JPS6234760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明は、ヒトγ型インターフエロンの精製法
に関する。 背景技術 一般にインターフエロン（以下IFNと略記する
ことがある）は、生体の産生する抗ウイルス作用
をもつものとして定義されているが、この他に多
くの生物活性をもつことが証明されており、特に
抗腫瘍効果を有する点で注目されている〔ブラツ
ド、55、711（1980）；同誌、55、875（1980）〕。
腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細胞の増
殖を直接抑制する方法と、宿主の免疫反応を介し
て、間接的に腫瘍を抑制する方法が考えられ、後
者の場合、例えばナチユラルキラー細胞（NK）
や、マクロフアージの活性化、或いはキラーＴ細
胞の活性化などが考えられる。実際、IFNには直
接作用の他に、この様な種々の免疫増強活性があ
ることが証明されている〔バイオケミカ エト
バイオフイジカ アクタ、516、231（1978）〕。γ
型インターフエロン（以下IFN−γと略記するこ
とがある）は、免疫インターフエロン（以下Ｉ−
IFNと略記することがある）とも呼ばれ、インビ
トロでのこれら抗腫瘍につながる各種の活性、お
よびインビボに於ける抗腫瘍活性が、IFN−αや
IFN−βに比べ遥かに高いことから、その重要性
が強く指摘されている〔セルラーイムノロジー、
49、390（1980）〕。 然しながら、インビトロで誘導されるIFN−γ
の力価は一般に低いことや適切なIFN−γ産生株
細胞がほとんどないこと、さらに熱や酸に対する
安定性が悪いため精製がむつかしいことなどのた
めにIFN−γの大量生産および精製はIFN−αや
IFN−βに比べ大幅に遅れている。 ごく最近、天然のIFN−γが単一に出来たとい
う報告があるが〔プロシジング オブ ナシヨナ
ル アカデミー オブ サイエンス、79、1820
（1982）〕、活性の回収が大変悪く、より効果的な
精製法が待望されている。 一方最近に至り、ヒトIFN−γ遺伝子のクロー
ニングが報告され、少くともIFN−γの一種とし
て、146個のアミノ酸から成る約17キロダルトン
の分子種が、大腸菌で作られる様になつた〔ネー
チヤー、295、503（1982）；ヌクレイツク アシ
ツズ リサーチ、10、2487（1982）〕が、精製法
が確立されていないため、高純度の蛋白質として
得たとの報告はいまだなされていない。したがつ
て、IFN−γを実質的に純粋な蛋白質として得る
ことのできる精製法の確立が望まれていた。 発明の開示 本発明は、式 Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met −Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala −Ser−Gln−OH （） で表わされるポリペプチドに対する新規モノクロ
ーナル抗体を用いるヒトIFN−γ、とりわけ遺伝
子組み換え技術で得られるヒトIFN−γ（以下
rIFN−γと略記することがある）の精製法に関
する。 本発明者らは、構造遺伝子のヌクレオチド配列
から推定されたヒトIFN−γのアミノ酸配列に関
する報告〔ヌクレイツク アシツズ リサーチ
10、2487（1982）〕をもとに、そのアミノ酸配列
のＣ末端側の部分構造を有する新規ポリペプチド
（）を化学的に合成し、さらにキヤリヤー蛋白
と化学結合させ蛋白複合体とした。 ここで得られたポリペプチド（）または蛋白
複合体で哺乳動物を免疫し、取り出した脾臓細胞
と同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合
によりハイブリドーマとし、これをクローン化し
た。 ここで得られたハイブリドーマを哺乳動物に接
種し、モノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、こ
れを採取して前記のポリペプチドに対するモノク
ローナル抗体を製造した。 そして、ここで得られたモノクローナル抗体を
使用し、粗ヒトIFN−γ含有物からヒトIFN−γ
を精製する方法を確立し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、粗ヒトIFN−γ含有物を
ポリペプチド（）に対するモノクローナル抗体
を用いて精製することを特徴とするヒトIFN−γ
の精製法を提供するものである。 本発明の精製法によれば、粗ヒトrIFN−γ含
有物を新規ポリペプチド（）に対するモノクロ
ーナル抗体を用いて精製処理することによつて、
実質的に純粋なヒトrIFN−γ蛋白質を製造する
ことができる。 本発明の方法によりIFN−γを精製するにさい
しては、精製した上記モノクローナル抗体を例え
ば活性化したアガロースゲルビーズの様な適切な
担体に常法に従つてカプリングさせた後、カラム
に充め、培養上清或いは破さいした菌体等の粗
IFN−γを含む資料をカラムにかけ、吸着させた
後、洗浄し、その後例えばKSCNの様なカオトロ
ピツク試薬、或いはIFN−γの失活のない程度の
弱酸性条件で溶出させる方法等により、効率よく
精製できる。 抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを
接種した腹水等から純粋に精製した本発明のモノ
クローナル抗体を適切な担体とカプリングさせる
ことにより、以下の様な方法でできる。 用いる担体は、カプリングの後にIFN−γが特
異的に効率よく吸着され、その後適切な溶出が可
能なものであればどの様なものでもよいが、一例
として蛋白の一級アミンが結合し易い様に活性化
されたアガロースゲルビーズ、例えばアフイゲル
−10（バイオラド社製）などが以下に述べる様な
方法で好都合に用いられる。アフイゲル−10と抗
体との反応は、0.001〜1M、好ましくは0.1Mのバ
イカーボネート等の緩衝液中で反応を行なう。反
応条件は０゜〜20℃、10分〜24時間、種々のPHが
可能であるが、好ましくは、４℃、４時間、PH３
〜10の条件が用いられる。混合するアフイゲル−
10と抗体の量比は、アフイゲル１mlに対し抗体量
が約50mg位迄は多ければ多い程多くの抗体がつく
ので、この範囲内でいくらでもよいが、結合効率
およびアフイニテイカラムクロマトグラフイーに
おける精製効率を考慮して10〜30mgの抗体が好都
合に用いられる。この様にしてできた抗体−担体
結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗つた後、
数日放置するか、もしくは最終濃度0.05Mのエタ
ノールアミン・塩酸を加え４℃で１時間反応させ
る等の方法により、残存する未反応の活性基をブ
ロツクした後、適切なカラムにつめることによ
り、抗体カラムとして使用できる。 上記した抗体カラムで精製するに際しては、た
とえばヒトIFN−γ蛋白質含有資料を中性附近の
緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩
衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカ
ラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、IFN−γを溶
出する。溶出液としては、弱酸性溶液たとえば酢
酸溶液、ポリエチレングリコールを含む溶液、資
料にくらべ抗体に、より結合し易いペプチドを含
む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれらを組み合
せた溶液などが用いられ、ヒトIFN−γの分解を
あまり促進しないものが好ましい。 カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和す
る。必要により再度上記の抗体カラムによる精製
操作を行なうことができる。 ここで得られるヒトIFN−γ蛋白質溶液は透析
に付し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末と
することができる。凍結乾燥に際しては、ソルビ
トール、マンニトール、デキストロース、マルト
ース、グリセロールなどの安定剤を加えることが
できる。 本発明の方法によつて得られるヒトrIFN−γ
蛋白質はヒト羊膜由来WISH細胞に対する水泡性
口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止試
験によるウイルス活性測定において10⁷U／mg以
上の比活性を示すものである。 なおここでIFNの活性としてのＵ／ml（ユニツ
ト／ml）の出し方は以下の様に行つた。ユニツト
の確定した国際標準IFN−αと白血球由来の粗
IFN−γをヒト羊膜由来FL細胞株に対するVSV
の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、その力
価の比較から白血球由来粗IFN−γの力価を決定
しIFN−γの標準品とした。目的とする資料中の
IFN−γの力価算定のためには、常にこの標準
IFN−γを並べて前述のWISH−VSVの系でアツ
セイを行い、その比率から力価を算出した。 本発明で精製処理されるヒトrIFN−γ蛋白質
は、たとえば一般式 （Ｎ）Ｈ−Ａ−Z₁ Tyr Z₂ Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln−OH(C) （） 〔式中、ＡはMetまたは結合手を示し、Z₁、Z₂は
それぞれCysまたは1/2Cysを示す〕のアミノ酸
配列からなるポリペプチドを含有するものであ
る。本発明の精製処理によれば当該ポリペプチド
を乾燥品基準で90％以上とりわけ95％以上含有す
るものを得ることができる。 本発明の精製法により例えば以下に示す実質的
に純粋なヒトrIFN−γ蛋白質を得ることができ
る。 (1) SDS−ポリアクリルアミドゲル（17.5％）電
気泳動による分子量測定で17000±1000を示
す。 (2) アミノ末端アミノ酸としてシステインもしく
はハーフシスチンまたはメチオニンを有する。 (3) Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met
−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−
Ser−Gln−OHに対するモノクローナル抗体と
結合する。 本発明により精製されたヒトIFN−γ蛋白質は
従来の方法で得られるIFN−γと同様の目的に同
様の用法により使用できるが、従来品に比し、夾
雑蛋白質、発熱物質が少ないので、注射剤原体等
としてより安全に使用される。 本発明により製造されるヒトIFN−γ蛋白質は
抗ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増
強作用を示す。本発明により製造されるヒトIFN
−γ蛋白質は滅菌水、ヒト血清アルブミン
（HSA）、生理食塩水その他公知の生理学的に許
容される担体と混合することができ、非経口的に
又は局所に投与することができる。例えば、成人
１日当り10万〜１億ユニツト、好ましくは5000万
〜6000万ユニツトを静注又は筋注などにより投与
することができる。 本発明のヒトIFN−γ蛋白質を含有する製剤
は、塩、希釈剤、アジユバンド、他の担体、バツ
フアー、結合剤、界面活性剤、保存剤のような生
理的に許容される他の活性成分も含有していても
よい。非経口的投与用製剤は、滅菌水溶液又は生
理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプル、ま
たは生理学的に許容される希釈液で用事希釈して
使用しうる滅菌粉末（通常IFN−γ溶液を凍結乾
燥して得られる）アンプルとして提供される。 さらに上記したヒトIFN−γ蛋白質を含有する
製剤は、IFN−αまたはIFN−βまたはインター
ロイキン２などのリンホカインのような他の活性
成分を本発明物質に対し１〜99％を含有していて
もよい。 前記した新規ポリペプチド（）に対するモノ
クローナル抗体は、例えばポリペプチド（）ま
たはその蛋白複合体で哺乳動物を免疫し、取り出
した脾臓細胞を細胞融合によりハイブリドーマと
し、これをクローン化した後、哺乳動物に接種
し、モノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、該モ
ノクローナル抗体を採取することにより製造する
ことができる。 当該ポリペプチド（）は、ペプチド合成の常
套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法の
いずれによつてもよいが、液相合成法が有利な場
合が多い。このようなペプチドの合成の手段は、
たとえば、“ザ ペプタイズ”第１巻（1966）、シ
ユレダーとルブケ著、アカデミツク プレス、ニ
ユーヨーク、U.S.A.あるいは“ペプチド合成”、
泉屋ら著、丸善株式会社（1975）、あるいは“生
化学実験講座、第１巻、207頁−400頁”矢島治明
著、東京化学同人株式会社（1977年）に記載され
ており、たとえば、アジド法、クロライド法、酸
無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エス
テル法、ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、カル
ボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC／アデ
イテイブ（例、HONB、HOBt、HOSu）法など
があげられる。 ポリペプチド（）は、いずれも保護されてい
てもよい、(a)ポリペプチドの一部に相当する反応
性カルボキシル基を有する原料と、(b)ポリペプチ
ド（）の残部に相当する反応性アミノ基を有す
る原料をペプチド合成の常套手段で縮合させ、生
成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基
を常套手段で脱離させることにより製造しうる。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護お
よび保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に
関与する官能基の活性化などもまた公知のものあ
るいは手段から適宜選択しうる。 原料のアミノ基の保護基としては、たとえばカ
ルボベンゾキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル、
ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキ
シカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニ
ル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオ
ロアセチル、フタリル、ホルミン、ｏ−ニトロフ
エニルスルフエニル、ジフエニルホスフイノチオ
イル、４−メトキシ−２・３・６−トリメチルベ
ンゼンスルホニルなどがあげられる。カルボキシ
ル基の保護基としては、たとえばアルキルエステ
ル（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ
−ブチルなどのエステル基）、ベンジルエステル
基、ｐ−ニトロベンジルエステル基、ｐ−メトキ
シベンジルエステル基、ｐ−クロルベンジルエス
テル基、ベンズヒドリルエステル基、カルボベン
ゾキシヒドラジド基、ｔ−ブチルオキシカルボニ
ルヒドラジド基、トリチルヒドラジド基などがあ
げられる。 アルギニンのグアニジノ基の保護基としては、
たとえばニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベン
ゼンスルホニル基、カルボベンゾキシ、イソボル
ニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカル
ボニル、４−メトキシ−２・６−ジメチルベンゼ
ンスルホニル基、ペンタメチルベンゼンスルホニ
ル基等が例示される。また、そのグアニジノ基
は、酸（例、ベンゼンスルホン酸、トルエンスル
ホン酸、塩酸、硫酸など）塩の形で保護してもよ
い。 スレオニンおよびセリンの水酸基は、たとえば
エステル化またはエーテル化によつて保護するこ
とができる。このエステル化に適する基としては
たとえばアセチル基などの低級アルカノイル基、
ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシ
カルボニル基、エチルオキシカルボニル基などの
炭酸から誘導される基などがあげられる。またエ
ーテル化に適する基としては、たとえばベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基など
である。しかしながらスレオニンの水酸基は必ず
しも保護する必要はない。メチオニンはスルホキ
サイドの形で保護しておいてもよい。原料のカル
ボキシル基の活性化されたものとしては、たとえ
ば対応する酸無水物、アジド、活性エステル（ベ
ンタクロロフエノール、ｐ−ニトロフエノール、
Ｎ−ハイドロキシサクシンイミド、Ｎ−ハイドロ
キシベンズトリアゾール、Ｎ−ハイドロキシ−５
−ノルボルネン−２・３−ジカルボキシイミドな
どとのエステル）などがあげられる。ペプチド結
合形成反応は脱水剤（例、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド、カルボジイミダゾール等のカルボジ
イミド試薬）の存在下に実施しうる場合がある。 本ペプチド縮合反応は溶媒の存在下に行うこと
ができる。溶媒としては、ペプチド縮合反応に使
用しうることが知られているものから適宜選択さ
れうる。たとえば無水または含水のジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキサイド、ピリジン、
クロロホルム、ジオキサン、ジクロルメタン、テ
トラハイドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピ
ロリドンあるいはこれらの適宜の混合物などがあ
げられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用されう
ることが知られている範囲から適宜選択され、通
常約−40℃−約60℃、好ましくは約−20℃−約０
℃の範囲から適宜選択される。 本縮合反応終了後、生成物が保護基を有してい
る場合、それは常法により離脱できる。かかる常
法としては、たとえば還元的方法（例、パラジウ
ム黒等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア
中金属ナトリウムによる還元）、アシドリシス
（例、トリフルオロ酢酸、フツ化水素、メタンス
ルホン酸あるいは、チオアニソール等の含硫化合
物の存在下、上記の酸あるいは、その混合物によ
るアシドリシス）などがあげられる。 上記のようにして製造されたペプチド（）
は、反応終了後混合物から、通常のペプチドの分
離手段、抽出、分配、カラムクロマトグラフイー
などにより採取できる。 哺乳動物を免疫するために用いられるポリペプ
チド（）とキヤリヤー蛋白との蛋白複合体に関
し、キヤリヤー蛋白の種類およびキヤリヤーとハ
プテン（この場合ペプチド）との混合比は、キヤ
リヤーにカプリングさせて免疫したハプテンに対
して抗体が効率よく出来れば、どの様なものをど
の様な比率でカプリングさせてもよいが、例えば
牛血清アルブミンや牛サイログロブリン等を重量
比でハプテン１に対し0.1〜20、好ましくは１〜
５の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、ハプテンとキヤリヤーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることが出来るが、グル
タルアルデヒドやカルボジイミド等が好都合に用
いられる。 ポリペプチド（）または蛋白複合体を用いて
免疫するに際し、免疫する哺乳動物は、羊、山
羊、兎、モルモツト、ラツト、マウス等の実験動
物が使われるが、モノクローナル抗体を得るため
には、ラツト、マウスが好ましい。免疫方法は、
例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔内、静
脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に
（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。また、
免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種々の方法
法が可能であるが、例えば２週間隔で２〜６回免
疫し、最終免疫後、１〜５日、好ましくは２〜４
日後の脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。
免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り
0.1μｇ以上、好ましくは10μｇ〜300μｇ用いる
ことが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分
採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上
で、脾臓細胞を用いる融合実験を行うことが望ま
しい。 上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合
は、例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキ
サンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
エラーゼ欠損（HGPRT^-）や、チミジンキナーゼ
欠損（TK^-）の様なマーカーを持つた適切な同種
または異種（好ましくは同種）のミエローマ等
の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。融合
には、センダイウイルス、ポリエチレングリコー
ル（PEG）等の融合剤が用いられる。もちろん
ジメチルスルホキシド（DMSO）その他の融合促
進剤を加えることも加能である。PEGの重合度
は、ふつう1000〜6000、時間は0.5〜30分、濃度
は10％〜80％等が用いられるが、好ましい条件の
一例として、PEG6000を35〜55％で４〜10分処
理することにより、効率よく融合させることが出
来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン培地〔HAT培地；ネイチヤー、
256、495（1975）〕等を用いて、選択的に増殖さ
せることが出来る。 増殖して来た細胞の倍養上清は、目的とする抗
体産生があるか否かについてスクリーニングを行
うことができるが、抗体価のスクリーニングは次
の様に行うことが出来る。即ち、この場合には、
まず第１段階として免疫したペプチドに対する抗
体産生の有無を、RIA法またはEIA法等の方法で
調べることが出来るが、これらの方法についても
種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例
として、EIAを用いる一つの方法について述べ
る。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ
抗マウスイムノグロブリン抗体を常法に従つてカ
プリングさせておき、これに測定したい培養上清
や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（以下
４〜40℃を示す）で反応させる。この後、反応物
をよく洗つた後、酵素で標識したペプチド（酵素
とペプチドを常法に従いカプリングさせた後精
製）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応
物をよく洗つた後、酵素基質を加え、一定時間、
定温で反応させ、その後、生成発色物を吸光度ま
たは螢光度等で測定することが出来る。 選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプ
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞
は、限界稀釈法等によりクローニングを行うこと
が望ましい。クローン化された細胞の上清につい
て同様にスクリーニングを行い抗体価の高いウエ
ルの細胞を増やすことにより、免疫したペプチド
と反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマクローンが得られる。 次にこれらクローンの産生する抗体が免疫に用
いたペプチドだけでなく、IFN−γ分子そのもの
と反応性を示すか否かを調べる必要があるが、こ
のためには、標識されたIFN−γを用いたRIA法
またはEIA法を用いて反応性を調べる方法や、生
物活性（IFN−γ活性）がこの抗体により吸収さ
れるか否かを見る方法等が用いられる。後者の場
合はIFN−γを精製する必要がないので有利に用
いることが出来る。有利に用いられる一例を次に
述べるが、もちろんこの他にもプロテインＡを用
いて免疫沈降物を除いた上清中の残存IFN−γ活
性を測定する方法等も可能である。例えばウサギ
抗マウスイムノグロブリン抗体をセルロースビー
ズ等の担体に常法に従いカプリングさせておき、
これに測定したいハイブリドーマ上清またはマウ
スの血清を加え、一定時間、定温で反応させる。
この後反応物をよく洗い一定量のIFN−γを加え
る。IFN−γとして例えばヒト末梢血リンパ球か
らレクチンとホルボールエステル等で誘導した
IFN−γを含む培養上清や、組み換え体で大腸菌
等で作らせたIFN−γを含む抽出液等を用いるこ
とが出来る。IFN−γを加えた後、一定時間、定
温で反応させた後、反応上清中に含まれるIFN−
γの活性を測定する。この様にして目的とする抗
体のIFN−γ活性の吸収能を測定することが出来
る。 このようにしてクローン化されたハイブリドー
マは、液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖
させる。具体的には例えば、液体培地たとえば
RPMI−1640に0.1〜40％の牛血清を加えた培地等
で２〜10日間、好ましくは３〜５日間培養するこ
とにより、培養液から該モノクローナル抗体を得
ることができるが、この他にマウス等の適切な哺
乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水
を採取することにより、細胞培養上清よりも遥か
に高力価の抗体を、多量に効率よく取得すること
が出来る。このためには、例えばマウスの場合、
ミネラルオイル等を前もつて接種したBALB／ｃ
等のマウスに１×10⁴〜１×10⁷個、好ましくは５
×10⁵〜２×10⁶個のハイブリドーマを腹腔内等に
接種し、７〜20日後、好ましくは10〜14日後に腹
水液等を採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、
例えば硫安分画、DEAE−セルロースカラムクロ
マト等により、容易にモノクローナル抗体を純粋
な免疫グロブリンとして単離することが出来る。 上記モノクローナル抗体は、下記の性状を有す
る。 (1) 免疫に用いたポリペプチド（）と結合す
る。 (2) IFN−γ分子と結合し、IFN−αやIFN−β
とは結合しない。 (3) オクタロニー法による検定によりIgG2bまた
はIgG1のサブクラスの抗体に属する。 (4) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて、標準免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖に
完全に一致する２本のバンドのみを示す。 なお本モノクローナル抗体は安全に製造、使
用、保管することができる。また本発明のヒト
rIFN−γ精製のための抗体カラム製造に有利に
使用できる。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB（Commission on
Biological Nomenclature）による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し
光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 DNA：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン RNA：リボ核酸 dATP：デオキシアデノシン三リン酸 dTTP：デオキシチミジン三リン酸 dGTP：デオキシグアノシン三リン酸 dCTP：デオキシシチジン三リン酸 ATP：アデノシン三リン酸 EDTA：エチレンジアミン四酢酸 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム Gly：グリシン Ala：アラニン Val：バリン Leu：ロイシン Ile：イソロイシン Ser：セリン Thr：スレオニン Cys：システイン Met：メチオニン Glu：グルタミン酸 Asp：アスパラギン酸 Lys：リジン Arg：アルギニン His：ヒスチジン Phe：フエニールアラニン Tyr：チロシン Trp：トリプトフアン Pro：プロリン、 Asn：アスパラギン Gln：グルタミン Ｚ：カルボベンゾキシ Boc：ｔ−ブトキシカルボニル Mtr：４−メトキシ−２・３・６−トリメチルベ
ンゼンスルホニル Pme：ペンタメチルベンゼンスルホニル OBu：ｔ−ブチルエステル ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２・３−ジカルボキシイミドエステル DCC：Ｎ・N′−ジシクロヘキシカルボジイミド DCU：Ｎ・N′−ジシクロヘキシルウレア HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２・３−ジカルボキシイミド HOBt：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール CHA：シクロヘキシルアミン DCHA：ジシクロヘキシルアミン TEA：トリエチルアミン TFA：トリフルオロ酢酸 MSA：メタンスルホン酸 THF：テトラヒドロフラン DMF：ジメチルホルムアミド MeOH：メタノール AcOEt：酢酸エチル 以下、実施例および参考例により本発明をより
具体的に説明するが、本発明はこれらに制限され
るものではない。 なお、下記参考例２および３に開示しているマ
ウスＢハイブリドーマγ２−11.1およびマウスＢ
ハイブリドーマγ３−11.1は、パスツール研究所
〔フランス国パリ〕のC.N.C.M.にそれぞれ寄託番
号No.I−242およびNo.I−243として寄託されてい
る。 また、下記参考例３(2)−(iv)に開示している菌株
E.coli 294／PHITtrp2101は、通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（FRI）に受託番号
FERM Ｐ−7550として寄託されている。 実施例 rIFN−γの精製 Ａ 抗体カラムの製造 参考例1B(6)記載の方法で精製された素通り
分画のモノクローナル抗体（γ２−11.1モノク
ローナル抗体）25ml（65.3mg）を0.1M NaH
CO₃、PH8.3溶液に対して一晩透析を行つた。
一方、アフイゲル−10（バイオ・ラド社）25ml
をグラスフイルターを用いて充分水洗を行つた
後、0.1M NaHCO₃PH8.3溶液に浮遊させ前記抗
体とを混合し、４℃で４時間、ゆつくり撹拌し
ながら反応させた。その後、４℃で一晩放置し
た後、グラスフイルターを用いて0.1M
NaHCO₃PH8.3溶液でよく洗浄した。反応させ
たゲルに0.1Mエタノールアミン、0.15M NaCl
を含む溶液（PH8.0）を25ml加え、４℃、１時
間振とうし、残存するかも知れない未反応の活
性基をブロツクした。その後ゲルをPBSでよく
洗浄し、0.1％NaN₃を含むPBS25mlに懸濁し、
４℃で保存した。加えた抗体量と回収された
液中の抗体量から、ゲル１ml当り2.35mgの抗体
が結合していることが判明した。この様にして
得た反応物をカラムに充め、抗体カラムとして
使用した。 Ｂ 抗体カラムを用いるrIFN−γの精製 参考例２(4)で得た粗rIFN−γ含有上清60ml
を１ｍ MEDTA、0.15M NaClを含む20ｍＭ
Tris・HCl、PH7.6（TEN）で150mlに希釈し
たのち、上記Ａの方法で調製した抗IFN−γ抗
体カラム（９ml）にかけた。TENで十分洗浄
したのち、さらに0.01％ノニデツトＰ−40（シ
エル社製）0.5M NaClを含むTENで洗浄し
た。次に0.25M NaClを含む0.1M酢酸でIFN−
γを溶出し、溶出液はただちに1MトリスHCl
PH7.6で中和した。得られた溶液を蒸留水に
対し４℃、16時間透析し、これをアセトン−ド
ライアイスで凍結後凍結乾燥に付し粉末とし
た。 結果は以下の通りであつた。

【表】 ム処理
ここで得られた最終のヒトrIFN−γ蛋白質の
比活性（WISH細胞に対するVSVの細胞変性効果
阻止試験によるウイルス活性測定による（前
出））は7.5×10⁷U／mgであつた。この蛋白質の性
状は下記のとおりであつた。 ヒトrIFN−γ蛋白質の性状 (i) 分子量 上記Ｂで得られた蛋白質を２−メルカプトエ
タノールで処理してSDS−ポリアクリルアミド
ゲル（17.5％）電気泳動（15ｍＡ、６時間）に
かけ、クマジーブルーで染色したところ、蛋白
質は単一のバンドとして確認できた（第１
図）。なお同時に泳動させた分子量マーカーの
泳動距離と蛋白質の泳動距離との関係から蛋白
質の分子量は17000±1000と推定された（第２
図）。一方、２−メルカプトエタノールで処理
しなかつた蛋白質は分子量33000±2000の位置
にもう一本のバンドが検出された。この値は
IFN−γの分子量17000±1000の約２倍に相当
することから、このバンドはIFN−γの二量体
に由来すると考えられる。 (ii) アミノ酸分析 上記Ｂで得られた蛋白質をガラス製加水分解
用試験管にとり、200倍量（Ｖ／Ｗ）の４％チ
オグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて、減
圧下に封管したのち、110℃で24、48、72時間
加水分解した。加水分解後、開管し、塩酸を減
圧下で除去し、残渣を0.02N塩酸に溶解して日
立製835型高速アミノ酸分析計によりアミノ酸
分析を実施した。 シスチンおよびシステインは、ハースの方法
〔メソツズ オブ エンチモロジー 11、197
（1967）〕に従い、上記蛋白質を過ギ酸酸化した
のち、上記と同様に24時間加水分解して、アミ
ノ酸分析計によりシステイン酸として定量し
た。アミノ酸分析値は、24、48および72時間の
加水分解で得られた値を平均して求めた。但
し、セリン、スレオニン、チロシンおよびトリ
プトフアンの値は加水分解時間を０時間に外挿
して求めた。その結果を第１表に示す。

【表】

【表】 (iii) アミノ末端アミノ酸分析 上記Ｂで得られた蛋白質をハースの方法〔メ
ソツズ オブ エンチモロジー 11、197
（1967）〕に従つて過ギ酸酸化したのち、エドマ
ン分解法の岩永らによる変法〔ヨーロピアン
ジヤーナル オブ バイオケミストリー、８、
189（1969）〕によりそのアミノ末端アミノ酸分
析を実施した。生成したフエニルチオヒダント
イン−アミノ酸（PTH−アミノ酸）はウルト
ラスフエアーODSカラム〔アルテツクス社製
（U.S.A.）、4.6×250mm、粒子径５μｍ〕を用
い、アルチヤーの方法〔アルテツクス クロマ
トグラム、３、８（1980）〕により、バリアン
製高速液体クロマトグラフ5040型（U.S.A.）
で同定、定量した。その結果、PTH−メチオ
ニンスルホンおよびPTH−システイン酸が検
出された。 上記実施例より明らかなように本発明の精製法
によれば、7.5×10⁷U／mg以上の比活性を有する
実質的に純粋なヒトγ型インターフエロン蛋白質
を製造することができる。 参考例 １ モノクローナル抗体の製造 Ａ 免疫原の製造および免疫 以下の参考例1A(1)において、薄層クロマト
グラフイーは、メルク社製シリカゲルプレート
60F₂₅₄又は、フナコシ薬品社製セルロースプレ
ート、アビセルSFを用い、下記の展開溶媒を
用いた。 Rf¹：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf²：酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝30：
10：３：５ Rf³：クロロホルム：メタノール：水＝７：
３：0.5 Rf⁴：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 Rf⁵：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水
＝１：１：１：１ (1) ポリペプチド（）の製造 (i) Ｚ−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Gln−OBu^t10.1ｇをメタノール500
mlに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素気
流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留
去した残留物をＺ−Ser−OH7.5ｇ、
HONB6.8ｇとともにDMF250mlに溶解
し、氷冷した。氷冷下にDCC7.15ｇを加
え、０℃で４時間室温で12時間撹拌した。
析出したDCUをろ去し、溶媒を留去のの
ち残留物をAcOEt300mlに抽出し、４％
NaHCO₃水、0.2N塩酸、水で洗い、無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、
析出した結晶をエーテルでろ取し、乾燥の
のちCH₃CNより再結晶した。収量6.5ｇ、
収率51.2％、mp.97−100℃、〔α〕^２５ _Ｄ−24.1
゜（ｃ＝0.40、メタノール）、Rf¹0.64 元素分析 C₂₀H₂₉O₇N₃として 計算値： Ｃ、56.72；Ｈ、6.90；Ｎ、9.92 実験値： Ｃ、56.21；Ｈ、6.72；Ｎ、9.76 (ii) Ｚ−Ala−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Ser−Gln−OBu^t4.23ｇをメタノー
ル300mlに溶解し、パラジウム黒を触媒に
水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶
媒を留去した残留物をＺ−Ala−OH2.34
ｇ、HONB2.27ｇとともに、AcOEt200ml
とジオキサン200ml、DMF100mlの混合溶
媒に溶解し、氷冷した。冷却下にDCC2.38
ｇを加えて０℃で４時間、室温で12時間撹
拌ののち、DCUをろ去し、溶媒を留去し
た。残留物にCH₃CNとエーテルを加え結
晶としろ取、乾燥ののちCH₃CNより再結
晶した。収量3.72ｇ、収率75.3％、mp.165
−170℃、〔α〕^２５ _Ｄ−41.2゜（ｃ＝0.50、メタ
ノール）、Rf¹0.60 元素分析 C₂₃H₃₄O₈N₄として 計算値：
Ｃ、55.86；Ｈ、6.93；Ｎ、11.33 実験値：
Ｃ、55.58；Ｈ、6.74；Ｎ、11.12 (iii) Ｚ−Arg（Pme）−Ala−Ser−Gln−
OBu^tの製造 Ｚ−Ala−Ser−Gln−OBu^t3.46ｇをメタ
ノール300mlに溶解し、パラジウム黒を触
媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去
し、溶媒を留去した残留物を、Ｚ−Arg
（Pme）−OH・CHA4.54ｇから調製したＺ
−Ａ−ｇ（Pme）−OH、HOBt1.9ｇととも
にDMF150mlに溶解し氷冷した。冷氷下に
DCC1.9ｇを加え、０℃で４時間、室温で
15時間撹拌した。DCUをろ去し、溶媒を
留去し残留物にAcOEtを加えゲル状の沈
澱を得、ろ取した。乾燥後、メタノールと
AcOEtより再沈澱した。収量4.55ｇ、収率
75.5％、mp.130−134℃、〔α〕^２５ _Ｄ−24.1゜
（ｃ＝0.26、メタノール）、Rf¹0.57 元素分析 C₄₀H₆₀O₁₁N₈S・１／２H₂Oとして 計算値：Ｃ、55.22；Ｈ、7.07；
Ｎ、12.88；Ｓ、3.69 実験値：Ｃ、55.23；Ｈ、6.93；
Ｎ、12.54；Ｓ、3.48 (iv) Ｚ−Arg（Pme）−Arg（Pme）−Ala−
Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Ala−Ser−Gln−
OBu^t4.3ｇをメタノール400mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元し
た。触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物
を、Ｚ−Arg（Pme）−OH・CHA3.24ｇよ
り調製したＺ−Arg（Pme）−OH、
HOBt1.42ｇとともにDMF200mlに溶解し
氷冷した。冷却下にDCC1.41ｇを加え０℃
で４時間、室温で20時間撹拌した。DCU
をろ去し、溶媒を留去した残留物に
AcOEtを加え沈澱を得、ろ取した。乾燥
後、メタノールとAcOEtより、再沈澱し
た。収量4.4ｇ、収率71.7％、mp.125−130
℃、〔α〕^２５ _Ｄ−18.0゜（ｃ＝0.40、メタノー
ル）、Rf¹0.63 元素分析 C₅₇H₈₆O₁₄N₁₂S₂・H₂Oとして 計算値：Ｃ、54.96；Ｈ、7.12；
Ｎ、13.50；Ｓ、5.15 実験値：Ｃ、54.66；Ｈ、6.92；
Ｎ、13.32；Ｓ、5.34 (v) Ｚ−Arg（Pme）−Gly−OBu^tの製造 Ｚ−Gly−OBu^t13.0ｇをMeOH500mlに
とかし、Pd黒を触媒として、水素気流
中、接触還元した。触媒を別し、液を
減圧濃縮し、残留物をDMF200mlにとかし
た。これに、Ｚ−Arg（Pme）−OH・
CHA20.0ｇより調製したＺ−Arg（Pme）
−OH、HOBt5.4ｇを加えて氷冷し、
DCC8.2ｇを加えて48時間かき混ぜた。析
出したDCUを別し、濃縮後、AcOEt500
mlにとかした。AcOEt層を４％NaHCO₃
水、10％クエン酸水で洗浄後、Na₂SO₄で
乾燥した。濃縮後、石油ベンジンを加えて
沈澱として取した。収量19.8ｇ（96.8
％）。mp.71−73℃、〔α〕^２３ _Ｄ＋0.2゜（ｃ＝
0.9、DMF）、Rf¹0.62 元素分析 C₃₁H₄₅O₇N₅Sとして 計算値：Ｃ、58.93；Ｈ、7.18；
N.11.09；Ｓ、5.08 実験値：Ｃ、59.42；Ｈ、7.58；
Ｎ、10.95；Ｓ、4.84 (vi) Ｚ−Phe−Arg（Pme）−Gly−OBu^tの製
造 Ｚ−Arg（Pme）−Gly−OBu^t10.0ｇを
MeOH500ml中、接触還元したのち、
DMF300mlに転溶した。これにＺ−Phe−
OH4.72ｇ、HOBt2.35ｇを加えて氷冷し、
DCC3.59ｇを加えて、15時間かきまぜた。
析出したDCUを別し、液を濃縮後、
残留物をAcOEt400mlにとかした。AcOEt
層は、４％NaHCO₃水、10％クエン酸水で
洗浄し、Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後、エ
ーテルを加えて結晶として取し、MeOH
−エーテルより再結晶した。収量10.5ｇ
（85.3％）。mp.101−103℃、〔α〕^２６ _Ｄ−8.3゜
（ｃ＝0.9、DMF）、Rf¹0.64 元素分析 C₄₀H₅₄O₈N₆Sとして 計算値：Ｃ、61.67；Ｈ、6.99；
Ｎ、10.79；Ｓ、4.12 実験値：Ｃ、61.66；Ｈ、6.56；
Ｎ、10.93；Ｓ、4.14 (vii) Ｚ−Leu−Phe−Arg（Pme）−Gly−
OBu^tの製造 Ｚ−Phe−Arg（Pme）−Gly−OBu^t5.5
ｇをMeOH300ml中、接触還元したのち、
DMF300mlに転溶した。これに、Ｚ−Leu
−OH DCHA3.31ｇより調製したＺ−Leu
−OH、HONB1.47ｇを加えて氷冷し、
DCC1.68ｇを加えて48時間かきまぜた。析
出したDCUを別し、濃縮後、AcOEt300
mlにとかした。AcOEt層は、４％NaHCO₃
水、10％クエン酸水で洗浄し、Na₂SO₄で
乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて粉末
として取した。収量6.2ｇ（98.3％）
mp.171−173℃、〔α〕^２６ _Ｄ−15.5゜（ｃ＝
0.9、DMF）、Rf¹0.64 元素分析 C₄₆H₆₅O₉N₇S 計算値：Ｃ、61.93；Ｈ、7.34；
Ｎ、10.99；Ｓ、3.59 実験値：Ｃ、62.02；Ｈ、7.37；
Ｎ、11.08；Ｓ、3.59 (viii) Boc−Met−Leu−Phe−Arg（Pme）−
Gly−OBu^tの製造 Ｚ−Leu−Phe−Arg（Pme）−Gly−
OBu^t6.0ｇをMeOH200ml中、接触還元した
のち、DMF150mlに転溶した。これに、
Boc−Met−OH・DCHA3.0ｇより調製し
たBoc−Met−OH、HONB1.39ｇを加えて
氷冷し、DCC1.59ｇを加えて15時間かきま
ぜた。析出したDCUを取し、濃縮後、
ｎ−BuOH−AcOEtにとかし、10％クエン
酸水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥した。濃縮
後、エーテルを加えて結晶として取し
た。収量6.2ｇ（93.1％）。mp.192−195
℃、〔α〕^２６ _Ｄ−19.7゜（ｃ＝1.0、DMF）、
Rf¹0.64 元素分析 C₄₈H₇₆O₁₀N₈S₂として 計算値：Ｃ、58.27；Ｈ、7.74；
Ｎ、11.33；Ｓ、6.48 実験値：Ｃ、58.48；Ｈ、7.79；
Ｎ、11.34；Ｓ、5.98 (ix) Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg
（Pme）−Gly−OHの製造 Boc−Met−Leu−Phe−Arg（Pme）−
Gly−OBu^t5.5ｇにTFA50mlを加え、室温
で10分間振りまぜたのち濃縮し、エーテル
を加えて取し乾燥した。これを、
DMF50mlにとかして氷冷し、TEA1.8mlを
加えた。これにBoc−Gln−OH1.85ｇ、
HONB1.49ｇ、DCC1.90ｇより調製した
Boc−Gln−ONBを加え、15時間かきまぜ
た。濃縮後、AcOHを加え、AcOEtを加え
て沈澱として取した。収量5.3ｇ（89.8
％）。mp.181−183℃（分解）、〔α〕^２６ _Ｄ−
19.6゜（ｃ＝1.0、DMF）、Rf¹0.30 元素分析 C₄₉H₇₆O₁₂N₁₀S₂として 計算値：Ｃ、55.45；Ｈ、7.22；
Ｎ、13.20；Ｓ、6.04 実験値：Ｃ、55.39；Ｈ、7.17；
Ｎ、13.34；Ｓ、6.20 (x) Ｚ−Ser−NHNH−Bocの製造 Ｚ−Ser−OH10.0ｇ、ｔ−ブチルカルバ
ゼート6.2ｇをDMF150mlにとかして氷冷
し、HONB8.0ｇ、DCC9.3ｇを加えて15時
間かきまぜた。析出したDCUを取し、
濃縮後、AcOEtに転溶した。AcOEt層
は、４％NaHCO₃水、10％クエン酸水で洗
浄し、Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後、エー
テルを加えて結晶として取した。収量
7.3ｇ（50.4％）。mp.95−98℃、〔α〕^２６ _Ｄ−
6.2゜（ｃ＝0.8、DMF）、Rf¹0.62 元素分析 C₁₆H₂₃O₆N₃として 計算値：
Ｃ、54.38；Ｈ、6.56；Ｎ、11.89 実験値：
Ｃ、54.77；Ｈ、6.88；Ｎ、12.29 () Ｚ−Arg（Pme）−Ser−NHNH−
Bocの製造 Ｚ−Ser−NHNH−Boc3.9ｇをMeOH300
ml中接触還元したのち、DMF50mlに転溶
した。これに、Ｚ−Arg（Pme）−OH・
CHA6.2ｇより調製したＺ−Arg（Pme）−
OH、HOBt1.5ｇを加えて氷冷し、DCC2.3
ｇを加えて15時間かきまぜた。析出した
DCUを取し、濃縮後、AcOEtにとかし
た。AcOEt層は、４％NaHCO₃水、10％ク
エン酸水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥した。
濃縮後エーテルを加えて、沈澱として取
した。収量7.45ｇ（93.7％）。mp.100−101
℃、〔α〕^２６ _Ｄ−0.9゜（ｃ＝1.2、DMF）、
Rf¹0.51 元素分析 C₃₃H₄₉O₉N₇Sとして 計算値：Ｃ、55.06；Ｈ、6.86；
Ｎ、13.62；Ｓ、4.46 実験値：Ｃ、55.49；Ｈ、6.94；
Ｎ、13.14；Ｓ、3.86 () Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser
−NHNH−Bocの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Ser−NHNH−Boc3.9
ｇをMeOH300mlにとかし、接触還元した
のち、DMF50ml転溶した。これに、Ｚ−
Lys（Mtr）−OH・DCHA3.4ｇより調製し
たＺ−Lys（Mtr）−OH、HOBt0.88ｇを加
えて氷冷し、DCC1.34ｇを加えて20時間か
きまぜた。析出したDCUを別し、濃縮
後、AcOEtを加えて粉末として取し、
MeOH−AcOEtより再結晶した。収量5.1
ｇ（93.4％）。mp.103−105℃、〔α〕^２６ _Ｄ−
7.2゜（ｃ＝0.8、DMF）、Rf¹0.57 元素分析 C₄₉H₇₃O₁₃N₉S₃として 計算値：Ｃ、55.50；Ｈ、6.94；
Ｎ、11.89；Ｓ、6.05 実験値：Ｃ、55.70；Ｈ、7.15；
Ｎ、11.60；Ｓ、5.63 () Ｚ−Arg（Pme）−Lys（Mtr）−Arg
（Pme）−Ser−NHNH−Bocの製造 Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser−
NHNH−Boc4.8ｇをMeOH300mlにとか
し、接触還元したのち、DMF70mlに転溶
した。これに、Ｚ−Arg（Pme）−OH・
CHA2.8ｇより調製したＺ−Arg（Pme）−
OH、HOBt0.74ｇを加えて氷冷し、
DCC1.12ｇを加えて15時間かきまぜた。析
出したDCUを別し濃縮後、AcOEtにと
かし、AcOEt層を４％NaHCO₃水、10％ク
エン酸水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥した。
濃縮後、エーテルを加えて沈澱として取
し、MeOH−エーテルより再沈澱した。収
量5.8ｇ（89.8％）。mp.136−137℃、〔α〕
^２６ _Ｄ−6.6゜（ｃ＝1.0、DMF）、Rf¹0.58 元素分析 C₆₆H₉₉O₁₆N₁₃S₃として 計算値：Ｃ、55.56；Ｈ、6.99；
Ｎ、12.76；Ｓ、6.74 実験値：Ｃ、55.34；Ｈ、7.07；
Ｎ、12.50；Ｓ、6.59 () Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Lys
（Mtr）−Arg（Pme）−Ser−NHNH−Boc
の製造 Ｚ−Arg（Pme）−Lys（Mtr）−Arg
（Pme）−Ser−NHNH−Boc3.0ｇを
MeOH150mlにとかし、接触還元したの
ち、DMF60mlに転溶した。これに、Ｚ−
Lys（Mtr）−OH・DCHA1.54ｇより調製
したＺ−Lys（Mtr）−OH、HOBt0.31ｇを
加えて氷冷し、DCC0.57ｇを加えて15時間
かきまぜた。析出したDCUを別し、濃
縮後、AcOEtにとかし、AcOEt層を４％
NaHCO₃水、10％クエン酸水で洗浄し、
Na₂SO₄で乾燥した。濃縮後、エーテルを
加えて結晶として取し、AcOEtより再
結晶した。収量2.70ｇ（72.8％）mp.123−
125℃、〔α〕^２６ _Ｄ−5.9゜（ｃ＝1.1、DMF）、
Rf¹0.57 元素分析 C₈₂H₁₂₃O₂₀N₁₅S₄として 計算値：Ｃ、55.73；Ｈ、7.02；
Ｎ、11.89；Ｓ、7.26 実験値：Ｃ、55.89；Ｈ、7.30；
Ｎ、11.72；Ｓ、7.08 () Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg
（Pme）−Gly−Arg（Pme）−Arg（Pme）−
Ala−Ser−Gln−OBu^tの製造 Ｚ−Arg（Pme）−Arg（Pme）−Ala−
Ser−Gln−OBu^t1.0ｇをMeOH100mlにと
かし、接触還元したのちDMF20ml転溶し
た。これに、Boc−Gln−Met−Leu−Phe
−Arg（Pme）−Gly−OH0.85ｇ、
HOBt135mgを加えて水冷し、DCC210mgを
加えて20時間かきまぜた。析出したDCU
を別し、濃縮後、MeOHを加えて沈澱と
して取した。収量1.50ｇ（87.4％）。
mp.216−217℃（分解）、〔α〕^２６ _Ｄ−11.8゜
（ｃ＝1.0、DMF）、Rf¹0.43 元素分析 C₉₈H₁₅₄O₂₃N₂₂S₄として 計算値：Ｃ、55.09；Ｈ、7.27；
Ｎ、14.42；Ｓ、6.00 実験値：Ｃ、54.81；Ｈ、7.33；
Ｎ、14.23；Ｓ、5.79 () Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−
Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−
Arg−Ala−Ser−Gln−OHの製造 Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg
（Pme）−Gly−Arg（Pme）−Arg（Pme）−
Ala−Ser−Gln−OBu^t1.0ｇにTFA10mlを
加え、室温で50分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテルを加えて沈殿として取し、
乾燥した。 一方、Ｚ−Lys（Mtr）−Arg（Pme）−
Lys（Mtr）−Arg（Pme）−Ser−NHNH−
Boc0.83ｇにTFA10mlを加えて室温で10分
間振り混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加
えて沈澱として取し乾燥した。これを
DMF10mlにとかし、ドライアイス−アセ
トンで冷却後、6.2N HCl／AcOEt0.23
ml、亜硝酸イソアミル（0.075ml）を加
え、−25゜〜−20℃で20分間保つた（ヒド
ラジンテスト：陰性）。これを再びドライ
アイス−アセトンで冷却し、TEA0.25ml
を加えて中和した。アミン成分をDMF40
mlにとかし、氷冷しTEA0.16mlを加えた
のち、先に調製したアジド溶液を加えて、
４℃で72時間かきまぜた。反応液を、希酢
酸水にそそぎ、析出したゲルを取し、含
水CH₃CNで洗浄した。収量1.40ｇ（81.5
％）、Rf¹0.09。このうち400mgを
0.15MMSAを含むTFA−チオアニソール
−メチルスルフイド（８：１：１）60mlに
とかし、室温で２時間振りまぜたのち、
AcONH₄400mgを加えて濃縮し、エーテル
を加えて沈澱とし取し、乾燥した。これ
を少量の1N AcOHにとかしセフアデツク
スＧ−25のカラム（2.2×120cm）に付し
た。1N AcOHで溶出し160ml−260mlの分
画を集めて凍結乾燥し、ついでアンバーラ
イトIRA−410（酢酸型）のカラムを通
し、凍結乾燥した。これをさらにTSK−
LS−410のカラム（2.14×7.5cm＋2.14×30
cm）を用いるHPLCで精製し、目的物を得
た。収量45mg、〔α〕^２４ _Ｄ−45.9゜（ｃ＝0.7、
0.1N AcOH）、Rf⁴（cellulose）0.20 アミノ酸分析：Lys1.71、Arg4.71、
Ser1.69、Glu2.12、Gly1.00、Ala1.03、
Met0.32、Leu1.30、Phe1.08（平均回収
率77％） (2) キヤリヤー蛋白とポリペプチド複合体の合
成 上記(1)−（）で得たポリペプチドとサ
イログロブリン（以下TG）との結合を、グ
ツトフレンドらの方法に準じて行なつた〔サ
イエンス、144、1334（1964）〕。即ち、当該
ポリペプチド2.5mgをTG3.75mgと混合し、２
mlの50ｍＭのフオスフエートバツフアーを加
え、氷水中でよく撹拌した。これにカルボジ
イミド塩酸塩30.4mgを蒸留水200μに溶か
したものを１滴ずつゆつくりと加えた後、３
時間氷水中で撹拌しながら反応させた。反応
後、蒸留水で透析を充分に行ない、凍結乾燥
を行なつて蛋白複合体4.7mgを得た。 (3) 抗体検出のためのEIA用抗原の調製 EIA用抗原の調製は北川らの方法〔ジヤー
ナル オブ バイオケミストリー、79、233
（1976）〕に準じて行つた。 (i) ポリペプチドへのマレイミド基の導入 前記(1)−（）で得たポリペプチド
（350nmoles）を１mlの100ｍＭフオスフエ
ートバツフアーPH6.8に溶解し、Ｎ−（４−
カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイ
ミドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステ
ル585μｇ（1.75μmoles）と70μのＮ・
Ｎ−ジメチルホルマミド溶液に加え混合
し、30℃で30分撹拌して反応後、セフアデ
ツクスＧ−25カラムで分画を行ないマレイ
ミド基の導入されたポリペプチド分画
185nmolesを得た。 (ii) マレイミド基導入ポリペプチドとβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼとの結合 上記(3)−(i)で得たマレイミド基導入ポリ
ペプチド16.5nmolesとβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ3.3nmolesを混合し、４℃で18時
間反応後、412.5nmolesのβ−メルカプト
エタノールで反応を停止させた。β−Ｄ−
ガラクトシダーゼと結合したポリペプチド
は、セフアロース6Bカラムで分画を行な
い、以下の実験に使用した。 (4) EIA法 前記(2)で得た蛋白複合体で免疫したマウス
血清あるいはハイブリドーマ上清中の抗体活
性の検出はEIA法を用いて行なつた〔イムノ
フアーマコロジー、１、３（1978）〕。すなわ
ち、血清あるいはハイブリドーマ上清をバツ
フアーＡ（20ｍＭ Na₂HPO₄、100ｍＭ
NaCl、0.1％NaN₃、１ｍＭ MgCl₂、PH7.0）
で希釈し、この100μをとり、前記(3)で得
たポリペプチド誘導体100μとよく混合
し、24℃で24時間反応させた。反応後、ウサ
ギ抗マウスIgGを結合した３％セルロース
100μを加えて24℃、４時間反応させた。
反応後、セルロースを0.5％ツイーン20を含
んだバツフアーＡでよく洗浄し、４−メチル
ウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシド20
μｇ／mlを500μ加え、37℃で２時間反応
後、100ｍＭカーボネートバツフアー（PH
10.5）を３ml加えて反応を停止し、上清中の
螢光強度を螢光計で測定した（エキサイテー
シヨン365nｍ、エミツシヨン450nｍ）。 (5) 免疫 ７〜８週令のBALB／Ｃ雌マウス６匹各々
に抗原として前記(2)で得た蛋白複合体の、タ
ンパク量として、40μｇをフロインドコンプ
リート アジユバントとよく混合し、皮下に
接種した（初回免疫）。初回免疫の２週後、
同量の抗原をフロインドインコンプリート
アジユバントとよく混合し、皮下に接種した
（二次免疫）。さらに、その２週後、二次免疫
と同様の方法で三次免疫を行なつた。三次免
疫の６日後、マウスから血液を部分採取し、
血清中の抗体価を前記(4)記載のEIA法で測定
した。このうち、高い抗体価を示したγ−２
マウスに対して120μｇの抗原を0.5mlの食塩
水に溶解させたものを静脈内に接種すること
により最終免疫を行なつた。各マウスの抗体
価は第２表に示した。

【表】 Ｂ モノクローナル抗体γ２−11.1の製造 (1) 細胞融合 前記Ａ(5)記載の方法で免疫を行ない、最終
免疫の３日後のγ−２マウスから脾臓を摘出
し、ステンレスメツシユで圧迫、過し、イ
ーグルズ・ミニマム・エツセンシヤルメデイ
ウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液
を得た。細胞融合に用いる細胞として、
BALB／Ｃマウス由来ミエローマ細胞P3−×
63.Ag8.U1（P3U1）を用いた〔カレント
トピツクス イン マイクロバイオロジー
アンド イムノロジー、81、１（1978）〕。細
胞融合は、原法〔ネイチヤー、256、495
（1975）〕に準じて行なつた。即ち、脾臓細胞
およびP3U1をそれぞれ血清を含有しない
MEMで３度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比
率を５：１になるよう混合して、800回転で
15分間遠心を行なつて細胞を沈澱させた。上
清を充分に除去した後、沈澱を軽くほぐし、
45％ポリエチレングリコール（PEG）6000
（コツホライト社製）を0.3ml加え、37℃温水
槽中で７分間静置して融合を行なつた。融合
後細胞に毎分２mlの割合でMEMを添加し、
合計12mlのMEMを加えた後600回転15分間遠
心して上清を除去した。この細胞沈澱物を10
％牛胎児血清を含有するRPMI1640メデイウ
ム（RPMI1640−10FCS）にP3U1が１ml当
り２×10⁵個になるように浮遊し、24穴マル
チデイシユ（リンブロ社製）に１ウエル１ml
ずつ144ウエルに播種した。播種後、細胞を
37℃で５％炭酸ガスフラン器中培養した。24
時間後HAT（ヒポキサンチン１×10^-4M、
アミノプテリン４×10^-7M、チミジン1.6×
10^-5M）を含んだRPMI1640−10FCS培地
（HAT培地）を１ウエル当り１mlずつ添加す
ることにより、HAT選択培養を開始した。
HAT選択培養は、培養開始３、５、７日後
に旧液を１ml捨てたあと、１mlのHAT培地
を添加することにより継続した。ハイブリド
ーマの増殖は、細胞融合後10〜14日で認めら
れ、培養液が黄変したとき（約１×10⁶／
ml）、上清を採取し、EIA法で、抗体の有無
を検索した。このようにして、ハイブリドー
マの増殖が認められた141ウエルの上清を調
べたところ、２ウエル（γ２−11、γ２−
100）に強い抗体活性、２ウエル（γ２−
62、γ２−70）に弱い活性を認めた。 (2) クローニング 抗体活性が陽性を示した３ウエル（γ２−
11、62、100）の各ハイブリドーマを、限界
希釈法によつてクローニングを行なつた。即
ちハイブリドーマが２個／mlになるよう
RPMI1640−20FCSに浮遊させ、96穴マイク
ロプレート（ヌンク社製）に１ウエル当り
0.1mlずつ分注した。分注する際、フイーダ
ー細胞としてBALB／Ｃマウスの胸腺細胞を
ウエル当り５×10⁵個になるように加えた。
このようにして、約２週間後には細胞の増殖
が認められるようになり、上清を採取して、
抗体の有無を前記Ａ(4)記載のEIA法で調べ
た。その結果、γ２−11では19クローン中８
クローン、γ２−62では54クローン中３クロ
ーン、γ２−100では47クローン中５クロー
ンに抗体活性を認めた（第３表）。 (3) モノクローナル抗体のIFN−γに対する

【表】 結合能 モノクローナル抗体のIFN−γに対する結合
能は、次の方法で検討した。即ち、ウサギ抗マ
ウスIgG抗体を結合させた３％セルロース溶液
300μに、γ２−11、γ２−62、γ２−100由
来のそれぞれ２〜３種のクローン細胞の培養上
清を各々300μ加え、室温で18〜20時間反応
させた。反応後セルロースを生理食塩水でよく
洗浄し、550U／mlの下記により得たIFN−γ
を加え、３〜４時間反応させた。反応後、上清
を採取し上清中のIFN−γ活性をマイクロプレ
ートを用いた細胞変性効果（CPE）リーデン
グ法で測定した〔アプライド マイクロバイオ
ロジー、16、1706（1968）〕。すなわち、96穴マ
イクロプレート（ヌンク社製）全てのウエルに
50μのMEMを入れ、最初のウエルにIFNサ
ンプルを50μ加えて、連続的に２倍希釈を行
なつた。このようにした各ウエルに、WISH細
胞を20％FCS含有MEMに１ml当り４×10⁵個に
なるよう調整した細胞浮遊液50μを加え、24
時間、37℃、炭酸ガスフラン器で培養した。培
養後、水泡性口内炎ウイルス（ニユージヤージ
ー株）を2000TCID₅₀（テイツシユーカルチユ
アインフエクテイングドーズ50）になるよう
MEMで調整し、その50μを各々のウエルに
加え、37℃、炭酸ガスフラン器内で培養した。
約35時間後、IFNサンプルを加えていないウエ
ルの細胞が100％CPEを起こした時点で、各ウ
エルのCPEを顕微鏡で観察し、50％のCPEを
起こしているウエルのIFN−サンプルの希釈数
の逆数をもつてIFNの力価とした。 IFN−γサンプルとして用いたものは、ヒト
末梢血リンパ球を、コンカナバリンA40μｇ／
mlと12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13
アセテート15nｇ／mlで刺激して72時間後に採
取した上清で、この培養上清１ml中にはヒト
IFN−γ（酸、PH処理に不安定）を4400ユニツ
ト含有していた。もし、クローン細胞の培養上
清中にIFN−γに対して結合能を持つ抗体が存
在していれば、後で加えたIFN−γ活性は、セ
ルロース上の抗体に結合し、上清中の活性は低
減される筈である。結果は、γ２−11のクロー
ンの上清中に比較的強いIFN−γ結合能が認め
られ、加えたIFN−γ（550U／ml）の50〜75
％が抗体に結合した（第４表）。

【表】

【表】 (4) モノクローナル抗体産性ハイブリドーマの
腹水化 IFN−γに対して結合能を示す抗体を産生
するγ２−11.1クローン細胞（マウスＢハイ
ブリドーマγ２−11.1）×10⁶個を、あらかじ
め0.5mlのミネラルオイルを腹腔内に投与し
ておいたBALB／ｃマウスの腹腔内に接種す
ることにより腹水を行つた。ハイブリドーマ
を腹腔に投与して10日後、腹水を採取して抗
体価をEIA法で測定したところ、10⁷倍希釈
まで抗体活性を示した。なお、当該クローン
細胞の倍養上清中の抗体活性は、10⁴倍希釈
まで認められているが、腹水化することによ
り約1000倍程度抗体活性が上昇した。 (5) モノクローナル抗体の精製 上記(4)で得られた腹水４mlを出発材料とし
て、ステーリンら〔ジヤーナル オブ バイ
オロジカルケミストリー、256、9750
（1981）〕の方法に準じてモノクローナル抗体
を精製した。まず腹水からフイブリン様物質
を除去するため10000回転15分間遠心した
後、リン酸緩衝液−食塩水（PBS：8.1ｍＭ
−NaH₂PO₄、1.5ｍＭ KH₂PO₄、2.7ｍＭ
KCl、137ｍＭ NaCl、PH7.2）で280nｍの紫
外部吸収（A₂₈₀）が12〜14の値を示す濃度に
希釈した。希釈後サンプルに飽和硫酸アンモ
ニウム溶液を47％の濃度になるように加え、
４℃で撹拌しながら60分間塩析を行ない、そ
の後遠心（10000回転、15分間）を行なつて
沈澱物を得た。沈澱物を50ｍＭ NaCl含有
20ｍＭトリス緩衝溶液（PH7.9）に溶遊し、
同溶液２に対して透析を行なつた。２時間
後、２の新しい同じ透析液に換え、さらに
15時間透析を行なつた。透析後、沈澱を除去
するため10000回転15分間遠心を行ない、上
清をA₂₈₀の値が20〜30の濃度になるように調
整した。このサンプルを充分量の50ｍＭ−
NaCl含有トリス緩衝溶液で順化した８mlの
DEAEセルロースカラム（ワツトマン
DE₅₂）にかけ、50ｍＭ NaCl含有トリス緩衝
溶液を用いて1.5ml／分の流出速度で分画を
行なつた。この条件下では、抗体活性は主と
して素通り分画に認められた（第３図）。こ
こで得たモノクローナル抗体γ２−11.1の確
認にはラエムリらの方法〔ネイチヤー、
227、680（1970）〕に準じてSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）法
を用いた。すなわち、硫安塩析−DEAEセル
ロースカラムで分画したいくつかのフラクシ
ヨンを、各々２−メルカプトエタノールで還
元を行ない17％SDSゲル、30ボルト、24時間
泳動を行なつた。その結果、抗体活性に一致
して、分子量約55キロダルトン前後にＨ鎖、
約28キロダルトン前後にＬ錯の２つのバンド
が認められた（第４図）。このように精製さ
れた抗体フラクシヨン17がIFN−γに対し
て、結合能を示すかどうかを前記Ａ(3)の方法
に従つてIFN−γ2200U／mlを加えて検索し
たところ、IFN−γの約50％が抗体に結合性
を示すことが判明した（第５表）。

【表】 (6) モノクローナル抗体の属するサブクラス γ２−11.1モノクローナル抗体の属する
IgGサブクラスは、上記(5)の方法で精製した
フラクシヨン17を10倍に希釈し、ヤギ抗マウ
スIgG1、G2a、G2b、G3抗体（マイルス社）
との寒天内沈降反応法（オクタロニー法：イ
ムノロジカルメソツド ゲル−デイフユージ
ヨン テクニツク、ブラツクウエル オツク
スフオード、1964年）で検討した。結果は、
モノクローナル抗体とヤギ抗マウスIgG2b抗
体との間に著明な１つのバンドが認められ、
他の抗IgG抗体との間には、バンドの形成は
みられなかつた。従つて、当該モノクローナ
ル抗体は、IgG2に属するものであることが
判明した（第６表）。

【表】 Ｃ モノクローナル抗体γ３−11.1の製造 以下にγ−３マウスより得たγ３−11.1モノ
クローナル抗体の製造法を示す。本モノクロー
ナル抗体もγ２−11.1モノクローナル抗体と同
様にIFN−γの精製に用いることができる。 (1) 免疫 前記Ａ(5)の第２表に記載のγ−３マウス
に、二次、三次と同様の方法で四次免疫を行
ない四次免疫の２週後、前記Ａ(5)と同様に
120μｇの抗原を0.5mlの食塩水に溶解させた
ものを静脈内に接種することにより最終免疫
を行なつた。 (2) 細胞融合 上記(1)に記載した最終免疫の３日後のγ−
３マウスから脾臓を摘出し、前記Ｂ(1)記載の
方法で細胞融合ならびにHAT選択培養を行
なつた。その結果43ウエルに、ハイブリドー
マの増殖を認め、前記Ａ(4)に記載のEIA法で
抗体の有無を検索したところ、２ウエル（γ
３−11、γ３−19）に強い抗体活性を認め
た。 (3) クローニング 抗体活性が強陽性を示した２ウエル（γ３
−11、γ３−19）の各ハイブリドーマを、前
記Ｂ(2)記載の方法でクローニングを行なつ
た。その結果、γ３−11では21クローン中９
クローン、γ３−19では25クローン中15クロ
ーンに抗体活性を認めた（第７表）。 (4) モノクローナル抗体のIFN−γに対する結
合能 モノクローナル抗体のIFN−γに対する結
合

【表】 能は、前記Ｂ(3)に記載の方法で検討した。但
し、本参考例で用いたIFN−γサンプルは、ヒ
トIFN−γ遺伝子をプラスミドに組み込んで大
腸菌で発現させたもの（リコンビナントIFN−
γ；参考例２(4)参照）で、1100U／mlになるよ
う調製した。結果は、γ３−11.1、γ３−
19.20クローンの上清中に強いIFN−γ結合能
が認められ、加えたIFN−γの約90％が抗体に
結合した（第８表）。

【表】 (5) モノクローナル抗体の属するサブクラス γ３−11.1、γ３−19.20クローン細胞
を、前記Ｂ(4)に記載の方法で腹水化を図り、
得られた腹水につき、前記Ｂ(5)記載の方法で
精製を行なつた。得られたモノクローナル抗
体のサブクラスは、前記Ｂ(6)記載の寒天内沈
降反応法で検討した。結果は、γ３−11.1、
γ３−19.20何れのモノクローナル抗体と
も、ヤギ抗マウスIgG1抗体との間に著明な
バンドが認められ、他の抗IgG抗体との間に
は、バンドの形成はみられなかつた。従つ
て、γ３−11.1、γ３−19.20モノクローナ
ル抗体は、IgG1に属するものであることが
判明した（第９表）。

【表】

【表】 参考例 ２ 形質転換体の製造およびIFN−γ含有上清の製
造 実施例Ｂおよび参考例1C(4)で使用した粗IFN
−γ含有上清は以下の参考例で示す方法により得
られた。 (1) IFN−γ遺伝子含有プラスミドPHIT3709の製
造 (i) ヒトIFN−γをコードするｍRNAの分離ヒ
ト末梢血より調製したリンパ球を12−０−テ
トラデカノイルホルボール−13−アセテート
（TPA）（15nｇ／ml）とコンカナバリンＡ
（40μｇ／ml）を含むRPMI−1640培地（10
％の牛胎児清を含む）で37℃培養し、IFN−
γを誘導させた。24時間後、この誘導した１
×10¹⁰個のヒトリンパ球をチオグアニジン変
性溶液（5Mグアニジンチオシアネート、５
％メルカプトエタノール、50ｍＭ Tris・
HCl PH7.6、10ｍＭ EDTA）中でテフロ
ンホモゲナイザーによつて破壊変性した後Ｎ
−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４
％になるように加え、均質化した混合物を
5.7M塩化セシウム溶液〔5.7M塩化セシウ
ム、0.1Mエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）６ml上に重層し、ベツクマン
SW27のローターを用いて15℃で24000rpm30
時間遠心処理を行い、RNA沈澱を得た。 このRNA沈澱を0.25％Ｎ−ラウロイルザ
ルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後、エ
タノールで沈澱させ、8.3mgのRNAを得た。
このRNAを高温溶液〔0.5M NaCl、10ｍＭ
Tris・HCl PH7.6、１ｍＭ EDTA、0.3
％SDS〕中でオリゴ（dT）セルロースカラ
ムに吸着させ、ポリ(A)を含むｍRNAを低塩
溶液（10ｍＭ Tris−HCl・PH7.6、１ｍＭ
EDTA、0.3％SDS）で溶出させることに
より、ポリ(A)を含むｍRNA700μｇを分取し
た。 このｍRNAを更にエタノールで沈澱さ
せ、0.2mlの溶液（10ｍＭ Tris・HCl PH
7.6、２ｍＭ EDTA、0.3％SDS）に溶か
し、65℃で２分間処理して10〜35％庶糖密度
勾配遠心処理（ベークマンSW27のローター
を用いて20℃、25000rpmで21時間遠心分
離）することにより分画化して22分画を得
た。この各分画につきRNAの一部ずつを、
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、、
合成される蛋白質中のインターフエロン活性
〔ヒト羊膜由来WISH細胞に対する水泡性口
内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止
試験を用いて測定した。抗ウイルス活性〔ザ
インターフエロン システム、スプリンガ
ー社、ニユーヨーク、11頁、1979年〕を測定
し、分画12（沈降定数Ｓ値は12−14Sを示し
た）に195ユニツト／μｇ RNAの活性を検
出した。このようにして得た分画12のｍ
RNAは約20μｇであつた。 (ii) 単鎖DNAの合成 上記で得たｍRNAおよび逆転写酵素を用
い、100μｇの反応液（５μｇのｍRNA、50
μｇオリゴ（dT）、100ユニツトの逆転写酵
素、１ｍＭずつのdATP、dCTP、dGTPお
よびdTTP、８ｍＭ MgCl₂、50ｍＭ
KCl、10ｍＭジチオスレイトール、50ｍＭ
Tris−HCl PH8.3）中で42℃、１時間イン
キユベートした後に、フエノールで除蛋白
し、0.1NのNaOHで70℃、20分処理してRNA
を分解除去した。 (iii) 二重鎖DNAの合成 ここで合成された単鎖の相補DNAを50μ
の反応液（ｍRNAとオリゴdTを含まない
以外は上記と同じ反応液）中で42℃２時間反
応させることにより二重鎖DNAを合成し
た。 (iv) dCテイルの付加 この二重鎖DNAにヌクレアーゼS1を50μ
の反応液（二重鎖DNA0.1M酢酸ナトリウ
ムPH4.5、0.25M NaCl、1.5ｍＭ ZnSO₄、60
ユニツトのS1ヌクレアーゼ）中で室温30分
間作用させ、フエノールで除蛋白し、エタノ
ールでDNAを沈澱させた後、これにターミ
ナルトランスフエラーゼを50μの反応液
（二重鎖DNA、0.14Mカコジル酸カリ、0.3M
Tris（塩基）PH7.6、２ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ C₀Cl₂、0.15ｍＭ dCTP、30
ユニツトターミナルトランスフエラーゼ）中
で３分間37℃で作用させ二重鎖DNAの3′両
端に約20個のデオキシシチジン鎖を伸長させ
た。これらの一連の反応で約300nｇのデオ
キシシチジン鎖をもつた二重鎖DNAを得
た。 (v) 大腸菌プラスミドの開裂ならびにdGテイ
ルの付加 一方、10μｇの大腸菌プラスミド
pBR322DNAに制限酵素PstIを50μの反応
液〔10μｇ DNA、50ｍＭ NaCl、６ｍＭ
Tris・HCl（PH7.4）、６ｍＭ MgCl₂、６
ｍM2−メルカプトエタノール、100μｇ／
ml、牛血清アルブミン、20ユニツトのPstI〕
中で３時間37℃で作用させてpBR322DNA中
に１ケ所存在するPstI認識部位を切断し、フ
エノールで除蛋白した後、ターミナルトラン
スフエラーゼを50μの反応液〔DNA10μ
ｇ、0.14Mカコジル酸カリ、0.3M Tris（塩
基）PH7.6、２ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ C₀Cl₂、0.15ｍＭ dGTP、30ユニツト
ターミナルトランスフエラーゼ〕中で３分間
37℃で作用させ上記プラスミドpBR322DNA
の3′両端に約８個のデオキシグアニン鎖を延
長させた。 (vi) cDNAの会合ならびに大腸菌の形質変換 このようにして得られた合成二重鎖
DNA0.1μｇと上記プラスミドpBR322 0.5μ
ｇを0.1M NaCl、50ｍＭ Tris・HCl PH
7.6、１ｍＭ EDTAよりなる溶液中で65℃
２分間、45℃２時間加熱しその後除冷して会
合させエネアらの方法〔ジヤーナル オブ
モレキユラー バイオロジー、96、495
（1975）〕に従つて大腸菌χ1776を形質転換さ
せた。 (vii) cDNA含有プラスミドの単離 こうして約8500のテトラサイクリン耐性株
が単離され、これら各々のDNAをニトロセ
ルロースフイルターの上に固定した。〔プロ
シーデイング オブ ナシヨナル アカデミ
ー サイエンス USA72、3961（1975）〕 一方、ゴエデルらの報告〔ネイチヤー、
295、503（1982）〕のIFN−γのアミノ酸配
列をもとにしてアミノ酸No.1−５（Cys・
Tyr・Cys・Gln・Asp）及びアミノ酸No.77
−82（Lys・Gln・Asp・Met・Asn・Val）
より推測できる塩基配列（それぞれ

【式】 および

【式】 ）をトリエステル法〔クレアら、プロシーデイ
ング オブ ナシヨナルアカデミー サイエン
ス USA、75、5765（1978）〕を用いて化学合
成した。このオリゴヌクレオチドに対してT4
ポリヌクレオチドカイネースを用いて50μの
反応液（オリゴヌクレオチド0.2μｇ、50ｍＭ
Tris・HCl PH8.0、10ｍＭ MgCl₂・10ｍＭ
メルカプトエタノール、50μCiγ−
³²PATP、３ユニツトT4ポリヌクレオチドカイ
ネース）中で１時間37℃で反応させ、5′末端を
³²Pで標識した。この標識されたオリゴヌクレ
オチドをプローブとしてラウンらの方法〔ヌク
レイツク アシツズ リサーチ、９、6103
（1981）〕に従つて上記のニトロセルロースフイ
ルター上に固定したDNAに会合させ、オート
ラジオグラフイーによつて上記二種類のオリゴ
ヌクレオチドプローブに反応する菌株を４個単
離した。これらの菌株の各々の菌体からプラス
ミドDNAをアルカリ法〔バーンボイムとドリ
ー、ヌクレイツク アシツズ リサーチ、７、
1513（1979）〕によつて単離した。次にプラス
ミドDNAの挿入部を制限酵素PstIにより切り
出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
の長さの最も長い断片を含むものをえらび、こ
のプラスミドをPHIT3709と名づけた。 次にこのPHIT3709プラスミドに挿入された
cDNA配列の一次構造（塩基配列）をジヌクレ
オチド合成鎖停止法とマキサム−ギルバートの
方法によつて決定した。その一次構造は第５図
の通りであつた。PHIT3709のIFN−γ暗号領域
（コドンNo.S1〜No.146）の塩基配列は公表文
献〔ヌクレイツク アシツズ リサーチ、10、
2487（1982）中の第３図〕に記載されたものと
同一であつた。 (2) 発現用プラスミドならびに発現用形質転換体
の製造 (i) 発現プラスミドとして大腸菌のトリプトフ
アン合成のプロモーター部分〔プロモータ
ー、オペレーターを含むDNA断片、276塩基
対、ベネツトら、ジヤーナル オブ モレキ
ユラーバイオロジー、121113（1978）〕を含
むプラスミドptrp601（ベクターは
pBR322）を構築した。 一方、プラスミドpBR322を制限酵素
EcoRIおよび制限酵素AvaIで切断し、得られ
たテトラサイクリン耐性遺伝子を含むEcoRI
−AvaI断片ののりしろ部分をDNAポリメラ
ーゼＩラージフラグメントでうめた。この断
片をT4DNAリガーゼを用いてptrp601のPvu
の切断部位に結合させptrp701を構築した
（第６図）。 (ii) 次にptrp701に２ケ所存在する制限酵素
ClaI切断部位の一つを消去するため、
ptrp701をClaIで部分分解して二つのClaI切
断部位のうち一方のみが切断されたものを得
た。生じたのりしろ部分をDNAポリメラー
ゼＩラージフラグメントでうめたのち、
T4DNAリガーゼで再度結合させてptrp771を
得た（第６図）。 (iii) PHIT3709を制限酵素PstIで切断してIFN−
γの構造遺伝子を含むPstI断片を得た。この
断片を制限酵素BstNIで部分分解し、IFN−
γ構造遺伝子内にあるBstNI部位の切断され
たBstNI−PstI断片を得た。BstNI切断部位
ののりしろ部分をDNAポリメラーゼＩラー
ジフラグメントでうめたのち、前述したトリ
エステル法によつて化学合成した蛋白合成開
始コドンATGを含むオリゴヌクレオチドア
ダプター CGATAATGTGTTACTGCC TATTACACAATGACGG をT4DNAリガーゼで結合させた。 一方、上記アダプターを結合させたIFN−
γ遺伝子をptrp771を制限酵素pstIと制限酵
素ClaIで切断して得た断片をトリプトフアン
プロモータの下流に挿入してT4DNAリガー
ゼを用いて結合させ、IFN−γ発現プラスミ
ドPHITtrp1101を構築した（第７図）。 (iv) PHITrp1101をさらに改良して次の通りPH
ITtrp2101を構築した。 まずptrp601を制限酵素ClaIおよび制限酵
素Hpaで処理してtrpプロモータを含む
ClaI−Hpa断片0.33Kbを得た。この断片
を、ClaIで切断しアルカリホスフアターゼ処
理したPHITtrp1101にT4DNAリガーゼを用
いて結合させtrpプロモーターが二つ直列に
入つたPHITtrp2101を得た（第８図）。 このプラスミドPHITtrp2101を用いてコー
エンらの方法〔前出〕に従つて、大腸菌（エ
シエリヒア コリ）294を形質転換させ、こ
のプラスミドを含む菌株エシエリヒア コリ
（E.coli）294／PHITtrp2101を得た。 (3) 発現用形質転換体の培養 E.coli294／PHITtrp2101を８μｇ／mlのテト
ラサイクリン、0.4％カザミノ酸、１％グルコ
ースを含むM9培地200mlを分注した１マイヤ
ー中で37℃で培養し、生育がKU220に達した
時に３β−インドリールアクリル酸（IAA）を
30μｇ／mlになるように加えて更に４時間培養
した。 (4) IFN−γ含有上清の製造 上記(3)で得られた培養液1.2を遠心分離し
て菌体を集め、これを60mlの10％シユクロース
を含む0.05M Tris・HCl PH7.6に懸濁した。
この菌体懸濁液に0.2Mフエニル−メチル−ス
ルフオニルフルオライド（PMSF）0.3ml、5M
NaCl2.4ml、0.2Mエチレンジアミンテトラアセ
テート（EDTA）2.4ml、1Mスペルミジン2.4
ml、５mg／mlリゾチーム2.4mlを加え０℃で１
時間放置したのち、37℃で５分処理し、これを
更にアルテツク社（米国）製超音波破砕器で０
℃30秒処理した。 この溶菌液を105000×ｇで１時間遠心分離し
て上清66mlを集めた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例に示した本発明の精製法で得ら
れたヒト免疫インターフエロン蛋白質の電気泳動
の結果を、第２図は同蛋白質の分子量測定の結果
を示す。第３図は参考例1C(5)における本発明の
モノクローナル抗体のDEAEセルロースカラムに
おける溶出パターンを示し、第４図は参考例1C
(5)におけるモノクローナル抗体の電気泳動の結果
を示す。第５図は参考例２(1)−(vii)で得られたPH
IT3709プラスミドの一次構造（塩基配列）を、
第６図は参考例２(2)−(i)および−(ii)のptrp701お
よびptrp771、第７図は参考例２(2)−(iii)のPH
ITtrp1101、第８図は参考例２(2)−(iv)のPH
ITtrp2101のそれぞれ構築図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 粗ヒトγ型インターフエロン含有物を式 Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met −Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala −Ser−Gln−OH で表されるポリペプチドに対するモノクローナル
   抗体を用いて精製することを特徴とするヒトγ型
   インターフエロンの精製法。 ２ 粗ヒトγ型インターフエロン含有物を、担体
   にカツプリングしたモノクローナル抗体によるア
   フイニテイーカラムクロマトグラフイ処理する特
   許請求の範囲第１項記載の精製法。