JPS6232879A - ヒトｔ細胞ハイブリド−マおよびその作成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、新規でかつ安定なヒトキラーＴ−ハイブリド
ーマ、さらに詳しくは、ヒトＴ細胞抗原すセプターを安
定に産生ずることを特徴とするヒトキラーで一ハイブリ
ドーマ、さらに、別の腹黒からみると、ハイブリドーマ
がヒトキラーＴ細胞クローンと８−アザグアニン耐性ヒ
トＴ−リンホーマを融合して得られるハイブリドーマで
あることを特徴とするヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ
、およびこれらヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマの確立
方法に関する。 本発明者らは、先に出願し友特許（特願昭６Ｏ−９２２
９９）で述べたように、ヒトＴ細胞抗原すセブターの腫
喝抗原認識における重要性に着目して精力的に研究開発
を進めているが、ヒト上２−Ｔ細胞クローンの大量培養
には、大量のインターロイキン２を必要とし、フィーダ
ーとしてマイトマイシンＣ処理したこれらのクローンが
由来スるヒトの自己末梢血リンパ球を定期的に加えなけ
ればならない等、非常に手間がかかり、自律的に増殖し
、かつ安定に抗原リセプターを保持するキラーＴ細胞ハ
イブリドーマの作成が必要になってきた。 すなわち、本発明の目的は、安定にＴ細胞抗原リセプタ
ーを保持するヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマの作成で
ある。 （従来の技術） ヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマに関する報告、文献の
ＭＬ／′１はまだ見られない。しかし、ヒトへルバーハ
イブリドーマに関する報告〔エム・オカダ。 エヌ・ヨシムラ、ティー・カイエダ、ワイ・ヤマムラ、
ティー・キシモト；プロシーディング　オブ　ナショナ
ル　アカデミ−オプ　サ・イエンス。 Ｔ−ニスＴ−、７８．７７ｔ’（’ａ１）：Ｉネズミの
キラーハイブリドーマに関する報告〔オー・カナカワ、
チェー・エム・ｆ　２　　、’　ジャーナル　オブ　イ
ムノロジー、」止、５９７　（’８５　）］はある。 （発明が解決しようとする問題点） ヒトのキラーＴ細胞ハイブリドーマが命まで樹立されな
かった理由は、増殖性の高論ヒトキラーＴ細胞クローン
が細胞融合に用いられなかったためと思われる。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記目的の九めにヒトのリンパ球を＠鋳
細胞あるいはレクチン、もしくはリンフ才力インの一種
であるインターロイキン２等を用いて、槙々の方法でリ
ンパ球の活性化を行い、腫瘍細胞を殺す機能を持ったキ
ラーＴ＃ｉｆＵ胞を誘導し、クローニングを行って殺腫
瘍性キラーＴ細胞クローンを樹立する実験ｔｍ力的に行
った。このようにして得られ友りローン化キラーＴ細胞
の種々の腫瘍細胞に対するキラー活性を調べたところ、
驚ろくべきことに広範囲の腫瘍細胞を認識して強力に殺
し、正常細胞は殺さないキラーＴ細胞クローンが存在す
ることを見い出し友。このような広範囲殺腫瘍性キラー
Ｔ細胞クローンは、リンパ球の活性化およびクローニン
グ法を一定にして行えば、再現性良く、種々の特異性を
有するクローンを樹立することができた。そして、これ
らのキラーＴ細胞クローンから分離したＴ細胞抗原リセ
ブターが腫瘍細胞と特異的に結合することを見い出し、
新規腫瘍認識物質としてすでに特許出願し之（特願昭６
Ｏ−９２２９９）。 しかし、前記したように１　このようにして得たキラー
Ｔ細胞クローンの維持には、非常圧手間がかかり、自律
的に増殖し、かつ安定に抗原リセプターを保持するキラ
ーＴ細胞ハイブリドーマの作成が必要になってきた。そ
こで、本発明者らは、８−アザグアニン耐性ヒトＴ−リ
ンホーマと、前記し友ようにして得た増殖性の高いヒト
キラーＴ細胞クローンとの融合実験を何度も試みた結果
、ついに各々のヒトキラーＴ細胞クローンについて、Ｔ
細胞抗原リセブターを安定に保持するキ７−Ｔ細胞ハイ
ブリドーマを得て１本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、ヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマであシ
、また、ヒトキラーＴ細胞クローンと８−アザグアニン
耐性ヒトＴリンホーマを融合することを特徴とするヒト
キラーＴ細胞ハイブリドーマの作成方法に関する。 リンパ球は末梢血、牌臓、リンパ節から得ることができ
るが、末梢血より採取するのが簡便である。 本発明のヒトキラーＴ細胞クローンを得る方法は、次の
ようなものである。すなわち、まずリンパ球を腫瘍細胞
、レクチン、インターロイキン２等で刺激する。この場
合、レクチンあるいはインターロイキン２を用いると、
株々の特異性の異なるクローン化Ｔ細胞が得られるので
好ましい。レクチンとしてはファセオラス・ブルガリス
（Ｐｈａ−ｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）由来の
７カインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）、コンカナバリア
・エンラフオルミス（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ　ｅｎ
ｓｉｆｏｒｍｉｓ　）由来のコンカナバリンＡ　（Ｃｏ
ｎ　Ａ　）　ｓ　ライステリア・アオリバンダ（Ｗｉｓ
ｔｅｒｉａ　ａｏｒｉｂａｎｄａ　）由来のノダクヅマ
メレクチン（ＷＦＡ）、　レンズ・キュリナリス（Ｌｅ
ｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ　）由来のレンズマメレクチン
（ＬＣＨ）、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏ
ｌａｃｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ　）由来のアメリカヤ
マゴボウレクチン（ＰＷＭ）ｉ使用する。これらのレク
チンの中でも、ＰＨＡ、ＰＷＭは腫瘍認識性Ｔ細胞を強
く活性化するので好ましい。 刺激活性化しタリンパ球をインターロイキン２含有培地
に浮遊させ、マイクロウェルプレートの各ウェルに細胞
が１個ずつ入るように分注した後、培養を行ってクロー
ニングし、〔ティー・カイエダ；ジャーナル　オプ　イ
ムノロジー、１２９゜４６（’８２））クローン化Ｔ細
胞を得る。このような方法で得られた多くのクローン化
Ｔ細胞の中から、腫瘍細胞ｌｔ認識するものをスクリー
ニングする。スクリーニングは、クローン化Ｔ細胞と腫
瘍細胞を混合培養し、腫瘍細胞を認識して殺すか（キラ
ー活性）で腫瘍細胞に対する認識性を評価することＫよ
シ行う。 本発明のヒトキラーＴ細胞クローンが認識する＠易細胞
は、少なくとも固型癌（充実性ｆｉｌｌｌりであり、ヒ
ト胃癌細胞株ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ヒト肺癌
細胞株ＰＣ−１，ＰＣ−９，ＰＣ−１０、ＰＣ−９、Ｐ
Ｃ−１４，ヒト結腸癌細胞株Ｃ−１，１ｆ１７６０９、
ヒト直腸癌細胞株ＣａＲ−１゜Ｓ−７５１２，ヒト胆管
癌細胞株Ｈ−１、ヒト肝癌細胞株ＨＬＥ、ＨＬＦ、ヒト
膀胱癌細胞株ＮＥＴ−２、ＫＵ−１％ヒト咽喉癌細胞株
ＫＢ、ヒト胃癌細胞株Ｗ−２、ＮＲＣ−１２、ヒト乳癌
細胞株ＭＢＣ−４、ＨＢＣ−６，ヒト子宮癌細胞株Ｈｅ
Ｌａ、　ヒト黒色腫細胞株ＨＭＶ−１、）（ＭＶ−２の
うち少なくとも２種以上であり、認識しない正常細胞は
、健常人リンパ球、健常人赤血球、ヒト胎児由来繊維芽
細胞株ＨＥＴ％ＨＥＬ％ＭＲＨＦのうち少なくとも１種
以上である。なお、クローン化Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識
するかどうかは、３１Ｃｒ標識法を用い、ｇ／Ｔ比（ク
ローン化Ｔ細胞と＠瘍細胞の混合比）１０で４時間、３
７Ｃ培養を行い、１０チ以上のキラー活性を示すものｔ
ｌ−認識するとする。 本発明で述べたリンパ球の刺激、クローニング、スクリ
ーニング法により、種々の特異性を有する腫瘍認識性ヒ
トキラーＴ細胞クローンを得ることができる。すなわち
、少なくと鬼ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯ−［
Ｉを殺し、健常人リンパ球、胎児由来繊維芽細胞ＨＥＬ
は殺さない胃癌に特異的と考えられるヒトキラーＴ細胞
クローンが得られ友。まｍ、少なくともヒト肺癌細胞株
ｐｃ−１、ＰＣ−１、ＰＣ−９、ＰＣ−１４を殺し、健
常人リンパ球、胎児由来繊維芽細胞ＷＥＴは殺さず、肺
癌特異的と考えられるクローン化ヒトキラーＴ細胞が得
られ次。さらに、少なくともヒト肝癌細胞株ＨＬＥ、Ｈ
ＬＦｉ殺し、健常人リンパ球は殺さない肝癌特異的と考
えられるヒトキラーＴ細胞クローンが得られた。 Ｔ細胞抗原リセブターは１次の方法〔ニス・シー・モイ
ヤー；ジャーナル　オプ　イクスペリメンタル　メデイ
スン、」ユ、７’０５（’８５　）］を用すればＴ細胞
ハイブリドーマより効率良く分離することができる。す
なわち、ヒトキラーＴ細胞クローンから後述し友方法で
得たヒトキラーＴ−ハイプリド−７ｔ−１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ　−１００ｆ含むＰＢＳ（、８５１ＮａＣ４含有
リン酸緩衝液、ｐＨ７，２）中に浮遊させ、水中にて１
時間攪拌することにより膜たんばくを溶出させ、これを
Ｔ細胞抗原リセプターに対するモノクローナル抗体を結
合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂでアフイニティ精鯛
を行う。 組人したＴ細胞抗原リセプタ−１１１：ｓＤｓポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけると、非還元条件では分
子量約９万の位置に１本のバンドが検出され、還元条件
では分子量約５万および分子量約４万５千に２本のバン
ドが検出される。 さらに５本発明の殺腫瘍性ヒトキラーＴ細胞クローンか
ら後述した方法で得たヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ
をチュニカマイシン処理して糖部分のないＴ細胞抗原リ
セプターを得ると、それぞれ分子量約３万の二つの蛋白
質成分がジスルフィド結合を介して互いに共有結合して
いる分子量約６万のヘテロダイマーが得られる。すなわ
ち、本発明のＴ細胞ハイブリドーマが産生ずるＴ細胞抗
原リセブターは、糖の結合したものおよび糖の結合して
いないものの両者を含むものである。 本発明のヒトＴ細胞ハイブリドーマは、安定に。 かつ大量にＴ細胞抗原リセブターを提供する。 本発明の８−アザグアニン耐性と）Ｔ−リンホーマと上
記ヒトキラーＴ細胞クローンとの融合反応は、融合促進
剤の存在下に適当な培地内で行われ　　　□る。融合促
進剤としては、例えば、センダイウィルス（ＨＶＪ）等
のウィルスを用いてもよいが、　　　　□近年開発され
たポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるのが好ま
しい。該ＰＥＧとしては、平均分子量１０００〜６００
０程度のものが好ましく、これは培地に約３０〜６０Ｗ
／Ｖ％の濃度で存在させるのが適当である。また、培地
としては、上記し友親細胞株の増殖に用いられるような
ＭＥＭ培地、そのドルベツコ改質培地、ＲＰＭＩ　１６
４０培地、その他のこの種の細胞培養に利用される通常
の各種培地を利用できる。ま之、上記細胞融合用培地に
は、所望により融合効率を高めるｔめの補助剤として、
例えば、ジメチルスルホキシド等を添加してもよい。 上記細胞融合に当り、本発明ヒトキラーＴ細胞クローン
と８−アザグアニン耐性ヒトＴ−リンホーマとの使用量
比は、特に制限はないが、一般にはヒトキラーＴ細胞ク
ローンの１ＪＪ３胞数に対し、８−アザグアニン耐性ヒ
）Ｔ−リンホーマの細胞数を約１〜１０倍にして用いる
ことができる。好ましい細胞融合は、例えば、次の如く
して行なわれる。 すなわち、８−アザグアニン耐性ヒ）Ｔリンホーマとヒ
トキラーＴ細胞クローンとの所定量を適当な培地内でよ
く混ぜ、遠沈後、上清を除去し、予め３７Ｃに加温した
ＰＥＧ溶液の適当量を加えてまぜ合せる。これにより細
胞融合反応が開始される。以後適当な時間、細胞をイン
キュベイトし、適当な培地を逐時添加し、遠沈させ、上
溝をすてる操作を総り返すことにより、所望の融合細胞
の出現が認められる。 所望融合細胞の分離は、上記細胞融合後の細胞を、通常
の雑種選別用培地で培養することにより行なわれる。こ
の選別用培地は、親細胞は増殖できず、目的とする交雑
細胞のみが増殖できる培地（ヒトキラー細胞クローンは
本来増殖できない）であり、その代表例としては、例え
ば、ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを
含む培地（ＨＡＴ培地）を例示できる。該ＨＡＴ培地と
しては、例えば、１０％ＦＣＳ含有Ｍ　Ｅ　Ｍ培地に１
アミノプテリン２ｘ１０−Ｍ、　　ヒボキ丈ンチンｌＸ
１０−４Ｍ、チミジンＬ６　ｘ　１０−’Ｍおよびグリ
シン３Ｘ　１０′Ｍを添加した培地が例示できる。該Ｈ
ＡＴ培地での細胞の培養は、通常の限界希釈法にしたが
い、目的とする交雑細胞以外の細胞（未融合細胞等）が
死滅するに充分な時間、通常約数日〜数週間はど行なわ
れる。これにより目的とするヒトキラーＴ細胞ハイブリ
ドーマのみが選択的に増殖する。 かくして得られるハイブリドーマは、核形（核染色体数
）細胞表面の表現型、マイトジェン反応性、リンホカイ
ン産性能等において、８−アザグアニン耐性ヒトＴリン
ホーマ、ヒトキラーＴ細胞クローンとは明らかに異なる
新しい特性を具備している。このハイブリドーマは、前
記と同様の適当な培地中で増殖維持することができるが
、ＨＡＴ培地による選別後、ヒボキサンチンおよびチミ
ジンを含むＨＴ培地で１〜２週間培養した後、通常の培
地に移す方が好ましい、 ヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマとは、ヒトキラーＴ細
胞クローンと８−アザグアニン耐性ヒトＴリンホーマを
融合して得られるハイブリドーマであし、キラー活性を
有するもの、および有しなニものを含み、少なくとも抗
原特異的に認識するハイブリドーマである。本発明の対
象とする抗原とは、腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原等の腫
瘍抗原、あるいはウィルス抗原等を有する生体の悪性細
胞の表面抗原である。 （発明の効果） 上記殺腫瘍性ヒトキラーＴ細胞より前述の方法で得たヒ
トキラーＴ細胞ハイブリドーマから得た精製Ｔｄ３胞抗
原リセすターの腫瘍細胞および正常細胞に対する結合性
を、１次抗体として抗Ｔｄ胞抗原すセプターモノクロー
ナル抗体、２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウス免疫グ
ロブリン抗体を用いて調べたところ、驚くべきことに、
元のヒトキラーＴ細胞クローンと同じ認識性を有してお
り、このように細胞膜から分離したＴ細胞抗原リセプタ
ーが、特異的に腫瘍細胞と結合することを見い出した。 すなわち、胃癌特異的あるいは肺癌特異的もしくは汎腫
瘍特異的であり、腫瘍細胞とは結合するが正常細胞とは
結合しないきわめて有用で新規な腫瘍細胞結合物質とし
て癌に対する診断薬および治療薬に用いうることが判明
した。 本発明の腫瘍細胞認識性ヒトキラーで細胞ハイブリドー
マおよび該細胞より得たＴ細胞抗原リセプターは、腫瘍
抗原解析のための基礎研究、および細胞が癌細胞である
かどうかの判定、血清検査を行うことにより癌患者であ
るかどうかの判定、標識物質を結合して癌患者に投与す
ることにより転移部位を検出する等の癌診断薬、さらに
、毒素あるいは放射性物質を結合して癌治療薬として用
いようとするものである。しかし、本発明のヒトキラー
Ｔ　、＠Ｂ胞ハイブリドーマの有用性は、１１≠に限定
されるものではなく、ウィルス抗原等を有する生体の悪
性細胞を認識するＴ細胞抗原リセプターを有するものも
含まれる。 （実施例） 以下、実施例により、本発明の実施の態様をより詳細に
説明する。 実施例１ ヒトＴ　：細胞のクローニングおよび腫４Ｊｉ認識性ヒ
トキラーＴ細胞クローンのスクリーニングは、以下のよ
うにして行った。 ヒトリンパ球は次のよう

【して得た。すなわち、採血し
たヘパリン加ヒト末梢血をハンクス液にッスイ）で２倍
希釈し、フィコールバック液（ファルマシア社製）に重
層し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。中
間層のリンパ球層を採取して、これをハンクス液で洗っ
た後、牛胎児血清を１０％添加したＲＰＭ１１６４０培
地にツスイ）に２　Ｘ　１０’個／−細胞濃度で浮遊さ
せた。 これにＰＨＡ−Ｐ（ディフコ裂）を０．１壬の濃度で添
加し、培養びんに移して、５７Ｃ，５％ＣＯ１中で４８
時間培安全行った。リンパ球はレクチン（ＰＩ（Ａ−Ｐ
）によって活性化され、種々のヒト腫瘍細胞株を認識す
る種々のキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞が誘導された。 このポリクローナルな活性化リンパ球をモノクローナル
にするために、公知の方法Ｃ海江田豪児；免疫実験操作
法ＸＩ。 Ｐ、５６８９、日本免疫学会編】にてクローニングを行
った。すなわち、活性化リンパ球を市販のイアｐ−ロイ
キン２（ベーリンガー・マンハイム社製）含有ＲＰＭ１
１６４０培地（２０％牛脂児血清含有）に５Ｃｅｌｌｓ
／ｄの細胞濃度で浮遊させ、この、畑胞浮遊培地にマイ
トマイシンＣ（協和醗酵製）処理＜　１００ａ？／ｍｌ
、３７Ｃ，４５分）した自己リンパ球をＩ　Ｘ　１０’
個／−の細胞濃度で加えた鎌、２００μｉｆつ９６穴２
００μを容マイクロウェルプレートＣファルコン黒３０
７２）Ｋ分注し、３７Ｃ，５％ＣＯ７中で培養を行った
。約２週間でクローン化Ｔ細胞が増殖した。このクロー
ン化Ｔ細胞が＠瘍細胞認識性を持つかどうかは、次のよ
うに腫瘍細胞に対してキラー活性を■するかどうかで評
価した。すなわち、各種腫瘍細胞を５１Ｃｒで公知の方
法〔アール・エム・ンーンら、ジャーナル　オブ　イム
ノロジカル　メンラド、４゜５０１（’７４）、）で標
識し、１×１０４個の標識腫瘍細胞と１　ｘ　１０’個
のクローン化Ｔ細胞を、２００μｔのＲＰＭＩ培地（５
％牛脂児血清含有）中で４時間混合培養Ｃ５７Ｃ，５％
Ｃｏ、）ｌ、た後、上清に遊離される５１Ｃｒの放射活
性をカウントして、キラー活性を有するかどうかを評価
した。 キラー活性は次式により算定した。 キラー活性−（（Ｂ−Ｃ）／（Ａ−Ｃ））Ｘ１００Ａ＝
標識腫瘍細胞Ｉ　Ｘ　１０’個の放射活性Ｂ：標識腫瘍
細胞Ｉ　Ｘ　１０’個とクローン化Ｔ、刑胞Ｉ　Ｘ　１
０’個を混合培養した場合の上清中の放射活性 Ｃ：標識腫瘍細胞Ｉ　Ｘ　１０４個だけを培養した場合
の上清中の放射活性 １万個の活性化リンパ球を上記条件下でクローニングし
た結果、Ｔ細胞クローンが約５００個得られた。このう
ち、各種ヒト腫瘍細胞株の少なくとも１種に対してキラ
ー活性を有するヒトキラーＴ細胞クローンが約１００個
存在した。このようにしてクローニング実験をくりかえ
して得たヒトクローン化キラーＴ細胞の中で、典型的な
りローンの各種腫瘍細胞および胎児由来［維芽細胞に対
するキラー活性を表１に示す。これらのクローンは、培
養にインターロイキン２を必要とし、長期間培養維持す
るためには、インターロイキン２を含有するＲＰＭ１１
６４０培地（２０％牛脂児血　　　：清含有）で培養を
行う。さらに、７〜１０日に−ｉ、ＰＨＡ−Ｐおよびこ
れらのクローンが由来す　　　□るヒトの自己末梢血リ
ンパ球をマイトマイシン処理した後、培養に添加する。 このような条件下で培養を行うこと罠より、６ケ月以上
の長期培養維持が可能であった。また、このような腫瘍
細胞認識性ヒトキラーＴ細胞クローンは、上記と同じ灸
件　　□でヒト末梢血リンパ球のレクチン刺激、クロー
ニング、スクリーニングを行えば、再現性良く得ること
ができた。 表１　ヒトキラーＴ細胞クローンの　種標的細胞に対す
るキラー°性腫瘍認識性ヒトキラーＴ−ハイブリドーマ
は、以下のようにして得た。８−アザグアニン耐性ヒ）
Ｔ一すンホーマとしてＯＥＭ−ＡＣを用いた。 ＯＥ　Ｍ　−Ａ　ＧＲの作成は、公知の方法（特開昭５
７−２０６３８３）によった。親細胞ＣＥＭ−ＡＧＲは
、融合の３日前より毎日培地（ＲＰＭ１１６４０＋２０
％ＦＣ８＋１００μＭ８−アザグアニン）を交換して、
増殖が活発な状態に保持しておき、１日前より上記培地
から１００μＭＳ−アザグアニンを除いた培地に浮遊さ
せた。上記ＣＥＭ−ＡＧＲの６　Ｘ　１０７個と、前記
表１で示した広範囲腫瘍紹識性ヒトキラーＴ細胞クロー
ン５１の８　Ｘ　１０’個とを細胞融合に利用した。す
なわち、上記各細胞を、予め３７Ｃ加温保持したＦｅ２
を含まないＭＥＭ培地で３回洗浄し、仄いで、５０−の
コニカルチューブに移しよく混合し、室温８００　ｒｐ
ｍで１０分遠沈した。上清を除去して得られた細：塩ベ
レットを軽く振とうし、その上に５７Ｃに加温したＰＥ
Ｇ−６０００（コツホライト社）を４５係になるように
ＭＥＭ中に浴解させたもの０．５　ｄを注いだ。３０秒
間よく振とうした後、５％炭酸ガス〉よび９５％空気の
炭酸ガスインキュベーター内で、３７Ｃ下Ｖｃ６分間静
置した。これにＦｅ２を含まないＭＥＭ（予め３７ＣＩ
ｃ加温）を１分間に２−の速度で総計１２−、コニカル
チューブを回転させながら加えた。さらに、ＭＥＭ２５
ＷＬｔをすばやく加えた後、８００　ｒｐｍ、室温で１
０分間遠沈し、上清を除去した。ベレットをよくほぐし
、これに２０係ＦＣ３含有ＲＰＭＩ　１６４０培地（予
め５７Ｃに加温）の１２０−を静かに加えてＯＥＭ−Ａ
Ｇ　　９度を５　Ｘ　１０’個／ｒｎｔとし、これを２
４穴カルチヤープレート（Ｃｏ５ｔａｒ　属３５２４）
の各ウェル１２０個に夫々１−づつ分注した。 ２４時間１、ＨＡＴ培地〔ヒボキサンチン（シグマ社）
　Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ、アミノプテリン（シグマ社）２
　ｘ　１０−’Ｍ、およびチミジン（シグマ社）１．６
Ｘ１０−５Ｍを含むＲＰＭＩ　１６４０−１−２０％Ｆ
Ｃ８培地〕１−を各ウェルに加えた。２日毎に上清の半
分を捨て、ＨＡＴ培地１１Ｉ！／を各ウェルに加える操
作を繰り返し、２〜４週間５％炭酸ガスインキュベータ
ー内で、３７Ｃ下に培養した。増殖する細胞株を、次い
で、アミノプテリン（Ａ）を含まないＨＴ培地（ＨＡＴ
培地よりＡを除いたもの）Ｋ移し、さらに−週間培養ｉ
、ＨＡＴを含まないＲＰＭＩ　１６４０−１−２０％Ｆ
Ｃ８培地（正常培地）に移した。同様な細胞融合を２回
繰り返した結果、合計６クローンのハイブリドーマが得
られた。 得られたハイブリドーマがＴ細胞抗原リセプターを産生
じていることをチェックするために、Ｔ細胞抗原リセプ
ターと結合していると考えられているＴ細胞表面抗原Ｔ
３の抗体０ＫＴ３を一次抗体とし、ＦＩＴＣ標識マウス
Ｉｇ抗体（タボ社！りを二次抗体とする、いわゆる間接
法で染色してみた。螢光顕微鏡で観察した結果、合計６
クローンのハイブリドーマ中、１クローンのみリング状
に染まっている細胞がみられた。このクローンをＨ５１
−４と呼ぶことにした。なお、親細胞株ＣＥＭ−ＡＧＲ
は、この染色法では全く染１らなかった。Ｈ５１−４の
中には、明確にＴ３を発現しているｍｔＱが存在する一
方、はとんどＴ３を倹出できない細胞も数多く存在して
いた。そこで、Ｔ細胞抗原リセプター産生を上昇させる
ため、明確九Ｔ３を発現しているサブクローンを得るべ
く、以後常法にしたがいクローニングを行なった。すな
わち、ＣＥＭ−ＡＧ　１　ｘ　１０’個を正常培地で洗
い、６０ｄの）（ＡＴ培地に浮遊させ、）（！Ｍ−４を
２．５個／ゴとなるよう希釈して、上記ＨＡＴ培地に浮
遊させた。これを９６穴２００μを容マイクロウェルプ
レー）（７アルコン７％３０７２）に０．２ｒｒＩｔ／
ウエルづつ分注し、２週問おきに上清を半分槽て、予め
３７Ｃに加温したＨＡＴ培地を加え、上記細胞の増殖を
続けた。かくして交雑、１ｔＩｌ胞株の単一クローンを
得た。得られた単一クローンを上記の間接法で染色した
結果、細胞がほとんど全部淡く染まり、リング状に染ま
るものがかなり多いクローンが二つとれた。これをＨ５
１−４−Ａ２、Ｈ５１−４−ＤＩと呼ぶ。これらのＴハ
イフリドーマのＴ　、ｉ（Ｂ胞抗原すセプターの産生は
、非常に安定していた。 ハイブリドーマＨ５１−４−ＤＩから特願昭６０−９２
２９９の実施例４の方法にしたがって分離したＴ細胞抗
原リセプターは、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−１、Ｋ　Ａ　
Ｔ　Ｏ−■、ヒト肺癌細胞株ＰＣ−１０、ＰＣ−９、Ｐ
Ｃ−１４、ヒト膀胱癌細胞株ＮＢＴ−２、ヒト咽喉癌細
胞株ＫＢ、　ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａ　、　ヒト黒色
腫細胞株ＨＭＶ−１、ＨＭＶ−２と結合し、クローン５
１が認識しない細胞とは結合しなかった。細胞膜より分
難精製したＴ細胞抗原リセプターは、元のクローン５１
と同じ認識性を示した。 実施例２ 表１で示したヒトキラーＴ細胞クローン８より実施例１
に示した方法を用いて、ヒトキラーでハイブリドーマを
作成したところ、安定にＴ５生産を示した。続いて、Ｔ
細胞抗原リセプターをｎｔ製し、腫瘍細胞結合性を調べ
こところ、ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯ−１１７と結合し、ク
ローン８非認識細胞とは結合しなかった。 実施例３ 表１で示したヒトキラーＴ細胞クローン１９より実施例
１に示した方法を用いて、ヒトキラーＴハイブリドーマ
を作成したところ、安定にＴ３産生を示しＬ０続いて、
Ｔ細胞抗原リセグターを稍製し、腫瘍細胞結合性を調べ
たところ、ＰＣ−１、ＰＣ−１、ＰＣ−９、ＰＣ−１４
と結合し、クローン１９非認Ｆａ細胞とは結合しなかっ
た。 実施例４ 表１で示したヒトキーｙ−Ｔ、ｌｌ！を胞クローン２４
より実施例１に示した方法を用いて、ヒトキラーＴハイ
ブリドーマを作成したところ、安定にＴ５産生を示した
。続いて、Ｔ細胞抗原リセプターを精製し、腫瘍細胞結
合性を調べたところ、ＨＬＥ。 ＨＬＦと結合し、クローン２４非認識細胞とは結合しな
かった。 実施例５ 表１で示したヒトキラーＴ細胞クローン７５より実施例
１に示した方法を用いて、ヒトキ７−Ｔハイブリドーマ
を作成したところ、安定にＴ３産生を示した。続いて、
Ｔ細胞抗原リセプターを招製し、腫瘍細胞結合性を調べ
たところ、ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯｒＩＩ、　　ＰＣ−９
、ＰＣ−１０、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、Ｃ−１、Ｈ−１
、ＮＢＴ−２、ＫＢＸ−ｂＶ−２、ＩＩ　ｅ　Ｌ　ａ　
−、ＨＭ　Ｖ　　１と結合し、クローン７５非認識細胞
とは結合しなかった。 以上、本発明を代表実施例につき説明したが、本発明は
、これらのみに限定されない。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ。
2. （２）Ｔ細胞抗原リセプターを産生する特許請求の範囲
   第１項記載のヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ。
3. （３）Ｔ細胞抗原リセプターがＴ細胞膜表面上にある抗
   原認識分子であり、約５０キロダルトンの分子量を有す
   るポリペプチドと約４５キロダルトンの分子量を有する
   ポリペプチドの二つのポリペプチドがジスルフィド結合
   を介して互いに共有結合しているヘテロダイマーである
   特許請求の範囲第２項記載のヒトキラーＴ−細胞ハイブ
   リドーマ。
4. （４）ハイブリドーマがヒトキラーＴ細胞クローンと８
   −アザグアニン耐性ヒトＴリンホーマを融合して得られ
   るハイブリドーマである特許請求の範囲第１項記載のヒ
   トキラーＴ細胞ハイブリドーマ。
5. （５）ヒトキラーＴ細胞クローンがインターロイキン２
   を用いてクローニングして得られた細胞である特許請求
   の範囲第４項記載のヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ。
6. （６）８−アザグアニン耐性ヒトＴリンフオーマがＣＥ
   Ｍ、ＪｕｒＫａｔ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＨＰＢ−ＭＬＴ、
   Ｍｏｌｔ３、Ｍｏｌｔ４由来の８−アザグアニン耐性株
   である特許請求の範囲第４項記載のヒトキラーＴ細胞ハ
   イブリドーマ。
7. （７）ヒトキラーＴ細胞クローンがヒト胃癌細胞株ＭＫ
   Ｎ−１、ＫＡＴＯ−III、ヒト肺癌細胞株ＰＣ−１、Ｐ
   Ｃ−９、ＰＣ−１０、ＰＣ−１３、ＰＣ−１４、ヒト結
   腸癌細胞株Ｃ−１、Ｍ７６０９、ヒト直腸癌細胞株Ｃａ
   Ｒ−１、Ｓ−７５１２、ヒト胆管癌細胞株Ｈ−１、ヒト
   肝癌細胞株ＨＬＥ、ＨＬＦ、ヒト膀胱癌細胞株ＮＢＴ−
   ２、ＫＵ−１、ヒト咽喉癌細胞株ＫＢ、ヒト腎癌細胞株
   Ｗ−２、ＮＲＣ−１２、ヒト乳癌細胞株ＨＢＣ−４、Ｈ
   ＢＣ−６、ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａ、ヒト黒色腫細胞
   株ＨＭＶ−１、ＨＭＶ−２のうち少なくとも２種以上に
   対してキラー活性を有するキラーＴ細胞である特許請求
   の範囲第４項記載のヒトキラーＴ−ハイブリドーマ。
8. （８）ヒトキラーＴ細胞クローンが少なくともヒト胃癌
   細胞株ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯ−IIIに対してキラー活性
   を有するキラーＴ細胞である特許請求の範囲第４項記載
   のヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ。
9. （９）ヒトキラーＴ細胞クローンが少なくともヒト肺癌
   細胞株ＰＣ−１、ＰＣ−１０、ＰＣ−１３、ＰＣ−１４
   に対してキラー活性を有するキラーＴ細胞である特許請
   求の範囲第４項記載のヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ
   。
10. （１０）ヒトキラーＴ細胞クローンが少なくともヒト肝
    癌細胞株ＨＬＥ、ＨＬＦに対してキラー活性を有するキ
    ラーＴ細胞である特許請求の範囲第４項記載のヒトキラ
    ーＴ細胞ハイブリドーマ。
11. （１１）ヒトキラーＴ細胞クローンが少なくともヒト胃
    癌細胞株ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯ−III、ヒト肺癌細胞株
    ＰＣ−１０、ＰＣ−１３、ＰＣ−１４、ヒト膀胱癌細胞
    株ＮＢＴ−２、ヒト咽喉癌細胞株ＫＢ、ヒト子宮癌細胞
    株ＨｅＬａ、ヒト黒色腫細胞株ＨＭＶ−１、ＨＭＶ−２
    に対してキラー活性を有するキラーＴ細胞である特許請
    求の範囲第４項記載のヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ
    。
12. （１２）ヒトキラーＴ細胞クローンが少なくとも胃癌細
    胞株ＭＫＮ−１、ＫＡＴＯ−III、肺癌細胞株ＰＣ−９
    、ＰＣ−１０、ＰＣ−１３、ＰＣ−１４、結腸癌細胞株
    Ｃ−１、胆管癌細胞株Ｈ−１、膀胱癌細胞株ＮＢＴ−２
    、咽喉癌細胞株ＫＢ、腎癌細胞株Ｗ−２、子宮癌細胞株
    ＨｅＬａ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−１に対してキラー活性
    を有するキラーＴ細胞である特許請求の範囲第４項記載
    のヒトキラーＴ細胞ハイブリドーマ。
13. （１３）ヒトキラーＴ細胞クローンと８−アザグアニン
    耐性ヒトＴリンホーマを融合することを特徴とするヒト
    キラーＴ細胞ハイブリドーマの作成方法。