊し、12000ｇで20分
間遠心分離して上澄液を得た。この菌体抽出液の
20℃におけるアクリロニトリル水和の酵素活性は
200μmole／mlproteinであつた。 これを酵素標品とし、この標品30部にアクリロ
ニトリル６部、0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.7）
64部を混合し20℃にて40分間反応させた。反応終
了液は8.0％のアクリルアミドを含み、未反応の
アクリロニトリルは全く検出されなかつた。 実施例 ２ 実施例１で使用した酵素標品40部に50％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを加え、生じた沈で
んを一夜おいてから遠心分離して除き、この上澄
液をさらに70％飽和になるように硫酸アンモニウ
ムを加えて沈でんを生ぜしめ、同様に一夜おいて
から遠心分離して沈でんを集めた。このようにし
て得られた沈でんを少量の0.05Mリン酸塩緩衝液
（PH7.7）に溶解し、同じ緩衝液で一夜透析して１
ml当り15mgの蛋白質を含む粗酵素液20部を得た。
この粗酵素液の20℃におけるアクリロニトリル水
和の酵素活性は38μmole／proteinであつた。 この粗酵素液を酵素標品とし、その10部に
0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.7）81部を混合し、
アクリロニトリルを20分間当り２部の割合で間欠
的に添加し、20℃にて90分間反応させた。反応終
了液は12.1％のアクリルアミドを含み未反応のア
クリロニトリルは全く検出されなかつた。
す。 アクリルアミドの生成反応を行うには、アクリ
ロニトリルの水溶液または懸濁液に酵素標品を添
加し、温度25〜30℃、PH７〜９で0.5〜10時間ゆ
るやかに撹拌しつつ反応させる。反応開始時のア
クリロニトリルの濃度は５重量％以下が好ましい
が勿論これに限定されるものではない。反応の進
行に応じて、系内のアクリロニトリル濃度を２重
量％以下に保ちつつ、さらにアクリロニトリルを
逐次添加すれば、アクリルアミド濃度を25％程度
にまで高めることも出来る。また、酵素標品とし
ては、精製酵素、粗酵素液、菌体抽出液および固
定化酵素等から適当に選ぶことが出来る。 反応液からのアクリルアミドの採取は公知の方
法で行うことが出来る。すなわち、反応液または
それから菌体を遠心分離して除いた液を活性
炭、イオン交換処理等にかけ着色物質、不純物等
を除去した後、減圧濃縮してアクリルアミドの濃
縮液または結晶を得ることが出来る。 次に、実施例により本発明を説明する。なお、
下記実施例中の部および％は重量に関する。ま
た、アクリルアミドおよびアクリロニトリルの分
析定量はガスクロマトグラフイーにより行つた。 実施例 １ グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％からなる培地（PH7.2）に
より好気的に培養して調製したＮ−774菌株の休
止菌体（含水率75％）10部に0.05Mリン酸塩緩衝
液（PH7.7）40部を加えて菌体懸濁液とする。こ
れを４℃以下に保ちつつ20kc／ｓ、20分間超音
波処理をして菌体細胞を破壊し、12000ｇで20分
間遠心分離して上澄液を得た。この菌体抽出液の
20℃におけるアクリロニトリル水和の酵素活性は
200μmole／mlproteinであつた。 これを酵素標品とし、この標品30部にアクリロ
ニトリル６部、0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.7）
64部を混合し20℃にて40分間反応させた。反応終
了液は8.0％のアクリルアミドを含み、未反応の
アクリロニトリルは全く検出されなかつた。 実施例 ２ 実施例１で使用した酵素標品40部に50％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを加え、生じた沈で
んを一夜おいてから遠心分離して除き、この上澄
液をさらに70％飽和になるように硫酸アンモニウ
ムを加えて沈でんを生ぜしめ、同様に一夜おいて
から遠心分離して沈でんを集めた。このようにし
て得られた沈でんを少量の0.05Mリン酸塩緩衝液
（PH7.7）に溶解し、同じ緩衝液で一夜透析して１
ml当り15mgの蛋白質を含む粗酵素液20部を得た。
この粗酵素液の20℃におけるアクリロニトリル水
和の酵素活性は38μmole／proteinであつた。 この粗酵素液を酵素標品とし、その10部に
0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.7）81部を混合し、
アクリロニトリルを20分間当り２部の割合で間欠
的に添加し、20℃にて90分間反応させた。反応終
了液は12.1％のアクリルアミドを含み未反応のア
クリロニトリルは全く検出されなかつた。
第１図は20℃、10分の反応条件における相対活
性（％）とPHの関係、第２図はPH7.7、10分の反
応条件における相対活性（％）と温度（℃）との
関係および第３図は酵素溶液をPH7.7、30分、各
温度で処理した後の20℃、10分の反応条件におけ
る残存活性（％）と温度（℃）との関係を示す。
性（％）とPHの関係、第２図はPH7.7、10分の反
応条件における相対活性（％）と温度（℃）との
関係および第３図は酵素溶液をPH7.7、30分、各
温度で処理した後の20℃、10分の反応条件におけ
る残存活性（％）と温度（℃）との関係を示す。
Claims (1)
- １ アクリルロニトリルまたはメタアクリロニト
リルを水和しうる酵素を産出するコリネバクテリ
ウム（Corynebacterium）属またはノカルジア
（Nocardia）属に属する微生物から該酵素を取り
出し、該酵素をアクリルロニトリルまたはメタア
クリロニトリルに作用せしめてアクリルアミドま
たはメタアクリルアミドを生成せしめることを特
徴とする酵素によるアクリルアミドまたはメタア
クリルアミドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12401079A JPS5648889A (en) | 1979-09-28 | 1979-09-28 | Preparation of acrylamide or methacrylamide by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12401079A JPS5648889A (en) | 1979-09-28 | 1979-09-28 | Preparation of acrylamide or methacrylamide by fermentation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5648889A JPS5648889A (en) | 1981-05-02 |
| JPS6231914B2 true JPS6231914B2 (ja) | 1987-07-10 |
Family
ID=14874782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12401079A Granted JPS5648889A (en) | 1979-09-28 | 1979-09-28 | Preparation of acrylamide or methacrylamide by fermentation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5648889A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6439819U (ja) * | 1987-09-01 | 1989-03-09 | ||
| JPH0242111A (ja) * | 1988-08-03 | 1990-02-13 | Asahi Glass Co Ltd | パティキュレートトラップ装置およびパティキュレート捕集方法 |
| EP0790310A2 (en) | 1996-02-14 | 1997-08-20 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Nitrile hydratase, derivatives thereof and methods of producing compounds |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61115495A (ja) * | 1984-11-09 | 1986-06-03 | Nitto Chem Ind Co Ltd | アクリルアミド系重合体の製造方法 |
| JPS63137688A (ja) * | 1986-12-01 | 1988-06-09 | Res Assoc Util Of Light Oil | アミド化合物の製造法 |
| CN1308456C (zh) * | 2003-02-27 | 2007-04-04 | 上海市农药研究所 | 微生物催化法生产丙烯酰胺 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2294999A1 (fr) * | 1974-12-18 | 1976-07-16 | Anvar | Procede de preparation d'amides par hydrolyse biologique |
-
1979
- 1979-09-28 JP JP12401079A patent/JPS5648889A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6439819U (ja) * | 1987-09-01 | 1989-03-09 | ||
| JPH0242111A (ja) * | 1988-08-03 | 1990-02-13 | Asahi Glass Co Ltd | パティキュレートトラップ装置およびパティキュレート捕集方法 |
| EP0790310A2 (en) | 1996-02-14 | 1997-08-20 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Nitrile hydratase, derivatives thereof and methods of producing compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5648889A (en) | 1981-05-02 |
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