JPS6231919B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアモキシシリンの酵素的製造法に関
し、更に詳細には６−アミノペニシラン酸と５−
（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダントインから
直接アモキシシリンを製造するアモキシシリンの
酵素的製造法に関する。 アモキシシリン（６−〔Ｄ−（−）−α−アミノ
−Ｄ−ヒドロキシフエニルアセトアミド〕ペニシ
ラン酸）は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に対
し広範囲に強い抗菌力を有する優れた抗性物質で
あり、これら細菌の汚染に起因する人間や動物の
諸感染症の化学治療剤として近年特に重要な位置
を占めるようになつてきている。 アモキシシリンの製造法は化学合成法及び酵素
的製造法が知られているが、化学的合成法は保護
基の導入及びその脱離、アシル供与体の活性誘導
体への変換等の工程を必要とし、全反応工程が複
雑多岐に亘るため、これに代るものとして酵素的
製造法が開発されている。しかしながら従来知ら
れている酵素的製造法は基質の６−アミノペニシ
ラン酸とＤ−ｐ−ヒドロキシフエニルグリシリン
活性誘導体をシユードモナス属、アクロモバクタ
ー属、バチルス属等に属する微生物の菌体又はそ
の処理物の存在下で酵素反応せしめアモキシシリ
ンを製造する方法で、一工程でアモキシシリンを
製造する優れた方法であるが、６−アミノペニシ
ラン酸と反応させるＤ−ｐ−ヒドロキシフエニル
グリシン活性誘導体は、一般に５−（ｐ−ハイド
ロキシフエニル）ヒダントインの加水分解工程、
Ｄ体を得るための光学分割工程及び活性誘導体と
するためのエステル化又はアミド化工程等煩雑な
工程を経て製造されているため必ずしも満足すべ
きものとはいえない。 本発明者等により簡単な工程で効率的にアモキ
シシリンを酵素的に製造する方法を開発すべく鋭
意研究を重ねた結果、フラボバクテリウム属に属
する微生物の培養物又はその処理物の共存下で、
６−アミノペニシラン酸と５−（ｐ−ハイドロキ
シフエニル）ヒダントインを反応させると、アモ
キシシリンが一工程で直接に生産できることを発
見し本発明を完成するに至つた。即ち、本発明は
フラボバクテリウム属に属し、６−アミノペニシ
ラン酸と５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダ
ントインとからアモキシシリンを合成する能力を
有する微生物の培養物又はその処理物の存在下
で、６−アミノペニシラン酸と５−（ｐ−ヒドロ
キシフエニル）ヒダントインを反応させてアモキ
シシリンを生成せしめることを特徴とするアモキ
シシリンの酵素的製造法である。 本発明の方法で使用する微生物として、フラボ
バクテリウム属に属し、５−（ｐ−ハイドロキシ
フエニル）ヒダントインと６−アミノペニシラン
酸とからアモキシシリンを合成する酵素を生産す
る能力を有する微生物例えばフラボバクテリウ
ム・ヒダントイノフイラムAJ 11322、FERM−
Ｐ 4819が利用できるが、この菌株に限らず、合
成酵素を生産するものであれば自然株、変異株を
問わずすべて本発明に於て使用することができ
る。 上記微生物AJ11322株の菌学的性質を以下に記
載する。 AJ11322株の菌学的性質 (a) 形 態 (1) 細胞の形および大きさ：球菌状〜短桿菌
0.4〜１×１〜2.5μ (2) 細胞の多形性の有無：なし (3) 運動性の有無、鞭毛の着生状態：なし (4) 胞子の有無：なし (5) グラム染色性：陰性 (6) 抗酸性：陰性 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天板培養：適度な生育、円形、凸円
状〜隆起状、全縁、半透明、湿光、均質、円
滑、バフ色〜ストロ色 (2) 肉汁寒天斜面培養：適度な生育、薄膜状、
糸状、バフ色〜ストロ色 (3) 肉汁液体培養：均一に濁る (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。 (5) リトマス・ミルク：液化しない、弱アルカ
リ性 (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：＋ (2) 脱窒反応：− (3) MRテスト：− (4) VPテスト：− (5) インドールの生成：− (6) 硫化水素の生成：− (7) デンプンの加水分解：− (8) クエン酸の利用：Koser培地で利用しない
Christensen培地で利用する (9) 無機窒素源：硝酸塩を利用しない アンモニウム塩を利用しない (10) 色素の生成：生成しない (11) ウレアーゼ：− (12) オキシダーゼ：＋ (13) カタラーゼ：＋ (14) 生育の範囲： 温度37℃で生育するが41℃で生育しない PH６〜９ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト（Hugh＆Leifson法によ
る）：Ｏ (17) 糖類から酸およびガスの生成の有無〔ペ
プトン培地〕

【表】 (18) グルコン酸の酸化（Haynesの方法）：
− (19) フエニルアラニンのデアミナーゼ反応
（Ewing etalの方法）：− (20) デカルボキシラーゼ反応（Ｍφllerの方
法）：リジン − オルニチン − アルギニン − (21) アルギニンジヒドロラーゼ反応
（Stanieret alの方法）：NT (22) カゼインの分解性：− (23) DNAの分解性：− (24) Poly−β−hydroxybutyrateの蓄積の有
無：なし (25) 栄養要求性：ある (26) セルロースの分解性：− (27) 耐塩性：食塩３％で生育しない (d) DNAのGO含有量：69.5％ 本菌はグラム陰性桿菌、非運動性、好気性、
カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、糖を酸化
的に徐々に分解して酸を生成し、集落の色調が
バフ色〜ストロ色であることからフラボバクテ
リウム属に属する。 種について検索するとBergey Manual第８版
記載の既知菌種と本菌とでは運動性、耐塩性、
37℃に於ける生育の有無、ゼラチン分解性、セ
ルロース分解性、DNAのGO含量などの重要性
状で一致しない。 従つて本菌を新菌種と認めて
Flavobacterium hydantoinophilumフラボバク
テリウム・ヒダイントノフイラムと命名した。 本発明の方法で使用する微生物の中には生成さ
れたアモキシシリンに作用してこれを変換する有
害酵素、例えばβ−ラクタマーゼ、アミダーゼ等
を生産するものもあるが、その場合には有害酵素
を生成しない変異株を育種することが望ましい。 アモキシシリン合成酵素を生産する微生物を用
いて、目的のアモキシシリンを製造するには通常
まずこれらの微生物を栄養培地で培養し、得られ
る培養物またはその処理物の存在下で６−アミノ
ペニシラン酸と５−（ｐ−ハイドロキシフエニ
ル）ヒダントインを反応させればよいが、培地又
は培養中に６−アミノペニシラン酸と５−（ｐ−
ハイドロキシフエニル）ヒダントインを添加し、
微生物の培養と同時に酵素反応を行わせアモキシ
シリンを製造することもできる。 微生物の培養に用いる培地は炭素源、窒素源、
無機イオン、更に必要に応じてビタミン、アミノ
酸、酵母エキス等有機微量栄養素を含む通常の栄
養培地が用いられる。上記炭素源としては、グル
コース、シユークロース、マルトース、澱粉水解
物等の炭水化物、酢酸、エタノール等が適宜使用
される。又、窒素源としてはアンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、動植物蛋白質の加水分解物等が
用いられる。無機イオンとしてはマグネシウムイ
オン、カリイオン、ナトリウムイオン、カルシウ
ムイオン、鉄イオン、マンガンイオン等が必要に
応じて適宜用いられる。 さらに、アモキシシリン合成酵素の活性を高め
るため、DL−５−メチルメルカプトエチルヒダ
ントイン、DL−５−インドリルメチルヒダント
イン、DL−５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒ
ダントイン等第１表に示す５−置換ヒダントイン
誘導体を適宜培地に添加することが望ましく、培
地に0.1〜0.5ｇ／dl添加することにより、酵素活
性は４〜５倍に増大することができる。 培養温度は微生物の生育に適した温度範囲であ
ればよく、15〜40℃、好ましくは25〜37℃であ
る。培養時間は使用する菌株の種類、培養条件等
によつて変化するが合成酵素の酵素活性が最大と
なつた時点で培養を終了すればよく、通常16〜48
時間が適当である。 このようにして得られる培養物又はその処理物
がアモキシシリンの生成反応に応用されるが、こ
こでいう培養物とは培養液自体のほか、培養液か
ら分離した生菌体、又は培養液から菌体等不溶性
物質を除去した培養液（上澄液）を指し、その
処理物とは、上記培養物に適当な処理を施してア
モキシシリン合成酵素の酵素活性を高めたり、長
時間安定に活性を持続させる等、アモキシシリン
の製造により適した状態に処理したものをいう。 例えば本合成酵素が菌体外酵素であれば、上記
培養液から塩析、透析、吸着・イオン交換クロ
マトーグラフイー、ゲル過など公知の酵素精製
手段を適宜単独又は併用することにより精製、も
しくは部分精製した酵素、又は上記酵素を水に不
溶性の担体に吸着もしくは包括固定化せしめた固
定化酵素等を指し、本合成酵素が菌株内酵素であ
る場合には培養液から分離した生菌体を水で洗浄
後、アセトン、メタノール、エタノール等有機溶
媒で処理して得られる有機溶媒処理菌体、生菌体
に磨砕、超音波処理、細胞壁溶解酵素処理、又は
界面活性剤処理等の物理的、化学的処理を施した
菌株、これら処理菌株を水、緩衝液等で抽出した
無細胞抽出液、及びその精製酵素、固定化酵素、
もしくは固定化微生物等をいう。 これら培養物とその処理物を用いて６−アミノ
ペニシラン酸と５−（ｐ−ハイドロキシフエニ
ル）ヒダントインとからアモキシシリンを製造す
る際の酵素反応は、水溶液中でも行われるが、収
率の面からメタノール、エタノール、イソプロパ
ノール、アセトン、メチルセルソルブ、ジオキサ
ン、ｔ−ブタノール等の親水性有機溶媒を５〜20
％含む水溶液中で行うことがより望ましい。 酵素反応を行う際の反応PHは4.0〜9.0、反応温
度は20〜50℃で行われる。酵素が水に可溶性の場
合上記酵素反応は溶液中で行われるが、酵素が水
に不溶の場合又は固定化酵素の場合には懸濁液中
又はカラム中に於て反応が行われる。又微生物を
培養する際の培地もしくは培養中に５−（ｐ−ハ
イドロキシフエニル）ヒダントインと６−アミノ
ペニシラン酸を添加して培養すれば、微生物の培
養即ち酵素の生産とアモキシシリンの合成が同時
に行われるので便利である。 酵素反応時間は基質の濃度、酵素活性、PH、夾
雑不純物の種類、量、反応温度等反応条件によつ
て左右されるが、要はアモキシシリンの生成量が
最大に達する時に反応を終了すればよく通常１〜
10時間で十分である。 本発明で用いる６−アミノペニシラン酸は遊離
の形でもよく又ナトリウム塩、カリウム塩等塩の
形でも使用され、５−（ｐ−ハイドロキシフエニ
ル）ヒダントインはＤ体、Ｌ体、DL体のいずれ
でもよく、DL体が直接使用できるので工業的製
造法としては極めて便利である。 このようにして得られる反応液からアモキシシ
リンを採取する方法としては、公知の方法に準じ
て行えばよく、例えば未反応の５−（ｐ−ハイド
ロキシフエニル）ヒダントインは水に溶けにくい
物質であることから、反応液を遠心分離すること
の未反応の５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒ
ダントインの大部分及び菌株等の不溶性物質が除
去される。 そこでこの液をHP−20等吸着樹脂カラムに通
してアモキシシリンを吸着させ有機溶媒、水など
の適当な溶媒で溶出し、アモキシシリンを含む区
分を濃縮し、適当な親水性有機溶媒を加えて晶析
することによりアモキシシリンを採取することが
できる。 上述の如く、本発明は６−アミノペニシラン酸
と５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダントイ
ンとから直接アモキシシリンを製造する新しいア
モキシシリンの酵素的製造法を提供するものであ
る。以下実施例にて本発明を具体的に説明する。 実施例 １ グルコース2.0ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄0.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.1ｇ／dl、K₂HPO₄0.3ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、酵母エキス1.0ｇ／
dl、ペプトン1.0ｇ／dl、DL−５−メチルカプト
エチルヒダントイン0.2ｇ／dl、炭酸カルシウム
（別殺菌）を含む培地（PH7.0）を500ml容フラス
コに50ml宛入れ120℃で15分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて24時間培養
したフラボバクテリウム・ヒダントイノフイルム
AL 11322FERM−P4819を１白金耳接種し30℃
で20時間培養した。この培養液より菌体を遠心分
離により採取し、培養液と同量の生理食塩水で１
回洗浄し菌体を集めた。 この菌体を６−アミノペニシラン酸0.5ｇ／dl
及びDL−５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダ
ントイン１ｇ／dlを含む0.05M／dlリン酸緩衝液
（終末PH7.0、５ml）に５ｇ／dlになるように添加
し、３時間30℃に保持反応させた。反応後、菌体
を遠心分離で除去し、反応液中に生成したアモキ
シシリンをカチオン交換樹脂（デユポン社製の
「ZIPAX−SCX」使用）を用いる高速液体クロマ
トグラフイーで定量し、54.6μｇ／mlのアモキシ
シリンを得た。 尚、反応生成したアモキシシリンをｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：２、ｎ−プロパノー
ル：水＝７：３を用いた薄層クロマトグラフイー
で比較したところ標準標品のアモキシシリンと完
全に一致した。また、プロテウスミラビリスを用
いるバイオアツセイ法によつて生成量を確認した
所ほぼ同一の結果が得られた。 実施例 ２ グルコース2.0ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄0.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.1ｇ／dl、K₂HPO₄0.3ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、酵母エキス1.0ｇ／
dl、ペプトン1.0ｇ／dl、炭酸カルシウム（別殺
菌）を含む培地（PH7.0）を500ml容フラスコに50
ml入れ120℃、15分間殺菌した。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて24時間培養
したフラボバクテリウム・ヒダントイノフイルム
FERM−P4819を接種し、30℃で16時間培養し
た。培養液に第１表に示す５−置換シダントイン
（別殺菌したもの）を0.2ｇ／dlになるように添加
し、更に６時間培養を続けた。この培養液より菌
株を遠心分離により採取し、培養液と同量の生理
食塩水で１回洗浄し菌株を集めた。 この菌株を６−アミノペニシラン酸0.5ｇ／dl
とDL−５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダン
トイン１ｇ／dlを含む0.05Mリン酸緩衡液（終末
PH7.0 ５ml）に５ｇ／dlになるように添加し、３
時間30℃に保持反応させた。反応後菌体を遠心分
離で除去し、反応液中に生成したアモキシシリン
を実施例１と同様の方法で定量した。その結量を
第１表に示した。

【表】

【表】 実施例 ３ 実施例２に示した培地にブイヨン寒天上で30℃
にて24時間培養したフラボバクテリウム・ヒダン
トイノフイラムFERM−P4819を接種して30℃で
16時間培養した後、培養液にDL−５−ｐ−（ハイ
ドロキシフエニル）ヒダントイン（別殺菌）を
0.4ｇ／dlになるように添加し、４時間培養をし
た。この培養液に無菌物に６−アミノペニシラン
酸とDL−５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダ
ントインをそれぞれ0.5ｇ／dl、1.0ｇ／dlになる
ように添加し、更に３時間培養を続けた。 この培養液の菌株を遠心分離によつて除去し、
培養液上清に生成したアモキシシリンを実施例１
と同様の方法で定量した結果45μｇ／mlであつ
た。 実施例 ４ 実施例１と同様に調製したフラボバクテリウ
ム・ヒダントイノフイラムFERM−P4819の菌体
を５ｇ／dlの濃度になるように0.5Mリン酸緩衡
液（終末10ml）に添加し、20KCの超音波にて５
分間処理した。この処理物を遠心し上清液を取得
した。この上清液５mlに６−アミノペニシラン酸
とDL−（５−ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダン
トインをそれぞれ0.5ｇ／dl、1.0ｇ／dlになるよ
うに添加（終末PH7.0）し、30℃で３時間反応さ
せた。この反応液上清を測定したところ73.5μ
ｇ／mlのアモキシシリンが生成していた。 実施例 ５ 実施例１と同様に調製したフラボバクテリウ
ム・ヒダントイノフイラムFERM−P4819の菌体
１ｇを脱イオン水４mlに加えて懸濁し、氷冷した
のち、アクリルアミド750mgとメチレンビスアク
リルアミド45mgを加えて溶解させ、過硫酸アンモ
ニウム3.5mgおよびＮ・N′−ジメチルアミノプロ
ピオニトリル８μ／を加えて氷冷下に静置し
た。１時間後、生成した菌体含有ゲルを50メツシ
ユの金網で裏ごしし、生理食塩水で洗浄しゲル固
定化物を調製した。 この固定化物２ｇをDL−５−（ｐ−ハイドロキ
シフエニル）ヒダントイン１ｇ／dl、６−アミノ
ペニシラン酸0.5ｇ／dlを含む0.05リン酸緩衡液
（PH7.0）５mlに添加し、30℃、３時間反応させ
た。この反応液上清を測定したところ17.8μｇ／
mlのアモキシシリンが生成していた。 実施例 ６ 実施例１の方法で調製したフラボバクテリウ
ム・ヒダントイノフイラムFERM−P4819の菌体
を６−アミノペニシラン酸0.5ｇ／dl、DL−５−
（ｐ−ハイドロキシフエニル）ヒダントイン1.0
ｇ／dl、及びエタノール５〜20％（Ｖ／Ｖ）を含
む0.05Mリン酸緩衡液（終末PH7.0、5.0ml）に5.0
ｇ／dlになるように添加し、30℃で３時間酵素反
応を行つた。第２表に示すようにエタノールを添
加することによつてアモキシシリンの生成量は約
２倍に増大した。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ フラボバクテリウム属に属し、６−アミノペ
   ニシラン酸と５−（ｐ−ハイドロキシフエニル）
   ヒダントインとからアモキシシリンを合成する能
   力を有する微生物の培養物もしくはその処理物の
   存在下に６−アミノペニシラン酸と５−（ｐ−ハ
   イドロシキフエニル）ヒダントインとを反応させ
   ることを特徴とするアモキシシリンの製造方法。