JPS6232898A - 発現蛋白の発酵収率増大 - Google Patents
発現蛋白の発酵収率増大Info
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- JPS6232898A JPS6232898A JP61178990A JP17899086A JPS6232898A JP S6232898 A JPS6232898 A JP S6232898A JP 61178990 A JP61178990 A JP 61178990A JP 17899086 A JP17899086 A JP 17899086A JP S6232898 A JPS6232898 A JP S6232898A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
望みの異鍾蛋白発現のための形質転換真核細胞の利用は
、本分野において組み換えＤＮＡ技術の利用として知ら
れている。望みの異種蛋白をコードするＤＮＡ ｉもつ
ベクターを含む形質転換細胞は次いで通常技術音用いる
細胞培養で生育させられ、該異種蛋白は、形質転換宿主
により分泌される際は細胞培養液から単離され、分泌さ
れない際は細胞全破壊することにより単離される。
、本分野において組み換えＤＮＡ技術の利用として知ら
れている。望みの異種蛋白をコードするＤＮＡ ｉもつ
ベクターを含む形質転換細胞は次いで通常技術音用いる
細胞培養で生育させられ、該異種蛋白は、形質転換宿主
により分泌される際は細胞培養液から単離され、分泌さ
れない際は細胞全破壊することにより単離される。
発酵技術の改変は、特異的な栄養源が培地中に添加され
るまで望みの異種蛋白を生産しないベクターを用いるこ
とである。ガラクトースは本分野において知られる技術
を用いて望みの異種蛋白の発現を誘導するために用いら
れるそのような栄養培地である（ステビシ：／ｌ （５
ｔｅｐｉｅｎ ）ほか、シーン（Ｑｅｎｅ ）第２４巻
：２８９−２９８頁、 １９８３年）、ガラクトース誘
導系は望みの異種蛋白の発現開始によく機能するが、よ
シ高い収率で望みの蛋白金増得することが望ましいであ
ろう。
るまで望みの異種蛋白を生産しないベクターを用いるこ
とである。ガラクトースは本分野において知られる技術
を用いて望みの異種蛋白の発現を誘導するために用いら
れるそのような栄養培地である（ステビシ：／ｌ （５
ｔｅｐｉｅｎ ）ほか、シーン（Ｑｅｎｅ ）第２４巻
：２８９−２９８頁、 １９８３年）、ガラクトース誘
導系は望みの異種蛋白の発現開始によく機能するが、よ
シ高い収率で望みの蛋白金増得することが望ましいであ
ろう。
従って、望みの異種蛋白を、ガラクトース−誘導発酵行
程において、増大収率で取得するための方法を供給する
ことが、本発明の目的である。本発明のこの目的および
他の目的は以下の記載から明らかとなろう。
程において、増大収率で取得するための方法を供給する
ことが、本発明の目的である。本発明のこの目的および
他の目的は以下の記載から明らかとなろう。
ガラクトース−制御酵母菌株は、該形質転換酵母細胞を
培養生育させ、異種蛋白の発現を誘導する目的でガラク
トースを添加する前に培地を新鮮培地と交替することに
より望みの蛋白を改善された収率で発現する。
培養生育させ、異種蛋白の発現を誘導する目的でガラク
トースを添加する前に培地を新鮮培地と交替することに
より望みの蛋白を改善された収率で発現する。
本発明に従って、真核細胞が、ガラクトースにより誘導
されたとき、望みの蛋白を発現するように構築されたＤ
ＮＡ ｆ、含むベクターの挿入により形質転換される。
されたとき、望みの蛋白を発現するように構築されたＤ
ＮＡ ｆ、含むベクターの挿入により形質転換される。
該ベクターはまた、非形質転換宿主によってはつくられ
ない必須栄養Ｘ例えば、ロイシン、ウラシルまたはトリ
プトファンの生産全コードするＤＮＡも含む。このこと
は、プラスミドを失った細胞は死滅するであろうから、
組み換え体プラスミドベクターを保持する宿主細胞のみ
が再生することを保証する。該組み換え体臭核細胞、例
えばサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）が、ロイシンお
よびガラクトース欠乏培地例えば寒天斜面に植えるのに
用いられる。
ない必須栄養Ｘ例えば、ロイシン、ウラシルまたはトリ
プトファンの生産全コードするＤＮＡも含む。このこと
は、プラスミドを失った細胞は死滅するであろうから、
組み換え体プラスミドベクターを保持する宿主細胞のみ
が再生することを保証する。該組み換え体臭核細胞、例
えばサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）が、ロイシンお
よびガラクトース欠乏培地例えば寒天斜面に植えるのに
用いられる。
該宿主細胞は次いで、望みの最終産物を発現するために
選ばれた特定の細胞の培養に適する技術に従って培養さ
れる。細胞密度が最大またはほぼ最大で、細胞が、対数
増殖後期／定常期初期にあるとき、該細胞は、発現を誘
導するためにガラクトースを含む新鮮細胞培地に移され
る。該細胞は次いで、生産物の最大発現を保証するため
に、２から３世代時間培養される。任意に、しかし、好
ましくは、細胞は新鮮培地に移される前に洗浄される。
選ばれた特定の細胞の培養に適する技術に従って培養さ
れる。細胞密度が最大またはほぼ最大で、細胞が、対数
増殖後期／定常期初期にあるとき、該細胞は、発現を誘
導するためにガラクトースを含む新鮮細胞培地に移され
る。該細胞は次いで、生産物の最大発現を保証するため
に、２から３世代時間培養される。任意に、しかし、好
ましくは、細胞は新鮮培地に移される前に洗浄される。
洗浄は、生理食塩水、燐酸緩衝生理食塩水または他の生
理学上受容可能な溶液によりなされよう。
理学上受容可能な溶液によりなされよう。
宿主細胞および望みの蛋白の型により、望みの蛋白は培
地に分泌されよう、そのような場合は、望みの蛋白の回
収を容易にするために合成培地が用いられる。望みの蛋
白が培地中に分泌されないときは、該蛋白は、細胞を約
２°から約８℃の温度で破壊し、望みの蛋白を適当な手
段により単離することにより得られる。
地に分泌されよう、そのような場合は、望みの蛋白の回
収を容易にするために合成培地が用いられる。望みの蛋
白が培地中に分泌されないときは、該蛋白は、細胞を約
２°から約８℃の温度で破壊し、望みの蛋白を適当な手
段により単離することにより得られる。
本発明は、特定の酵母菌株を参考とする以下の記載にお
いて例示されるが、本発明が、他の酵母菌株においても
同等に実施され得ることが理解されるべきである。
いて例示されるが、本発明が、他の酵母菌株においても
同等に実施され得ることが理解されるべきである。
以下の実施例は本発明を説明するが、それだけに限定す
るものではない。
るものではない。
実施例１
酵母サツカロマイセス・セレビシェの厚辻上およびＧａ
ｌ １０遺伝子の間にある該Ｇａ１４制御領域は、プラ
スミドｐｉ ＧＳＤ ５から３７０ｂｐ Ｘｈｏ ■−
５ａｌＡ ３ Ａ断片として単離された。
ｌ １０遺伝子の間にある該Ｇａ１４制御領域は、プラ
スミドｐｉ ＧＳＤ ５から３７０ｂｐ Ｘｈｏ ■−
５ａｌＡ ３ Ａ断片として単離された。
グアレンチ（Ｑｕａｒｅｎｔｅ ）ほか、プロシーデン
グス・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイ
エンス（ｐｒｏｃ、１ｔＪａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ第７９巻： ７４１０−７４１４頁（１９
８２年）。
グス・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイ
エンス（ｐｒｏｃ、１ｔＪａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ第７９巻： ７４１０−７４１４頁（１９
８２年）。
本断片は常法によッテ−３７０ｂｐ ＢａｍＨＩ−３ａ
ｌＩ断片に変換され、酵母発現ベクターｐｃｌ／ｌ。
ｌＩ断片に変換され、酵母発現ベクターｐｃｌ／ｌ。
Ｂｒａｋｅほか、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オフ゛・サイエンスＵＳＡ第８１
巻＋ ４６４２−４６４６頁（１９８４年）中に１３ゴ
ｍＨＩ−８ａｌｌ置換としてクローン化され、プラスミ
ドＩ）ＣＩ／Ｉ ＧＡＬ ４ ／ ３７０を与えた。
ョナル・アカデミ−・オフ゛・サイエンスＵＳＡ第８１
巻＋ ４６４２−４６４６頁（１９８４年）中に１３ゴ
ｍＨＩ−８ａｌｌ置換としてクローン化され、プラスミ
ドＩ）ＣＩ／Ｉ ＧＡＬ ４ ／ ３７０を与えた。
３７６ ｂｐのＧＡＰＤＨ，プロモーター配列ホランド
（Ｈｏ１ｌａｎｄ ）ほか、ジャーナル・オフ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｄ、 Ｃｈｅｍ、
）第２５４巻： ９８３９−９８４５頁（１９８５年）
、成熟Ｂ型肝炎表面抗原の全コード領域の配列およびｉ
２８ ｂｐの３′非非翻訳列バレン・ソエラ（Ｖａｌ
ｅｎｚｕｅｌａ ）ほか、Ｆｉｅｌｄｓ、 Ｊａｅｎｉ
ＳＣｈ オよびＦＯＸ編、動物ウィルス遺伝学（Ａｎｉ
ｍａｌ（Ｊｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） 、アカデ
ミツク・プレス。
（Ｈｏ１ｌａｎｄ ）ほか、ジャーナル・オフ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｄ、 Ｃｈｅｍ、
）第２５４巻： ９８３９−９８４５頁（１９８５年）
、成熟Ｂ型肝炎表面抗原の全コード領域の配列およびｉ
２８ ｂｐの３′非非翻訳列バレン・ソエラ（Ｖａｌ
ｅｎｚｕｅｌａ ）ほか、Ｆｉｅｌｄｓ、 Ｊａｅｎｉ
ＳＣｈ オよびＦＯＸ編、動物ウィルス遺伝学（Ａｎｉ
ｍａｌ（Ｊｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） 、アカデ
ミツク・プレス。
ニューヨーク、１９８０年中、とともに３５０ｂｐ Ａ
ＤＨ１ターミネータ（ｔａｒｍｉｎａｔｏｒ終結構造）
、ペンネンツエン（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ）ほか、ジャ
ーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー第２５７
巻： ３０１８−３０２５頁、 （１９８２年）を含む
−１，６ｋｂ発現カセットが３ａｌＩ断片として構築さ
れ、Ｉ）Ｃ１／ Ｉ ＧＡｌ、 ４ ／３７０の３ａｌ
ｒ部位中にクローン化された。該発現カセットケ、Ｇ
ＡＬ制御領域に対して望みの方向で有するプラスミドｐ
ＨＢＳＧＡＰ ８０ＧＡｒ、、３７０／２が得られた。
ＤＨ１ターミネータ（ｔａｒｍｉｎａｔｏｒ終結構造）
、ペンネンツエン（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ）ほか、ジャ
ーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー第２５７
巻： ３０１８−３０２５頁、 （１９８２年）を含む
−１，６ｋｂ発現カセットが３ａｌＩ断片として構築さ
れ、Ｉ）Ｃ１／ Ｉ ＧＡｌ、 ４ ／３７０の３ａｌ
ｒ部位中にクローン化された。該発現カセットケ、Ｇ
ＡＬ制御領域に対して望みの方向で有するプラスミドｐ
ＨＢＳＧＡＰ ８０ＧＡｒ、、３７０／２が得られた。
このプラスミドの制限地図は第１図に示す。
酵母菌株２１５０−２−３（Ｙ３７９−５−Ｄ ＣＹｈ
２ｎｉｂ ｌ （ｒｈｏ ）株、リビングストン（Ｉ、
ｉｖｉ−ｎｇｓｔｏｎ ） 、ジエネテイツクス（Ｑｅ
ｎｅｔ １ｃｓ）第８６巻ニア３頁（１９７７年）およ
び曳Ａｄｅｘ、 １ｅｕ２− Ｑ ４ （ｃｉｒ’ ）
であるＤＣＯ４。
２ｎｉｂ ｌ （ｒｈｏ ）株、リビングストン（Ｉ、
ｉｖｉ−ｎｇｓｔｏｎ ） 、ジエネテイツクス（Ｑｅ
ｎｅｔ １ｃｓ）第８６巻ニア３頁（１９７７年）およ
び曳Ａｄｅｘ、 １ｅｕ２− Ｑ ４ （ｃｉｒ’ ）
であるＤＣＯ４。
１３ｒｏａｃｈ、セル（（：ａｌｌ）第２１巻：５０１
頁（１９８０年）との間の遺伝的交配により得られ的に
ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ ）ほか、プロシーディンゲス
・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエン
ス、 ＵＳＡ第７５巻： １９１９−１９３３頁（１９
７８年）に従い ｐＨＢＳＧＡＰ８０ ＧＡＬ３７０／
２により形質転換され、形質転換酵母菌株ｐｓｉ与えた
。Ｌｅｕ 形質転換株が選択され、ロイシンを欠く合
成完全培地（ＳＣ−１ｅｕ）中に維持された。５Ｃ−１
ｅｕ培地は０．６７％アミノ酸のない酵母窒素基；１％
コハク酸；０．６％ＮａＯＨ： ２％グルコース： １
００ ｔｎ／ｒｎｌアデニン；各３０μｆ／ｍｌのウリ
ジン、チロシン、リジン；各２０μｌｉｌ／ ｍｌのト
リプトファン、ヒスチジン、アルギニンおよびメチオニ
ン；そして２００μｔ ／ ｍｌのスレニオンを含んだ
。
頁（１９８０年）との間の遺伝的交配により得られ的に
ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ ）ほか、プロシーディンゲス
・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエン
ス、 ＵＳＡ第７５巻： １９１９−１９３３頁（１９
７８年）に従い ｐＨＢＳＧＡＰ８０ ＧＡＬ３７０／
２により形質転換され、形質転換酵母菌株ｐｓｉ与えた
。Ｌｅｕ 形質転換株が選択され、ロイシンを欠く合
成完全培地（ＳＣ−１ｅｕ）中に維持された。５Ｃ−１
ｅｕ培地は０．６７％アミノ酸のない酵母窒素基；１％
コハク酸；０．６％ＮａＯＨ： ２％グルコース： １
００ ｔｎ／ｒｎｌアデニン；各３０μｆ／ｍｌのウリ
ジン、チロシン、リジン；各２０μｌｉｌ／ ｍｌのト
リプトファン、ヒスチジン、アルギニンおよびメチオニ
ン；そして２００μｔ ／ ｍｌのスレニオンを含んだ
。
実施例２
Ａ ロイシンおよびガラクトース欠乏寒天斜面に、１ｍ
ｌのガラクトースで誘導される際Ｋ ＨＢｓ Ａｇ遺伝
子を発現する菌株ｐ５の組み換え体サツ力ロマイセスセ
レビシニ再生凍結乾燥菌体が植えられた。２８℃で４日
後、該斜面は、５ｍｌの酵母抽出物−ペプトン−デキス
トロース（ＹＥＰＤ）培地中に再懸濁され、４６ゴの非
植菌ＹＥＰＤ培地を含む２５０ｒｎｌのフラスコが、４
ｍｌの該懸？蜀Ｍ、を植えられた。該フラスコは、２８
℃で振盪／培養機中で３５ Ｏｒｐｍ ７．５時間イン
キュベートされた。２５０ ｍｌフラスコの内容物は、
４５０ｍ１の非植菌ＹＥＰＤ培地を含む２リツトルフラ
スコに移され、インキュベーションが１９時間続けらｎ
た。
ｌのガラクトースで誘導される際Ｋ ＨＢｓ Ａｇ遺伝
子を発現する菌株ｐ５の組み換え体サツ力ロマイセスセ
レビシニ再生凍結乾燥菌体が植えられた。２８℃で４日
後、該斜面は、５ｍｌの酵母抽出物−ペプトン−デキス
トロース（ＹＥＰＤ）培地中に再懸濁され、４６ゴの非
植菌ＹＥＰＤ培地を含む２５０ｒｎｌのフラスコが、４
ｍｌの該懸？蜀Ｍ、を植えられた。該フラスコは、２８
℃で振盪／培養機中で３５ Ｏｒｐｍ ７．５時間イン
キュベートされた。２５０ ｍｌフラスコの内容物は、
４５０ｍ１の非植菌ＹＥＰＤ培地を含む２リツトルフラ
スコに移され、インキュベーションが１９時間続けらｎ
た。
この５００ｍ１ｃ７）酵母培養（６６００ｍの０、Ｄ、
７．５ ）は、５．ＯＬの非植菌ＹＥＰＤ培地ヲ含む
１６Ｌのニュー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎ
ｓｗｉｃｋ ）発醪機に加えられた。
７．５ ）は、５．ＯＬの非植菌ＹＥＰＤ培地ヲ含む
１６Ｌのニュー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎ
ｓｗｉｃｋ ）発醪機に加えられた。
発酵は２８℃で続けられ、初期には３００ｒＰｍで攪拌
され、３Ｌ／分の割合で通気された。発酵の間全通して
、溶存酸素は飽和の約１０％に、ｐ■は５．０に調整さ
れた。細胞の生育が増大し始めた後、発酵１８がら５２
時間に以下の割合でＹＥＰＤ培地が注入された： 時 間 割合（ｍｌ ７時） ２７−２９． ５ １３０２９．５−
５２ １８０５２時間で細胞密度は
最大で、細胞は対数増殖後期／定常初期にあった。
され、３Ｌ／分の割合で通気された。発酵の間全通して
、溶存酸素は飽和の約１０％に、ｐ■は５．０に調整さ
れた。細胞の生育が増大し始めた後、発酵１８がら５２
時間に以下の割合でＹＥＰＤ培地が注入された： 時 間 割合（ｍｌ ７時） ２７−２９． ５ １３０２９．５−
５２ １８０５２時間で細胞密度は
最大で、細胞は対数増殖後期／定常初期にあった。
Ｂ 約１．ＯＬの酵母培養が、５２時間目に除去された
。該細胞グロスの半分（５００ｍｌ）が、２Ｌフラスコ
中に移された；ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／Ｖ ）
に添加された。
。該細胞グロスの半分（５００ｍｌ）が、２Ｌフラスコ
中に移された；ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／Ｖ ）
に添加された。
該フラスコは２８℃で振盪／培養機中３５Ｏｒｐｍ２０
時間インキュベートされた。
時間インキュベートされた。
培養における細胞の生育は、６６０ｎｍでの０．Ｄ、測
定によりまた、乾燥重量の測定により測られた。該０．
Ｄ、は３６−！た乾燥重量は３４．２８／Ｌであった。
定によりまた、乾燥重量の測定により測られた。該０．
Ｄ、は３６−！た乾燥重量は３４．２８／Ｌであった。
該細胞は次いで４℃でガラス・ビーズによる剪断により
破壊された。該ＨＢｓＡｇ濃度はＡＵＳＴＲＬＡによｆ
：ｒ ０．０００１ｍ９／ Ｌ以下テ、ｆｂツｉ。
破壊された。該ＨＢｓＡｇ濃度はＡＵＳＴＲＬＡによｆ
：ｒ ０．０００１ｍ９／ Ｌ以下テ、ｆｂツｉ。
Ｃもう一つの５００ｍ１発酵培養は、１０，０００ｘｇ
２０分間遠心された。ペレット化した細胞は４００ｍ
１の燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ）中に再懸濁され、
混入した培地成分を除くために再び１０． ｏｏｏｘｇ
２０分間遠心された。ペレット化した細胞は再び４０
０ｍ１のＰＢＳ中に再懸濁され、１０． ｏｏｏｘｇ
２０分の３回目の遠心にかけられた。ペレット化した酵
母細胞は次いでｓｏｏｍ／の酵母抽出物−ペプトン中に
再懸濁さｎ１ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／ｖ）に添
加され、培養は２８℃で振盪／培養機中３５ Ｏｒｐｍ
２０時間インキュベートされた。
２０分間遠心された。ペレット化した細胞は４００ｍ
１の燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ）中に再懸濁され、
混入した培地成分を除くために再び１０． ｏｏｏｘｇ
２０分間遠心された。ペレット化した細胞は再び４０
０ｍ１のＰＢＳ中に再懸濁され、１０． ｏｏｏｘｇ
２０分の３回目の遠心にかけられた。ペレット化した酵
母細胞は次いでｓｏｏｍ／の酵母抽出物−ペプトン中に
再懸濁さｎ１ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／ｖ）に添
加され、培養は２８℃で振盪／培養機中３５ Ｏｒｐｍ
２０時間インキュベートされた。
培養における細胞の生育は、’ ６６０ ｎｍでのＯ，
Ｄ、測定により、また乾燥重量の測定により測られた。
Ｄ、測定により、また乾燥重量の測定により測られた。
該０． Ｄ、は・１４また乾燥重量は３５．１？／Ｌで
あった。該細胞は次いで４℃でガラス・ビーズによる剪
断により破壊された。該ＨＢ Ｓ Ａｇ濃度は、ＡＵＳ
ＴＲＩＡにより、０．１５■／Ｌであった。
あった。該細胞は次いで４℃でガラス・ビーズによる剪
断により破壊された。該ＨＢ Ｓ Ａｇ濃度は、ＡＵＳ
ＴＲＩＡにより、０．１５■／Ｌであった。
実施例３
菓ｍ’ｒｕ２−のＡ部の手順が繰返される。１リツトル
の酵母培養が次いで除去され、０．４５μフイルターを
用いることによりＥ過される。
の酵母培養が次いで除去され、０．４５μフイルターを
用いることによりＥ過される。
該酵母細胞は次いで１．０Ｌ＠母抽出物−ペプトン中に
再懸濁され、ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／Ｖ）に添
加される。該培養は次いで２８℃で振盪／培養機中３５
Ｏｒｐｍ ２０時間インキュベートされる。ＨＢ Ｓ
Ａｇは、ｔ＊イ列１のものと同様濃度に得られる。
再懸濁され、ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／Ｖ）に添
加される。該培養は次いで２８℃で振盪／培養機中３５
Ｏｒｐｍ ２０時間インキュベートされる。ＨＢ Ｓ
Ａｇは、ｔ＊イ列１のものと同様濃度に得られる。
実施例４
部笠ＪＩ列２のＡ部の手順が繰返される。１リツ酵母細
胞は次いで１．ＯＬ酵母抽出物・ペプトン中に再懸濁さ
れ、ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／ｖ）に添加される
。該培養は次いで２８℃で振盪／培養機中３５ Ｏｒｐ
ｍ ２０時間インキュベートされる。ＨＢＳＡｇは１ｆ
ｉｌイ！旧のものと同様濃度に得られる。
胞は次いで１．ＯＬ酵母抽出物・ペプトン中に再懸濁さ
れ、ガラクトースが終濃度２％（Ｗ／ｖ）に添加される
。該培養は次いで２８℃で振盪／培養機中３５ Ｏｒｐ
ｍ ２０時間インキュベートされる。ＨＢＳＡｇは１ｆ
ｉｌイ！旧のものと同様濃度に得られる。
第１図は、プラスミドｐｎ ＢＳＧＡＰ８０ ＧＡＬ３
７０／２の制限地図である。
７０／２の制限地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 実質的にガラクトースを含まない培地中で形質転換
酵母細胞を生育させ、異種蛋白 を生産させる目的で少なくともいくらかの 新鮮培地とガラクトースの存在下で該形質 転換酵母の培養を継続する前に、少なくと も使用済培地の一部を酵母細胞から取り除 くことからなる、ガラクトースにより誘導 された際に異種蛋白を発現する該形質転換 酵母細胞により生産される異種蛋白の収率 を増大させるための方法。 ２ 該使用消培地が、遠心により除去される特許請求の
範囲第１項による方法。 ３ 該使用済培地が、濾過により除去される特許請求の
範囲第１項による方法。 ４ 該使用済培地が、ジアフィルトレーションにより除
去される特許請求の範囲第１項による方法。 ５ 異種蛋白を生産させる目的で、新鮮培地とガラクト
ースの存在下で該形質転換酵母 の培養を継続する前に実質的に全ての該培 地が、該酵母細胞から除去される特許請求 の範囲第１項による方法。 ６ 該使用済培地が、遠心により除去される特許請求の
範囲第５項による方法。 ７ 該使用済培地が、限外濾過により除去される特許請
求の範囲第５項による方法。 ８ 該使用済培地が、ジアフィルトレーションにより除
去される特許請求の範囲第５項による方法。 ９ 該形質転換酵母が生育している培養液にガラクトー
スを添加することにより形質転換酵母中に異種蛋白の発
現を誘導するための 方法における、ガラクトース添加時以前ま たは、ほぼその時に、少なくともいくらか の生育培地を新鮮培地と交替することから なる改良法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76200085A | 1985-08-02 | 1985-08-02 | |
| US762000 | 1985-08-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232898A true JPS6232898A (ja) | 1987-02-12 |
| JP2677350B2 JP2677350B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=25063856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61178990A Expired - Lifetime JP2677350B2 (ja) | 1985-08-02 | 1986-07-31 | 発現蛋白の発酵収率増大 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0213029B1 (ja) |
| JP (1) | JP2677350B2 (ja) |
| DE (1) | DE3689020T2 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5247977A (en) * | 1975-10-14 | 1977-04-16 | Res Inst For Prod Dev | Semi-batch process of fermentation wherein feed rate of substrate or i ts solution is increased exponentially with time |
| JPS6058077A (ja) * | 1983-02-28 | 1985-04-04 | コラボラテイヴ・リサ−チ・インコ−ポレイテツド | Ｇａｌ１酵母菌プロモ−タ−の使用 |
| JPS61282097A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-12-12 | デルタ バイオテクノロジ− リミテツド | 発酵製品の分離法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0128743A3 (en) * | 1983-06-07 | 1985-12-27 | Genex Corporation | Expression of foreign genes in yeast |
-
1986
- 1986-07-31 EP EP19860401710 patent/EP0213029B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-31 DE DE19863689020 patent/DE3689020T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-31 JP JP61178990A patent/JP2677350B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5247977A (en) * | 1975-10-14 | 1977-04-16 | Res Inst For Prod Dev | Semi-batch process of fermentation wherein feed rate of substrate or i ts solution is increased exponentially with time |
| JPS6058077A (ja) * | 1983-02-28 | 1985-04-04 | コラボラテイヴ・リサ−チ・インコ−ポレイテツド | Ｇａｌ１酵母菌プロモ−タ−の使用 |
| JPS61282097A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-12-12 | デルタ バイオテクノロジ− リミテツド | 発酵製品の分離法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0213029A2 (en) | 1987-03-04 |
| DE3689020D1 (de) | 1993-10-21 |
| DE3689020T2 (de) | 1994-04-07 |
| EP0213029A3 (en) | 1988-07-13 |
| EP0213029B1 (en) | 1993-09-15 |
| JP2677350B2 (ja) | 1997-11-17 |
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