JPS6232344A - 乾式分析要素を用いる酵素活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、反射光学系を用いた酵素活性測定方法に関す
る。さらに詳しくは本発明は、反射光学系を用いる乾式
分析要素を用いて液体試料中の酵素活性を測定する方法
に関する。

［発明の背景］ 臨床検査上、ヒトの血清等の液体試料中の酵素活性を測
定することは極めて重要である。すなわち体液中の酵素
活性値は、疾患部を推定し、患部の損傷程度を推定する
場合等において重要な知見となる、 一方、臨床検査の憤域においては診断に関与する医師算
の医療関係者から、簡便な操作による迅速な測定を求め
る強い要請がある。

これに答える方向どして従来用いられてきた透過光学系
を基本とする通常の溶液法に代えて、反射光学系を基本
とする乾式分析法が開発され、近年その実用化が進めら
れている。上記乾式分析方法は、検出反応に必要な試薬
類が乾燥状態でシート玉の要素内に保存されている乾式
分析要素を使用するものであり、この乾式分析要素に点
着した液体試料と上記試薬類との反応を検出、測定する
ものである。特に上記乾式分析要素のうち、取り扱いの
簡便性および分析精度がさらに向上した多層塗布を特徴
とする一体型多層分析要素′、Ｌ、様々な種類のものが
既に市販されている。

液体試料中の被検成分濃度の測定に一体型多層分析要素
等の乾式分析要素を用いる場合には、従来より用いられ
ている終点比色法で並行光源を用いて直接測光される反
射光学濃度ｃ以下ＯＤＲと略記）と染料濃度との対応づ
けをした検量線を作成し−Ｃおけば、通常の測定には何
らの問題も生じなかった。

しかしながら乾式分析要素による酵素活性測定には、多
点反Ｑ４測光による速度法の解析法が必須である。その
ためには第一に、ＯＤＲから直線性が成立する透過光学
濃度（以下ＯＵＴ　と略記）への変換が必要で、その研
究は古くからなされている。理論的にはウィリアムズ（
Ｗｉｌｌｉａ層Ｓ）とクラッパ−（Ｈａｐｐｅｒ）の提
唱した変換式でＯＤＲをＯｎ＋　に変換できることが明
らかになった（ジャーナル拳オブティ力ルーソサエティ
ーオブＧアメリカ［Ｊ、　０ｐｔｉｃａｌ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　ｏｆ　Ａｓ＋ｅｒｉｅａｌ　Ｖｏｌ　４３Ｎｏ、
７　５９５〜５９９（１９５３）参照）、シかし実用系
では上記変換式は各種のパラメーターが複雑であるため
、経験的にＯＤＲをＯＤ＋　に変換した値（ＯＤＤ’）
が使用されている。この変換式の一つとしては一体型多
層分析要素に関するものとして、エイチ争ジーーキュー
ム（Ｈ，Ｇ、　Ｃｕｒｓｅ）　’ｆ−がクリニカル・ケ
ミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｇｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ
）Ｖａｔ　２４　Ｎｏ、８１３３５〜４２（１９７８）
に記載した下記の式％式％ また試験紙タイプの乾式分析要素は通常、散乱光を光源
とする積分球を使用し、クベルカームンク（Ｋｕｂｅ　
ｌｋａ−Ｍｕｎｋ）の式に基づいて反射光の測定値を処
理している（ツァイトゥング番テヒノロジーやフィジー
ク［２，ＴＩ！ｃｈ、　Ｐｈｙｓｉｋｌ　１２５’９３
（１９３１）参照）、」二足のような測光系は、一般に
狭い光学濃度域でベールの法則を満たす範囲内で使用１
，７ている（末広雅也；　Ｊ　Ｊ　ＣＬ　Ａ　Ｖｏ１８
　Ｎｏ、４　（１９８３）３５８〜３６３参照）。

乾式分析要素仁による酵−も活性測定には、前述したよ
うに多点反射測光による速度法の解析法が必須である。

よって酵素活性測定においては、上記ＯＤ＋”への変換
に加えて、酵素反応速度法に基づく酵素活性値への変換
式が必要である。

しかしキューバの式等を用いて得られたＯＤ＋’は物理
量としての意味が！り昧であり、かつ−・般にＯＤ＋’
への変換には測定系固有のパラメーターが関ケ、する。

よってＯＤ−を用いて酵素活性値への変換式を作成して
も、その変換式の信頼性は低く、かつ全ての系に適用可
能とすることは困難である。

［発明の要旨］ 本発明名は、酵素反応速度法に基づく酵素活性値への変
換方法としてキューバの式におけるＯＤＤ’の値に代わ
る全く別個の概念を導入して、酵素活性値を求めること
が有効であることを見出し本発すＪに到達した。

本発明の目的は、ＯＤＲを従来用いられてきたＯＤＤ’
の値に代わる具体的な実験値に裏付けられた数値に対応
させることである。

さらに本発明の目的は、新たな概念に基づき具体的な実
験値に裏＋１けられた数値を求める工程を含む、乾式分
析要素を用いて液体試料中の酵素活性を反射光学系を用
いて測定する方法を提供することである。

本発明は、乾式分析要素を用いて液体試料中の酵素活性
を反射光学系を用いて測定する方法において、 （１）上記染料または兵役反応を通して上記染料を榮え
うる化学種を異なる濃度値で含む二以ヒの標準溶液を用
いて、この溶液を点着した上記乾式分析要素の反射光学
濃度値と上記染料または上記化学種の濃度値との相関式
（１）を実験的に求める工程；および （ＩＩ）上記液体試料を点着した」二足乾式分析要素の
反射光学濃度値を時間を隔てた二以上の点で測定し、こ
れらの測定値を」二足相関式（１）を用いて上記二以上
の点における染料または化学種の濃度値に変換し、そし
てこれらの染料濃度値から単位時間当りの染料または化
学種の濃度変動値を求める工程； を含むことを特徴とする反射光学系を用いる酵素活性測
定方法を提供するものである。

［発明の効果］ 本発明はＯＤＲを従来用いられてきたＯ　Ｄ　＋“の値
に代えて、酵素活性により生成される染料濃度値または
共役反応を通して染料をケえうる化学種濃度値の概念を
導入するものである。−１−記染料濃度値または化学種
濃度値は、本発明の（Ｉ）の工程に示すように具体的な
実験値に裏付けられた数値である。よって本発明におけ
る染料濃度値または化学種濃度値は各測定系に対応しう
る具体性がＩＪＪ確な物理量であるため、測定値を処理
するうえでの信頼性が高い、また本発明の酵素活性測定
方法により得られたデータは、測定値処理やその解釈が
容易である。

上記の結果、本発明の酵素活性測定方法は、従来の方法
と比較して測定値の処理において誤差が生じるｉｉ）能
性が低く測定精度が向上する効果を有する。

［発明の詳細な記述］ 本発明に使用する反射光学系の乾式分析要素は、酵素活
性測定用であれば特に他の制限はなく、公知のものを用
いることができる。乾式分析要素の具体例としては、試
験紙タイプのものとして、米国エイムズ（Ａ腫ｅ、）社
よりセラライザーおよヒ西独国ヘーリンガー・マンハイ
ム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＮａｎｎｂｅｉｍ）社よりレ
フロトロンの商品名でそれぞれ市販されているものを挙
げることができる。また一体型多層分析要素としては、
米国イーストマン・コダック社よりエクタケム、富士写
真フィルム株式会社よりドライケムの商品名でそれぞれ
市販されているものを挙げることができる。特に他に乾
式分析要素の種類を限定する条件がない場合には、取り
扱いの簡便性および分析精度の点から一体型多層分析要
素を使用することが好ましい。

またこれらの市販品の代りに各種文献を参考にして、分
析目的、検査項目等の条件に対応した乾式分析要素を作
成することもできる。

乾式分析要素の酵素活性検査項目としては、リパーゼ、
アミラーゼ、ＧＧＴ　（γ−グルタミルトランスフェラ
ーゼ）、ＡＬＰ　（アルカリ性フォスファターゼ）、Ａ
ＬＴ（アラニン舎アミノトランスフェラーゼ）およびＡ
ＳＴ　（アスパルテート−アミノトランスフェラーゼ）
等のアミントランスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ（
ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、コリンエステラー
ゼ（ＣｈＥ）等が挙げられるが、本発明の方法は一般に
全ての酵素活性の測定に適用することができる。

上記の酵素活性測定用乾式分析要素には、液体試料中の
酵素活性に基づいて染料（色素、発色生成物）が生成さ
れるために必要な試薬類が、他の検出反応に必要な試薬
類と共に保存されている。

よって本発明におけるｒ染料Ｊは、具体的には本発明の
実施において使用する乾式分析要素の種類に対応して決
定される０例えば、γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリ
ドとグリシルグリシンおよびトリス塩を展開層中に含有
するＧＧＴ′ｆＦＪ性測定用一体型多層分析要素を用い
る場合には、本発明における「染料」は、ＧＧＴ活性に
よりγ−グルタミルーＰ−ニトロアニリドより遊離する
Ｐ−ニトロアニリンに相当する。

また本発明においてｒ共役反応を通して染料を与えうる
化学種Ｊとは、活性測定対象の酵素反応またはそれに共
役する化学反応の生成物あるいは生成する補酵素で、酵
素反応と共役する化学反応により化学量論に従って上記
染料を形成しうる化合物を意味する０本発明の各工程に
おいて上記化学種を染料に代えて使用することは、生成
する染料が水に難溶性で染料の標準溶液の調整が困難な
場合に特に有効である。

たとえば、ＬＤＨ測定等でり、Ｐ型反応として公知の反
応例では、補酵素ＮＡＤＨにコチン酸アミド・ジヌクレ
オチド（還元型夛が系に生成して来るので、本反応に電
子伝達系を関与させてテトラゾリウム塩を還元し、生成
するホルマザン色素の生成速度でＬＤＨ活性を可視スペ
クトル域でａｔ　　ａｌ、　　ＣＬＩＮＩＣＡ　　ＣＨ
ＩＭＩＣＡ　　ＡＣ丁Ａ　　１２　　（１９Ｅ１５）　
　２１０〜２１５頁参照）、この様な系では生成するホ
ルマザン染料が難溶性であり、染料標準液を作成するの
が困難である。この様な時には、比較的安定性が高く、
高純度試薬が入手し易いＮＡＤＨを共役反応を通して染
料を芋えうる化学種として選択される。

他の「化学種」の例としては、特公昭５９−１５６３７
号公報またはＵＳＰ４２４６３４２号明細書等で既に公
知化されているｐｏｐ　（ピルビン酸オキシダーゼ）酵
素を用いたＡＬＴまたはＡＳＴ乾式酵素分析要素等にお
いても、生成させる色素の反応時間拡散を防止し、分析
精度を挙げるために難溶性染料を形成することが好まし
いが、この様な系では、過酸化水素またはピルビン酸を
染料を与える化学種として選定できる。上記の場合は、
結晶状態で安定またサン−プルが入ｆできるピルビン酸
が特に好ましい。

本発明の（Ｉ）の工程において使用する上記染料すかｔ
士ト記化ｊ”ｆ：　Ｊｉｍ　ｆｒ−合むｔ準泣前は、粘
度象の条件が液体試料に類似するように調製することが
好ましい、よって液体試料が生体液である場合には、一
般にフルブミン等の蛋白質の溶液を用いて調製する。

上記標準溶液は染料または化学種を異なる濃度値で含む
ものを少なくとも二以上用いるが、乾式分析要素の反射
光学濃度値と上記染料または化学種の濃度値との相関式
（１）の信頼性を向上させるためには可能な限り多数の
標準溶液について実施することが好ましい。

乾式分析要素に上記標準溶液を点着（＋１着等の他の試
料付与態様も含む）する場合、使用する乾式分析要素が
必要とする液体試料の点着量の範囲内の点着量、好まし
くは液体試料の点着量と同−雀で実施する。乾式分析要
素が液体試料計量作用（メータリング争エフェクト）を
有していない場合には、上記標準溶液の点着量は、液体
試料の点着量と同一量でなければならない。

染料濃度値または化学種濃度値に対応する反射光学濃度
値の測定は、乾式分析要素に標準溶液を点着し、一定時
間後の反射濃度を反射濃度計を用いて実施する。なおＬ
記測定は、以下において説明する液体試料を点着した乾
式分析要素の測定条件（測定機材、インキュベーション
等）と同一の条件下で実施することが好ましい。

以上のように測定された標準溶液の反射光学濃度値と上
記染料濃度値または化学種濃度値から相関式（１）を作
成する。相関式（１）の形式には特に制限はないが、１
ユ記染料濃度値又は化学種濃度値（［Ｐ］）が上記反射
光学濃度値（ＯＤＲ）の関数（［Ｐ］　＝ｆ　（ＯＤＲ
））として表されることがデータの処理上好ましい。特
にデータをコンピューター等で処理する場合には、Ｌ記
聞数はは０以上の整数、Ａｎはパラメーターである）で
あることが好ましい。

本発明の（ＩＩ）の工程における、液体試料を点着した
上記乾式分析要素の反射光学濃度値を時間を隔てた二以
上の点で測定する操作は、一般に乾式分析要素をインキ
ュベーター内で一定温度に均一加熱し、かつその間の乾
式分析要素上の反射光学濃度を測光するものである。上
記測光はインキュベーターに付設した反射濃度計を用い
て実施することができるが、インキュベーターと反射濃
度計が一体に組み込まれていなくても測光は可能である
。

インキュベーション中の温度としては、一般に２５℃、
３０℃、３７℃等で実施されるが、特に限定する必要は
ない、ただし反応時間内での温度変動は±０．２℃以内
に制御することが好ましい。

上記の反射光学濃度測定値を、前述の相関式（１）を用
いて染料濃度値または化学種濃度値に変換する。

また上記液体試料を点着した上記乾式分析要素の反射光
学濃度値は時間を隔てた二以上の点で測定するが、一般
には時間当りの染料生成量が一定値（酵素反応の初速度
に相当する値）を示す範囲内の二点で測定する。染料濃
度値の測定を二点において行なう場合は、一般に単位時
間当りの染料濃度値の差を栄位時間当りの染料濃度変動
値とする。

酵素活性の測定においては一般に、酵素活性値と、染料
濃度の時間変動または化学種濃度の時間変動とを相関さ
せて検量線または相関式（２）を作成する。特に本発明
において検量線または相関式（２）の作成は、基準法で
酵素活性値の測定されている二以上の標準液を用いて、
上記乾式分析要素に点着し、時間を隔てた二以上の点で
反射濃度を測光し、上記相関式（１）を用いて上記染料
濃度または上記化学種濃度の時間変動を算出し、そして
基準法で求められた酵素活性値と、標準液による染料濃
度の時間変動または化学種濃度の時間変動とを相関させ
て検量線または相関式（２）を作成する工程（ＩＩＩ）
を用いて実施することが好ましい。

上記工程（ＩＩＩ）において使用す−る酵素標準液も、
粘度等の条件が液体試料に類似するように調製すること
が好ましい、Ｆ、記酵素標準液は、市販の標準酵素サン
プルを用いて容易に［Ｊすることができる。

上記酵素標準液は酵素活性を異なる値で有するものを少
なくとも二以上用いるが、染料濃度の時間変動または化
学種濃度の時間変動と該酵素活性値との検量線または相
関式（２）の信頼性を向−ヒさせるためには可能な限り
多数の酵素標準液について実施することが好ましい。

工程（ＩＩＩ）において反射光学濃度値の測定は。

Ｌ記工程（ＩＩ）において説明した液体試料を点着した
乾式分析要素の測定条件（測定機材、インキュベーショ
ン′：Ｊ）と同一の条件下で実施することが好ましい。

１−、記（ＩＩＩ）の工程は、Ｌ記酵素標準液を点着し
た−１−２乾式分析要素の反射光学濃度値を時間を隔て
た二以上の点で測定するが、一般には時間当りの染料生
成量または化学種生成量が一定値（酵素反応の初速度に
相当する値）を示す範囲内の二点で測定する。染料濃度
値または化学種濃度値の測定を二点において行なう場合
は、一般に単位時間当りの染料濃度値または化学種濃度
値の差を単位時間当りの染＄−１ｅ度変動値とする。

以１：のように測定された酵素標準液の染料濃度値また
は化学種濃度値の単位時間当りの変動値と酵素活性値か
ら検量線または相関式（２）を作成する。検量線は両者
の関係を視覚的に把握できるため、その関係を理解、検
討するうえで有利であるが、マイクロコンピュータへ−
等を用いて自動的に処理する場合には一般に相関式とし
て両名の関係を表すことが好ましい。

Ｌ記相関式（２）の形式としては特に制限はないが、上
記酵素活性値（［Ｅ］）が染料濃度値または化学種濃度
値の中位時間当りの変動値（Δ［Ｐ］）の関数（［Ｅ］
＝ｆ（Δ［Ｐ］　））として表されることがデータの処
理上好ましい。

特に、データをコンピューター等で処理する場合（Δ［
Ｐ］）ｎ；ただしｎは０以上の整数、Ｂ、はパラメータ
ーである）であることが好ましい。

以上のように求められた測定値および関係式等を用いて
液体試料中の酵素活性値を算出する。具体的には例えば
、あらかじめアナライザーに上記（Ｉ）の工程により得
られた相関式（１）あるいは上記（ＩＩＩ）の工程によ
り得られた検量線または相関式（２）を内在させ、液体
試料を乾式分析要素上に点着し、時間を隔てた二点以上
の反射光学濃度を測光することにより酵素活性を算出す
ることができる。

以下本発明の酵素活性測定方法を実施例に従ってさらに
詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。

なお実施例において使用した乾式分析要素（一体型多層
分析要素）は、以下のように製造したものである。

［ＧＧＴ活性測定用一体型多層分析要素］透明ポリエチ
レンテレフタレート支持体（厚さ：１８０ｇｍ）の表面
を親水化処理し、その処理表面上に下記の１成の塗布液
を塗布、乾燥して乾燥膜厚１５ＪＬｍの吸水層を形成し
た。

吸水層形成用塗布液： アルカリ処理 脱イオンゼラチン　　　　　　Ｌｏｇ オクチルフェノキシ薯 ポリエトキシエタノール　　０．５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００＋
ｎＪ１１．２−ビス （ビニルスルホニル アセトアミド）エタン　０．１５ｇ 次いで吸水層上に下記の塗布液を塗布し、乾燥膜厚３ｐ
ｍの接着層を形成した。

接着層形成用塗布液： ゼラチン　　　　　　　　　　　１２ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２９０ｇノニルフェノ
キシφ ポリグリシトール　　　　　１．３ｇ 上記接着層上に０．４％ノー二ルフェノキシボリグリシ
ドール水溶液を塗布し１次いでポリエチレンテレフタレ
ート紡績糸（３６ゲージ、５０デ二着して展開層とした
。

上記展開層にｒ記の基質塗布液を、塗布量が１２０＋ｎ
Ｊ１／ｍ’になるように塗布、乾燥した。

基質塗布液の調製： Ｆ２均−液に、γ−グルタミルーＰ−ニトロアニリド２
．２８ｇを２Ｎ塩酸１ｍ９．およびエタノール１＋ｎＪ
１に溶解したものを添加し、次いで、６Ｎ塩酸約１．３
＋ｎ文を用いてｐＨｓ　、　３に調製し、基質塗布液と
した。

［均−液］ トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン　　　　　３　、０３ｇ グリシルグリシン　　　０．６５１ｇ セチルトリメチルアンモニウム ブロマイド　　　　　　０．５００ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　、
　０ｇ１Ｏ％ポリアクリルアミド　　２５ｇ さらに上記展開層に下記の二酸化チタン塗布液を塗布量
が１１２ｍ交／ゴになるように塗布した後、乾燥した。

二酸化チタン塗４ｊ液： アナターゼ型二酸化チタン　　２．５ｇ０．５％メチル
セルロース　　５０ｍ文以上の方法によりＧＧＴ活性測
定用一体型多層分析要素を作成した。

［Ａ　Ｉ、　Ｐ活性測定用一体型多層分析ｆ素Ｊ透明ポ
リエチレンテレフ・タレート支持体（厚さ二１８０μ、
ｍ）の表面を親木化処理し、その処理表面−１−に下記
の組成の塗布液を塗布、乾燥して乾燥膜厚１５μｍの緩
＃層を形成した。

緩衝層形成用塗布液： アルカリ処理 脱イオンゼラチン　　　　　　２４ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０
ｇノニルフェノキシＯ ポリグリシトール　　　　　１．６ｇ ポリ（Ｎ−［（ジメチルアミン） プロピル］アクリルアミド） １８％水溶液 （モ均分子量的１０万）　　　３０ｇ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル） エチレンジアミン− Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−三酢酸　２ミリモル Ｚｎ　（ＣＨ３Ｃｏｏ）２　　・ ２Ｈ２０１ミリモル Ｍｇ５ｏ４　・７Ｈ２０２ミリモル 以上の溶液に５ＮのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを１１
．０に調整した。

上記緩衝層の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が３．６ｇ
ｍになるように塗布、乾燥して硬膜層を形成した。

硬膜層形成用塗布液： ゼラチン　　　　　　　　　　　１２ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２６８　ｇノニルフェ
ノキシ・ ポリグリシトール　　　　　１・３ｇ １．２−ビス（ビニルスルホニル アセトアミド）エタン　　０．７２ｇ 水／アセトン 上記硬膜層の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が３ルｍに
なるように塗布し、接着層とした。

接着層形成用捨ｊ： ゼラチン　　　　　　　　　　　１２ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２８６　．７ｇノニルフェノ
キシ昏 ポリグリシトール　　　　　１．３ｇ 上記接着層の上に、０．４％ノニルフェノキシ・ポリグ
リシトール水溶液を塗布し１次に３６ゲージ５０Ｄポリ
エチレンテレフタレート紡績糸からなるトリコット編物
を圧着して展開層とした。

上記展開層に、下記の組成の塗布液を１２０ｍ見／ｍｌ
となるよう゛に塗布、乾燥した。

自己顕色性基質含有塗布液： ｐ−ニトロフェニルホスフェート ビス［トリス （ヒドロキシメチル） アミノメタン］塩　　　５０ミリモル ポリビニルピロリドン （平均分子量ｌＯ万）　　　　　　６ｇエタノール　　
　　　　　　　　　２２ｇアセトン　　　　　　　　　
　　２２ｇ以上の方法によりＡＬＰ活性測定用一体型多
層分析要素を作成した。

［実施例１］ ｐ−ニトロアニリンを下記第１表に示す各種濃度で含む
７％ヒトアルブミン水溶液を上記ＧＧＴ活性測定用一体
型多層分析要素にｔｏｐ文づつ点着し、一定時間後の反
射濃度を４００ｎｍ干渉フィルターを介して測光した。

上記ｐ−ニトロアニリンの濃度［Ｐ］および反射光学濃
度（ＯＤＡ　）の相関関係を下記相関式（１１）で近似
した。

［Ｐ］　−Ａｏ　＋ＡＩ（ＯＤＲ）＋Ａ２（ＯＤＲ）２
＋Ａ３（ＯＤＲ）３　　　　　（１１）相関式（１１）
における各パラメーターＡＯ１ＡＩ　、Ａ２およびＡ３
は、下記の値であった。

Ａｏ　＝　　−３，３６４６０１３ ＡＩ　　＝　　　１０．２６８１６９５７Ａ２　　＝−
１１、２９０２０８ Ａ、＋　　＝　　　　　７．４５９９１３９６Ｌ記相関
式を用いてＯＤ　Ｒから計算した染料濃度を、ＯＤＡお
よび実際に点着した染料濃度と共に下記第１表に記載す
る。

第１表 ＯＤ　Ｒ染料濃度　　　染料濃度 （計算値）　　　（実測値） ０．５２５　　−０．００６ｍＭ　　　０ｍＭ０　、７
３３　　　１　、０３３　　　　１０．８７２　　　１
．９５０　　　　２０．９９５　　　３．０２３　　　
　３１．０８３　　　３．９８９　　　　４１．１６１
　　　５．０１２　　　　５１　、２８４　　　６　、
９９７　　　　６次いでウシ腎臓由来ＧＧＴをパーサト
ールＥＮＰｌｕｇに添加した６レベルのサンプル（下記
第２表に示す）を用いて、点着インキュベート後２分お
よび５分後の各反射濃度値を測定し、部分後および５分
後に生成したｐ−ニトロアニリン染料の生成量を上記変
換式（ｉ　ｔ）を用いて算出した。

各標準液についてのＧＧＴ活性と点着インキュベート時
間２分〜５分の間に生成したＰ−ニトロアニリン染料の
生成量（Δ［Ｐ］）との相関式を下記の多次式（２１）
として近似した。

ＧＧＴ活性（Ｕ／Ｌ） ＝　イＢ　２　　（Δ［Ｐ］）”　　　　（２１）上記
相関式（２１）における各パラメーターＢｏ　、Ｂ＋　
、Ｂ２　、Ｂ３　、ＢｓおよびＢ５は、下記の値であっ
た。

Ｂｏ　＝　　−２３，６１０６２８ Ｂ＋　＝　　３８１．１６０２２４５ Ｂ２　＝　　−３６，６０４６９３８７Ｂ３＝　　３２
１．２８９４．９８ ＲＡ　　　＝−９ｎ　　６−７　９　Ｒ９６７８Ｂｓ　
　＝　　　　　４２．７３９１７０８上記相関式（２１
）を用いて計算したＧＧＴ活性値を、２分〜５分の間に
生成したｐ−ニトロアニリン染料の生成量（Δ［Ｐ］）
および各コントロール中のＧＧＴ活性値を溶液法で実際
に測定した値（ＲＡｌｏｏＯにて測定）と共に下記第２
表に記載する。

第２表 コントａ−ｈ　　Ｇ　Ｇ　Ｔ濃度　Δ［Ｐ］　　　ＧＧ
Ｔ濃度Ｎｏ、　　　（実測値）　　　　　　　　（計算
値）１　　　１１　　　　０．０９１　　　　１１　、
０２　　１４１　　　　０．４０５　　　１４１　、０
３　　２９３　　　　０．７００　　　２９２　、９４
　　６０２　　　　１．１８３　　　６０２　、０５　
１１４８　　　　１．９１５　　１−１４７　、９６　
１５５６　　　　２．３１９　　１５５６　、０上記Ｇ
ＧＴ活性測定用分析要素を用いて７＋ε者血清８５例に
ついてＧＧＴ活性の測定を実施し、各反射光学濃度の測
定値を１記相関式（１１）および（２１）を用いて処理
することで各個のＧＧＴ活性を定量した。またＲＡ−１
０００（テクニコン社）を用いたＧＧＴ活性の溶液法に
よる測定を行ない、上記測定値との相関性を検討した。

両者の測定値は、Ｙを本発明の方法、ＺをＲＡ１０００
法の測定値とすると下記の良好な相関性が得られた。

Ｙ＝０．９６８Ｘ＋４．９　（ＩＩ＝８５）γ＝０．９
９９ Ｓｙｘ＝７．５ よって本発明の方法は反射光学系を用いるものであるが
、透過光学系を用いる溶液法に匹敵する分析精度が得ら
れることがわかった。

［実施例２］ 実施例１における標準溶液をＰ−ニトロアニリンに代え
て、ｐ−ニトロフェノールを用いて作成し、前述したＡ
ＬＰ活性測定用一体型多層分析要素を用いて反射光学濃
度値（ＯＤＲ）と上記染料（Ｐ−ニトロフェノール）濃
度値との相関式ｒＦ記１２）を作成した。

［Ｐ］　＝ＣＯ＋ＣＩ（ＯＤＲ）＋Ｃ２（ＯＤＲ）２＋
Ｃ３（ＯＤＡ　）３＋Ｃａ（ＯＤＲ）’＋Ｃ３（ＯＤＲ
）５＋Ｃ６（ＯＤＲ）６＋ＣＩ（ＯＤＲ）’＋Ｃ５（Ｏ
ＤＲ）ｓＥ記相関式（１２）における各パラメーターＣ
ｏ−ｃ８は下記の値であった。

Ｃｏ　＝−２３，７２７６２６３１ Ｃ＋　＝　　８８．６７７１９５５１ Ｃ２＝−８７，６６９５３２１５ Ｃ３＝−５１，５０９７９６２１ Ｃ４＝１１９．３９５８３４１ Ｃ５＝　　　２．９９３５９９５８１ Ｃｂ　＝−８９，３３２９２５２７ Ｃ７＝　　５０．３５９８６４７１ Ｃａ　＝　　−７，７６５５０８３９６次いでヒト胎盤
由来ＡＬＰをパーサトールＥＮプラスに添加した６レベ
ルのサンプルを用いて。

点着インキュベート後２分および５分後の各反射濃度値
を測定し、部分後および５分後に生成したｐ−二トロフ
ェノール染料の生成量を上記変換式（１２）を用いて算
出した。

各標準液についてのＡＬＰ活性［Ｅ］　と点着インキュ
ベート時間２分〜５分の間に生成したｐ　−二トロフェ
ノール染料の生成量（Δ［Ｐ］）との相関式（２２）を
以下に示す。

［Ｅ］　＝Ｄｏ　＋Ｄ＋　　（Δ［Ｐ］）　　　（２２
）上記相関式（２２）における各パラメーターＤｏおよ
びＤｌは、下記の値であった。

Ｄｏ＝　　−８ Ｄ＋　＝６６７ 上記ＡＬＰ活性測定用分析要素を用いて患者血清１０１
例についてＡＬＰ活性の測定を実施し、各反射光学濃度
の測定値を上記相関式（１２）および（２２）を用いて
処理することで各個のＡＬＰ活性を定量した。またＲＡ
−１０００ＡＬＰ法（テクニコン社）を用いた溶液法に
よる測定を行ない、上記測定値との相関性を検討した０
両者の測定値は、Ｙを本発明の方法、ＺをＲＣ１００Ｏ
法の測定値とすると下記の良好な相関性が得られた。

Ｙ＝１．１４８Ｘ＋１９．１　（ＩＩ＝８５）γ＝０．
９９４ Ｓｙｘ＝１０．７ よって上記実施例における本発明の方法も、透過光学系
を用いる溶液法に匹敵する分析精度が得られることがわ
かった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、点着された液体試料中の酵素活性に基づいて染料を
   生成する機能を有する乾式分析要素を用いて液体試料中
   の酵素活性を反射光学系を用いて測定する方法において
   、 （ I ）上記染料または共役反応を通して上記染料を与
   えうる化学種を異なる濃度値で含む二以上の標準溶液を
   用いて、この溶液を点着した上記乾式分析要素の反射光
   学濃度値と上記染料または上記化学種の濃度値との相関
   式（１）を実験的に求める工程；および （II）上記液体試料を点着した上記乾式分析要素の反射
   光学濃度値を時間を隔てた二以上の点で測定し、これら
   の測定値を上記相関式（１）を用いて上記二以上の点に
   おける染料または化学種の濃度値に変換し、そしてこれ
   らの濃度値から単位時間当りの染料または化学種の濃度
   変動値を求める工程； を含むことを特徴とする反射光学系を用いる酵素活性測
   定方法。 ２、上記（ I ）および（II）の工程に加えて、（III）
   基準法で酵素活性値の測定されている二以上の標準液を
   上記乾式分析要素に点着し、時間を隔てた二以上の点で
   反射濃度を測光し、上記相関式（１）を用いて上記染料
   濃度または上記化学種濃度の時間変動を算出し、そして
   基準法で求められた酵素活性値と、標準液による染料濃
   度の時間変動または化学種濃度の時間変動とを相関させ
   て検量線または相関式（２）を作成する工程；を含むこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の測定方法。 ３、あらかじめ上記（ I ）の工程により得られた相関
   式（１）を内在させたアナライザーを用いて、液体試料
   を乾式分析要素上に点着し、時間を隔てた二点以上の反
   射光学濃度を測光することにより酵素活性を算出する工
   程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の測定方法。 ４、あらかじめ上記（III）の工程により得られた検量
   線または相関式（２）を内在させたアナライザーを用い
   て、液体試料を乾式分析要素上に点着し、時間を隔てた
   二点以上の反射光学濃度を測光することにより酵素活性
   を算出する工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第２項記載の測定方法。 ５、上記乾式分析要素が、一体型多層分析要素であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載
   の酵素活性測定方法。 ６、上記（II）の工程が、上記液体試料を点着した上記
   乾式分析要素の反射光学濃度値を一定時間を隔てた二点
   で測定し、そして該測定値を上記相関式（１）を用いて
   上記二点における各染料または化学種の濃度値に変換し
   、そして単位時間当りの染料濃度変動値を、これら二点
   の濃度値の差として求める工程であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の酵素活性測定方法。 ７、上記相関式（１）において、上記染料または化学種
   の濃度値が上記反射光学濃度値の関数として表されるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載
   の酵素活性測定方法。 ８、上記関数が代数関数であることを特徴とする特許請
   求の範囲第７項記載の酵素活性測定方法。 ９、上記検量線または相関式（２）が相関式（２）であ
   り、上記相関式（２）において、上記酵素活性値が上記
   染料濃度の時間変動または化学種濃度の時間変動の関数
   として表されることを特徴とする特許請求の範囲第２項
   記載の酵素活性測定方法。 １０、上記関数が代数関数であることを特徴とする特許
   請求の範囲第９項記載の酵素活性測定方法。