JPS6232422B2 - - Google Patents
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- JPS6232422B2 JPS6232422B2 JP56206303A JP20630381A JPS6232422B2 JP S6232422 B2 JPS6232422 B2 JP S6232422B2 JP 56206303 A JP56206303 A JP 56206303A JP 20630381 A JP20630381 A JP 20630381A JP S6232422 B2 JPS6232422 B2 JP S6232422B2
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- JP
- Japan
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- component
- enzyme
- liquid phase
- solid phase
- antibody
- Prior art date
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/971—Capture of complex after antigen-antibody reaction
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
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- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫結合性蛋白質及びこれと結合しう
る物質の間の反応の一成分を、不均一相で酵素免
疫法の原理を使用して測定する方法に関する。
る物質の間の反応の一成分を、不均一相で酵素免
疫法の原理を使用して測定する方法に関する。
血清成分及び類似の生物学的材料の臨床化学分
析がますます増加しているため、この種の方法の
自動化がますます重要になつている。自動化によ
つてはじめて、このような測定数の増加を克服で
き、また一回の測定当りの必要な操作費用も低減
することができる。最近では、遠心分析原理に基
づく自動分析機が著しく重要になつてきた。それ
というのはこのような自動分析機は特に設備費を
特に増加することなく分析頻度を更に増加しうる
からである〔Ｇ−ｉ−Ｔ、Fachz.Lab.21巻
（1977）、866〜874頁〕。
析がますます増加しているため、この種の方法の
自動化がますます重要になつている。自動化によ
つてはじめて、このような測定数の増加を克服で
き、また一回の測定当りの必要な操作費用も低減
することができる。最近では、遠心分析原理に基
づく自動分析機が著しく重要になつてきた。それ
というのはこのような自動分析機は特に設備費を
特に増加することなく分析頻度を更に増加しうる
からである〔Ｇ−ｉ−Ｔ、Fachz.Lab.21巻
（1977）、866〜874頁〕。
臨床診断には最近、免疫反応の成分の測定方法
の重要性も増している。同位元素標識免疫分析
（RIA）の方法は、測定感度を著しく向上するの
で、著しく進歩した。RIAの欠点、即ち放射性物
質を取り扱う必要性は同位元素標識を酵素標識で
代えることによつて排除され、これによりいわゆ
る酵素−免疫−分析（EIA）が生じる。通常エリ
ザ（ELISA）−法と言われる、このような方法の
実施形式では、特異結合性蛋白質及びこれと結合
しうる物質の間の反応の成分は、測定すべき物質
の未知量を含む試料溶液を予め確認された量の不
溶性結合成分と共に、結合成分の一方の既知量を
酵素で標識された形で含む試薬の存在で恒温保持
することによつて測定される。液相を固相から分
離した後、液相中に残留する標識酵素の活性は、
免疫反応の測定すべき成分の、試料溶液中に存在
する未知量の尺度である〔J.Clin.Chem.Clin.
Biochem.18巻（1980）、197〜208頁〕。この不均
一系酵素免疫試験は放射性物質を用いて操作する
必要性を実際に排除するが、その際必要な分離工
程は自動化の際に困難を生じ、例えばドイツ連邦
共和国特許出願公開第2736527号公報に記載され
ているような付加的手段を必要とする。
の重要性も増している。同位元素標識免疫分析
（RIA）の方法は、測定感度を著しく向上するの
で、著しく進歩した。RIAの欠点、即ち放射性物
質を取り扱う必要性は同位元素標識を酵素標識で
代えることによつて排除され、これによりいわゆ
る酵素−免疫−分析（EIA）が生じる。通常エリ
ザ（ELISA）−法と言われる、このような方法の
実施形式では、特異結合性蛋白質及びこれと結合
しうる物質の間の反応の成分は、測定すべき物質
の未知量を含む試料溶液を予め確認された量の不
溶性結合成分と共に、結合成分の一方の既知量を
酵素で標識された形で含む試薬の存在で恒温保持
することによつて測定される。液相を固相から分
離した後、液相中に残留する標識酵素の活性は、
免疫反応の測定すべき成分の、試料溶液中に存在
する未知量の尺度である〔J.Clin.Chem.Clin.
Biochem.18巻（1980）、197〜208頁〕。この不均
一系酵素免疫試験は放射性物質を用いて操作する
必要性を実際に排除するが、その際必要な分離工
程は自動化の際に困難を生じ、例えばドイツ連邦
共和国特許出願公開第2736527号公報に記載され
ているような付加的手段を必要とする。
本発明は、このような酵素−免疫−試験法を、
自動化が改善され、特に遠心分析機で実施できる
ように構成することを課題とする。
自動化が改善され、特に遠心分析機で実施できる
ように構成することを課題とする。
この課題は本発明によれば、試料溶液を予め確
認された量の不溶性免疫学的結合成分と共に、既
知量の酵素標識免疫学的結合成分を含む試薬の存
在で恒温保持し、液相を遠心分離により固相から
分離し、液相に残留する標識酵素の活性を測定す
ることによつて免疫学的結合性蛋白質及びこれと
結合しうる物質の反応の一成分を測定する方法に
おいて、酵素活性の測定を遠心分離管中で高い重
力の作用中または作用後に、固相と液相とがなお
相互に接触している間に行なうことを特徴とす
る、免疫学的結合性蛋白質及びこれと結合しうる
物質の反応の一成分の測定方法によつて解決され
る。
認された量の不溶性免疫学的結合成分と共に、既
知量の酵素標識免疫学的結合成分を含む試薬の存
在で恒温保持し、液相を遠心分離により固相から
分離し、液相に残留する標識酵素の活性を測定す
ることによつて免疫学的結合性蛋白質及びこれと
結合しうる物質の反応の一成分を測定する方法に
おいて、酵素活性の測定を遠心分離管中で高い重
力の作用中または作用後に、固相と液相とがなお
相互に接触している間に行なうことを特徴とす
る、免疫学的結合性蛋白質及びこれと結合しうる
物質の反応の一成分の測定方法によつて解決され
る。
本発明は、遠心分離管中で重力の作用下に、酵
素の固相に結合した部分が酵素反応に実際に関与
せず、本発明による条件下で酵素活性を測定する
際に液相中に存在する酵素だけが有効になり、液
相と直接接触していて、高い重力が作用している
ため器壁に結合した酵素は測定の際に捕捉されな
いという、極めて意外な事実に基づく。遠心分離
機において、反応の成分は通常まず重力の作用下
に混合され、次に一種のキユベツトとして構成さ
れている測定容量中に送られ、管が回転している
間にキユベツト中で測定が行なわれる。本発明方
法では、重力が作用するキユベツト壁のところ
は、固相に結合したマーカー酵素が集まり、従つ
てそこでは測定のためキユベツトを通して送られ
る光線が遮断されるが、マーカー酵素は更に試薬
溶液と接触しているので、従来技術からはこの固
相に結合したマーカー酵素も試薬溶液中で更に反
応に関与すると予期された。事実、従来固相で結
合した酵素が溶液中で反応に関与することは、支
持体に結合した酵素の場合に殊に技術的に広範囲
に利用されている。このような反応の場合に重力
をかけると、器壁に遠心分離された酵素の関与が
増強されるということも予期された。それという
のは反応成分が重力の作用下に一般にその作用の
方向にだけ、即ち固相中に存在する酵素に向つて
移動するが、固相酵素から離れないと予測される
からである。
素の固相に結合した部分が酵素反応に実際に関与
せず、本発明による条件下で酵素活性を測定する
際に液相中に存在する酵素だけが有効になり、液
相と直接接触していて、高い重力が作用している
ため器壁に結合した酵素は測定の際に捕捉されな
いという、極めて意外な事実に基づく。遠心分離
機において、反応の成分は通常まず重力の作用下
に混合され、次に一種のキユベツトとして構成さ
れている測定容量中に送られ、管が回転している
間にキユベツト中で測定が行なわれる。本発明方
法では、重力が作用するキユベツト壁のところ
は、固相に結合したマーカー酵素が集まり、従つ
てそこでは測定のためキユベツトを通して送られ
る光線が遮断されるが、マーカー酵素は更に試薬
溶液と接触しているので、従来技術からはこの固
相に結合したマーカー酵素も試薬溶液中で更に反
応に関与すると予期された。事実、従来固相で結
合した酵素が溶液中で反応に関与することは、支
持体に結合した酵素の場合に殊に技術的に広範囲
に利用されている。このような反応の場合に重力
をかけると、器壁に遠心分離された酵素の関与が
増強されるということも予期された。それという
のは反応成分が重力の作用下に一般にその作用の
方向にだけ、即ち固相中に存在する酵素に向つて
移動するが、固相酵素から離れないと予測される
からである。
しかしながら、意外にも本発明方法において酵
素反応は液相中でのみ行なわれた。
素反応は液相中でのみ行なわれた。
本発明によれば、現在まで絶対必要と考えられ
ていた操作工程、即ち固相及び液相の分離、並び
に固相の洗浄（Dt.Ges.f.Klin.Chemie、
Mitteilungen １／79、22〜30）を省くことがで
き、操作を通常の遠心分析機で実施することが可
能になる。従つて自動分析機でエリザ法を実施す
る際の主な障害は排除される。
ていた操作工程、即ち固相及び液相の分離、並び
に固相の洗浄（Dt.Ges.f.Klin.Chemie、
Mitteilungen １／79、22〜30）を省くことがで
き、操作を通常の遠心分析機で実施することが可
能になる。従つて自動分析機でエリザ法を実施す
る際の主な障害は排除される。
酵素反応の不溶性成分は、本発明方法において
は、支持体に結合した形で使用するのが好まし
い。支持体との結合は、生物学的活性物質の固定
のため当業者に公知の方法により行なうことがで
きる。また、不溶性成分を例えば多官能性網状化
剤との自体公知の反応によつて、網状化した形で
使用することもできる。この種の網状化剤、例え
ばグルタルジアルデヒド等は当業者に公知であ
り、ここで詳述する必要はない。免疫反応の一成
分を網状化によつて支持体上で固定することによ
り、網状化と支持体固定とを組合せて使用するこ
ともできる。不溶性成分を粒子の形で使用し、粒
状支持体に固定するか、または支持体なしで網状
化することによつて粒状に変えるのが特に有利で
ある。
は、支持体に結合した形で使用するのが好まし
い。支持体との結合は、生物学的活性物質の固定
のため当業者に公知の方法により行なうことがで
きる。また、不溶性成分を例えば多官能性網状化
剤との自体公知の反応によつて、網状化した形で
使用することもできる。この種の網状化剤、例え
ばグルタルジアルデヒド等は当業者に公知であ
り、ここで詳述する必要はない。免疫反応の一成
分を網状化によつて支持体上で固定することによ
り、網状化と支持体固定とを組合せて使用するこ
ともできる。不溶性成分を粒子の形で使用し、粒
状支持体に固定するか、または支持体なしで網状
化することによつて粒状に変えるのが特に有利で
ある。
不溶性成分用の支持体を使用する場合には、支
持体は液体または固体であつてよい。本発明の特
に好ましい実施形式によれば、免疫反応の不溶性
成分をラテツクス粒子に結合して使用する。ラテ
ツクス粒子の特別の利点は、ラテツクス粒子を水
溶液中に浮遊する粒子の密度にある。この目的で
特に適当なラテツクス粒子は発明の名称「親水性
ラテツクス粒子の製法」の下に出願した特願昭56
−207275号明細書（特公昭60−43361号公報）に
記載されている。この親水性ラテツクス粒子は水
に難溶性のモノマーのホモ重合物または共重合物
から成り、水溶性のラジカル形成開始剤の存在
で、乳化剤、安定剤または湿潤剤を添加すること
なく乳化重合することによつて製造しうる。製造
は、１種以上のモノマーの水性分散液中で酸素の
不存在で乳化重合することによつて行なう。
持体は液体または固体であつてよい。本発明の特
に好ましい実施形式によれば、免疫反応の不溶性
成分をラテツクス粒子に結合して使用する。ラテ
ツクス粒子の特別の利点は、ラテツクス粒子を水
溶液中に浮遊する粒子の密度にある。この目的で
特に適当なラテツクス粒子は発明の名称「親水性
ラテツクス粒子の製法」の下に出願した特願昭56
−207275号明細書（特公昭60−43361号公報）に
記載されている。この親水性ラテツクス粒子は水
に難溶性のモノマーのホモ重合物または共重合物
から成り、水溶性のラジカル形成開始剤の存在
で、乳化剤、安定剤または湿潤剤を添加すること
なく乳化重合することによつて製造しうる。製造
は、１種以上のモノマーの水性分散液中で酸素の
不存在で乳化重合することによつて行なう。
しかし本発明の範囲内で、生物学的に活性な蛋
白質の固定に通常に使用されるような他の支持
体、例えば不溶性炭水化物、例えばセルロース誘
導体、網状化デキストラン、特にアクリルアミド
に基づく親水性ポリマー及びコポリマーが適当で
ある。
白質の固定に通常に使用されるような他の支持
体、例えば不溶性炭水化物、例えばセルロース誘
導体、網状化デキストラン、特にアクリルアミド
に基づく親水性ポリマー及びコポリマーが適当で
ある。
本発明の範囲で必要な重力は市販の自動遠心分
析機で通常生じる値に相当する。
析機で通常生じる値に相当する。
この方法に保持すべき他の条件はすべて、エリ
ザ法によるその都度の測定に公知条件に相当す
る。これらの条件は主としてマーカー酵素のPH−
及び緩衝剤−依存性によつて決定される。これら
の条件は当業者には公知である。濃度及び恒温保
持時間も従来公知の程度であつてよい。
ザ法によるその都度の測定に公知条件に相当す
る。これらの条件は主としてマーカー酵素のPH−
及び緩衝剤−依存性によつて決定される。これら
の条件は当業者には公知である。濃度及び恒温保
持時間も従来公知の程度であつてよい。
使用しうるマーカー酵素に関しても制限はな
い。エリザ法に適当なマーカー酵素はすべて本発
明の範囲にも使用することができる。
い。エリザ法に適当なマーカー酵素はすべて本発
明の範囲にも使用することができる。
本発明方法はエリザ法の種々の公知変法、即ち
いわゆる競合酵素−免疫−試験法、競合サンドイ
ツチ法、サンドイツチ−抗原法、サンドイツチ−
抗体法及び免疫−酵素測定法に適当である。これ
らの方法は前記文献J.Clin.Chem.Clin.Biochem.
図解されている。適当なマーカー酵素は例えばパ
ーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスフアターゼ、グルコ
アミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ及びカ
タラーゼである。
いわゆる競合酵素−免疫−試験法、競合サンドイ
ツチ法、サンドイツチ−抗原法、サンドイツチ−
抗体法及び免疫−酵素測定法に適当である。これ
らの方法は前記文献J.Clin.Chem.Clin.Biochem.
図解されている。適当なマーカー酵素は例えばパ
ーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスフアターゼ、グルコ
アミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ及びカ
タラーゼである。
本発明方法を用いて測定しうる抗原またはハプ
テンの代表例は、チロキシン、ジゴキシン、エス
トリオール、α１−フエトプロテイン、インシユ
リン、チロトロピン、フエリチン、癌胎児抗原、
HB2−抗原等である。同様に、対応する抗体また
は他の任意の抗体を測定することができる。
テンの代表例は、チロキシン、ジゴキシン、エス
トリオール、α１−フエトプロテイン、インシユ
リン、チロトロピン、フエリチン、癌胎児抗原、
HB2−抗原等である。同様に、対応する抗体また
は他の任意の抗体を測定することができる。
次に、実施例に基づいて本発明を詳述する。
例 １
使用する試薬：
(a) セフアロース−抗−T4−抗体（T4＝テトラ
ヨード−チロシン＝チロキシン） ブロムシアンで活性化した市販の網状化アガ
ロース（セフアロース）１ｇを製造者の規則に
より抗−T4−免疫グロブリン（家兎の抗−T4
−IgG）10mlと結合させる。その際抗−T4−
IgGは14％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム溶液で
沈澱させることによつて抗−T4−抗血清から
得たものである（試料溶液）。
ヨード−チロシン＝チロキシン） ブロムシアンで活性化した市販の網状化アガ
ロース（セフアロース）１ｇを製造者の規則に
より抗−T4−免疫グロブリン（家兎の抗−T4
−IgG）10mlと結合させる。その際抗−T4−
IgGは14％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム溶液で
沈澱させることによつて抗−T4−抗血清から
得たものである（試料溶液）。
(b) T4−グルコースオキシダーゼ（T4−GOD）
凍結乾燥したグルコースオキシダーゼ200mg
（＝1.07μＭ）をPH8.6の0.1M燐酸塩緩衝液20ml
中に溶かし、冷却及び撹拌しながらジメチルホ
ルムアミド18.8mlを滴加する。この溶液にジメ
チルホルムアミド1.2mlに溶かしたBOC−T4−
OSu（Su＝スクシンイミド）15mg（＝15.4μ
Ｍ）を３時間以内に400μづつ添加する。反
応溶液を４℃で撹拌しながら光の排除下に20時
間保持する。生ずる僅かな混濁を遠心分離によ
り除去する。上澄液を網状化したデキストラン
（セフアデツクスＧ−25、微細）を基質とする
モレキユラーシーブでPH7.5の40ｍＭトリス−
緩衝液及び150ｍＭの塩化ナトリウム中で分離
する。最初のフラクシヨン（初留）を受容する
（86ml）。得られた溶液をPH6.5の40ｍＭ燐酸塩
緩衝液12に対して２回透析する。こうして得
られたGOD−T4を含む溶液を下記の実験のた
め、PH6.5の燐酸塩緩衝液で１：10の比で希釈
する。
（＝1.07μＭ）をPH8.6の0.1M燐酸塩緩衝液20ml
中に溶かし、冷却及び撹拌しながらジメチルホ
ルムアミド18.8mlを滴加する。この溶液にジメ
チルホルムアミド1.2mlに溶かしたBOC−T4−
OSu（Su＝スクシンイミド）15mg（＝15.4μ
Ｍ）を３時間以内に400μづつ添加する。反
応溶液を４℃で撹拌しながら光の排除下に20時
間保持する。生ずる僅かな混濁を遠心分離によ
り除去する。上澄液を網状化したデキストラン
（セフアデツクスＧ−25、微細）を基質とする
モレキユラーシーブでPH7.5の40ｍＭトリス−
緩衝液及び150ｍＭの塩化ナトリウム中で分離
する。最初のフラクシヨン（初留）を受容する
（86ml）。得られた溶液をPH6.5の40ｍＭ燐酸塩
緩衝液12に対して２回透析する。こうして得
られたGOD−T4を含む溶液を下記の実験のた
め、PH6.5の燐酸塩緩衝液で１：10の比で希釈
する。
(c) 酵素基質溶液
ペルオキシダーゼ（POD）20mg、２・2′−ア
ジノージ−〔３−エチル−ベンゾチアゾリンス
ルホネート(6)〕4.6ｇ及びグルコース50ｇをPH
5.6の0.01M燐酸塩／クエン酸−緩衝液及び0.1
％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー
ト（ツイーン20）で１の最終容量にする。
ジノージ−〔３−エチル−ベンゾチアゾリンス
ルホネート(6)〕4.6ｇ及びグルコース50ｇをPH
5.6の0.01M燐酸塩／クエン酸−緩衝液及び0.1
％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー
ト（ツイーン20）で１の最終容量にする。
(d) 試験の実施
種々の、その都度既知の量の(a)項記載のセフ
アロース−抗−T4−IgG−溶液（50／100／
200／500／1000μ）をそれぞれ100μの(b)
項記載のT4−GOD−溶液と混合し、室温で15
分撹拌する。この恒温保持混合物35μを自動
遠心分析機〔セントリフイケム
（Centrifichem）400〕の試料槽中に入れる。試
薬領域に(c)項記載の酵素基質混合物60μを充
填する。その後遠心分離し、その間に405nｍ
で吸光度を測定する。第１図はセフアロース−
抗−T4−IgG−含有率の増加に対してプロツト
した、遠心分離の始めから25分後に測定した吸
光度の低下をグラフで示す。
アロース−抗−T4−IgG−溶液（50／100／
200／500／1000μ）をそれぞれ100μの(b)
項記載のT4−GOD−溶液と混合し、室温で15
分撹拌する。この恒温保持混合物35μを自動
遠心分析機〔セントリフイケム
（Centrifichem）400〕の試料槽中に入れる。試
薬領域に(c)項記載の酵素基質混合物60μを充
填する。その後遠心分離し、その間に405nｍ
で吸光度を測定する。第１図はセフアロース−
抗−T4−IgG−含有率の増加に対してプロツト
した、遠心分離の始めから25分後に測定した吸
光度の低下をグラフで示す。
例 ２
セフアロース−抗−T4−IgG100μ、PH7.0の
0.1M燐酸塩緩衝液900μ、T4−GOD−溶液100
μ及びPH7.0の0.1M燐酸塩緩衝液中のT4−標準
100μを１時間撹拌する。この恒温保持混合物
35μを例１(d)に記載したように自動遠心分析機
で再び処理する。T4−含有量の異なるT4−標準
溶液を使用することによつて検定曲線を作る。測
定した値を第２図に示す。この検定曲線に基づい
て未知のT4−濃度を測定することができる。こ
のため前記方法で操作するが、T4−標準溶液の
代わりに未知T4−含有量の相当量の試料を使用
する。
0.1M燐酸塩緩衝液900μ、T4−GOD−溶液100
μ及びPH7.0の0.1M燐酸塩緩衝液中のT4−標準
100μを１時間撹拌する。この恒温保持混合物
35μを例１(d)に記載したように自動遠心分析機
で再び処理する。T4−含有量の異なるT4−標準
溶液を使用することによつて検定曲線を作る。測
定した値を第２図に示す。この検定曲線に基づい
て未知のT4−濃度を測定することができる。こ
のため前記方法で操作するが、T4−標準溶液の
代わりに未知T4−含有量の相当量の試料を使用
する。
例 ３
使用した試薬
(a) ラテツクス−抗−T4−抗体
羊の抗−T4−血清からのT4−抗体をホモポ
リグリシジルメタクリレート−ラテツクス粒子
（特願昭56−207275号明細書（特公昭60−43361
号公報）により製造）に同明細書記載の方法で
共有結合する。
リグリシジルメタクリレート−ラテツクス粒子
（特願昭56−207275号明細書（特公昭60−43361
号公報）により製造）に同明細書記載の方法で
共有結合する。
(b) T4−β−ガラクトシダーゼ（T4−β−Gal）
T4を例１(b)と同様によりβ−Galで標識する。
T4を例１(b)と同様によりβ−Galで標識する。
(c) β−Gal−基質溶液
ｐ−ニトロルフエニル−β−ガラクトシド
〔シグマ社（Fa.Sigma）〕 450mg／ 塩化ナトリウム 100ｍＭ 塩化マグネシウム 10ｍＭ トリス−緩衝液／HCl、PH−値7.3 10ｍＭ メルカプトエタノール 0.4％（ｖ／ｖ） (d) 試験の実施 希釈したラテツクス−抗−T4−懸濁液0.5ml
をそれぞれ既知の異なるT4−含有量のT4−血
清−標準溶液100μ及びT4−β−Gal−複合
体溶液100μと混合する。反応混合物を室温
で30分放置する。それぞれの恒温保持混合物35
μを市販の自動遠心分析機（セントリフイケ
ム400）の試料槽中に入れる。この遠心分析機
の試薬領域中に(c)項に記載した基質溶液60μ
を充填する。その後、遠心分離し、405nｍの
波長で吸光度を測定する。
〔シグマ社（Fa.Sigma）〕 450mg／ 塩化ナトリウム 100ｍＭ 塩化マグネシウム 10ｍＭ トリス−緩衝液／HCl、PH−値7.3 10ｍＭ メルカプトエタノール 0.4％（ｖ／ｖ） (d) 試験の実施 希釈したラテツクス−抗−T4−懸濁液0.5ml
をそれぞれ既知の異なるT4−含有量のT4−血
清−標準溶液100μ及びT4−β−Gal−複合
体溶液100μと混合する。反応混合物を室温
で30分放置する。それぞれの恒温保持混合物35
μを市販の自動遠心分析機（セントリフイケ
ム400）の試料槽中に入れる。この遠心分析機
の試薬領域中に(c)項に記載した基質溶液60μ
を充填する。その後、遠心分離し、405nｍの
波長で吸光度を測定する。
この方法でT4−検定曲線を作つた後、引続
き、T4−標準血清100μの代わりにそれぞれ
未知のT4−含有量の試料100μを使用して同
じ方法で測定を実施した。
き、T4−標準血清100μの代わりにそれぞれ
未知のT4−含有量の試料100μを使用して同
じ方法で測定を実施した。
第１図は実施例１で測定したセフアロース−抗
−T4−IgG−含有量と吸光度との関係を示すグラ
フ、第２図はT4−含有量と吸光度との関係を示
す検定曲線である。
−T4−IgG−含有量と吸光度との関係を示すグラ
フ、第２図はT4−含有量と吸光度との関係を示
す検定曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 試料溶液を予め確認された量の不溶性免疫学
的結合成分と共に、既知量の酵素標識免疫学的結
合成分を含む試薬の存在で恒温保持し、液相を遠
心分離により固相から分離し、液相に残留する標
識酵素の活性を測定することによつて免疫学的結
合性蛋白質及びこれと結合しうる物質の反応の一
成分を測定する方法において、酵素活性の測定を
遠心分離管中で高い重力の作用中または作用後
に、固相と液相とがなお相互に接触している間に
行なうことを特徴とする免疫学的結合性蛋白質及
びこれと結合しうる物質の反応の一成分の測定方
法。 ２ 不溶性成分を支持体の結合した形で使用する
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 不溶性成分を網状化した形で使用する特許請
求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４ 不溶性成分を粒状形で使用する特許請求の範
囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方
法。 ５ 不溶性成分をラテツクス粒子に結合して使用
する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 不溶性成分として抗体または抗抗体を使用す
る特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
か１項記載の方法。 ７ 酵素標識成分として抗原、ハプテン、抗体ま
たは抗抗体を使用する特許請求の範囲第７項記載
の方法。 ８ 不溶性成分として抗原またはハプテンを使用
し、酵素標識成分として抗体を使用する特許請求
の範囲第１項から第６項までのいずれか１項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19803048884 DE3048884A1 (de) | 1980-12-23 | 1980-12-23 | Verfahren zur enzymimmunobestimmung in heterogener phase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57132060A JPS57132060A (en) | 1982-08-16 |
| JPS6232422B2 true JPS6232422B2 (ja) | 1987-07-14 |
Family
ID=6120186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56206303A Granted JPS57132060A (en) | 1980-12-23 | 1981-12-22 | Peculiarly bonding protein and method of measuring one component in reaction of material able to be bonded thereto |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4743536A (ja) |
| EP (1) | EP0054675B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57132060A (ja) |
| AT (1) | ATE13356T1 (ja) |
| AU (1) | AU524904B2 (ja) |
| CA (1) | CA1170180A (ja) |
| DD (1) | DD201943A5 (ja) |
| DE (2) | DE3048884A1 (ja) |
| ES (1) | ES8302312A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60152953A (ja) * | 1984-01-20 | 1985-08-12 | Hitachi Ltd | 免疫測定用分析装置 |
| JPS60152954A (ja) * | 1984-01-20 | 1985-08-12 | Hitachi Ltd | 生体試料の測定方法 |
| JPH0799369B2 (ja) * | 1985-11-25 | 1995-10-25 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 上皮細胞増殖因子の酵素免疫測定法 |
| JPH06105252B2 (ja) * | 1986-02-05 | 1994-12-21 | 三共株式会社 | 遊離型サイロキシンの酵素免疫測定法 |
| JPH0750112B2 (ja) * | 1988-04-26 | 1995-05-31 | 日本電信電話株式会社 | レーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法 |
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| US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
| US5804141A (en) * | 1996-10-15 | 1998-09-08 | Chianese; David | Reagent strip slide treating apparatus |
| US7118878B1 (en) | 2000-06-09 | 2006-10-10 | Promega Corporation | Method for increasing luminescence assay sensitivity |
| CA2515217A1 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Promega Corporation | Methods and kits for dual enzymatic assays whereby light is quenched from luminescent reactions |
| WO2008118445A1 (en) * | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Promega Corporation | Methods to quench light from optical reactions |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
| US3654090A (en) * | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| AT357272B (de) * | 1976-09-18 | 1980-06-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und vorrichtung zum nachweis und zur bestimmung eines spezifischen bindeproteins oder einer damit bindefaehigen substanz |
| FR2418463A1 (fr) * | 1978-02-28 | 1979-09-21 | Nal Transfusion Sanguine Centr | Procede pour le depistage ou l'identification, dans un milieu biologique, d'antigenes viraux, d'antigenes erythrocytaires ou cellulaires ou d'anticorps |
| US4222744A (en) * | 1978-09-27 | 1980-09-16 | Becton Dickinson & Company | Assay for ligands |
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
-
1980
- 1980-12-23 DE DE19803048884 patent/DE3048884A1/de not_active Withdrawn
-
1981
- 1981-10-22 EP EP81108754A patent/EP0054675B1/de not_active Expired
- 1981-10-22 DE DE8181108754T patent/DE3170532D1/de not_active Expired
- 1981-10-22 AT AT81108754T patent/ATE13356T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-12-02 CA CA000391389A patent/CA1170180A/en not_active Expired
- 1981-12-09 ES ES507817A patent/ES8302312A1/es not_active Expired
- 1981-12-14 DD DD81235744A patent/DD201943A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-12-16 US US06/331,339 patent/US4743536A/en not_active Expired - Fee Related
- 1981-12-18 AU AU78668/81A patent/AU524904B2/en not_active Ceased
- 1981-12-22 JP JP56206303A patent/JPS57132060A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3170532D1 (en) | 1985-06-20 |
| JPS57132060A (en) | 1982-08-16 |
| AU524904B2 (en) | 1982-10-07 |
| DD201943A5 (de) | 1983-08-17 |
| EP0054675B1 (de) | 1985-05-15 |
| ES507817A0 (es) | 1983-01-16 |
| ES8302312A1 (es) | 1983-01-16 |
| CA1170180A (en) | 1984-07-03 |
| US4743536A (en) | 1988-05-10 |
| ATE13356T1 (de) | 1985-06-15 |
| EP0054675A1 (de) | 1982-06-30 |
| DE3048884A1 (de) | 1982-07-15 |
| AU7866881A (en) | 1982-07-22 |
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