JPH06105252B2

JPH06105252B2 - 遊離型サイロキシンの酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPH06105252B2
Application number: JP61023421A
Authority: JP
Inventors: 章夫辻
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1986-02-05
Filing date: 1986-02-05
Publication date: 1994-12-21
Anticipated expiration: 2009-12-21
Also published as: JPS62180269A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、血清中の遊離型サイロキシン（以下FT₄と略
す）を酵素免疫法によつて定量する新しい測定法に関す
る。

〔従来の技術〕

血清中のFT₄を酵素免疫法によつて定量する方法として
は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以下β−Galと略す）
を標識酵素として使用する測定法〔Clinical Chemistry
30 1682（1984）、同誌31 750（1985）〕、ホース・
ラデイツシユ・ペルオキシダーゼ（以下HRPと略す）を
使用する方法〔同上誌28 666（1982）〕が知られてい
た。

〔発明が解決しようとする問題点〕

FT₄の測定は、新生児甲状腺機能不全、産後甲状腺機能
障害などの種々の甲状腺機能に関する検査に有効である
が、従来の測定法に用いる標識抗原は、サイロキシン結
合グロブリン（Thyroxine Binding Globul in:以下T
BGと略す）およびヒト血清アルブミン（Human Serum
Albumin:以下HSAと略す）等、血液中のサイロキシン結
合性蛋白に結合してしまい、免疫測定における標識抗原
の機能が果たせなくなるほか、血液中のFT₄のバランス
が崩れ、正確な測定値を得ることが困難であった。

最近、サイロキシン（以下T₄と略す）とβ−Galとの結
合体（Conjugate）が、TBGおよびHSA等の影響を受ける
ことが比較的少ないことが見いだされ、前記のごとく、
β−Galを標識酵素とした測定法が提案された。

しかしながら、より一層TBG及びHSA等の影響を受けるこ
とがない標識酵素を見いだすことによって、血液中のFT
₄の正しい値を得るための測定法の開発が望まれてい
た。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は長年に亙り酵素免疫測定法の開発研究に携
り、本研究に関しても鋭意研究を重ねていたところ、Ｄ
−グルコースオキシダーゼ（以下GODと略す）を標識酵
素として使用すると、GODの分子量が約15万と大きいこ
とから、標識されたT₄が立体障害によってTBGおよびHSA
等のサイロキシン結合性蛋白と結合しないため、TBGお
よびHSAの人における正常値をはるかに越えた異常値に
おいても、酵素免疫測定における標識抗原の機能が果た
せて、血液中のFT₄のバランスが崩れずに正確なFT₄の測
定ができる本発明を完成した。

本発明に係わる反応手法自体は、競合法による酵素免疫
測定法において、標識酵素にGODを使用し、抗T₄血清の
濃度を希薄な状態において、蛋白解離剤を使用しないこ
とを特徴とする方法で、先に述べたようにGODを標識酵
素に用いるために、TBGやHSA等のサイロキシン結合性蛋
白の影響を受けることなく測定できる。更に、抗T₄血清
を希薄な状態で用いることは、競合法による高感度化が
図れるほか、サイロキシン結合性蛋白に結合したT₄を抗
T₄血清が引き抜いてしまうことを防ぎ、正確なFT₄の測
定に寄与している。更に、FT₄測定を目的とするため、
蛋白解離剤を測定系には使用していない。

酵素活性の測定自体は、いずれも種々の公知の手段（例
えば、石川・河合・宮井共編：酵素免疫測定法第２版、
1982年株式会社医学書院発行を参照）を採用しうるもの
であるが、酵素反応としては簡単に且つ比較的妨害なく
実施しうるものとして、二抗体固相法が好ましい。これ
によれば、血清中の遊離T₄は測定試料血清および標識抗
原であるT₄とGODとの結合体（以下T₄−GODと略す）を第
１抗体と接触反応させ、次いで固相化第２抗体と接触反
応させ、固相上の酵素活性を測定し、予めT₄標準試料を
用いて作成した検量線と対比させて定量される。酵素活
性の測定法としては、通常は螢光法が高感度である。例
えば、グルコース−グルコースオキシダーゼの反応によ
り生じた過酸化水素を、HRPとｐ−ヒドロキシフエニル
プロピオン酸との系にのせ、励起波長320nm、螢光波長4
05nmで螢光強度を測定する。

〔実施例〕

次に二抗体固相法による実施例および参考例をあげて、
本発明の方法を更に具体的に説明するが、本発明はこれ
によつて限定されるものではない。

参考例１緩衝液の調製 1. 0.2M（pH8.6）バルビタール緩衝液（試験用）バルビタールナトリウム12.3708gを500mlに近い量の水
に溶かし、0.2N塩酸でpH8.6とし、ウシ血清アルブミン
0.5gを加えた後水を加えて総量500mlとする。

2. 0.01M（pH7.0）リン酸（食塩を含む）緩衝液（HRP
希釈用）リン酸２水素カリウム1.3608gおよび食塩9gを水に溶か
し総量１とする（Ａ）。

リン酸水素２カリウム3.806gおよび食塩18gを水に溶か
して総量２とする（Ｂ）。

上記ＡとＢとを合しpH7.0に調整する。

3. 0.25M（pH5.0）酢酸緩衝液（グルコース希釈用）酢酸ナトリウム17.01gを水500mlに溶かす。

酢酸14.31mlを水１に溶かし、上記酢酸ナトリウム溶
液と合わせ、pH5.0に調整する。

参考例２各種溶液の調製 1. HRP溶液 HRP（261U/mg）（TOYOBO製）10mgをとり、前記リン酸緩
衝液6.525mlに溶かし（400U/ml）、用時20倍に希釈（20
U/ml）して使用する。

2. 0.5％３−（ｐ−ヒドロキシフエニル）プロピオン
酸（以下HPPAと略す）溶液 HPPA0.5gを水100mlに溶かす。

3. 0.5Mグルコース溶液グルコース22.52gを前記酢酸緩衝液250mlに溶かす。

4. アジ化ナトリウム溶液アジ化ナトリウム0.1gを水100mlに溶かす。

参考例 T₄−GODの調製 10ml用ナス型コルベンにサイロキシンメチルエステル塩
酸塩3mgを95％ジメチルホルムアミド1mlに溶解し、グル
コースオキシダーゼ（105U/mg、TOYOBO製）10mgを含む
水溶液1mlを加え、撹拌し、１％グルタルアルデヒド溶
液0.21mlを滴下しながら加え、室温で２時間反応する。
得られた結合物は0.05Mリン酸緩衝液（pH8.0）に１夜４
℃で透析し、Tyopal HW55（１×50cm）カラムクロマト
グラフイーにより精製した。

参考例４抗T₄血清の調製 T₄−ヘミグルタレート−BSAを抗原として家兎を免疫
し、抗血清を調製した（クリニカル・ケミストリー 31
巻430頁 1985年）。

本抗血清は使用時に、希薄な状態で使用する。

参考例５固定化第二抗体の調製精製された家兎のIgGを結合させたセフアロースゲルを
使用したアフイニテイクロマトグラフイーによつて精製
した抗家兎IgG山羊IgGを0.55％リン酸ナトリウム溶液
（１％アジ化ナトリウム含有、pH7.4）に溶かした22μg
/ml溶液に、ポリアセタールビーズ（フジレビオ製）１
個を４℃で１夜浸漬し、次いで0.3％BSA溶液でポストコ
ーテイングしたビーズを用いる。

参考例６ FT₄標準試料デイスクおよび検体試料デイス
クの調製常法（クルニカル・ケミストリー 24巻２号362頁1978
年）に従って調製したリガンドフリーの血清に、生理的
食塩水およびリガンドフリー血清で洗った血球を、ヘマ
トクリット50％として混合する。その4mlにT₄（遊離
酸）の希釈液（400〜6.25μg/mlの各種濃度）20μｌを
加え、よく混合する。これら各種濃度の液を夫々パスツ
ールパイペットを用いて新生児マススクリーニング用瀘
紙に１滴ずつたらし、室温で一夜乾燥して、FT₄標準試
料ディスクとした。この資料ディスク（3mmΦ）には2.7
μｌの血液を含んでいる（ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・エンドクリノロジー・メタボリズム 42巻987頁197
6年）。T₄（遊離酸）の希釈液の代りに検体試料血清１
滴を前記と同様の瀘紙にたらし、乾燥したものを検体試
料ディスクとした。

実施例１ FT₄の酵素免疫測定法抗T₄血清（参考例４、×400000）100μ、乾燥試料デ
イスク（参考例６、T₄標準試料デイスク、3mmφ）１
枚、T₄−GOD（参考例３、×2500）100μ、0.12Mバル
ビタール緩衝液（参考例１−１）250μおよび固定化
第二抗体ビーズ（参考例５、）１個を混合し４℃で１夜
放置した。取したビーズを生理食塩水1.5mlで３度洗
つた後、0.5Mグルコース溶液（参考例２−３）500μ
、HRP溶液（参考例２−１）50μおよび0.5％HPPA溶
液（参考例２−２）50μと共に37℃で１時間放置す
る。反応溶液に2N水酸化ナトリウム水溶液とアジ化ナト
リウム溶液（参考例２−４）との1:1混液100μを添加
し、日立螢光光度計を使用し320nm（励起波長）と405nm
（螢光波長）の螢光強度を測定し定量した。第１図にそ
の結果（FT₄の検量線）を示した。横軸はFT₄の量（ng/d
l）であり縦軸は相対強度を示す。B₀はFT₄のない場合の
強度でありＢはFT₄を添加した場合の強度である。

実施例２ TBGの影響実施例１においてT₄標準試料濃度を0.66ng/dlのデイス
クを使用し、反応系内にTBGを添加して、実施例１と同
様に反応を行なつた結果を第２図に示した（図中“●”
印）。比較として¹²⁵I−T₄を使用して行なつたFT₄の測
定値に対するTBGの影響をみたものを同図上に示した
（図中“▲”印）（¹²⁵−T₄を使用した測定はアマー社
アマレツクスFT₄キツトによつた）。

図から明らかなように、¹²⁵I−T₄を使用した測定法で
は、TBGの濃度の上昇によつて急激にFT₄の測定値が影響
されるが、本発明方法における測定値の受ける影響は著
しく弱い。

実施例３ HSAの影響実施例２においてTBGの代りにHSAを使用して同様に反応
を行なつた。結果を第３図に示した。図中“●”は本発
明方法による測定結果によるものであり、“▲”は¹²⁵
−T₄を使用した測定結果によるものである。

図から明らかなように、本発明の方法はHSAについては
殆んど影響を受けない。

〔発明の効果〕

標識抗原であるT₄−GODは、前述の様に分子量が大きい
ため、TBGやHSAに対する親和性が極めて低く、従ってそ
の測定値は血中のTBGやHSAにより影響を受けることが少
ない。（TBGは実施例２の第２図のから、1000ng/チュー
ブまで影響を受けない。１チューブには１枚の血液濾紙
ディスクをいれるので、その血液量は2.7μｌであるか
ら、340μg/mlまで影響を受けないことになる。TBGの正
常値は14〜28μg/mlと言われており、異常値としては、
異常妊娠等で90μg/mlまで上昇することがあるが、この
ような異常検体の場合でもTBGの影響を受けることなく
正確なFT₄を測定できる。

HSAの場合は、実施例３の第３図から10mg/チューブま
で、従って、3.70g/mlまで影響を受けない。HSAの正常
値は3.8〜4.9g/dlと言われているため、異常検体の場合
でもHSAの影響を受けることなく正確なFT₄の値を測定で
きる。）また感度が非常に高いので、全血2.7μｌ程度で十分FT₄
の測定を行うことができる。本発明方法の検出限界は0.
05ng/dl（1.35fg/チューブ）である。

【図面の簡単な説明】

第１図はT₄の検量線であり、横軸は試料T₄の量、縦軸
は、T₄−GODによる蛍光強度の相対値を示す。第２図は
¹²⁵I−T₄およびT₄−GODと抗T₄抗体との反応に対するTBG
の影響を示したもので、横軸はTBGの添加量、縦軸は¹²⁵
I−T₄（▲実線）とT₄−GOD（●実線）よる放射活性（cp
m）および蛍光強度の相対値を示す。第３図は¹²⁵I−T₄およびT₄−GODと抗T₄抗体との反応に
対するHSAの影響を示したもので、横軸はHSAの添加量、
縦軸は¹²⁵I−T₄（▲実線）とT₄−GOD（●実線）による
放射活性（cpm）および蛍光強度の相対値を示す。第１
図〜第３図の縦軸におけるB₀は横軸の添加物のない状態
の強度であり、Ｂは添加物の存在した状態での強度であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】競合法による酵素免疫測定法において、標
識酵素としてグルコースオキシダーゼを使用し、抗T₄血
清濃度が希薄な状態において蛋白解離剤を使用しないこ
とを特徴とする血清中の遊離型サイロキシンの測定法。