JPS6034994A - 新規ポリペプチドおよびその用途 - Google Patents
新規ポリペプチドおよびその用途Info
- Publication number
- JPS6034994A JPS6034994A JP59052244A JP5224484A JPS6034994A JP S6034994 A JPS6034994 A JP S6034994A JP 59052244 A JP59052244 A JP 59052244A JP 5224484 A JP5224484 A JP 5224484A JP S6034994 A JPS6034994 A JP S6034994A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- arg
- peptide
- formula
- ala
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/249—Interferons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ポリペプチドおよびその用途に関する。
背景技術
ケーラーとミルスタインにより開発されしネイチャー、
２５６，４９５（１９７５））、近年盛んになって来た
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造法は
、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗体が得
られることや、粗精製標品に対して得られた抗体につい
て吸収操作を必要としないことなどのすぐれた特徴をも
っている。
２５６，４９５（１９７５））、近年盛んになって来た
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造法は
、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗体が得
られることや、粗精製標品に対して得られた抗体につい
て吸収操作を必要としないことなどのすぐれた特徴をも
っている。
またこの他に・抗体取得という面からも、ハイブリドー
マの腹水化により、高力価の抗体が、自由に、冬瓜に、
しかも常に均質な標品を再現性まく得られるなど多くの
利点がある。この様な意味からハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体取得の手法は、多方面にわたってその
有用性が高く評価されている。また、その使い万も単に
抗原検出にとどまらず、抗体カラム作製を通じて＋ ｗ
！、■成分の精製に用いたり、〔ネイチャー、２８５
。
マの腹水化により、高力価の抗体が、自由に、冬瓜に、
しかも常に均質な標品を再現性まく得られるなど多くの
利点がある。この様な意味からハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体取得の手法は、多方面にわたってその
有用性が高く評価されている。また、その使い万も単に
抗原検出にとどまらず、抗体カラム作製を通じて＋ ｗ
！、■成分の精製に用いたり、〔ネイチャー、２８５
。
４４６（１９８０））、更には、参断薬、治療薬への応
用（ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー、
ユ、９４（１９７９）］も展開されている。
用（ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー、
ユ、９４（１９７９）］も展開されている。
ヒトのインターフェロンＣＩＦＮ月こは、抗原的に異な
るα、β、γ型の少くとも８柿のタイプが存在すること
が知られている（ネーチャー。
るα、β、γ型の少くとも８柿のタイプが存在すること
が知られている（ネーチャー。
２８６．１１０（１９８０）：］。ｒ型α型インターフ
ェロンＦＮ−γ）については、マイト−ジエンや抗原刺
激によって、主としてＴリンパ球から産生されることが
判っており、別名免疫インターフェロンＣＩ−ＩＦＮ）
とも呼ばれている（ザインターフェロン システム、ス
ブリンガー社。
ェロンＦＮ−γ）については、マイト−ジエンや抗原刺
激によって、主としてＴリンパ球から産生されることが
判っており、別名免疫インターフェロンＣＩ−ＩＦＮ）
とも呼ばれている（ザインターフェロン システム、ス
ブリンガー社。
ニューヨーク、１９７９年〕。Ｉ ＦＮ−７は生体内で
１種々の免疫反応にともなって産生されることが予想さ
れ、免疫調節に重要な役割を果たしていると考えられて
いる。また、ＩＦＮ−γの性質としては、α型インター
フェロン（ＩＦＮ−σ）やβ型インターフェロン（ＩＦ
Ｎ−β）と抗原性が異なることや・誘起剤の種類が異な
ることの他に、酸や熱に対する安定性が悪いことなども
判っている〔ザ インターフェロンシステム、スブリン
ガー社、ニューヨーク、１９７９年〕。
１種々の免疫反応にともなって産生されることが予想さ
れ、免疫調節に重要な役割を果たしていると考えられて
いる。また、ＩＦＮ−γの性質としては、α型インター
フェロン（ＩＦＮ−σ）やβ型インターフェロン（ＩＦ
Ｎ−β）と抗原性が異なることや・誘起剤の種類が異な
ることの他に、酸や熱に対する安定性が悪いことなども
判っている〔ザ インターフェロンシステム、スブリン
ガー社、ニューヨーク、１９７９年〕。
一般的にＩＦＮは、生体の産生ずる抗ウィルス作用をも
つものとして定義されているが、この他に多くの生物活
性をもつことが証明されており。
つものとして定義されているが、この他に多くの生物活
性をもつことが証明されており。
特に抗腫瘍効果を有する点で注目されている〔ブラッド
、５５，７１１（１９８０）；同誌、５６゜８７５（１
９８０））。腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細
胞の増殖を直接抑制する方法と。
、５５，７１１（１９８０）；同誌、５６゜８７５（１
９８０））。腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細
胞の増殖を直接抑制する方法と。
宿主の免疫反応を介して、間接的に腫瘍を抑制する方法
が考えられ、後者の場合、例えばナチュラルキラー細胞
（ＮＫ）や、マクロファージの活性化、或いはキラーＴ
細胞の活性化などが考えられる。実際、ＩＦＮには直接
作用の他に、この様な種々の免疫増強活性があることが
証明されているしバイオケミ力 エト バイオフィジヵ
アクタ。
が考えられ、後者の場合、例えばナチュラルキラー細胞
（ＮＫ）や、マクロファージの活性化、或いはキラーＴ
細胞の活性化などが考えられる。実際、ＩＦＮには直接
作用の他に、この様な種々の免疫増強活性があることが
証明されているしバイオケミ力 エト バイオフィジヵ
アクタ。
工１６，２８１（１９７８））。ＩＦＮ−γはインビト
ロでのこれら抗腫瘍につながる各種の活性。
ロでのこれら抗腫瘍につながる各種の活性。
およびインビボに於ける抗腫瘍活性が、ＩＦＮ−ａやＩ
ＦＮ−βに比べ遥かに高いことから、その重要性が強（
指摘されている〔セルラーイムノロジー、す、８９０（
１９８０）：ｌ。
ＦＮ−βに比べ遥かに高いことから、その重要性が強（
指摘されている〔セルラーイムノロジー、す、８９０（
１９８０）：ｌ。
然しながら、インビトロで誘導されるＩＦＮ−γの力価
は一般に低いことや適切なＩＦＮ−γ産生株細胞がほと
んどないこと、さらに熱や酸に対する安定性が悪いため
精製がむつかしいことなどのためにＩＦＮ−γの大量生
産および精製はＩＦＮ−１ｆｆｉやＩＦＮ−βに比べ大
幅に遅れている。
は一般に低いことや適切なＩＦＮ−γ産生株細胞がほと
んどないこと、さらに熱や酸に対する安定性が悪いため
精製がむつかしいことなどのためにＩＦＮ−γの大量生
産および精製はＩＦＮ−１ｆｆｉやＩＦＮ−βに比べ大
幅に遅れている。
ごく最近、天然のＩＦＮ−γが単一に出来たという報告
があるが〔プロシジング オブ ナショナル アカデミ
−オブ サイエンス、７９゜１８２０（１９８２））、
活性の回収が大変悪く。
があるが〔プロシジング オブ ナショナル アカデミ
−オブ サイエンス、７９゜１８２０（１９８２））、
活性の回収が大変悪く。
より効果的な精製法が待望されている。
−万最近に至り、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子のクローニング
が報告され、少くともＩＦＮ−γの一種として、１４６
個のアミノ酸から成る約１７キロダルトンの分子種が、
大腸菌で作られる様になった（ネーチャー、２９５，５
０８（１９８２）；ヌクレイツク アシッズ リサーチ
、１０．２４８７（１９８２））が、天然に昭生される
ＩＦＮ−γについては１種々の分子量のものが報告され
て居り、その分子種間の対応関係は未だ不明である。
が報告され、少くともＩＦＮ−γの一種として、１４６
個のアミノ酸から成る約１７キロダルトンの分子種が、
大腸菌で作られる様になった（ネーチャー、２９５，５
０８（１９８２）；ヌクレイツク アシッズ リサーチ
、１０．２４８７（１９８２））が、天然に昭生される
ＩＦＮ−γについては１種々の分子量のものが報告され
て居り、その分子種間の対応関係は未だ不明である。
この様な視点から、各種のＩＦＮ−γに対するモノクロ
ーナル抗体を得ることは１分子種間の対応をつけるのに
重要なだけでなく、天然の、或いは遺伝子組み換え法に
よる大腸菌などで作らせたＩＦＮ−γを精製する上に極
めて強力な武器となる。ごく最近に至り、天然のＩＦＮ
−γに対するモノクローナル抗体の取得が報告された〔
ネーチャー、２９６，２５８（１９８２））が、ＩＦＮ
−γが複数の分子種から成っている場合、遺伝子の組み
換え法によりクローン化された分子種に対するモノクロ
ーナル抗体を取得することは極めて重要となる。
ーナル抗体を得ることは１分子種間の対応をつけるのに
重要なだけでなく、天然の、或いは遺伝子組み換え法に
よる大腸菌などで作らせたＩＦＮ−γを精製する上に極
めて強力な武器となる。ごく最近に至り、天然のＩＦＮ
−γに対するモノクローナル抗体の取得が報告された〔
ネーチャー、２９６，２５８（１９８２））が、ＩＦＮ
−γが複数の分子種から成っている場合、遺伝子の組み
換え法によりクローン化された分子種に対するモノクロ
ーナル抗体を取得することは極めて重要となる。
発明の開示
本発明者らは、構造遺伝子のヌクレオチド配列から推定
されたヒトＩＦＮ−γのアミノ酸配列に関する報告〔ヌ
クレイツク アシッズ リサーチ１０．２４８７（１９
８２））をもとに、そのアミノ酸配列のＣ末端側の部分
構造を有するＨ−Ｘ−１：ｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ（Ｏ Ｇｔｙ−ｙ−ｏｎ （Ｉ） （Ｕン 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｉｎ Ｖａｌ Ｍ
ｅｔＡｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ（Ｑ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペプチド鎖において
そのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有すニオ
イてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有する
ペプチドもしくはアミノ酸残基を示すって表わされるポ
リペプチドを化学的に合成し、さらにキャリヤー蛋白と
化学結合させ蛋白複合体とした。
されたヒトＩＦＮ−γのアミノ酸配列に関する報告〔ヌ
クレイツク アシッズ リサーチ１０．２４８７（１９
８２））をもとに、そのアミノ酸配列のＣ末端側の部分
構造を有するＨ−Ｘ−１：ｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ（Ｏ Ｇｔｙ−ｙ−ｏｎ （Ｉ） （Ｕン 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｉｎ Ｖａｌ Ｍ
ｅｔＡｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ（Ｑ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペプチド鎖において
そのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有すニオ
イてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有する
ペプチドもしくはアミノ酸残基を示すって表わされるポ
リペプチドを化学的に合成し、さらにキャリヤー蛋白と
化学結合させ蛋白複合体とした。
ここで得られたポリペプチドまたは蛋白複合体で哺乳動
物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種または異種のリ
ンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリドーマとし、
これをクローン化した。
物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種または異種のリ
ンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリドーマとし、
これをクローン化した。
ここで得られたハイブリドーマを哺乳動物に接種し、モ
ノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取して前
記のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を製造し
た。
ノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取して前
記のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を製造し
た。
さ）に、ここで得られるモノクローナル抗体を利用し、
粗ヒトＩＦＮ−γ含有物からヒトＩＦＮ−γを精製する
方法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法ならびに
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ ）法によりヒトＩ
ＦＮ−γを検出する方法を確立し、本発明を完成した。
粗ヒトＩＦＮ−γ含有物からヒトＩＦＮ−γを精製する
方法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法ならびに
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ ）法によりヒトＩ
ＦＮ−γを検出する方法を確立し、本発明を完成した。
すなわち１本発明は、新規ポリペプチド（Ｉ）、その蛋
白複合体、新規クローン化されたハイブリドーマ、新規
モノクローナル抗体およびこれらの製造法、さらに該モ
ノクローナル抗体の用途を提供するものである。
白複合体、新規クローン化されたハイブリドーマ、新規
モノクローナル抗体およびこれらの製造法、さらに該モ
ノクローナル抗体の用途を提供するものである。
ｔｒｙ記ポリペプチド（１）に関し、ＹはＡｒｇ Ａｒ
ｇＡｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎであることが好ましく、とり
わけこれに加えＸがＬｙｓ Ａｒｇであることが好まし
く）また、ポリペプチド中はアミノ酸残基数とじてとリ
ワけ１５〜２５個であることが好ましい。
ｇＡｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎであることが好ましく、とり
わけこれに加えＸがＬｙｓ Ａｒｇであることが好まし
く）また、ポリペプチド中はアミノ酸残基数とじてとリ
ワけ１５〜２５個であることが好ましい。
当該ポリペプチドは、ペプチド合成の常套手段で製造し
うる。同相合成法、液相合成法のいずれによってもよい
が、液相合成法が有利な場合が多い。このようなペプチ
ドの合成の手段は、たとえば、″”Ｉ’ｈｅ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ ”第１巻（１９６６）。
うる。同相合成法、液相合成法のいずれによってもよい
が、液相合成法が有利な場合が多い。このようなペプチ
ドの合成の手段は、たとえば、″”Ｉ’ｈｅ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ ”第１巻（１９６６）。
５ｃｈｒ８ｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｂｋｅ著、 Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｕ、Ｓ
、Ａ、、あるいは“ペプチド合成″、泉屋ら著、丸善株
式会社（１９７５）。
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｕ、Ｓ
、Ａ、、あるいは“ペプチド合成″、泉屋ら著、丸善株
式会社（１９７５）。
あるいは“生化学実験講座、第１巻、２０７頁−４００
頁”矢島治明著、東京化学同人株式会社（１９７７年）
に記載されており、たとえば、アジド法、クロライド法
、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステ
ル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミ
ダゾール法。
頁”矢島治明著、東京化学同人株式会社（１９７７年）
に記載されており、たとえば、アジド法、クロライド法
、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステ
ル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミ
ダゾール法。
酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（例、 ＨＯＮＢ。
）１０Ｂｔ、 ＨＯ８ｕ Ｊ法などがあげられる。
ポリペプチド（１）は、いずれも保護されていてもよい
、（ａ）ポリペプチドの一部に相当する反応性カルボキ
シル基を有する原料と、 （Ｉ））ポリペプチド（＋）
の残部に相当する反応性アミノ基を有する原料をペプチ
ド合成の常套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基
を有する場合、その保護基を常套手段で脱離させること
により製造しうる。
、（ａ）ポリペプチドの一部に相当する反応性カルボキ
シル基を有する原料と、 （Ｉ））ポリペプチド（＋）
の残部に相当する反応性アミノ基を有する原料をペプチ
ド合成の常套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基
を有する場合、その保護基を常套手段で脱離させること
により製造しうる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護
基、ならびにその保護基の脱離１反応に関与する官能基
の活性化などもまた公知のものあるいは手段から適宜選
択しうる。
基、ならびにその保護基の脱離１反応に関与する官能基
の活性化などもまた公知のものあるいは手段から適宜選
択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、たとえ１ドブＪルボ
ペンゾキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル。
ペンゾキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル。
ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカル
ボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−
クロル−ベンジルオキシカルボニル。
ボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−
クロル−ベンジルオキシカルボニル。
アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル
、フタリル、ホルミン、０−ニトロフェニルスルフェニ
ル、ジフェニルホスフィノチオイル。
、フタリル、ホルミン、０−ニトロフェニルスルフェニ
ル、ジフェニルホスフィノチオイル。
４−メトキシ−２，８，６−）リメチルベンゼンスルホ
ニルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基として
は、たとえばアルキルエステル（例、メチル、エチル、
プロピル、ブチル、ｔ−ブチルなどのエステル基）、ベ
ンジルエステル基、ｐ−ニトロ・ベンジルエステル基、
ｐ−メトキシベンジルエステル基、ｐ−クロルベンジル
エステル基、ベンズヒドリルエステル基、カルボベンゾ
キシヒドラジド基、ｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラ
ジド基、トリチルヒドラジド基などがあげられる。
ニルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基として
は、たとえばアルキルエステル（例、メチル、エチル、
プロピル、ブチル、ｔ−ブチルなどのエステル基）、ベ
ンジルエステル基、ｐ−ニトロ・ベンジルエステル基、
ｐ−メトキシベンジルエステル基、ｐ−クロルベンジル
エステル基、ベンズヒドリルエステル基、カルボベンゾ
キシヒドラジド基、ｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラ
ジド基、トリチルヒドラジド基などがあげられる。
アルギニンのグアニジノ基の保護基としては。
たとえばニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンス
ルホニル基、カルボベンゾキシ、イソボルニルオキシカ
ルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキ
シ−２，６−シメチルベンゼンスルホニル基、ペンタメ
チルベンゼンスルホニル基等が例示される。また、その
グアニジノ基は。
ルホニル基、カルボベンゾキシ、イソボルニルオキシカ
ルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキ
シ−２，６−シメチルベンゼンスルホニル基、ペンタメ
チルベンゼンスルホニル基等が例示される。また、その
グアニジノ基は。
ｅｃ例、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、塩
酸、硫酸など）塩の形で保護してもよい。
酸、硫酸など）塩の形で保護してもよい。
スレオニンおよびセリンの水酸基は、たとえばエステル
化またはエーテル化によって保護することができる。こ
のエステル化に適する基としてはたとえばアセチル基な
どの低級アルカノイル基。
化またはエーテル化によって保護することができる。こ
のエステル化に適する基としてはたとえばアセチル基な
どの低級アルカノイル基。
ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボ
ニル基、エチルオキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などがあげられる。またエーテル化に適する基
としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル
基、【−ブチル基などである。しかしながらスレオニン
の水酸基は必ずしも保護する必要はない。メチオニンは
スルホキサイドの形で保護しておいてもよい。原料のカ
ルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対
応する酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フェノール、ｐ−ニトロフェノール。
ニル基、エチルオキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などがあげられる。またエーテル化に適する基
としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル
基、【−ブチル基などである。しかしながらスレオニン
の水酸基は必ずしも保護する必要はない。メチオニンは
スルホキサイドの形で保護しておいてもよい。原料のカ
ルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対
応する酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フェノール、ｐ−ニトロフェノール。
Ｎ−ハイドロキシサクシンイミド、Ｎ−ハイドロキシベ
ンズトリアゾール、Ｎ−ハイドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，８−ジカルボキシイミドなどとのエステル）な
どがあげられる。ペプチド結合形成反応は脱水剤（例、
ジシクロへキシルカルボジイミド、カルボジイミダゾー
ル等のカルボジイミド試薬）の存在下に実施しうる場合
がある。
ンズトリアゾール、Ｎ−ハイドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，８−ジカルボキシイミドなどとのエステル）な
どがあげられる。ペプチド結合形成反応は脱水剤（例、
ジシクロへキシルカルボジイミド、カルボジイミダゾー
ル等のカルボジイミド試薬）の存在下に実施しうる場合
がある。
本ペプチド縮合反応は溶媒の存在下に行うことができる
。溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうろことが
知られているものから適宜選択されうる。たとえば無水
または含水のジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
サイド、ピリジン。
。溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうろことが
知られているものから適宜選択されうる。たとえば無水
または含水のジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
サイド、ピリジン。
クロロホルム、ジオキサン、ジクロルメタン、テトラハ
イドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドンある
いはこれらの適宜の混合物などがあげられる。
イドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドンある
いはこれらの適宜の混合物などがあげられる。
反応温度はペプチド結合形成反応に使用されうろことが
知られている範囲から適宜選択され、通常的−４０℃−
約６０℃、好ましくは約−２０℃−約０℃の範囲から適
宜選択される。
知られている範囲から適宜選択され、通常的−４０℃−
約６０℃、好ましくは約−２０℃−約０℃の範囲から適
宜選択される。
水縮合反応終了後、生成物が保護基を有している場合、
それは常法により離脱できる。かかる常法としては、た
とえば還元的方法（例、パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
）、アシドリシス（例、トリフルオロ酢酸、フッ化水素
、メタンスルホン酸あるいは、チオアニソール等の含硫
化合物の存在下、上記の酸あるいは、その混合物による
アシドリシス）などがあげられる。
それは常法により離脱できる。かかる常法としては、た
とえば還元的方法（例、パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
）、アシドリシス（例、トリフルオロ酢酸、フッ化水素
、メタンスルホン酸あるいは、チオアニソール等の含硫
化合物の存在下、上記の酸あるいは、その混合物による
アシドリシス）などがあげられる。
上記のようにして製造された本発明のペプチドは、反応
終了後混合物から、通常のペプチドの分離手段、抽出２
分配、カラムクロマトグラフィーなどにより採取できる
。
終了後混合物から、通常のペプチドの分離手段、抽出２
分配、カラムクロマトグラフィーなどにより採取できる
。
ポリペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体に
関し、キャリヤー蛋白の［１ｆ１４およびキャリヤード
ハブテン（この場合ペプチド）との混合比は。
関し、キャリヤー蛋白の［１ｆ１４およびキャリヤード
ハブテン（この場合ペプチド）との混合比は。
キャリヤーにカプリングさせて免疫したハブテンに対し
て抗体が効率よく出来れば、どの様なものをどの様な比
率でカプリングさせてもよいが１例えば牛血清アルブミ
ンや牛サイログロブリン等を重量比でハブテンｌに対し
０．１〜２０．好ましくは１〜５の割合でカプルさせる
方法が用いられる。
て抗体が効率よく出来れば、どの様なものをどの様な比
率でカプリングさせてもよいが１例えば牛血清アルブミ
ンや牛サイログロブリン等を重量比でハブテンｌに対し
０．１〜２０．好ましくは１〜５の割合でカプルさせる
方法が用いられる。
また、ハブテンとキャリヤーのカプリングには。
種々の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデ
ヒドやカルボジイミド等が好都合に用いら第１る。
ヒドやカルボジイミド等が好都合に用いら第１る。
ポリペプチド（１）または蛋白複合体を用いて免疫する
に際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモッ
ト、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、モノク
ローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好まし
い。免疫方法は１例えばマウスを免疫する場合、皮下、
腹腔内、静脈内、筋肉内、皮肉等のいずれのルートから
でも可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（
とりわけ皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔
。
に際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモッ
ト、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、モノク
ローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好まし
い。免疫方法は１例えばマウスを免疫する場合、皮下、
腹腔内、静脈内、筋肉内、皮肉等のいずれのルートから
でも可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（
とりわけ皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔
。
免疫量等も可変度はＫ＜、Ｊ！Ｒ々の方法が可能である
が１例えば２週間隔で２〜６回免疫し、最終免疫後、１
〜５日、好ましくは２〜４日後の肺臓キイ１１胞を用い
る方法がよく用いられる。免変ケは１回にペプチド屋と
して、マウス当りＯ１μｆ以上、好ましくは１０１１ｇ
〜３００μｆ用いることが望ましい。
が１例えば２週間隔で２〜６回免疫し、最終免疫後、１
〜５日、好ましくは２〜４日後の肺臓キイ１１胞を用い
る方法がよく用いられる。免変ケは１回にペプチド屋と
して、マウス当りＯ１μｆ以上、好ましくは１０１１ｇ
〜３００μｆ用いることが望ましい。
又、肺臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体
価の上昇を確認した上で、Ｉｌｌ’ｌ！Ｉａ４（Ｉｆ胞
を用いる融合実験を行うことが望ましい。
価の上昇を確認した上で、Ｉｌｌ’ｌ！Ｉａ４（Ｉｆ胞
を用いる融合実験を行うことが望ましい。
上記＋１１’ｌｌ臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合
は。
は。
例えば摘出したマウスの肺臓細胞を、ヒポキサンチン−
グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（Ｈ
ＧＰＲＴ ）−や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ）の様
なマーカーを持ったＪＥａ切な同神または異種（好まし
くは同種）のミエローマ等の、リンパ球様細胞株との間
で融合させる。融合には。
グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（Ｈ
ＧＰＲＴ ）−や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ）の様
なマーカーを持ったＪＥａ切な同神または異種（好まし
くは同種）のミエローマ等の、リンパ球様細胞株との間
で融合させる。融合には。
センダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
等の融合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシ
ドＣＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加えるごとも可能
である。ＰＥＧの重合度は、ふつう１０００〜６０００
、時間はｏ、６〜３０分。
等の融合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシ
ドＣＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加えるごとも可能
である。ＰＥＧの重合度は、ふつう１０００〜６０００
、時間はｏ、６〜３０分。
濃度は１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件
の一例として、ＰＥＧ６０００を３６〜５５％で４〜１
０分処理することにより、効率よく融合させることが出
来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン培地（ＨＡＴ培地；ネイチャー、２５６，４９
５（１９７５）１等を用いて１選択的に増殖させる仁と
が出来る。
の一例として、ＰＥＧ６０００を３６〜５５％で４〜１
０分処理することにより、効率よく融合させることが出
来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン培地（ＨＡＴ培地；ネイチャー、２５６，４９
５（１９７５）１等を用いて１選択的に増殖させる仁と
が出来る。
増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるが否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には。
あるが否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には。
まず第１段階として免疫したペプチドに対する抗体ＢＨ
生の有ブＨ，（を、ＲＩＡ法またはＥＩＡ法へ、の方法
で調べることが出来るが、これらの方法についても種々
のヱぜ法が可能である。好ましい測定法の一例として、
ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロース
ビーズ等の担体に１例えばウサキ抗マウスイムノグロブ
リン抗体を常法に従ッてカプリングさせておき、これに
測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一定時間
、定温（以下４〜４０℃を示す）で反応させる。この後
。
生の有ブＨ，（を、ＲＩＡ法またはＥＩＡ法へ、の方法
で調べることが出来るが、これらの方法についても種々
のヱぜ法が可能である。好ましい測定法の一例として、
ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロース
ビーズ等の担体に１例えばウサキ抗マウスイムノグロブ
リン抗体を常法に従ッてカプリングさせておき、これに
測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一定時間
、定温（以下４〜４０℃を示す）で反応させる。この後
。
反応物をよく洗った後、酵素で標識したペプチド（Ｍ素
とペプチドを常法に従いカプリングさせた後精製）を加
え、一定時間、寅？晶で反応させる。
とペプチドを常法に従いカプリングさせた後精製）を加
え、一定時間、寅？晶で反応させる。
反応物をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定
温で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光
度等で測定することが出来る。
温で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光
度等で測定することが出来る。
選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は。
する抗体活性のみられたウェルの細胞は。
限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい
。クローン化された細胞の上清について同様にスクリー
ニングを行い抗体ｆ＋Ｉｔｉの高いウェルの細胞を増や
すことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモノク
ローナル抗体μＵ生ハイブリドーマクローンが得られる
。
。クローン化された細胞の上清について同様にスクリー
ニングを行い抗体ｆ＋Ｉｔｉの高いウェルの細胞を増や
すことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモノク
ローナル抗体μＵ生ハイブリドーマクローンが得られる
。
次にこれらクローンの産生ずる抗体が免役に用いたペプ
チドだけでなく、ＩＦＮ−１分子そのものと反応性を示
すか否かを調べる必要があるが。
チドだけでなく、ＩＦＮ−１分子そのものと反応性を示
すか否かを調べる必要があるが。
このためには、標識されたＩＦＮ−γを用いたＥＩＡ法
またはＥＩＡ法を用いて反応性を調べる方法や、生物活
性（ＩＦＮ−γ活性）がこの抗体により吸収されるか否
かを見る方法等が用いられる。後者の場合はＩＦＮ−γ
を精製する必要がないので有利に用いることが出来る。
またはＥＩＡ法を用いて反応性を調べる方法や、生物活
性（ＩＦＮ−γ活性）がこの抗体により吸収されるか否
かを見る方法等が用いられる。後者の場合はＩＦＮ−γ
を精製する必要がないので有利に用いることが出来る。
有利に用いられる一例を次に述べるが、もちろんこの他
にもプロティンＡを用いて免疫沈降物を除いた上清中の
残存ＩＦＮ−γ活性を測定する方法等も可能である。例
えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体をセルロース
ビーズ等の担体に常法に従いカプリングさせておき、こ
れに測定したいハイプリードーマ上清またはマウスの血
清を加え、一定時間。
にもプロティンＡを用いて免疫沈降物を除いた上清中の
残存ＩＦＮ−γ活性を測定する方法等も可能である。例
えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体をセルロース
ビーズ等の担体に常法に従いカプリングさせておき、こ
れに測定したいハイプリードーマ上清またはマウスの血
清を加え、一定時間。
定温で反応させる。この後反応物をよく洗い一定量のＩ
ＦＮ−γを加える。ＩＦＮ−γとして例えばヒト末梢血
リンパ球からレクチンとホルボールエステル等で誘導し
たＩＦＮ−γを含む培養Ｊｊｉｖや１組み換え体で大腸
菌等で作らせたＩＦＮ−γを含む抽出液等を用いること
が出来る。ＩＦＮ−γを加えた後、一定時間、定温で反
応させた後。
ＦＮ−γを加える。ＩＦＮ−γとして例えばヒト末梢血
リンパ球からレクチンとホルボールエステル等で誘導し
たＩＦＮ−γを含む培養Ｊｊｉｖや１組み換え体で大腸
菌等で作らせたＩＦＮ−γを含む抽出液等を用いること
が出来る。ＩＦＮ−γを加えた後、一定時間、定温で反
応させた後。
反応上清中に含まれるＩＦＮ−γの活性を測定する。こ
の様にして目的とする抗体のＩＦＮ−γ活性の吸収能を
測定することが出来る。
の様にして目的とする抗体のＩＦＮ−γ活性の吸収能を
測定することが出来る。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。具体的
には例えば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０に０
．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、
好ましくは８〜５日間培養することにより、培膚液から
該モノクローナル抗体を得ることができるが、この他に
マウス等の適切な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増
殖させ、腹水を採取することにより、細胞培養上清より
も遥かに高力価の抗体を、条里に効率よく取得すること
が出来る。このためには１例えばマウスの場合、ミネラ
ルオイル等を０１１もって接種したＢＡＬＢ ／ ｃ
等のマウスに１×１０４〜１ｘ１０７個、好ましくは５
ＸｌＯ’〜 ２Ｘ１０’個のハイブリドーマを腹腔内等
督こ接種し、７〜２０日後。
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。具体的
には例えば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０に０
．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、
好ましくは８〜５日間培養することにより、培膚液から
該モノクローナル抗体を得ることができるが、この他に
マウス等の適切な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増
殖させ、腹水を採取することにより、細胞培養上清より
も遥かに高力価の抗体を、条里に効率よく取得すること
が出来る。このためには１例えばマウスの場合、ミネラ
ルオイル等を０１１もって接種したＢＡＬＢ ／ ｃ
等のマウスに１×１０４〜１ｘ１０７個、好ましくは５
ＸｌＯ’〜 ２Ｘ１０’個のハイブリドーマを腹腔内等
督こ接種し、７〜２０日後。
好ましくは１０〜１４日後に腹水液等を採取する。
腹水に生成蓄積した抗体は５例えば硫安分画。
ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト等により。
容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとし
て単離することが出来る。
て単離することが出来る。
本発明のモノクローナル抗体は、下記の性状を有する。
（１）免疫に用いたポリペプチド（１）と結合する。
ｔ２１１ＦＮ−１分子と結合し、ＩＦＮ−σやＩＦＮ−
βとは結合しない。
βとは結合しない。
（３〕 オフタロニー法による検定：こよりＩｇＧ２ｂ
またはＩｇＧ１のサブクラスの抗体に属する。
またはＩｇＧ１のサブクラスの抗体に属する。
（４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、標準免疫グロブリンのＨ鎮およびＬ ＃）４に完全
に一致する２本の／＜ノドのみを示す。
て、標準免疫グロブリンのＨ鎮およびＬ ＃）４に完全
に一致する２本の／＜ノドのみを示す。
なお本モノクローナル抗体は？全にｔＡ造、使用。
保管することができる。
本発明により得られるモノクローナル抗体は。
ＥＩＡ法（イムノケミストリー、ｌ千、４２９（１９７
１））或いはＲＪ、Ａ法しサイエンス。
１））或いはＲＪ、Ａ法しサイエンス。
１５８．１５７０（１９６８））を活用することにより
、生体中の、或いは試＠管内でのｔｈ ｔａのＩＦＮ−
γのｍ出に用いることが出来ることの他に、たとえば抗
体カラムを作製することにより、令名大変困難とされて
いた天然の、或１．Ｊま遺伝子組みかえにより作られる
ＩＦＮ−γを、非″帛に効率良く精製するのに使用する
ことが出来る。
、生体中の、或いは試＠管内でのｔｈ ｔａのＩＦＮ−
γのｍ出に用いることが出来ることの他に、たとえば抗
体カラムを作製することにより、令名大変困難とされて
いた天然の、或１．Ｊま遺伝子組みかえにより作られる
ＩＦＮ−γを、非″帛に効率良く精製するのに使用する
ことが出来る。
ＩＦＮ−γの検出のためには、−例として、測定したい
ＩＦＮ−γを含む資料又は標準Ｉ ＦＮ−γを予め１例
えば放射性ヨード又は酵素等により標識した当該モノク
ローナル抗体と反応させ次いで免疫複合体を沈降させる
べく例えばプロティンＡを加え、一定時間反応させた後
、免役沈降物の放射活性又は酵素活性を測ることにより
ＩＦＮ−γの鼠を簡便に測定することができる。また、
抗原による競合法を用いる場合は１例えば目？リベブチ
ド（１）を放射性ヨード又は酵素標識し、これと一定規
の無標識の本発明モノクローナルの抗体を反応させる際
に、測定したいＩＦＮ−γを含む資料を共存させ１次い
で、免疫複合体を沈降させたり。
ＩＦＮ−γを含む資料又は標準Ｉ ＦＮ−γを予め１例
えば放射性ヨード又は酵素等により標識した当該モノク
ローナル抗体と反応させ次いで免疫複合体を沈降させる
べく例えばプロティンＡを加え、一定時間反応させた後
、免役沈降物の放射活性又は酵素活性を測ることにより
ＩＦＮ−γの鼠を簡便に測定することができる。また、
抗原による競合法を用いる場合は１例えば目？リベブチ
ド（１）を放射性ヨード又は酵素標識し、これと一定規
の無標識の本発明モノクローナルの抗体を反応させる際
に、測定したいＩＦＮ−γを含む資料を共存させ１次い
で、免疫複合体を沈降させたり。
あるいは抗マウス抗体に結合させることにより。
ＩＦＮ−γを定量することができる。ここで用（する放
射性ヨードまたは酵素標識体としては、ポリペプチド（
１）の代りに精製したＩＦＮ−γを使うこ部分精製され
たＩＦＮ−γまた１よポリペプチド（１）をマイクロト
レイ等の同相に固定する。固定する方法としては、例え
ば、０．１Ｍの重ソウを含有するリン酸緩１ＩＪＩ液に
ＩＦＮ−γまたはポリペプチド（１）を０１１１１−１
００μｆ／ｍｅ 濃度好ましくは１０〜２０μｐ／ｍ（
ｌ に浮遊させこの１００μｇｔマイクロトレイの各ウ
ェルに人件２４時間処理することにより可能である。こ
のウェルに本発明モノクローナル抗体と測定しｒＷ Ｆ
Ｎ−γを含む資料を８７℃で１時間又は４℃で２００
時間反応せたものを加え、さらに放射性ヨードまたは酵
素標識した抗マウス ウサギ抗体等を加えることにより
ＩＦＮ−γを定量することができる。これら一連のＥＩ
Ａ法において酵素標識した抗マウス ウサギ抗体等を用
いた場合は、いわゆるＥＬＩＳＡ、（エンザイム リン
クド イムノ ソーペント アッセイ）法によりマルチ
スキャン〔フロー社）等を用いた迅速アッセイ法が可能
となる。また、抗原認識部位の異なる２種の１１イブリ
ド−マクローンの産生ずるモノクローナル抗体を用いた
場合は。
射性ヨードまたは酵素標識体としては、ポリペプチド（
１）の代りに精製したＩＦＮ−γを使うこ部分精製され
たＩＦＮ−γまた１よポリペプチド（１）をマイクロト
レイ等の同相に固定する。固定する方法としては、例え
ば、０．１Ｍの重ソウを含有するリン酸緩１ＩＪＩ液に
ＩＦＮ−γまたはポリペプチド（１）を０１１１１−１
００μｆ／ｍｅ 濃度好ましくは１０〜２０μｐ／ｍ（
ｌ に浮遊させこの１００μｇｔマイクロトレイの各ウ
ェルに人件２４時間処理することにより可能である。こ
のウェルに本発明モノクローナル抗体と測定しｒＷ Ｆ
Ｎ−γを含む資料を８７℃で１時間又は４℃で２００
時間反応せたものを加え、さらに放射性ヨードまたは酵
素標識した抗マウス ウサギ抗体等を加えることにより
ＩＦＮ−γを定量することができる。これら一連のＥＩ
Ａ法において酵素標識した抗マウス ウサギ抗体等を用
いた場合は、いわゆるＥＬＩＳＡ、（エンザイム リン
クド イムノ ソーペント アッセイ）法によりマルチ
スキャン〔フロー社）等を用いた迅速アッセイ法が可能
となる。また、抗原認識部位の異なる２種の１１イブリ
ド−マクローンの産生ずるモノクローナル抗体を用いた
場合は。
いわゆるサンドウィッチ法（ヨーロピアン ジャーナル
オブ バイオケミストリー、 ７１ 、４５９（１９
７６））による、より簡便なＩＦＮ−γの測定が可能と
なる。もちろん、これらのＥ Ｉ Ａ。
オブ バイオケミストリー、 ７１ 、４５９（１９
７６））による、より簡便なＩＦＮ−γの測定が可能と
なる。もちろん、これらのＥ Ｉ Ａ。
ＲＩＡを利用したＩＦＮ−γの定Ｉｆ大に適切な抗体さ
え得られれば１種々の変法がＤｒ能であり、上記した方
法に限定されるものではない。
え得られれば１種々の変法がＤｒ能であり、上記した方
法に限定されるものではない。
ＩＦＮ−γの精製のためには、精製した当該抗体を例え
ば活性化したアガロースゲルピースの様な適切な担体に
常法に従ってカプリングさせた後、カラムに充め、培養
１清或いは破さいしｔこ菌体等ＣＤ粗ＩＦＮ−γを含む
資料をカラムにかけ、吸着させた後、洗浄し、その後例
えばＫＳＣＮの様なカオトロピック試菓、或いはＩＦＮ
−γの失地のない程度の弱酸性条件で溶出させる方法幅
により。
ば活性化したアガロースゲルピースの様な適切な担体に
常法に従ってカプリングさせた後、カラムに充め、培養
１清或いは破さいしｔこ菌体等ＣＤ粗ＩＦＮ−γを含む
資料をカラムにかけ、吸着させた後、洗浄し、その後例
えばＫＳＣＮの様なカオトロピック試菓、或いはＩＦＮ
−γの失地のない程度の弱酸性条件で溶出させる方法幅
により。
効率よく精製できる。
抗体カラムの作製は１例えばノ）イブリドーマを接種し
た腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗
体を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の
様な方法でできる。
た腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗
体を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の
様な方法でできる。
用いる担体は、カプリングの後にＩＦＮ−γが特異的に
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、−例として蛋白の一級ア
ミンが結合し易い様に粘性化す１１、ｒコアガロ−スプ
ルビーズ１例えばアフィゲル−１０（パイ１ラド社製〕
などが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。ア
フィゲル−１Ｏと抗体との反応は、０．００１〜ＩＭ、
好ましくは０．１ Ｍのバイカーボネート周：の緩衝液
中で反応を行なう。反応条件はθ°〜２０℃、１０分〜
２４時間１種々のＩ）Ｈが可能であるが、好ましくは、
４℃、４時間、ｐＨ８〜１０の条件が用いられる。混合
するアフィゲル−１０と抗体の量比は。
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、−例として蛋白の一級ア
ミンが結合し易い様に粘性化す１１、ｒコアガロ−スプ
ルビーズ１例えばアフィゲル−１０（パイ１ラド社製〕
などが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。ア
フィゲル−１Ｏと抗体との反応は、０．００１〜ＩＭ、
好ましくは０．１ Ｍのバイカーボネート周：の緩衝液
中で反応を行なう。反応条件はθ°〜２０℃、１０分〜
２４時間１種々のＩ）Ｈが可能であるが、好ましくは、
４℃、４時間、ｐＨ８〜１０の条件が用いられる。混合
するアフィゲル−１０と抗体の量比は。
アフィゲル１ｍＪに対し抗体以が約５０ｍ１位迄は勺３
０館ｊの抗体が好都合に用いられる。この様にしてでき
た抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗っ
た後、数日放置するか、もしくは最終濃度００５Ｍのエ
タノールアミン・塩酸を加え４℃で１時間反応させる等
の方法により、残存する未反応の活性基をブロックした
後、適切なカラムにつめることにより、抗体カラムとし
て使用できる。
０館ｊの抗体が好都合に用いられる。この様にしてでき
た抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗っ
た後、数日放置するか、もしくは最終濃度００５Ｍのエ
タノールアミン・塩酸を加え４℃で１時間反応させる等
の方法により、残存する未反応の活性基をブロックした
後、適切なカラムにつめることにより、抗体カラムとし
て使用できる。
上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばヒ
ト免疫インターフェロン蛋白質含有資料を中性附近の緩
衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶
解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝
液で洗浄したのち、ＩＦＮ−γを〆出する。溶出液とし
ては１弱酸性溶液たとえば酢酸出液、！リエチレングリ
コールを含む溶液、資料にくらべ抗体に、より結合し易
いペプチドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれら
を組み合せた２溶液などが用いられ、ヒトＩ−ＩＦＮの
分解をあまり促進しないものが好ましい。
ト免疫インターフェロン蛋白質含有資料を中性附近の緩
衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶
解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝
液で洗浄したのち、ＩＦＮ−γを〆出する。溶出液とし
ては１弱酸性溶液たとえば酢酸出液、！リエチレングリ
コールを含む溶液、資料にくらべ抗体に、より結合し易
いペプチドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれら
を組み合せた２溶液などが用いられ、ヒトＩ−ＩＦＮの
分解をあまり促進しないものが好ましい。
カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和す４必要によ
り再度上記の抗体カラムによる精製操作を行なうことが
できる。
り再度上記の抗体カラムによる精製操作を行なうことが
できる。
ここで得られるヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質溶液は透析に付し
、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることがで
きる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニトー
ル、デキストロース、マルトース、グリセロールなどの
安定剤を加えることができる。
、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることがで
きる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニトー
ル、デキストロース、マルトース、グリセロールなどの
安定剤を加えることができる。
かくして得られるヒト免疫インターフェロン蛋白質はヒ
ト羊膜由来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウィルス
（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験によるウィルス活性
測定において１０’Ｕ／ｍｙ以上の比活性を示すもので
ある。
ト羊膜由来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウィルス
（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験によるウィルス活性
測定において１０’Ｕ／ｍｙ以上の比活性を示すもので
ある。
なおここでＩＦＮの活性としてのＵ／ｍｇ（ユニット／
ｍｅ）の出し万は以下の様に行った。ユニットの確定し
た国際標準ＩＦＮ−αと白血球由来の粗ＩＦＮ−γをヒ
ト羊膜由来ＦＬ細胞株に対するｖＳｖの細胞変性効果阻
止試験を用いて測定し、その力価の比較から白血球由来
箱ＩＦＮ−γの力価を決定しＩＦＮ−γの標準品とした
。目的とする資料中のＩＦＮ−γの力価算定のためには
、畠にこの標準ＩＦＮ−γを並べて■ｉｆ述のＷＩＳＨ
−ＶＳＶの系でアッセイを行い、その比率から力価を算
出した。
ｍｅ）の出し万は以下の様に行った。ユニットの確定し
た国際標準ＩＦＮ−αと白血球由来の粗ＩＦＮ−γをヒ
ト羊膜由来ＦＬ細胞株に対するｖＳｖの細胞変性効果阻
止試験を用いて測定し、その力価の比較から白血球由来
箱ＩＦＮ−γの力価を決定しＩＦＮ−γの標準品とした
。目的とする資料中のＩＦＮ−γの力価算定のためには
、畠にこの標準ＩＦＮ−γを並べて■ｉｆ述のＷＩＳＨ
−ＶＳＶの系でアッセイを行い、その比率から力価を算
出した。
本発明で精製処理されるヒト免疫インターフェロン蛋白
質は、たとえば一般式 ％式％ （１） 〔式中、ＡはＭｅｔまたは結合手を示しｉ ｚｌｌ Ｚ
２はそれぞれＣｙｓまたはｔ／２ｃｙ ８を示す〕のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するものである
。本発明の精製処理によれば当該ポリペプチドを乾燥品
基準で９０％以ととりわけ９５％以上含ン蛋白質をｔカ
ることができる。
質は、たとえば一般式 ％式％ （１） 〔式中、ＡはＭｅｔまたは結合手を示しｉ ｚｌｌ Ｚ
２はそれぞれＣｙｓまたはｔ／２ｃｙ ８を示す〕のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するものである
。本発明の精製処理によれば当該ポリペプチドを乾燥品
基準で９０％以ととりわけ９５％以上含ン蛋白質をｔカ
ることができる。
１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１７，５％）電
気泳動による分子量測定で１７，０００±ｉ、ｏｏ。
気泳動による分子量測定で１７，０００±ｉ、ｏｏ。
を示す。
２）アミノ末端アミノ酸としてシスティンもしくはハー
フシスチンまたはメチオニンを有する。
フシスチンまたはメチオニンを有する。
８） Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−８ｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇｌｎ−ＯＨＩこ対
するモノクローナル抗体と結合する。
Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇｌｎ−ＯＨＩこ対
するモノクローナル抗体と結合する。
本発明により精製されたヒト免疫インターフェロン蛋白
質は従来の方法で得られるＩ−ＩＦＮと同様の目的に同
様の用法により使用できるカダ、従来品に比し５夾雑蛋
白質１発熱物質力；少な０ので。
質は従来の方法で得られるＩ−ＩＦＮと同様の目的に同
様の用法により使用できるカダ、従来品に比し５夾雑蛋
白質１発熱物質力；少な０ので。
注射剤原体等としてより安全に使用される。
本発明により製造されるヒトＩ −Ｉ ＦＮ蛋白質は抗
ウィルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を
示す。本発明により製造されるヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質は
滅菌水、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）、生理食塩水そ
の他公知の生理学的に許容される担体と混合すること力
Ｓでき、非紅口的に又は局所に投与することができる。
ウィルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を
示す。本発明により製造されるヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質は
滅菌水、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）、生理食塩水そ
の他公知の生理学的に許容される担体と混合すること力
Ｓでき、非紅口的に又は局所に投与することができる。
例えば、成人１日当り１０万〜１億ユニット好ましく【
よ６ ｏ ｏ ｏ万〜６００ （Ｉユニットを静注又（
よ筋注などにより投与することができる。
よ６ ｏ ｏ ｏ万〜６００ （Ｉユニットを静注又（
よ筋注などにより投与することができる。
本発明のヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質を含有する製剤は、塩、
希釈剤、アジュノくンド、他の担体、〕＜゛ノファー、
結合剤、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容され
る他の活性成分も含有していてもよい。非経口的投与用
製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との
懸濁液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で
用事希釈して使用しつる滅菌粉末（通常１−ＩＦＮ溶液
を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提供される。
希釈剤、アジュノくンド、他の担体、〕＜゛ノファー、
結合剤、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容され
る他の活性成分も含有していてもよい。非経口的投与用
製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との
懸濁液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で
用事希釈して使用しつる滅菌粉末（通常１−ＩＦＮ溶液
を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提供される。
さらに上記したヒト免疫インターフェロン蛋白質を含有
する製剤は、ＩＦＮ−αまたはＩ ＦＮ−βまたはイン
ターロイキン２などのリンホカインのような他の活性成
分を本発明物質に対し１〜９９％を含有していてもよい
。
する製剤は、ＩＦＮ−αまたはＩ ＦＮ−βまたはイン
ターロイキン２などのリンホカインのような他の活性成
分を本発明物質に対し１〜９９％を含有していてもよい
。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保獲基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合。
基、その他に関し略号で表示する場合。
それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ
ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｒｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒ
ｅ）による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり。
ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｒｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒ
ｅ）による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり。
その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光学異
性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。
性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。
ＤＮＡ 、デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ニゲアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三すン酸ｄ ＣＴＰ
：デオキシシチジン三すン酸ＡＴＰ ：アデノシン三リ
ン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ニゲリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン ｌｉｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ニジスティン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フエニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ニトリブトファン Ｐｒｏ ニブロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ２ ：カルボベンゾキシ Ｂｏａ ：ｔ−ブトキシカルボニル Ｍｔｒ’：４−メトキシ−２，８，６−）リメチルベン
ゼンスルホニル Ｐｍｅ ：ペンタメチルベンゼンスルホニルＯＢｕ ：
ｔ−ブチルエステル ＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８
−ジカルボキシイミドエステル ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド ＤＣＵ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルウレアＨＯＮＢ
： Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８−ジ
カルボキシイミド ＨＱＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールＣＨＡ
ニジクロヘキシルアミン ＤＣＨＡニジシクロヘキシルアミン ＴＥＡ：）リエチルアミン ＴＦＡニトリフルオロ酢酸 ＭＳＡ ：メタンスルホン酸 ＴＨＦ 、テトラヒドロフラン ＤＭＦ ニジメチルホルムアミド ＭｅＯＨ：メタノール Ａｃ０Ｅｔ：酢酸エチル 以下一実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが１本発明はこれらに制限されるものではない
。
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三すン酸ｄ ＣＴＰ
：デオキシシチジン三すン酸ＡＴＰ ：アデノシン三リ
ン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ニゲリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン ｌｉｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ニジスティン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フエニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ニトリブトファン Ｐｒｏ ニブロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ２ ：カルボベンゾキシ Ｂｏａ ：ｔ−ブトキシカルボニル Ｍｔｒ’：４−メトキシ−２，８，６−）リメチルベン
ゼンスルホニル Ｐｍｅ ：ペンタメチルベンゼンスルホニルＯＢｕ ：
ｔ−ブチルエステル ＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８
−ジカルボキシイミドエステル ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド ＤＣＵ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルウレアＨＯＮＢ
： Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８−ジ
カルボキシイミド ＨＱＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールＣＨＡ
ニジクロヘキシルアミン ＤＣＨＡニジシクロヘキシルアミン ＴＥＡ：）リエチルアミン ＴＦＡニトリフルオロ酢酸 ＭＳＡ ：メタンスルホン酸 ＴＨＦ 、テトラヒドロフラン ＤＭＦ ニジメチルホルムアミド ＭｅＯＨ：メタノール Ａｃ０Ｅｔ：酢酸エチル 以下一実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが１本発明はこれらに制限されるものではない
。
下記実施例に開示しているマウヌＢハイプリドーマγ２
−１１．１およびマウスＢハイプリドーマγ３−１１．
１は、パヌッー／Ｉ／り［突所〔フランス国パリ〕のＣ
，Ｎ、Ｃ，Ｍ、にそれぞれ寄託番号ｌ！１Ｌ１−２４２
およびｌ’ｈＩ−２４３として寄託されている。
−１１．１およびマウスＢハイプリドーマγ３−１１．
１は、パヌッー／Ｉ／り［突所〔フランス国パリ〕のＣ
，Ｎ、Ｃ，Ｍ、にそれぞれ寄託番号ｌ！１Ｌ１−２４２
およびｌ’ｈＩ−２４３として寄託されている。
また下記参考例２に開示している形質転換体Ｅ。
ｃｏｌｉ ２９４／ｐＨＩＴ ｔｒｐ ２１０１は、通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ Ｂ Ｉ
）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−り！り０ として寄託さ
れている。
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ Ｂ Ｉ
）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−り！り０ として寄託さ
れている。
発明′ｆ！：実施するための最良の形即以下の実施例に
おいて、薄層クロマトグラフィーは、メルク社製シリカ
ゲルプレート６０ Ｆ２５４又は、フナコシ薬品社製セ
ルロースプレート、アビセルＳＦを用い、下記の展開溶
媒を用いた。
おいて、薄層クロマトグラフィーは、メルク社製シリカ
ゲルプレート６０ Ｆ２５４又は、フナコシ薬品社製セ
ルロースプレート、アビセルＳＦを用い、下記の展開溶
媒を用いた。
Ｒｆ ｌ ：クロロホルム：メタノール、酢酸ヨ９：１
：０．５ Ｒｆ２：酢酸エチル：ピリジン：酢Ｇｔ：水＝ｓ。
：０．５ Ｒｆ２：酢酸エチル：ピリジン：酢Ｇｔ：水＝ｓ。
：１０：８：５
Ｒｆ３：クロロホルム：メタノール：水＝７二３：０．
５ Ｒｆ’： ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水−８０
：２０：６：２４ Ｒｆ’：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝ｌ：
１：１：１ 実施例１ （１） Ｚ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕＬの製造Ｚ−Ｇｉ
ｎ−ＯＢｕ ｌ Ｏ，１ｐをメタノール５００ｍｇに溶
解し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で環元した。触
媒をろ去し、溶Ｗ、Ｊｅ留去した残留物をＺ−５ｅｒ−
ＯＨ７，５ｆ 、 ＨＯＮＢ６．８１とともにＤＭＦ２
６０ｍｇ’に溶解し、氷冷した。水冷下にＤＣＣ７，１
５Ｆを加え、０℃で４時間室温で１２時間攪拌した。析
出したＤＣＵをろ去し、溶媒を留去ののち残留物をＡｃ
０Ｅｔ ８００ｍｇに抽出し、４％ＮａＨＣＯ３水、０
．２Ｎ塩酸、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した
。溶媒を留去し、析出した結晶をエーテルでろ取し、乾
燥ののちＣｆ１３ＣＮより再結晶した。収Ｍ６．５ｆ、
収率５１．２％。
５ Ｒｆ’： ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水−８０
：２０：６：２４ Ｒｆ’：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝ｌ：
１：１：１ 実施例１ （１） Ｚ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕＬの製造Ｚ−Ｇｉ
ｎ−ＯＢｕ ｌ Ｏ，１ｐをメタノール５００ｍｇに溶
解し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で環元した。触
媒をろ去し、溶Ｗ、Ｊｅ留去した残留物をＺ−５ｅｒ−
ＯＨ７，５ｆ 、 ＨＯＮＢ６．８１とともにＤＭＦ２
６０ｍｇ’に溶解し、氷冷した。水冷下にＤＣＣ７，１
５Ｆを加え、０℃で４時間室温で１２時間攪拌した。析
出したＤＣＵをろ去し、溶媒を留去ののち残留物をＡｃ
０Ｅｔ ８００ｍｇに抽出し、４％ＮａＨＣＯ３水、０
．２Ｎ塩酸、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した
。溶媒を留去し、析出した結晶をエーテルでろ取し、乾
燥ののちＣｆ１３ＣＮより再結晶した。収Ｍ６．５ｆ、
収率５１．２％。
ｍｐ、９７−１００℃、（αｌＶ’−２４，１’（ｃ＝
０．４０）ｐ ／ −Ｊｌ／ ） 、 Ｒｆ ’ ０．
６４元元素析 Ｃ２０Ｈ２Ｏ０７Ｎ３として計算値：
Ｃ，５６，７２； Ｈ，６，９０； Ｎ、９．９２実験
値： Ｃ，５６，２１； Ｈ，６，７２； Ｎ、９．７
６（Ｉｆ） Ｚ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの
Ｍ造Ｚ−５ｅ ｒ−Ｇ ｌ ｎ−０Ｂｕ ’ ４．２８
ｆをメタノール８００ｍ１？に溶解し、パラジウム黒
を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を
留去した残留物をＺ−Ａｌａ−ＯＨ２，８４１，ＨＯＮ
Ｂ ２．２７１とともに。
０．４０）ｐ ／ −Ｊｌ／ ） 、 Ｒｆ ’ ０．
６４元元素析 Ｃ２０Ｈ２Ｏ０７Ｎ３として計算値：
Ｃ，５６，７２； Ｈ，６，９０； Ｎ、９．９２実験
値： Ｃ，５６，２１； Ｈ，６，７２； Ｎ、９．７
６（Ｉｆ） Ｚ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔの
Ｍ造Ｚ−５ｅ ｒ−Ｇ ｌ ｎ−０Ｂｕ ’ ４．２８
ｆをメタノール８００ｍ１？に溶解し、パラジウム黒
を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を
留去した残留物をＺ−Ａｌａ−ＯＨ２，８４１，ＨＯＮ
Ｂ ２．２７１とともに。
ＡｃＯＥｔ２００ｍｅとジオキサン２ｏｏｍｅ、ＤＭＦ
ｌｏｏｍｌｉの混合俗媒に溶解し、水冷した。冷却下に
ＤＣＣ２，８８１を加えて０℃で４時間、室温で１２時
間攪拌ののち、ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去した。残留
物に（ＪＬｉＣＮとエーテルを加え結晶としろ取、乾燥
ののちＣＩ（：＋ＣＮより［１結晶した。
ｌｏｏｍｌｉの混合俗媒に溶解し、水冷した。冷却下に
ＤＣＣ２，８８１を加えて０℃で４時間、室温で１２時
間攪拌ののち、ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去した。残留
物に（ＪＬｉＣＮとエーテルを加え結晶としろ取、乾燥
ののちＣＩ（：＋ＣＮより［１結晶した。
収量８．７２ｇ、収率７５．８％、＋１１ｐ、１（ｉ５
１７０５ ℃、〔αｍｌ Ｄ−４１，２°（ｃ、＝０．５０ 、メ
タノール）。
１７０５ ℃、〔αｍｌ Ｄ−４１，２°（ｃ、＝０．５０ 、メ
タノール）。
Ｒｆｌｏ、６０
元素分析 Ｃ２ｓ Ｈ３４０ｓ Ｎイとして計算値：Ｃ
，５５，８６；Ｈ，６，９８；Ｎ、１１Ｊ８実験値：Ｃ
，５５，５８；Ｈ，６，７４； Ｎ、１１．１２（ｆｉ
ｌ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｉｎ
−ＯＢｕの製造 Ｚ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−ＯＢｕＬ８．４６ ｙを
メタノールｓｏｏｍｅに溶解し、パラジウム黒を触媒に
水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した
残留物を、 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０１１−ＣＩＩＡ
４．５４ ｆから調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ｏ
Ｈ，ＨＯＢｔ １．９ ｙとともにＤＭＦ１５０ｍｅに
溶解し水冷しｔこ。冷水下にＤＣＣ１，９ｔ ヲ加、ｔ
、 ０℃で４時間、室１！ｆ＋！ｔ テ１５時間攪拌し
た。ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去し残留物にＡｃ０Ｅｔ
を加えゲル状の沈澱を得、ろ取した。乾燥後、メタノー
ルとＡｃ０Ｅｔより再沈澱した。収ｆｉ４．５５Ｆ、収
率７５，５％、ｍｐ、１８０−５ １８４℃、［１Ｄ−２４，１°（ｃ＝０．２６．メタノ
ール）、Ｒｆ’０．５７ 元素分析 Ｃ４０Ｈ６ｏ ０ｔＩＮｓ ５−ｉＨ２０と
して計算値：Ｃ，５５，２２；Ｈ，７，０７；Ｎ、１２
．８８；Ｓ 、 ８．６９ 実験値、Ｃ，５５，２８； Ｈ，６，９８；Ｎ、１２．
５４；Ｓ、８．４８ （ＩＶ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇｌｎ−ＯＢｕ の製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌ ｎ−
０Ｂｕｔ４．８ ｙをメタノール４００ｍｅに溶解し、
パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ
去し、溶奴を留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−０Ｈ−ＣＨＡ８．２４ｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ ）−０ＩＩ、 １１０Ｂ ｔｌ、４２Ｆとともに
ＤＭＦ２００ｍｅにｔ６解し水ン令した。冷却下にＤｃ
ｃｔ４１ｐを加えＯ’Ｃ’ｔ’４時間。
，５５，８６；Ｈ，６，９８；Ｎ、１１Ｊ８実験値：Ｃ
，５５，５８；Ｈ，６，７４； Ｎ、１１．１２（ｆｉ
ｌ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｉｎ
−ＯＢｕの製造 Ｚ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−ＯＢｕＬ８．４６ ｙを
メタノールｓｏｏｍｅに溶解し、パラジウム黒を触媒に
水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した
残留物を、 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０１１−ＣＩＩＡ
４．５４ ｆから調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ｏ
Ｈ，ＨＯＢｔ １．９ ｙとともにＤＭＦ１５０ｍｅに
溶解し水冷しｔこ。冷水下にＤＣＣ１，９ｔ ヲ加、ｔ
、 ０℃で４時間、室１！ｆ＋！ｔ テ１５時間攪拌し
た。ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去し残留物にＡｃ０Ｅｔ
を加えゲル状の沈澱を得、ろ取した。乾燥後、メタノー
ルとＡｃ０Ｅｔより再沈澱した。収ｆｉ４．５５Ｆ、収
率７５，５％、ｍｐ、１８０−５ １８４℃、［１Ｄ−２４，１°（ｃ＝０．２６．メタノ
ール）、Ｒｆ’０．５７ 元素分析 Ｃ４０Ｈ６ｏ ０ｔＩＮｓ ５−ｉＨ２０と
して計算値：Ｃ，５５，２２；Ｈ，７，０７；Ｎ、１２
．８８；Ｓ 、 ８．６９ 実験値、Ｃ，５５，２８； Ｈ，６，９８；Ｎ、１２．
５４；Ｓ、８．４８ （ＩＶ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇｌｎ−ＯＢｕ の製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌ ｎ−
０Ｂｕｔ４．８ ｙをメタノール４００ｍｅに溶解し、
パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒をろ
去し、溶奴を留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−０Ｈ−ＣＨＡ８．２４ｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ ）−０ＩＩ、 １１０Ｂ ｔｌ、４２Ｆとともに
ＤＭＦ２００ｍｅにｔ６解し水ン令した。冷却下にＤｃ
ｃｔ４１ｐを加えＯ’Ｃ’ｔ’４時間。
室温で２０時間攪拌した。ＤＣＵをろ去し、１６媒を留
去した残留物にＡｃ０Ｅｔを加え沈澱を得、ろ取した。
去した残留物にＡｃ０Ｅｔを加え沈澱を得、ろ取した。
乾燥後、メタノールとＡｃ０Ｅｔより、置注ぬした。収
量４４ｇ、収率７１．７％、ｍｐ、１２５−１８０℃、
〔α］ ”、Ｆ −１８，０°（ｃ＝０．４０゜メタノ
ール） 、 Ｒｆ’ ０．６８ 元素分析 Ｃ５７Ｈ８６０１４Ｎ１２ Ｓ２°Ｈ２０と
して計算値：Ｃ，５４，９６；Ｈ，７，１２；Ｎ、１８
．５０；Ｓ、５．１５ 実験値： Ｃ，５４，６６； Ｈ，６，９２； Ｎ、１
８．８２；Ｓ 、 ５．８４ （Ｖ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−（）Ｂｕ の
製造Ｚ−Ｇｌｙ（）Ｂｕ １８．Ｏｆ’／ＭｅＯＨ５０
０ｍｌ？にとかじ、Ｐｄ黒を触媒として、水素気流中、
接触還元した０触媒を戸別し、Ｐ液を減圧濃縮し、残留
物をＤＭＦ２００ｍｅにとかした。これに、Ｚ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−０Ｈ−ＣＩ（Ａ ２０． ＯｆよりＩＩ、
］ １ｐｊＪ （、たＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−ＯＨ，
ＨＯＢ ｔ ５．４ ｙを加えて水冷し、ＤＣＣ８，２
ｆを加えて４８時間かき混ぜた。析出したＤＣＵを戸別
し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔ ５００ｍｅにとかした。Ａｃ
０Ｅｔ／ｌ’９を４％Ｎ ａ ＩＩＣＯ：＋ 水、１０
％クエン酸水で洗浄後、 Ｎａ２ＳＯ４で乾郷した。濃
縮後１石油ベンジンを加えて沈澱として炉取した。
量４４ｇ、収率７１．７％、ｍｐ、１２５−１８０℃、
〔α］ ”、Ｆ −１８，０°（ｃ＝０．４０゜メタノ
ール） 、 Ｒｆ’ ０．６８ 元素分析 Ｃ５７Ｈ８６０１４Ｎ１２ Ｓ２°Ｈ２０と
して計算値：Ｃ，５４，９６；Ｈ，７，１２；Ｎ、１８
．５０；Ｓ、５．１５ 実験値： Ｃ，５４，６６； Ｈ，６，９２； Ｎ、１
８．８２；Ｓ 、 ５．８４ （Ｖ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−（）Ｂｕ の
製造Ｚ−Ｇｌｙ（）Ｂｕ １８．Ｏｆ’／ＭｅＯＨ５０
０ｍｌ？にとかじ、Ｐｄ黒を触媒として、水素気流中、
接触還元した０触媒を戸別し、Ｐ液を減圧濃縮し、残留
物をＤＭＦ２００ｍｅにとかした。これに、Ｚ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−０Ｈ−ＣＩ（Ａ ２０． ＯｆよりＩＩ、
］ １ｐｊＪ （、たＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−ＯＨ，
ＨＯＢ ｔ ５．４ ｙを加えて水冷し、ＤＣＣ８，２
ｆを加えて４８時間かき混ぜた。析出したＤＣＵを戸別
し、濃縮後、Ａｃ０Ｅｔ ５００ｍｅにとかした。Ａｃ
０Ｅｔ／ｌ’９を４％Ｎ ａ ＩＩＣＯ：＋ 水、１０
％クエン酸水で洗浄後、 Ｎａ２ＳＯ４で乾郷した。濃
縮後１石油ベンジンを加えて沈澱として炉取した。
収ｆｆ１１９．８１ （９６，８％）。ｍｐ、７１−７
８℃。
８℃。
〔α〕２ｏ８＋０．２°（ｃ−０，９、ＤＭＦ ） 、
Ｒｆ’０．６２ 元素分析 Ｃ３１Ｈ４６０ｙ Ｎｓ Ｓ として計算値
： Ｃ，５８，９８； Ｈ，７，１８；Ｎ、１１．０９
；Ｓ 、 ５．０８ 実験値： Ｃ，５９，４２； Ｈ，７，５８； Ｎ、１
０．９５；Ｓ 、 ４．８４ （Ｖｌ） Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｂｕ’の製造Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕ
ｔｌ ０． ＯｆをＭｅＯＨ５ｏｏｍｔ’中、接触還元
したのち、ＤＭＦ８００ｍｅに転溶した。これにＺ−Ｐ
ｈｅ−ＯＨ４，７２ｆ 。
Ｒｆ’０．６２ 元素分析 Ｃ３１Ｈ４６０ｙ Ｎｓ Ｓ として計算値
： Ｃ，５８，９８； Ｈ，７，１８；Ｎ、１１．０９
；Ｓ 、 ５．０８ 実験値： Ｃ，５９，４２； Ｈ，７，５８； Ｎ、１
０．９５；Ｓ 、 ４．８４ （Ｖｌ） Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｂｕ’の製造Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕ
ｔｌ ０． ＯｆをＭｅＯＨ５ｏｏｍｔ’中、接触還元
したのち、ＤＭＦ８００ｍｅに転溶した。これにＺ−Ｐ
ｈｅ−ＯＨ４，７２ｆ 。
ＨＯＢｔ２．８５ ｙを加えて水冷し、 ＤＣＣ８，５
９１を加えて、１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵを
戸別し、Ｐ液を濃縮後、残留物をＡｃＯＥｔ４００ｍｌ
ｌにとかした。ＡｃｏＥｔ層は、４％ＮａＨＣＯ３水。
９１を加えて、１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵを
戸別し、Ｐ液を濃縮後、残留物をＡｃＯＥｔ４００ｍｌ
ｌにとかした。ＡｃｏＥｔ層は、４％ＮａＨＣＯ３水。
１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し島濃
縮後、エーテルを加えて結晶として枦取し・ＭｅＯＨ−
エーテルより再結晶した。収量１０．５＃６ （８５，８％）。ｍｐ、１０１−１０８℃、 ｒ−ａ〕
Ｄ−８，８° （ｃ＝０．９ 、ＤＭＦ ）、Ｒｆ’
０．６４元素分析 Ｃ４ｏ Ｈ６４０ｓ Ｎ、 Ｓとし
て計算値：Ｃ，６１，６７；Ｈ，６，９９；Ｎ、１０．
７９；Ｓ 、 ４．１２ 実験値： Ｃ，６１，６６； Ｈ，６，５６； Ｎ、１
０．９８；Ｓ 、 ４．１４ （Ｖｉｆ） Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ５−
５ ’をＭｅ０１８００ｍｅ中、接触還元したのち、Ｄ
ＭＦ８００ｍｅに転溶した。これに、 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｏ
ＨＤＣＩＩＡ ８．８１ｆより調製したＺ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ，ＨＯＮＢ １．４７ ｆを加えて氷冷し、ＤＣＣｌ
、６８ｆを加えて４８時間かきまぜた。析出したＤｃｕ
ｚ７ｐ別し、濃縮後。
縮後、エーテルを加えて結晶として枦取し・ＭｅＯＨ−
エーテルより再結晶した。収量１０．５＃６ （８５，８％）。ｍｐ、１０１−１０８℃、 ｒ−ａ〕
Ｄ−８，８° （ｃ＝０．９ 、ＤＭＦ ）、Ｒｆ’
０．６４元素分析 Ｃ４ｏ Ｈ６４０ｓ Ｎ、 Ｓとし
て計算値：Ｃ，６１，６７；Ｈ，６，９９；Ｎ、１０．
７９；Ｓ 、 ４．１２ 実験値： Ｃ，６１，６６； Ｈ，６，５６； Ｎ、１
０．９８；Ｓ 、 ４．１４ （Ｖｉｆ） Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ５−
５ ’をＭｅ０１８００ｍｅ中、接触還元したのち、Ｄ
ＭＦ８００ｍｅに転溶した。これに、 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｏ
ＨＤＣＩＩＡ ８．８１ｆより調製したＺ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ，ＨＯＮＢ １．４７ ｆを加えて氷冷し、ＤＣＣｌ
、６８ｆを加えて４８時間かきまぜた。析出したＤｃｕ
ｚ７ｐ別し、濃縮後。
ＡｃＯＥｔ８００ｍｅにとかした。Ａｃ０ＥｔｌＱは、
４％Ｎ ａ ＨＣＯｓ 水、１０％クエン酸水で洗浄し
、Ｎ ａ２ Ｓ ０４で乾燥した。濃縮後、エーテルを
加えて粉末として枦取した。収％６．２１ （９８，８
％）”’−１５，５°（ｃ＝ ｎ１ｐ、１７１−１７８℃、〔α〕Ｄ ０．９ 、 ＤＭＦ ） 、 Ｒｆ’ ０．６４元素分
析 Ｃ４６Ｉ（６５０９Ｎ７ Ｓ計算値：Ｃ，６１，９
８；Ｈ，７，８４；Ｎ、１０．９９；Ｓ 、 ８．５９ 実験値： Ｃ，６２，０２；Ｈ，？、８７； Ｎ、１１
．０８；Ｓ 、 ８．５９ （Ｖｉｌ：）Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−（）
Ｂｕｔ６． ＯｆをＭｅＯＨ２０Ｏｍｅ中、接触還元し
たのち、ＤＭＦ１５０ｍｅに転浴した。これに、Ｂｏｃ
−Ｍｅｔ−ＯＨ・ＤＣＨＡ ａ、ｏ ４１より調製した
Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ。
４％Ｎ ａ ＨＣＯｓ 水、１０％クエン酸水で洗浄し
、Ｎ ａ２ Ｓ ０４で乾燥した。濃縮後、エーテルを
加えて粉末として枦取した。収％６．２１ （９８，８
％）”’−１５，５°（ｃ＝ ｎ１ｐ、１７１−１７８℃、〔α〕Ｄ ０．９ 、 ＤＭＦ ） 、 Ｒｆ’ ０．６４元素分
析 Ｃ４６Ｉ（６５０９Ｎ７ Ｓ計算値：Ｃ，６１，９
８；Ｈ，７，８４；Ｎ、１０．９９；Ｓ 、 ８．５９ 実験値： Ｃ，６２，０２；Ｈ，？、８７； Ｎ、１１
．０８；Ｓ 、 ８．５９ （Ｖｉｌ：）Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−（）
Ｂｕｔ６． ＯｆをＭｅＯＨ２０Ｏｍｅ中、接触還元し
たのち、ＤＭＦ１５０ｍｅに転浴した。これに、Ｂｏｃ
−Ｍｅｔ−ＯＨ・ＤＣＨＡ ａ、ｏ ４１より調製した
Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ。
ＨＯＮＢｌ、８９１を加えて氷冷し、ＤＣＣ１，５９ｆ
を加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵをＰ別し
、濃縮後＊ ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＥｔにとかし、１０
％クエン酸水で洗浄し＋ Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃
縮後、エーテルを加えて結晶として戸数した。収＋１ｅ
２１ （９８，１％）。ｍｐ、１９２−１９５℃。
を加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵをＰ別し
、濃縮後＊ ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＥｔにとかし、１０
％クエン酸水で洗浄し＋ Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃
縮後、エーテルを加えて結晶として戸数した。収＋１ｅ
２１ （９８，１％）。ｍｐ、１９２−１９５℃。
（α）２６−１９．７°（ｃ＝１．０ 、 ＤＭＦ ）
、 Ｒｆ’０１６４ 元素分析 Ｃ４８Ｈ７６０１０Ｎｓ Ｓ２ として計算
値： Ｃ，５８，２７； Ｈ，７，７４； Ｎ、１１．
８３；Ｓ、６．４８ 実験値：Ｃ，５８，４８；Ｈ，７，７９；Ｎ、１１．８
４；Ｓ、５．９８ （ＩＸ） Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇ Ｉ Ｙ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）
−Ｇｌｙ−（）Ｂｕ’５．５ｆにＴ Ｆ Ａ ５０ ｍ
ｅを加え、室温で１０分間振りまぜたのち濃縮し、エ
ーテルを加えて戸数し乾燥した。これを、 ＤＡ（Ｆ
５０ ｍ ｅにとかして水冷し、ＴＥＡ １．８ｍｇを
加えた。これにＢｏｃ−ＧＩｎ−ＯＨ１，８５１、ＨＯ
ＮＢ １．４９ ｙ 、 ＤＣＣｌ、９Ｏｆより調製し
たＢｏｃ−Ｇ ｌ ｎ−０ＮＢを加え。
、 Ｒｆ’０１６４ 元素分析 Ｃ４８Ｈ７６０１０Ｎｓ Ｓ２ として計算
値： Ｃ，５８，２７； Ｈ，７，７４； Ｎ、１１．
８３；Ｓ、６．４８ 実験値：Ｃ，５８，４８；Ｈ，７，７９；Ｎ、１１．８
４；Ｓ、５．９８ （ＩＸ） Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇ Ｉ Ｙ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）
−Ｇｌｙ−（）Ｂｕ’５．５ｆにＴ Ｆ Ａ ５０ ｍ
ｅを加え、室温で１０分間振りまぜたのち濃縮し、エ
ーテルを加えて戸数し乾燥した。これを、 ＤＡ（Ｆ
５０ ｍ ｅにとかして水冷し、ＴＥＡ １．８ｍｇを
加えた。これにＢｏｃ−ＧＩｎ−ＯＨ１，８５１、ＨＯ
ＮＢ １．４９ ｙ 、 ＤＣＣｌ、９Ｏｆより調製し
たＢｏｃ−Ｇ ｌ ｎ−０ＮＢを加え。
１６時間かきまぜた。ｉ０縮後、Ａ ｃ ＯＨを加え、
Ａｃ０Ｅｔを加えて沈澱としてＰ取した。収量５３、（
８９，８％）。ｍｐ、１８１−１８８℃（分解）。
Ａｃ０Ｅｔを加えて沈澱としてＰ取した。収量５３、（
８９，８％）。ｍｐ、１８１−１８８℃（分解）。
６
（α］ Ｄ−１９，６°（ｃ＝１．０ 、 ＤＭＦ ）
、旧１０．８０ 元素分析 Ｃ４１１Ｈ７６０１２Ｎ１０Ｓ２ として計
算値： Ｃ，５５，４５； Ｈ，７，２２； Ｎ、１８
．２０；Ｓ、６．０４ 実験値： Ｃ，５５，８９； Ｈ，７，１７； Ｎ、１
８．８４；Ｓ、６．２０ （Ｘ） Ｚ−３ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ の製造Ｚ−８
ｅｒ−ｏＨ１０，Ｏｆ 、 ｔ−プチルカルバゼート６
．２ＩをＤＭＦ １５０ｍｇにとかして氷冷し。
、旧１０．８０ 元素分析 Ｃ４１１Ｈ７６０１２Ｎ１０Ｓ２ として計
算値： Ｃ，５５，４５； Ｈ，７，２２； Ｎ、１８
．２０；Ｓ、６．０４ 実験値： Ｃ，５５，８９； Ｈ，７，１７； Ｎ、１
８．８４；Ｓ、６．２０ （Ｘ） Ｚ−３ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ の製造Ｚ−８
ｅｒ−ｏＨ１０，Ｏｆ 、 ｔ−プチルカルバゼート６
．２ＩをＤＭＦ １５０ｍｇにとかして氷冷し。
ＨＯＮＢ ８．Ｏｆ 、 ＤＣＣ９，８１を加えて１５
時間かきまぜた。析出したＤＣＵをＰ別し、濃縮後。
時間かきまぜた。析出したＤＣＵをＰ別し、濃縮後。
ＡｃｏＥ口ζ転溶した。ＡｃｏＥｔ層は ４ ％ Ｎａ
ＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎ ａ２Ｓ
Ｏ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結晶として
戸数した。収ｊ９１７．ａ ｐ （５０，４％） ｍｐ
、９５−９８℃。
ＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎ ａ２Ｓ
Ｏ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結晶として
戸数した。収ｊ９１７．ａ ｐ （５０，４％） ｍｐ
、９５−９８℃。
〔α〕２６−６２°（ｃ ＝ ０．８ 、 ＤＭＦ ）
、 Ｒｆ’０９６２ 元素分析 Ｃ１６１１２３０８Ｎ３ として言１算値、
Ｃ，５４Ｊ８； Ｈ，６，５６； Ｎ、１１．８９実験
値： Ｃ，５４，７７； Ｉｆ、６．８８； Ｎ、１２
．２９（Ｘｔ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−８ｅｒ−Ｎ
ＩＩＮＨ−Ｂｏｃの製造Ｚ−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ
８．９ ｐをＭｅＯＨ８００ｍｅ中接触還元したのち
、ＤＭＦ ５０ｍｇにに溶り、 ｆ：。
、 Ｒｆ’０９６２ 元素分析 Ｃ１６１１２３０８Ｎ３ として言１算値、
Ｃ，５４Ｊ８； Ｈ，６，５６； Ｎ、１１．８９実験
値： Ｃ，５４，７７； Ｉｆ、６．８８； Ｎ、１２
．２９（Ｘｔ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−８ｅｒ−Ｎ
ＩＩＮＨ−Ｂｏｃの製造Ｚ−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ
８．９ ｐをＭｅＯＨ８００ｍｅ中接触還元したのち
、ＤＭＦ ５０ｍｇにに溶り、 ｆ：。
これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ） −０Ｈ−ＣＨＡ ６．
２ ｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ，１Ｉ
ＯＢｔ １．５ ｆを加えて水冷し、 ＤＣＣ２，８ｆ
を加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵをＰ別し
、濃縮後。
２ ｆより調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ，１Ｉ
ＯＢｔ １．５ ｆを加えて水冷し、 ＤＣＣ２，８ｆ
を加えて１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵをＰ別し
、濃縮後。
Ａｃ０Ｅｔにとカルだ。Ａｃ０Ｅ ｔ ｊｐｊは、４Ｏ
ｆ ａ ＨＣＯ：＋水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎ
ａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後エーテルを加えて、沈澱
として枦取する。収３１７．４５’ｆ （９８，７％）
。ｍｐ、１００−１０１℃、 （α’） Ｄ −０，９
°（ｃ＋ｐ１．２ 、ＤＭＦ ）。
ｆ ａ ＨＣＯ：＋水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎ
ａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後エーテルを加えて、沈澱
として枦取する。収３１７．４５’ｆ （９８，７％）
。ｍｐ、１００−１０１℃、 （α’） Ｄ −０，９
°（ｃ＋ｐ１．２ 、ＤＭＦ ）。
Ｒｆ’０．５ｘ
元素分析 Ｃ３３Ｈ４１＋ ０９ Ｎｙ Ｓ として計
算値： Ｃ，５５，０６； Ｈ，６，８６； Ｎ、１８
．６２；Ｓ 、 ４．４６ 実験値： Ｃ，５５，４９； Ｈ，６，９４； Ｎ、
１８．１４ ；Ｓ 、 ８．８６ （Ｘｔ：） Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−３ｅｒ−Ｎ）ＩＮＨ−Ｂｏｃ の製造 Ｚ−ＡｒｇＣＰｍｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ ８
．９ ｙ をＡｌｅＯＨ８００ｍｇにとかし、接触環元
したのち、ＤＭＦ５０ｍｇ に転溶した。これに、 Ｚ
−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−ＯＨ−ＤＣＨＡ ８．４ ｐより
調製したＺ−Ｌｙ ｓ （Ｍ ｔ ｒ ）−ＯＨ。
算値： Ｃ，５５，０６； Ｈ，６，８６； Ｎ、１８
．６２；Ｓ 、 ４．４６ 実験値： Ｃ，５５，４９； Ｈ，６，９４； Ｎ、
１８．１４ ；Ｓ 、 ８．８６ （Ｘｔ：） Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−３ｅｒ−Ｎ）ＩＮＨ−Ｂｏｃ の製造 Ｚ−ＡｒｇＣＰｍｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ ８
．９ ｙ をＡｌｅＯＨ８００ｍｇにとかし、接触環元
したのち、ＤＭＦ５０ｍｇ に転溶した。これに、 Ｚ
−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−ＯＨ−ＤＣＨＡ ８．４ ｐより
調製したＺ−Ｌｙ ｓ （Ｍ ｔ ｒ ）−ＯＨ。
１１０Ｂｔ ０．８８Ｆ を加えて氷冷し、 ＤＣＣ１
，８４ｆを加えて２０時間かきまぜた。析出したＤＣＵ
をＰ別し、Ｄ縮少、八ｃＯＥｔを加えて粉末として戸数
し、ＭｅＯＨ−ＡｃＯＥｔより再結晶した。収量５．１
ｊｌ（９３，４Ｒン。 ｍｐ、１０８−１０５℃。
，８４ｆを加えて２０時間かきまぜた。析出したＤＣＵ
をＰ別し、Ｄ縮少、八ｃＯＥｔを加えて粉末として戸数
し、ＭｅＯＨ−ＡｃＯＥｔより再結晶した。収量５．１
ｊｌ（９３，４Ｒン。 ｍｐ、１０８−１０５℃。
２６ 。
（α） Ｌ） ’１．２ （ｃ ”” ０．８ 、Ｄ
Ｍ Ｆ ） 、Ｒｆ ’０．５７ 元素分析 Ｃａ９Ｈ７３０１３Ｎ９ Ｓ２ として計算
値： Ｃ，５５，５０； Ｈ，６，９４； Ｎ、 １１
．８９ ；Ｓ、６．０５ 実験値： Ｃ，５５，７０； Ｈ，？、１５； Ｎ、１
１．６０；Ｓ 、 ５．６８ （Ｘｌｉｉ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ
）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅ ｒ−Ｎ）ＩＮＩＩ−Ｂｏ
ｃ の製造Ｚ−Ｌｙｓ（八（ｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−８ｅｒ−ＮＨＮＩＩ−Ｂｏａ４．８ｆをＭｅＯＨ８０
０ｍｇ にとかし、接触還元したのち、ＤΔＩＦ７０ｍ
ｅに転溶した。これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ−
Ｃ）ＩＡ ２．８ｇより調製したＺ−Ａ ｒ ｇ（Ｐｍ
ｅ）−ＯＨ，ＨＯＢｔ ０．７４１を加えて氷冷し。
Ｍ Ｆ ） 、Ｒｆ ’０．５７ 元素分析 Ｃａ９Ｈ７３０１３Ｎ９ Ｓ２ として計算
値： Ｃ，５５，５０； Ｈ，６，９４； Ｎ、 １１
．８９ ；Ｓ、６．０５ 実験値： Ｃ，５５，７０； Ｈ，？、１５； Ｎ、１
１．６０；Ｓ 、 ５．６８ （Ｘｌｉｉ） Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ
）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅ ｒ−Ｎ）ＩＮＩＩ−Ｂｏ
ｃ の製造Ｚ−Ｌｙｓ（八（ｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）
−８ｅｒ−ＮＨＮＩＩ−Ｂｏａ４．８ｆをＭｅＯＨ８０
０ｍｇ にとかし、接触還元したのち、ＤΔＩＦ７０ｍ
ｅに転溶した。これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ−
Ｃ）ＩＡ ２．８ｇより調製したＺ−Ａ ｒ ｇ（Ｐｍ
ｅ）−ＯＨ，ＨＯＢｔ ０．７４１を加えて氷冷し。
ＤＣＣｌ、ｔ２ｐを加えて１５時間かきまぜた。析出し
たＤＣＵ８Ｆ別し展縮後、Ａｃ０Ｅｔにとかし、ＡＣＯ
ＥｔＰを４％ＮａＨＣＯＡ 水、１０％クエン酸水で洗
浄しｔ Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを
加えて沈澱として戸板し、Ａｉ ｅ ＯＨ−エーテルよ
り再沈澱した。収量５．８１’ （８９，８％）。
たＤＣＵ８Ｆ別し展縮後、Ａｃ０Ｅｔにとかし、ＡＣＯ
ＥｔＰを４％ＮａＨＣＯＡ 水、１０％クエン酸水で洗
浄しｔ Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを
加えて沈澱として戸板し、Ａｉ ｅ ＯＨ−エーテルよ
り再沈澱した。収量５．８１’ （８９，８％）。
２６ 。
ｍｐ、１８６−１８７℃、 〔ｎ）ｌ）−６，６（’ｃ
＝１．０ 、 ＤＭＦ ） 、 Ｒｆｌｏ、５８元素分
析 ＣｇａＨ９９０＋ｓＮ＋３Ｓ３として刷算値、Ｃ，
５５，５６； Ｈ，６，９９； Ｎ、１２．７６；Ｓ、
６．７４ 実験値： Ｃ，５５，８４； Ｈ，７，０７； Ｎ、１
２．５０；Ｓ、６．５９ （ＸＩＶ）Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮ
Ｈ−Ｂｏｃの製造Ｚ−Ａｒ’ｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｓ（Ｍ
Ｌｒ）−ＡｒｇＣＰｍｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ
３． ＯＩをＭｅＯＨ１５０ｍｇにとかし。
＝１．０ 、 ＤＭＦ ） 、 Ｒｆｌｏ、５８元素分
析 ＣｇａＨ９９０＋ｓＮ＋３Ｓ３として刷算値、Ｃ，
５５，５６； Ｈ，６，９９； Ｎ、１２．７６；Ｓ、
６．７４ 実験値： Ｃ，５５，８４； Ｈ，７，０７； Ｎ、１
２．５０；Ｓ、６．５９ （ＸＩＶ）Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮ
Ｈ−Ｂｏｃの製造Ｚ−Ａｒ’ｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｓ（Ｍ
Ｌｒ）−ＡｒｇＣＰｍｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ
３． ＯＩをＭｅＯＨ１５０ｍｇにとかし。
接触還元したのち、ＤＭＦ６０ｍｅに転出した。これに
、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−０Ｈ−ＤＣＩＭ １．５４
ｐより調製したＺ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−ＯＨ，ＨＯＢｔ
Ｏ，８１ｔを加えて氷冷し、ＤＣＣｏ、５１を加えて
１６時間かきまぜな。析出したＤＣＵをＰ別し、濃縮後
、Ａｃ０Ｅｔにとかし、ＡｃｏＥｔ層を４％／’／ ａ
ＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し、 Ｎａ２Ｓ
Ｏ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結晶として
沖取し、Ａｃ０Ｅｔより再結晶した。収量２．７０１
（７２，８％）ｒｌｌｐ、１２８−１２５℃ Ｌ（’！
］”６−５．９°（ｃ ＝ １゜ｌ、ＤＭＦ）、Ｒｆ’
ｏ、ｓ７ 元素分析 Ｃｌ１２ＨＩ２３０２ＯＮ１５５４ として
計算値、Ｃ，５５，７８；Ｈ，？、０２；Ｎ、１１．８
９；Ｓ、７．２６ 実験値：Ｃ，５５，８９； Ｈ，？、８０； Ｎ、１１
．７２；Ｓ、７．０８ （ＸＶ） Ｂｏａ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔ の製
造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８
ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔｌ、 Ｏｌ ｆｊｅＭｅＯＨ１
００ｍｇ にとかし、接触還元したのちＤＩｌ（Ｆ２０
ｍｌ＋に転出した。これに。
、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−０Ｈ−ＤＣＩＭ １．５４
ｐより調製したＺ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−ＯＨ，ＨＯＢｔ
Ｏ，８１ｔを加えて氷冷し、ＤＣＣｏ、５１を加えて
１６時間かきまぜな。析出したＤＣＵをＰ別し、濃縮後
、Ａｃ０Ｅｔにとかし、ＡｃｏＥｔ層を４％／’／ ａ
ＨＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し、 Ｎａ２Ｓ
Ｏ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結晶として
沖取し、Ａｃ０Ｅｔより再結晶した。収量２．７０１
（７２，８％）ｒｌｌｐ、１２８−１２５℃ Ｌ（’！
］”６−５．９°（ｃ ＝ １゜ｌ、ＤＭＦ）、Ｒｆ’
ｏ、ｓ７ 元素分析 Ｃｌ１２ＨＩ２３０２ＯＮ１５５４ として
計算値、Ｃ，５５，７８；Ｈ，？、０２；Ｎ、１１．８
９；Ｓ、７．２６ 実験値：Ｃ，５５，８９； Ｈ，？、８０； Ｎ、１１
．７２；Ｓ、７．０８ （ＸＶ） Ｂｏａ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔ の製
造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−８
ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕｔｌ、 Ｏｌ ｆｊｅＭｅＯＨ１
００ｍｇ にとかし、接触還元したのちＤＩｌ（Ｆ２０
ｍｌ＋に転出した。これに。
Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ ）−Ｇｌｙ−ＯＨＯ，８５１、ＨＯ１３ｔ ｌ
ｆ３５ｍｆ を１１１１えて氷冷し、ＤＣＣ２１０ｍＦ
を加えて２０時間かきまぜ一二。析出したＤＣＵをＰ別
し、濃縮後、Ｍ ｅ ＯＨを加えて沈澱として戸数しγ
こ。収量１．５０ ｆ ｔ Ｂ ？、４Ｌ！１０）。
ｍｅ ）−Ｇｌｙ−ＯＨＯ，８５１、ＨＯ１３ｔ ｌ
ｆ３５ｍｆ を１１１１えて氷冷し、ＤＣＣ２１０ｍＦ
を加えて２０時間かきまぜ一二。析出したＤＣＵをＰ別
し、濃縮後、Ｍ ｅ ＯＨを加えて沈澱として戸数しγ
こ。収量１．５０ ｆ ｔ Ｂ ？、４Ｌ！１０）。
ｍｐ、２１６−２Ｈ℃（分解）、〔ｌｒ〕Ｄ−１１８゜
Ｉ ｃ＝ １．０ 、 ＤＭＦ ） 、 Ｒｆ’ ０．
４８元素分析 Ｃ９ＲＨＩＳ４０２３ Ｎ２２ Ｓ４
として語算組： Ｃ，５５，０９； Ｈ，７，２７；
Ｎ、１４．４２；Ｓ、６．００ ”１４ｍＶｊ： Ｃ，５４，８１； Ｈ，７，８８；
Ｎ、１４．２８ ；Ｓ、５．７９ （Ｘ＆ｉ） Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−３ｅｒ −Ｇ Ｉｎ−
０１１の製造 Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ −Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−Ａｒｇ（
Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｅ ）−Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇ Ｉｎ−０Ｂｕ ｔｌ、
ＯｆにＴＦＡ ｌＯｍｅを加え、室温で５０分間４辰り
混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加えて沈Ｉ段としてｐ
取し、乾燥した。
Ｉ ｃ＝ １．０ 、 ＤＭＦ ） 、 Ｒｆ’ ０．
４８元素分析 Ｃ９ＲＨＩＳ４０２３ Ｎ２２ Ｓ４
として語算組： Ｃ，５５，０９； Ｈ，７，２７；
Ｎ、１４．４２；Ｓ、６．００ ”１４ｍＶｊ： Ｃ，５４，８１； Ｈ，７，８８；
Ｎ、１４．２８ ；Ｓ、５．７９ （Ｘ＆ｉ） Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−３ｅｒ −Ｇ Ｉｎ−
０１１の製造 Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ −Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−Ａｒｇ（
Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ ）−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｅ ）−Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇ Ｉｎ−０Ｂｕ ｔｌ、
ＯｆにＴＦＡ ｌＯｍｅを加え、室温で５０分間４辰り
混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加えて沈Ｉ段としてｐ
取し、乾燥した。
−万、 Ｚ ＝Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨＮ
Ｈ−Ｂｏｃ Ｏ，８８ｔ にＴ Ｆ Ａｌｏｍｅ を加
えて室温で１０分間振り混ぜたのち。
Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨＮ
Ｈ−Ｂｏｃ Ｏ，８８ｔ にＴ Ｆ Ａｌｏｍｅ を加
えて室温で１０分間振り混ぜたのち。
濃Ｎ＜！ Ｌ、エーテルを加えて沈澱として戸数し乾燥
した。これをＩ）ＭＦ １０ｍｇにとかし、ドライアイ
ス−アセトンでン１ン却後、６．２Ｎ ＨＣＩ／Ａｃ０
ＥｔＯ，２８ｅｒ、 ＩＩ！、硝酸イソアミル（０，０
７５ｍ１ｌ’）を加え、−２５°〜−２０℃で２０分間
保った（ヒドラジンテスト：１会性几これを再びドライ
アイス−アセトノで冷却し、”ｌ”ＥＡＯ，２５ｍｇを
加えて中和した。アミン成分をＤＭＦ４０ｍｅにとかし
、水冷しＴＥＡｏ、１６ｍｇをＩＭＪえたのち、先に調
製したアジド溶液を加えて、４℃で７２時間かきまぜた
。反応液を、希酢酸水に−そそぎ、析出したゲルを戸数
し、含水Ｃｆｔ、ＣＮで洗浄した。収量１．４０ ＃（
８１，５％） 、ｉｆｆ ’ ０．０９゜このうち４０
０ｍＦを０．１５Ｍ？１（ＳＡ を含＆ＴＦＡ−チオア
ニソールーメチルスルフィドＬ ８ ： １ ： ｌ
） ６０ｍｇにとかし、室温で２時間振りまぜたのち、
Ａｃ０ＮＨ４４００ｍＦ を加えて＃縮し、エーテルを
加えて沈澱とし戸数し、乾燥した。これを少量の１ＮＡ
ｃＯＨにとかしセファデックスＧ−２５のカラム（２，
２ｘ１２０ｃｍ）に付した。ｌＮＡｃ０）ｆで溶出し１
６０ｗ１−２６０ｅｒの分画を集めて凍結乾燥し、つい
でアンバーライトＩＲＡ−４１０（酢酸型）のカラムを
通し、凍結乾燥した。
した。これをＩ）ＭＦ １０ｍｇにとかし、ドライアイ
ス−アセトンでン１ン却後、６．２Ｎ ＨＣＩ／Ａｃ０
ＥｔＯ，２８ｅｒ、 ＩＩ！、硝酸イソアミル（０，０
７５ｍ１ｌ’）を加え、−２５°〜−２０℃で２０分間
保った（ヒドラジンテスト：１会性几これを再びドライ
アイス−アセトノで冷却し、”ｌ”ＥＡＯ，２５ｍｇを
加えて中和した。アミン成分をＤＭＦ４０ｍｅにとかし
、水冷しＴＥＡｏ、１６ｍｇをＩＭＪえたのち、先に調
製したアジド溶液を加えて、４℃で７２時間かきまぜた
。反応液を、希酢酸水に−そそぎ、析出したゲルを戸数
し、含水Ｃｆｔ、ＣＮで洗浄した。収量１．４０ ＃（
８１，５％） 、ｉｆｆ ’ ０．０９゜このうち４０
０ｍＦを０．１５Ｍ？１（ＳＡ を含＆ＴＦＡ−チオア
ニソールーメチルスルフィドＬ ８ ： １ ： ｌ
） ６０ｍｇにとかし、室温で２時間振りまぜたのち、
Ａｃ０ＮＨ４４００ｍＦ を加えて＃縮し、エーテルを
加えて沈澱とし戸数し、乾燥した。これを少量の１ＮＡ
ｃＯＨにとかしセファデックスＧ−２５のカラム（２，
２ｘ１２０ｃｍ）に付した。ｌＮＡｃ０）ｆで溶出し１
６０ｗ１−２６０ｅｒの分画を集めて凍結乾燥し、つい
でアンバーライトＩＲＡ−４１０（酢酸型）のカラムを
通し、凍結乾燥した。
これをさらにＴＳＫ−ＬＳ−４１０のカラム（２，１４
ｘ７．５ｃｍ＋２．１４ｘ８０ｃｍ）を用いるＨ Ｐ
Ｌ Ｃで精製４ し、目的物を得た。収量４５９【α） Ｄ−４５，９゜
（ｃ ＝ ０．７ 、０．ＩＮ ＡｃＯＨ）Ｒｆ’（ｃ
ｅｌｌｕｌｏｓｅ） ０．２０アミノ酸分析： Ｌｙｓ
１．７１． Ａｒｇ ４．７１． Ｓｅｒ １．６９
゜Ｇｌｕ ２．１２． Ｇｌｙ １．００． Ａｌａ
１．０８． Ｍｅｔ Ｏ，８２，Ｌｅｕｌ、８０ 、
Ｐｈｅ １．０８ （平均回収率７７％）実施例２ キャリヤー蛋白とポリペプチド複合体の合成実施例１（
ＸＶｉ）で得たポリペプチドとサイログロブリン（以下
ＴＧ）との結合を、グツドフレンドらの方法に準じて行
なった（サイエンス、世。
ｘ７．５ｃｍ＋２．１４ｘ８０ｃｍ）を用いるＨ Ｐ
Ｌ Ｃで精製４ し、目的物を得た。収量４５９【α） Ｄ−４５，９゜
（ｃ ＝ ０．７ 、０．ＩＮ ＡｃＯＨ）Ｒｆ’（ｃ
ｅｌｌｕｌｏｓｅ） ０．２０アミノ酸分析： Ｌｙｓ
１．７１． Ａｒｇ ４．７１． Ｓｅｒ １．６９
゜Ｇｌｕ ２．１２． Ｇｌｙ １．００． Ａｌａ
１．０８． Ｍｅｔ Ｏ，８２，Ｌｅｕｌ、８０ 、
Ｐｈｅ １．０８ （平均回収率７７％）実施例２ キャリヤー蛋白とポリペプチド複合体の合成実施例１（
ＸＶｉ）で得たポリペプチドとサイログロブリン（以下
ＴＧ）との結合を、グツドフレンドらの方法に準じて行
なった（サイエンス、世。
１８８４（１９６４））。即ち、当該ポリペプチド２．
５ ）７１ 、をＴＧ８．７５岬と混合し、２ｅｒの６
゜ｍＭのフォスフェートバッファーを加え、 氷水中で
よく攪拌した。これにカルボジイミド塩酸塩３０４岬を
蒸留水２００μｅに溶かしたものを１滴ずつゆっくりと
加えた後、８時間氷水中で攪拌しながら反応させた。反
応後、蒸留水で透析を充分に行ない、凍結乾燥を行なっ
て蛋白複合体４．７ｑを得た。
５ ）７１ 、をＴＧ８．７５岬と混合し、２ｅｒの６
゜ｍＭのフォスフェートバッファーを加え、 氷水中で
よく攪拌した。これにカルボジイミド塩酸塩３０４岬を
蒸留水２００μｅに溶かしたものを１滴ずつゆっくりと
加えた後、８時間氷水中で攪拌しながら反応させた。反
応後、蒸留水で透析を充分に行ない、凍結乾燥を行なっ
て蛋白複合体４．７ｑを得た。
実施例８
抗体検出のためのＥＩＡ用抗原の調製
ＥＩＡ用抗原の調製は北側らの方法〔ジャーナル オブ
バイオケミストリー、？９，２，９８（１９７６）〕
０方決に準じて行った。
バイオケミストリー、？９，２，９８（１９７６）〕
０方決に準じて行った。
（１） ポリペプチドへのマレイミド基の導入実施例１
（Ｘｖｌ）で得たポリペプチド（８５０ｎｍｏ１ｅｓ
）をｌｌｌ１の１００ｍＭフ・オスフェートバッファー
ｐＨ６，８に溶解し、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミド
エステル６８５μ、（１，７５μｍｏｌｅｓ）と７０μ
ｅ のＮ、Ｎ−ジメチルホＩＬマミド溶液に加え混合し
、８０ｔｌ：で８０分攪拌して反応後、セファデックス
Ｇ−２５カラムで分画を行ないマレイミド基の導入され
たポリペプチド分画１８５ｎｍｏｌｅｓ を得た。
（Ｘｖｌ）で得たポリペプチド（８５０ｎｍｏ１ｅｓ
）をｌｌｌ１の１００ｍＭフ・オスフェートバッファー
ｐＨ６，８に溶解し、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミド
エステル６８５μ、（１，７５μｍｏｌｅｓ）と７０μ
ｅ のＮ、Ｎ−ジメチルホＩＬマミド溶液に加え混合し
、８０ｔｌ：で８０分攪拌して反応後、セファデックス
Ｇ−２５カラムで分画を行ないマレイミド基の導入され
たポリペプチド分画１８５ｎｍｏｌｅｓ を得た。
（１１） マレイミド基導入ポリペプチドとβ−高ラう
トシダーゼとの結合 実施例８（１）で得たマレイミド基導入ポリペプチド１
６゜５ｎｒｎｏｌｅｓとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ８８
ｎｍｏｌｅｓを混合し、４℃で１８時間反応後。
トシダーゼとの結合 実施例８（１）で得たマレイミド基導入ポリペプチド１
６゜５ｎｒｎｏｌｅｓとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ８８
ｎｍｏｌｅｓを混合し、４℃で１８時間反応後。
４１２．５ ｎ ｍｏｌｅｓ のβ−メルカプトエタノ
ールで反応を停止させた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼと
結合したポリペプチドは、セファロース６Ｂカラムで分
画を行ない、以下の実験に使用した。
ールで反応を停止させた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼと
結合したポリペプチドは、セファロース６Ｂカラムで分
画を行ない、以下の実験に使用した。
実施例４
ＥＩＡ法
実施例２で得た蛋白複合体で免疫したマウス血清あるい
はハイブリドーマ上清中の抗体活性の検出はＥＩＡ法を
用いて行なった（イムノファーマコロジー、１，８（１
９７８）］。すなわち、血清あるいはハイブリドーマ上
清をバッファーＡ（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１００
ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３ 、１ｍＭ ＭｇＣ
Ｉ２ 、 ｐＨ７，０） で希釈し、このｉ ｏ ｏ
ｐ ｅをとり、実施例３で得たポリペプチド誘導体１０
０μｅとよく混合し、２４℃で２４時間反応させた。反
応後、ウサギ抗マウスＩｇＧを結合した３％セルロース
１００μｅを加えて２４℃、４時間反応させた。反応後
、セルロースを０．５％ツイーン２０を含んだバッファ
ーＡでよく洗浄し、４−メチノ虎／ペリフェリルーβ−
Ｄ−ガラクトシド２０μｇ／ｍｅを５ｏｏｔｔｅ １ｌ
ｌｌ工、 ８７℃で２時間反応後、１００ｍＭカーボネ
ートバッファー（ｐＨ１０５）を８ｇｅ加えて反応を停
止し、上清中の蛍光強度を蛍光Ｊ１で測定した（エキサ
イチージョン８６５ｎｍ、エミッション４５０ｎｍ）。
はハイブリドーマ上清中の抗体活性の検出はＥＩＡ法を
用いて行なった（イムノファーマコロジー、１，８（１
９７８）］。すなわち、血清あるいはハイブリドーマ上
清をバッファーＡ（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１００
ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３ 、１ｍＭ ＭｇＣ
Ｉ２ 、 ｐＨ７，０） で希釈し、このｉ ｏ ｏ
ｐ ｅをとり、実施例３で得たポリペプチド誘導体１０
０μｅとよく混合し、２４℃で２４時間反応させた。反
応後、ウサギ抗マウスＩｇＧを結合した３％セルロース
１００μｅを加えて２４℃、４時間反応させた。反応後
、セルロースを０．５％ツイーン２０を含んだバッファ
ーＡでよく洗浄し、４−メチノ虎／ペリフェリルーβ−
Ｄ−ガラクトシド２０μｇ／ｍｅを５ｏｏｔｔｅ １ｌ
ｌｌ工、 ８７℃で２時間反応後、１００ｍＭカーボネ
ートバッファー（ｐＨ１０５）を８ｇｅ加えて反応を停
止し、上清中の蛍光強度を蛍光Ｊ１で測定した（エキサ
イチージョン８６５ｎｍ、エミッション４５０ｎｍ）。
実施例６
免疫
７〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウス６匹各々に抗原とし
て実施例２で得た蛋白複合体の、タンパクｈ１として、
４０μｇをフロイントコンプリート アジュバントとよ
く混合し、皮下に接種した〔初回免疫）。初回免疫の２
週後、同量の抗原をフロイントインコンプリート アジ
ュバントとよく混合し、皮下に接種した（二次免疫）。
て実施例２で得た蛋白複合体の、タンパクｈ１として、
４０μｇをフロイントコンプリート アジュバントとよ
く混合し、皮下に接種した〔初回免疫）。初回免疫の２
週後、同量の抗原をフロイントインコンプリート アジ
ュバントとよく混合し、皮下に接種した（二次免疫）。
さらに、その２週後、三次免疫と同様の方性で三次免疫
を行なった。三次免役の６日後、マウスから血液を部分
採取し、血清中の抗体価を実施例４記載のＥＩＡ法で測
定した。このうち、高い抗体価を示した７−−２マウス
に対して１２０μｇの抗原を０．５ ｗｅの食塩水に溶
解させたものを静脈内に接Ｆｌ＋＋することにより最終
免疫を行なった。各マウスの抗体価は第１表に示した。
を行なった。三次免役の６日後、マウスから血液を部分
採取し、血清中の抗体価を実施例４記載のＥＩＡ法で測
定した。このうち、高い抗体価を示した７−−２マウス
に対して１２０μｇの抗原を０．５ ｗｅの食塩水に溶
解させたものを静脈内に接Ｆｌ＋＋することにより最終
免疫を行なった。各マウスの抗体価は第１表に示した。
第１表
免疫したマウスの抗ペプチド抗体価
１）血清の希釈は１／１０００
２）血清の希釈は１／６８００
８）血清の希釈は１／７８００
４）−：検出不可能
５） Ｎ、Ｄ、、倹素せず
Ｂ／Ｔ ：（結合した酵素活性／加えた全酵素活性）
Ｘ １００ 実施例６ 細胞融合 実施例５記載の方法で免疫を行ない、最終免疫の３日後
のγ−２マウスからＪｌ’？ｌ１ｆｉを摘出し、ステン
レスメツシュで圧迫、濾過し、イーグルス・ミニマム・
エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、 Ｉ
Ｉ’／臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞とし
て、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞ＰＦ３−Ｘ
６８．Ａｇ ８．Ｕｌ（Ｐ２Ｏ３） を用いた〔カレン
ト トピックス イン マイクロバイオロジー アンド
イムノロジー、８１．１（１９７８））。細胞融合は
、原注〔ネイチャー。
Ｘ １００ 実施例６ 細胞融合 実施例５記載の方法で免疫を行ない、最終免疫の３日後
のγ−２マウスからＪｌ’？ｌ１ｆｉを摘出し、ステン
レスメツシュで圧迫、濾過し、イーグルス・ミニマム・
エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、 Ｉ
Ｉ’／臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞とし
て、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞ＰＦ３−Ｘ
６８．Ａｇ ８．Ｕｌ（Ｐ２Ｏ３） を用いた〔カレン
ト トピックス イン マイクロバイオロジー アンド
イムノロジー、８１．１（１９７８））。細胞融合は
、原注〔ネイチャー。
２５６．４９５（１９７５））に準じて行なつ總即ち、
肺臓細胞およびＰ２Ｏ３をそれぞれ血清を含有しないＭ
ＥＭで８度洗浄し、１１ｐ−臓細胞とＰ２Ｏ３数の比率
を５：１になるよう混合しで、８００回転で１５分間遠
心を行なって細胞を沈澱さセた。
肺臓細胞およびＰ２Ｏ３をそれぞれ血清を含有しないＭ
ＥＭで８度洗浄し、１１ｐ−臓細胞とＰ２Ｏ３数の比率
を５：１になるよう混合しで、８００回転で１５分間遠
心を行なって細胞を沈澱さセた。
上清を充分に除去した後、沈澱を軽くほぐし。
４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（コ
ツホライト社製）を０．８ ｇ／加え、８７℃温水槽中
で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分２
ＩＩｌの割合でＭＥＭを添加し１合δ１１２ｄのＭＥＭ
を加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した
。この細胞沈澱物を１０％牛脂児血清を含有するＲＰＭ
１１６４０ メディウム（ＲＰＭＩ １６４０−１０Ｆ
Ｃ５）にＰｄＵｌがｌｙｌ当り２ＸｌＯ５個になるよう
に浮遊し、２４穴マルチデイシユ（リンプロ社！！りに
１ウ工ル１ｍ１−ｆっ１４４ウエルに播種した。播種後
、細胞’ｉ？８７℃で５％炭酸ガスフラン１ツ中培養し
た。２４時間後ＨＡＴ （ヒポキサンチンＩ Ｘ １０
−’Ｍ 、アミノプテリン４Ｘ１０’Ｍ、チミジン１．
６ＸｌＯ’Ｍ）を含んだＲＰＭｌ １６４０−１０ＦＣ
３培地（Ｈ人１゛培地）を１ウェル当り１＋＋ｌずつ添
加することにより。
ツホライト社製）を０．８ ｇ／加え、８７℃温水槽中
で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分２
ＩＩｌの割合でＭＥＭを添加し１合δ１１２ｄのＭＥＭ
を加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した
。この細胞沈澱物を１０％牛脂児血清を含有するＲＰＭ
１１６４０ メディウム（ＲＰＭＩ １６４０−１０Ｆ
Ｃ５）にＰｄＵｌがｌｙｌ当り２ＸｌＯ５個になるよう
に浮遊し、２４穴マルチデイシユ（リンプロ社！！りに
１ウ工ル１ｍ１−ｆっ１４４ウエルに播種した。播種後
、細胞’ｉ？８７℃で５％炭酸ガスフラン１ツ中培養し
た。２４時間後ＨＡＴ （ヒポキサンチンＩ Ｘ １０
−’Ｍ 、アミノプテリン４Ｘ１０’Ｍ、チミジン１．
６ＸｌＯ’Ｍ）を含んだＲＰＭｌ １６４０−１０ＦＣ
３培地（Ｈ人１゛培地）を１ウェル当り１＋＋ｌずつ添
加することにより。
）（ＡＴ選択培養を開始した。ＨＡ Ｔ ｉ択培養は。
培養開始８，５．７日後に旧液を１ｓ＋／捨てたあと。
１ ｍｌのＨＡ Ｔ培地を添加することにより継続した
。
。
ハイブリドーマの増殖は、細胞融合？・１０〜１４日で
認められ、培養液が黄変したとき（約１×１０ ＠／
ｗｅ ） 、上清を採取し、ＥＩＡ法で、抗体の有無を
検索した。このようにして、ハイブリドーマの増殖が認
められた１４１ウエルの上清を調べたところ、２ウエル
（γ２−１１．γ２−１００） に強い抗体活性、２ウ
エル（γ２−６２．γ２−７０）に弱い活性を認めた。
認められ、培養液が黄変したとき（約１×１０ ＠／
ｗｅ ） 、上清を採取し、ＥＩＡ法で、抗体の有無を
検索した。このようにして、ハイブリドーマの増殖が認
められた１４１ウエルの上清を調べたところ、２ウエル
（γ２−１１．γ２−１００） に強い抗体活性、２ウ
エル（γ２−６２．γ２−７０）に弱い活性を認めた。
実施例７
クローニング
抗体活性が陽性を示した８ウエル（ｒ２−１１゜６２．
１００）の各ハイブリドーマを、限界希釈法によってク
ローニングを行なった。即ちハイブリドーマが２個／
ｗｅ ’ｒこなるようＲＰＭＩ １６４０−２０ＦＣ５
に浮遊させ、９６六マイクロプレート（ヌンク社製）に
ｌウェル当り０． ｌ ｍｌずつ分注した。
１００）の各ハイブリドーマを、限界希釈法によってク
ローニングを行なった。即ちハイブリドーマが２個／
ｗｅ ’ｒこなるようＲＰＭＩ １６４０−２０ＦＣ５
に浮遊させ、９６六マイクロプレート（ヌンク社製）に
ｌウェル当り０． ｌ ｍｌずつ分注した。
分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウス
の胸腺細胞をウェル当り５ｘｌＯ’個になるように加え
た。このようにして、約２週間後には細胞の増殖が認め
られるようになり、上滑を採取して、抗体の有無を実施
例４記載のＥＩＡ法で調べた。その結果、γ２−１１で
は１９クローン中８クローン、γ２−６２では５４クロ
ーン中８クローン。
の胸腺細胞をウェル当り５ｘｌＯ’個になるように加え
た。このようにして、約２週間後には細胞の増殖が認め
られるようになり、上滑を採取して、抗体の有無を実施
例４記載のＥＩＡ法で調べた。その結果、γ２−１１で
は１９クローン中８クローン、γ２−６２では５４クロ
ーン中８クローン。
γ２−１００では４７クローン中５クローンに抗体能
モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能は１次
の方法で検討した。即ち、ウサギ抗マウＸＩｇＧ抗体を
結合させた８％セルロースｆｆＪ Ｍａ ｏ ｏ ｔｔ
ｅに、７２−１１．７２−６２．７２−１００ 由来
のそれぞれ２〜ａ挿のクローン細胞の培養上清を各々８
００μｅ加え、室温で１８〜２０時間反応させた。反応
後セルロースを生理食塩水でよく洗浄し、５５０Ｕ／ｓ
ｔの下記により得たｌ Ｆ Ｎ−γを加え、８〜４時間
反応させた。反応後、上清を採苗 ２ 表 クローン化さｎたハイブリドー マの抗ペプチド抗体活性 Ｂ／Ｔ ： （結合した酵素活性／加えた全酵素活性）
× １００ 取し上清中のＩＦＮ−γ活性をマイクロプレートを用い
た細胞変性効果（ＣＰＥ）リーチング法で測定した。（
アプライド マイクロバイオロジー１６．１７０６（１
９６８Ｊ。すなわち、９６六マイクロプレート〔ヌンク
社製）全てのウェル１こ５０μｅのＭ Ｅ ｈｉを入れ
、最初のウェルにＩＦＮザンプルを５０μｅ加えて、連
続的に２倍希釈を行なった。このようにした各ウェルに
、 ＷＩＳＨ＃［ｌｌ１ｉｆｆｌを２０％ＦＣ８含有Ｍ
ＥＭに１ ｍｌ当り４８１０６個になるよう調整した細
胞浮遊液５０μｅを加え、２４時間、８７℃、炭酸ガス
フラン器で培養した。培養後、水泡性口内炎ウィルスに
ュージャーシー株）を２０００ＴＣＩＤｓｏ （ティッ
シューカルチュアインフエクティングドーズ５０）にな
るようＭＥＭで調整し、その５０μｅを各々のウェルに
加え、８７℃、炭酸ガスフラン器内で培養した。約８５
時間後、ＩＦＮサンプルを加えていないウェルの細胞が
１００％ＣＰＥを起こした時点で、各ウェルのＣＰＥを
顕微鏡で観察し、５０％のＣＩ・Ｅを起こしているウェ
ルのＩＦＮ−サンプルの希釈数の逆数をもってＩＦＮの
力価とした。
の方法で検討した。即ち、ウサギ抗マウＸＩｇＧ抗体を
結合させた８％セルロースｆｆＪ Ｍａ ｏ ｏ ｔｔ
ｅに、７２−１１．７２−６２．７２−１００ 由来
のそれぞれ２〜ａ挿のクローン細胞の培養上清を各々８
００μｅ加え、室温で１８〜２０時間反応させた。反応
後セルロースを生理食塩水でよく洗浄し、５５０Ｕ／ｓ
ｔの下記により得たｌ Ｆ Ｎ−γを加え、８〜４時間
反応させた。反応後、上清を採苗 ２ 表 クローン化さｎたハイブリドー マの抗ペプチド抗体活性 Ｂ／Ｔ ： （結合した酵素活性／加えた全酵素活性）
× １００ 取し上清中のＩＦＮ−γ活性をマイクロプレートを用い
た細胞変性効果（ＣＰＥ）リーチング法で測定した。（
アプライド マイクロバイオロジー１６．１７０６（１
９６８Ｊ。すなわち、９６六マイクロプレート〔ヌンク
社製）全てのウェル１こ５０μｅのＭ Ｅ ｈｉを入れ
、最初のウェルにＩＦＮザンプルを５０μｅ加えて、連
続的に２倍希釈を行なった。このようにした各ウェルに
、 ＷＩＳＨ＃［ｌｌ１ｉｆｆｌを２０％ＦＣ８含有Ｍ
ＥＭに１ ｍｌ当り４８１０６個になるよう調整した細
胞浮遊液５０μｅを加え、２４時間、８７℃、炭酸ガス
フラン器で培養した。培養後、水泡性口内炎ウィルスに
ュージャーシー株）を２０００ＴＣＩＤｓｏ （ティッ
シューカルチュアインフエクティングドーズ５０）にな
るようＭＥＭで調整し、その５０μｅを各々のウェルに
加え、８７℃、炭酸ガスフラン器内で培養した。約８５
時間後、ＩＦＮサンプルを加えていないウェルの細胞が
１００％ＣＰＥを起こした時点で、各ウェルのＣＰＥを
顕微鏡で観察し、５０％のＣＩ・Ｅを起こしているウェ
ルのＩＦＮ−サンプルの希釈数の逆数をもってＩＦＮの
力価とした。
ＩＦＮ−γサンプルとして用いたものは、ヒト末梢血リ
ンパ球を、コンカナバリンＡ４０μｇ ／ｍｅと１２−
〇−テトラデカノイルホルボールー１８アセテートｌ
５ ｎ ｇ／ｓ＋ｒ で刺激して７２時間後に採取した
上清で、この培養上清１ ｍｌ中にはヒトＩＦＮ−γ（
酸、ｐＨ処理に不安定）を４４００ユニツト含有してい
た。もし、クローン細胞の培養上清中にＩＦＮ−γに対
して結合能を持つ抗体が存在していれば、後で加えたＩ
ＦＮ−γ活性は、セルロース上の抗体に結合し、上清中
の活性は低減される筈である。結果は、γ２−１１のク
ローンの上清中に比較的強いＩＦＮ−γ結合能が認めら
れ、加えたＩＦＮ−γ（５５００／＊／ ）の５０〜７
５％が抗体に結合した（第３表）。
ンパ球を、コンカナバリンＡ４０μｇ ／ｍｅと１２−
〇−テトラデカノイルホルボールー１８アセテートｌ
５ ｎ ｇ／ｓ＋ｒ で刺激して７２時間後に採取した
上清で、この培養上清１ ｍｌ中にはヒトＩＦＮ−γ（
酸、ｐＨ処理に不安定）を４４００ユニツト含有してい
た。もし、クローン細胞の培養上清中にＩＦＮ−γに対
して結合能を持つ抗体が存在していれば、後で加えたＩ
ＦＮ−γ活性は、セルロース上の抗体に結合し、上清中
の活性は低減される筈である。結果は、γ２−１１のク
ローンの上清中に比較的強いＩＦＮ−γ結合能が認めら
れ、加えたＩＦＮ−γ（５５００／＊／ ）の５０〜７
５％が抗体に結合した（第３表）。
実施例９
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの腹水化
第８表
モノクローナル抗体によるＩＦＮ−γ活性の吸収能かじ
め０５耐のミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に接種することにより腹水化
を行った。ノ）イブリドーマを腹腔に投与して１０日後
、腹水を採取して抗体価をＥＩＡ法で測定したところ、
１０’倍希釈まで抗体活性を示した。なお、当該クロー
ン細胞の培養上清中の抗体活性は、１０４倍希釈まで認
められているが、腹水化することにより約１０００倍程
度抗体活性が上昇した。
め０５耐のミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に接種することにより腹水化
を行った。ノ）イブリドーマを腹腔に投与して１０日後
、腹水を採取して抗体価をＥＩＡ法で測定したところ、
１０’倍希釈まで抗体活性を示した。なお、当該クロー
ン細胞の培養上清中の抗体活性は、１０４倍希釈まで認
められているが、腹水化することにより約１０００倍程
度抗体活性が上昇した。
実施例１０
モノクローナル抗体の精製
実施例９で得られた腹水４ ｍｌを出発材料として。
ステーリンら（ジャーナル オブ バイオロジカルケミ
ストリー、２５６，９７５０（１９８１＞）の方法に準
じてモノクローナル抗体を精製した。
ストリー、２５６，９７５０（１９８１＞）の方法に準
じてモノクローナル抗体を精製した。
まず腹水からフィブリン様物質を除去するためｉｏ、ｏ
ｏｏ回転１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（
ＰＢＳ ： ８．１ｍ Ｍ−ＮａＨ２ＰＯ４、１，５ｍ
ＭＫＨ２ＰＯ４，２，７ｍＭＫＣｌ、１８７ｍＭＮａＣ
１、ｐＨ７，２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａ２１１
０）が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サ
ンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度にな
るように加え、４℃で攪拌しながら６０分間塩析を行な
い、その後遠心（１０，０００回転、１５分間）を行な
って沈澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ ＮａＣ１含有２
０ｍＲ１トリス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に旧遊し、同浴
液２ｅに対して透析を行なった。２時四後、２ｅの新し
い同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。
ｏｏ回転１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（
ＰＢＳ ： ８．１ｍ Ｍ−ＮａＨ２ＰＯ４、１，５ｍ
ＭＫＨ２ＰＯ４，２，７ｍＭＫＣｌ、１８７ｍＭＮａＣ
１、ｐＨ７，２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａ２１１
０）が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サ
ンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度にな
るように加え、４℃で攪拌しながら６０分間塩析を行な
い、その後遠心（１０，０００回転、１５分間）を行な
って沈澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ ＮａＣ１含有２
０ｍＲ１トリス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に旧遊し、同浴
液２ｅに対して透析を行なった。２時四後、２ｅの新し
い同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。
透析後、沈澱を除去するため１０，０００回転１５分間
遠心を行ない、上清をＡ２！１０の値が２０〜８０の濃
度になるように調整した。このサンプルを充分風の５０
ｍＭ−ＮａＣＩ含有トリス緩衝溶液で順化した８ｄのＤ
ＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥｓｚ）にかけ
、５０ｎ＋ＭＮａＣ＋含有トリス緩衝溶液を用いて１．
５＊／／分の流出速度で分画を行なった。この条件下で
は、抗体活性は主として素通り分画に認められた（第１
図）。
遠心を行ない、上清をＡ２！１０の値が２０〜８０の濃
度になるように調整した。このサンプルを充分風の５０
ｍＭ−ＮａＣＩ含有トリス緩衝溶液で順化した８ｄのＤ
ＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥｓｚ）にかけ
、５０ｎ＋ＭＮａＣ＋含有トリス緩衝溶液を用いて１．
５＊／／分の流出速度で分画を行なった。この条件下で
は、抗体活性は主として素通り分画に認められた（第１
図）。
抗体の確認にはラエムリらの方法（ネイチャー。
２２７．６８０（１９７０））に準じて５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気法Ｎ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法を用
いた。すなわち、硫安塩析−ＤＥＡＥセルロースカラム
で分画したいくつかのフラクションを、各々２−メルカ
プトエタノールでＭｉ元を行ない１７％ＳＤＳゲル、８
０ボルト、２４時間泳動を行なった。その結果、抗体活
性に一致して１分子爪約６５キロダルトン前後にＨ鎖、
約２８キロダルトン前後にＬ鎖の２つの）くンドカＳ認
められｔこ（第２図）。このように精製されｔこ抗体フ
ラクション１７がＩＦＮ−γに対して、結合能を示す力
）どうかを実施例８の方法に従ってＩＦＮ−γ２２００
０／＊？を加えて検索したところ、ＩＦＮ−Ｔの約５０
％が抗体に結合性を示すこと力； ！１′−１ｌＩｌｔ
３した（第４表）。
クリルアミドゲル電気法Ｎ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法を用
いた。すなわち、硫安塩析−ＤＥＡＥセルロースカラム
で分画したいくつかのフラクションを、各々２−メルカ
プトエタノールでＭｉ元を行ない１７％ＳＤＳゲル、８
０ボルト、２４時間泳動を行なった。その結果、抗体活
性に一致して１分子爪約６５キロダルトン前後にＨ鎖、
約２８キロダルトン前後にＬ鎖の２つの）くンドカＳ認
められｔこ（第２図）。このように精製されｔこ抗体フ
ラクション１７がＩＦＮ−γに対して、結合能を示す力
）どうかを実施例８の方法に従ってＩＦＮ−γ２２００
０／＊？を加えて検索したところ、ＩＦＮ−Ｔの約５０
％が抗体に結合性を示すこと力； ！１′−１ｌＩｌｔ
３した（第４表）。
第４表
実施例１１
モノクローナル抗体の属するサブクラスγ２−１１．１
モノクローナル抗体の属するＩｇＧサブクラスは、実
施例１Ｏの方法で’ｎ’ｌ 製したフラクション１７を
１０倍に希釈し、ヤギ抗マウスＩｇＧ１． Ｇ２ａ、
Ｇ２ｂ、 Ｃ８抗体（マイル注）との寒天内沈降反応法
（オフタロ二−法：イムノロジカルメソツド ゲル−デ
ィフュージョン テクニック、ブラックウェル、イック
スフオー１，１９６４年）で検討しｔコ。結果は、モノ
クローナル抗体とヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ 抗体との間
に著明な１つのバンドが認められ、他の抗１ｇＧ抗体と
の間には。
モノクローナル抗体の属するＩｇＧサブクラスは、実
施例１Ｏの方法で’ｎ’ｌ 製したフラクション１７を
１０倍に希釈し、ヤギ抗マウスＩｇＧ１． Ｇ２ａ、
Ｇ２ｂ、 Ｃ８抗体（マイル注）との寒天内沈降反応法
（オフタロ二−法：イムノロジカルメソツド ゲル−デ
ィフュージョン テクニック、ブラックウェル、イック
スフオー１，１９６４年）で検討しｔコ。結果は、モノ
クローナル抗体とヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ 抗体との間
に著明な１つのバンドが認められ、他の抗１ｇＧ抗体と
の間には。
ハントの形成はみられなかった。従って、当該モノクロ
ーナル抗体は、ＩｇＧ２ｂに属するものであることが判
明した（第６表）。
ーナル抗体は、ＩｇＧ２ｂに属するものであることが判
明した（第６表）。
実施例１２
実施例１Ｏの要領で精製されｔコ素通り分画のモノクロ
ーナル抗体２５ｇ／（６５，ａ’ｆ）を０．１ＭＮａＨ
ＣＯｓ 、 ｐＨ８，８溶液に対して一晩透析を行つｔ
、：Ｏ−万、アフィゲル−１０（バイオ・ラド社）２５
第５表 モノクローナル抗体の居するサブクラス−ｌをグラスフ
ィルターを用いて充分水洗を行った後、Ｏ，１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ３ｐＨ８，８溶液に浮遊させ前記抗体とを昆合し
、４℃で４時間、ゆつ（り檀拌しながら反応させた。そ
の後、４℃で一晩放置した後、グラスフィルターを用い
て０．１ Ｍ Ｎ ａ ＨＣ０３ｐＨ８，８溶液でよく
洗浄した。反応させたゲルに０、１ Ｍエタノールアミ
ン、０．１５ＭＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ８，０）を２
５１加え、４℃、１時間振とうし、残存するかも知れな
い未反応の活性基をブロックした。そのｉ（ゲルをＰＢ
Ｓでよく洗浄し。
ーナル抗体２５ｇ／（６５，ａ’ｆ）を０．１ＭＮａＨ
ＣＯｓ 、 ｐＨ８，８溶液に対して一晩透析を行つｔ
、：Ｏ−万、アフィゲル−１０（バイオ・ラド社）２５
第５表 モノクローナル抗体の居するサブクラス−ｌをグラスフ
ィルターを用いて充分水洗を行った後、Ｏ，１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ３ｐＨ８，８溶液に浮遊させ前記抗体とを昆合し
、４℃で４時間、ゆつ（り檀拌しながら反応させた。そ
の後、４℃で一晩放置した後、グラスフィルターを用い
て０．１ Ｍ Ｎ ａ ＨＣ０３ｐＨ８，８溶液でよく
洗浄した。反応させたゲルに０、１ Ｍエタノールアミ
ン、０．１５ＭＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ８，０）を２
５１加え、４℃、１時間振とうし、残存するかも知れな
い未反応の活性基をブロックした。そのｉ（ゲルをＰＢ
Ｓでよく洗浄し。
Ｏ１％Ｎ ａ Ｎ３を含むＰＢＳ２５１１／にＮ４訓し
、４℃で保存した。加えた抗体量と回収された！Ｆ３液
中の抗体量から、ゲル１ ｍｌ当り２８５岬の抗体が結
合していることが判明した。この様にして得た反応物を
カラムに充め、抗体カラムとして使用した。
、４℃で保存した。加えた抗体量と回収された！Ｆ３液
中の抗体量から、ゲル１ ｍｌ当り２８５岬の抗体が結
合していることが判明した。この様にして得た反応物を
カラムに充め、抗体カラムとして使用した。
実施例１８
参考例４で得た上清６０ ｍｌ ’ｅ １ｍ ＭＥＤＴ
Ａ 。
Ａ 。
０．１５ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐＨ７，６（ＴＥＮ）で１５０＊ｌ に希釈したのち、
実施例１２の方法で調製した抗ＩＦＮ−γ抗体カラムＣ
９ｍ１）にかけた。ＴＥＮで十分洗浄したのち、さらに
０．Ｏ１％ノニデットＰ−４０（シェル社製）０．５Ｍ
ＮａＣｌを含むＴＥＮで洗浄した。次にｏ、２５Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸でＩ ＦＮ−７をｍ出し、俗
出液はただちにＩＭＦリスＩＩＣＩ ｐＨ７，６で中和
した。得られた溶液を蒸留水に対し４℃、１６時間透析
し、これをアセトン−ドライアイスで凍結後凍結乾燥に
付し粉末とした。
ｐＨ７，６（ＴＥＮ）で１５０＊ｌ に希釈したのち、
実施例１２の方法で調製した抗ＩＦＮ−γ抗体カラムＣ
９ｍ１）にかけた。ＴＥＮで十分洗浄したのち、さらに
０．Ｏ１％ノニデットＰ−４０（シェル社製）０．５Ｍ
ＮａＣｌを含むＴＥＮで洗浄した。次にｏ、２５Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸でＩ ＦＮ−７をｍ出し、俗
出液はただちにＩＭＦリスＩＩＣＩ ｐＨ７，６で中和
した。得られた溶液を蒸留水に対し４℃、１６時間透析
し、これをアセトン−ドライアイスで凍結後凍結乾燥に
付し粉末とした。
結果は以下の通りであった。
蛋白質全活性 比活性 回収率
ＣＱ） （Ｕ） （Ｕ／岬） （％）
溶蘭液上清 ２５０．８ ４Ｘ１０’ １．６Ｘ１０’
−抗体力ラム％Ｊｌ ２，０１．５Ｘ１０” ７．５
ｘｌＯ’ ８７．５ここで得られた最終のヒト免疫イン
ターフェロン蛋白質の比活性（ＷＩＳＨ細胞に対するＶ
Ｓ■の細胞変性効果阻止試呼によるウィルス活性ＩＩ定
による（口ｉ１出））は７．５ｘ １０’ Ｕ／ｍｙで
あった。この蛋白質の性状は下記のとおりであった。
−抗体力ラム％Ｊｌ ２，０１．５Ｘ１０” ７．５
ｘｌＯ’ ８７．５ここで得られた最終のヒト免疫イン
ターフェロン蛋白質の比活性（ＷＩＳＨ細胞に対するＶ
Ｓ■の細胞変性効果阻止試呼によるウィルス活性ＩＩ定
による（口ｉ１出））は７．５ｘ １０’ Ｕ／ｍｙで
あった。この蛋白質の性状は下記のとおりであった。
ヒト免疫インターフェロン蛋白質の性状（１）分子ｔ（
実施例１８で得られた蛋白質を２−メルカプトエタノー
ルで処理して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１７，
５％）電気泳動（１５ｍＶ、６時間）にかけ、クマジー
ブルーで染色したところ、蛋白Ｐｉ ハｔｌ−のバンド
として確認できた（第３図）。
ルで処理して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１７，
５％）電気泳動（１５ｍＶ、６時間）にかけ、クマジー
ブルーで染色したところ、蛋白Ｐｉ ハｔｌ−のバンド
として確認できた（第３図）。
なお同時に泳動させた分子量マーカーの泳動距離と蛋白
質の泳動距離との関係から蛋白質の分子量は１７，００
０±１，０００と推定された（第４図）。−万、２−メ
ルカプトエタノールで処理しなかった蛋白質は分子量８
８，０００±２，０００の位置にもう一本のバンドが検
出された。この（ｔｅｆ旧１； Ｎ−γの分子量１７，
０００±１，０００の約２＠１こ相当ｒることから、こ
のバンドはＩＦＮ−γの二［１（体に由来すると考えら
れる。
質の泳動距離との関係から蛋白質の分子量は１７，００
０±１，０００と推定された（第４図）。−万、２−メ
ルカプトエタノールで処理しなかった蛋白質は分子量８
８，０００±２，０００の位置にもう一本のバンドが検
出された。この（ｔｅｆ旧１； Ｎ−γの分子量１７，
０００±１，０００の約２＠１こ相当ｒることから、こ
のバンドはＩＦＮ−γの二［１（体に由来すると考えら
れる。
（１１）アミノ酸分析
実施例１８で得られた蛋白質をガラス製加水分解用試験
管にとり、２００倍Ｍ（Ｖ／ｗ）の４％チオグリコール
酸を含む定１！Ｉｌｊ ！、塩酸を加えて、減圧下に封
管したのち一１ｏ℃で２４．４８．７２時間加水分解し
た。加水分解後、開甘し、塩酸を減圧下で除去し１残渣
を０．０２Ｎ塩酸に后ｈルで日立製８８５型尚速アミノ
酸分析ｇ１によりアミノ酸分析を実施した。
管にとり、２００倍Ｍ（Ｖ／ｗ）の４％チオグリコール
酸を含む定１！Ｉｌｊ ！、塩酸を加えて、減圧下に封
管したのち一１ｏ℃で２４．４８．７２時間加水分解し
た。加水分解後、開甘し、塩酸を減圧下で除去し１残渣
を０．０２Ｎ塩酸に后ｈルで日立製８８５型尚速アミノ
酸分析ｇ１によりアミノ酸分析を実施した。
シスチンおよびシスティンは、ハースの方法（メソッズ
オブ エンチモロジ−１１、１９７（１９６７））に
従い、上記蛋白質を描ギ酸酸化したのち、上記と同様に
２４時間加水分解して。
オブ エンチモロジ−１１、１９７（１９６７））に
従い、上記蛋白質を描ギ酸酸化したのち、上記と同様に
２４時間加水分解して。
アミノ酸分析計によりシスティン酸として定量した。ア
ミノ酸分析値は、２４．４８および７２時間の加水分解
で得られた値を平均してめた。但し、セリン、スレオニ
ン、チロシンおよヒトリフトファンの値は加水分解時間
を０時間に外挿してめた。その結果を第６表に示す。
ミノ酸分析値は、２４．４８および７２時間の加水分解
で得られた値を平均してめた。但し、セリン、スレオニ
ン、チロシンおよヒトリフトファンの値は加水分解時間
を０時間に外挿してめた。その結果を第６表に示す。
第６表
（１１Ｄ アミノ末端アミノ酸分析
実施例１８で得られた蛋白質をハースの方法しメソッズ
オブ エンチモロジ−１１、１９７（１９６７））に
従って過ギ酸酸化したのち、エドマン分解法の岩永らに
ょる２゛法しヨーロピアンジャーナル オブ バイオケ
ミストリー、８゜１８９（１９６９）］によりそのアミ
ノ末端アミノ酸分析を実施した。生成したフェニルチオ
ヒダントイン−アミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸ンはウルト
ラスフェア−０ＤＳカラムしアルテックス社製（［Ｊ、
Ｓ 、Ａ、） 、 ４．６ ｘ ２５０ｍｍ 、 粒子
径５μｍ〕を用い、アルチャーの方法〔アルテックス
クロマトグラム、８．８（１９８０）Ｅに、Ｊ：す、
バ’）７ン製高速液体クロマトグラフ５０４ Ｉ９ （
Ｕ、Ｓ、Ａ、）で同定、定量した。その結、！Ｑ！、、
ＰＴＨ−メチオニンスルホンおよびＰＴＨ−システィン
酸が検出された。
オブ エンチモロジ−１１、１９７（１９６７））に
従って過ギ酸酸化したのち、エドマン分解法の岩永らに
ょる２゛法しヨーロピアンジャーナル オブ バイオケ
ミストリー、８゜１８９（１９６９）］によりそのアミ
ノ末端アミノ酸分析を実施した。生成したフェニルチオ
ヒダントイン−アミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸ンはウルト
ラスフェア−０ＤＳカラムしアルテックス社製（［Ｊ、
Ｓ 、Ａ、） 、 ４．６ ｘ ２５０ｍｍ 、 粒子
径５μｍ〕を用い、アルチャーの方法〔アルテックス
クロマトグラム、８．８（１９８０）Ｅに、Ｊ：す、
バ’）７ン製高速液体クロマトグラフ５０４ Ｉ９ （
Ｕ、Ｓ、Ａ、）で同定、定量した。その結、！Ｑ！、、
ＰＴＨ−メチオニンスルホンおよびＰＴＨ−システィン
酸が検出された。
上記実施例より明らかなように本発明の精製法によれば
、７．５Ｘ１０７Ｕ／岬以上の比活性を有する実質的に
純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質を製造すること
ができる。
、７．５Ｘ１０７Ｕ／岬以上の比活性を有する実質的に
純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質を製造すること
ができる。
以下にγ−３マウスより得たモノクローナル抗体を用い
た成績を示す。
た成績を示す。
実施例１４
三次と同様の方法で四次免疫を行ない四次免疫の２週後
、実施例５と同様に１２０μｇの抗原を０．５ｍｌの食
塩水に溶解させたものを静脈内に接種することにより最
終免疫を行なった。
、実施例５と同様に１２０μｇの抗原を０．５ｍｌの食
塩水に溶解させたものを静脈内に接種することにより最
終免疫を行なった。
実施例１５
細胞融合
実施例１４に記載した最終免疫の８日後のγ−８マウス
から肺臓を摘出し、実施例６記載の方法で細胞融合なら
びにＨＡ Ｔ選択培養を行なった。
から肺臓を摘出し、実施例６記載の方法で細胞融合なら
びにＨＡ Ｔ選択培養を行なった。
その結果４３ウエルに、ハイブリドーマの増殖を認め、
実施例４に記載のＥＩＡ法で抗体の有無を模索したとこ
ろ、２ウエル（γ８−１１．γ８−１９）に強い抗体活
性を認めた。
実施例４に記載のＥＩＡ法で抗体の有無を模索したとこ
ろ、２ウエル（γ８−１１．γ８−１９）に強い抗体活
性を認めた。
実施例１６
クローニング
抗体活性が強雨性を示した２ウエル（γ８−１１゜γａ
−１９）の各ハイブリドーマを、実施例７記載の方法で
クローニングを行なった。その結果。
−１９）の各ハイブリドーマを、実施例７記載の方法で
クローニングを行なった。その結果。
γ８−１１では２１クローン中９クローン、γ３−１９
では２５クローン中１５クローンに抗体活性を認めた（
第７表）。
では２５クローン中１５クローンに抗体活性を認めた（
第７表）。
実施例１７
モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能
モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能は、実
施例８に記載の方法で検討した。但し。
施例８に記載の方法で検討した。但し。
本実施例で用いたＩＦＮ−γサンプルは、七トＩＦＮ−
γ遺伝子をプラスミドに組み込んで大腸菌で発現させた
もの〔ソコンビナントＩＦＮ−γ；参考例４参照）で、
１１０００／＋＋Ｚになるよう調製した。結果は、γ８
−１１．１．γ８−１９．２０クローンの上清中に強い
ＩＦＮ−γ結合能が認められ、加えたＩＦＮ−γの約９
０％が抗体に結合し第７表 クローン化されたハイブリ
ドーマの抗ペプチド抗体活性 Ｒ／Ｔ ’ ＋ ｕｉ会Ｉ 、？−ＲＶｉ’ＬＧｂ／ｙ
＋ｎ４ す・仝ｉＷＷ；：Ｅｌ １ｖ１ｎ ｎた（第８
表れ 第８表 モノクローナル抗体によるリコンビナントＩＦ
Ｎ−γ活性の吸収能 実施例１８ モノクローナル抗体の属するサブクラスγＢ−１１，１
，γＢ−１９，２０クローン細胞を。
γ遺伝子をプラスミドに組み込んで大腸菌で発現させた
もの〔ソコンビナントＩＦＮ−γ；参考例４参照）で、
１１０００／＋＋Ｚになるよう調製した。結果は、γ８
−１１．１．γ８−１９．２０クローンの上清中に強い
ＩＦＮ−γ結合能が認められ、加えたＩＦＮ−γの約９
０％が抗体に結合し第７表 クローン化されたハイブリ
ドーマの抗ペプチド抗体活性 Ｒ／Ｔ ’ ＋ ｕｉ会Ｉ 、？−ＲＶｉ’ＬＧｂ／ｙ
＋ｎ４ す・仝ｉＷＷ；：Ｅｌ １ｖ１ｎ ｎた（第８
表れ 第８表 モノクローナル抗体によるリコンビナントＩＦ
Ｎ−γ活性の吸収能 実施例１８ モノクローナル抗体の属するサブクラスγＢ−１１，１
，γＢ−１９，２０クローン細胞を。
実施例９に記載の方法で腹水化を図り、得られた腹水に
つき、実施例１０記載の方法で精製を行なつｔコ。得う
れたモノクローナル抗体のサブクラスは、実施例１１記
載の寒天内沈降反応法で検討した。結果は、γ３−１１
．１．γ３−１９．２０何れのモノクローナル抗体とも
、ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体との間に著明なバンドが認
められ、他の抗１ｇＧ抗体との間には、バンドの形成は
みられなかった。
つき、実施例１０記載の方法で精製を行なつｔコ。得う
れたモノクローナル抗体のサブクラスは、実施例１１記
載の寒天内沈降反応法で検討した。結果は、γ３−１１
．１．γ３−１９．２０何れのモノクローナル抗体とも
、ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体との間に著明なバンドが認
められ、他の抗１ｇＧ抗体との間には、バンドの形成は
みられなかった。
従って、γＢ−１１，１γ８−１９．２０ モノクロー
ナル抗体は、ＴｇＧｌに属するものであることが判明し
た（第９表れ 第９表 モノクローナル抗体の属するサブクラス実施例１９ ＥＩＡ法によるＩＦＮ−γの定量法１ モノクローナル抗体に対する（ａ） Ｉ Ｆ Ｎ−γと
（ｂ）固相に固定されたＩＦＮ−γとの競合による定量
法 実施例１３で示された大腸菌で発現させた後精製したＩ
ＦＮ−γを１５μｆ ／ｍｌになるよう０１Ｍ重炭酸ナ
トリウムを含有したリン酸緩衝液（ｐｉ８．０）ニ浮遊
させ、こ（Ｄ １００ ｔｔ ｅを９６ウエルマイクロ
プレートの各ウェルに分注し、４℃で２４時間反応させ
た。反応後、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２％
牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液を１００μｅずつ分
注し、４℃で２４時間処理し、ＥＬＩＳＡに使用するプ
レートを作製した。
ナル抗体は、ＴｇＧｌに属するものであることが判明し
た（第９表れ 第９表 モノクローナル抗体の属するサブクラス実施例１９ ＥＩＡ法によるＩＦＮ−γの定量法１ モノクローナル抗体に対する（ａ） Ｉ Ｆ Ｎ−γと
（ｂ）固相に固定されたＩＦＮ−γとの競合による定量
法 実施例１３で示された大腸菌で発現させた後精製したＩ
ＦＮ−γを１５μｆ ／ｍｌになるよう０１Ｍ重炭酸ナ
トリウムを含有したリン酸緩衝液（ｐｉ８．０）ニ浮遊
させ、こ（Ｄ １００ ｔｔ ｅを９６ウエルマイクロ
プレートの各ウェルに分注し、４℃で２４時間反応させ
た。反応後、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２％
牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液を１００μｅずつ分
注し、４℃で２４時間処理し、ＥＬＩＳＡに使用するプ
レートを作製した。
以上のように調製したプレートに、最大凪結合する抗体
の約５０％量の抗体を含む１００μｅの抗体（１ｇ−１
１，１）溶液と種々の濃度（７５，８Ｘ１０２゜１．２
５ＸＩＯ’、５Ｘ１０”、２Ｘ１０’、８Ｘ１０’Ｕ／
ｇｌ）に調製したりコンビナンドＴＦＮ−γを８７℃で
１時間反応させた混合液を加え、室温で３時間反応させ
た。反応後リン酸緩衝液でよく洗浄し、ホースラデイシ
ュペルオキシダ７ゼでラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗
体を１００μｅ加え、室温で８時間反応させた。反応終
了後、ウェルをリン酸緩衝液でよく洗浄し、１０ｇ１の
０．１ Ｍクエン酸緩衝液に２２＃のオルソフェニレン
ジアミン、１０μｅの過酸化水素を加えｔコ基質溶液」
００μｅを加えて酵素反応を室温で１５分行ない、４規
定硫酸で反応を停止させた。停止後、マルチスキャン（
タイ・本ＥＬＩＳＡ法を用いることにより８Ｘ１０’〜
５×Ｉ Ｑ３ Ｕ／鱈ｌのＩＦＮ−ｒ含有液中のＩ Ｆ
Ｎ−７−が定量されることが判明した。
の約５０％量の抗体を含む１００μｅの抗体（１ｇ−１
１，１）溶液と種々の濃度（７５，８Ｘ１０２゜１．２
５ＸＩＯ’、５Ｘ１０”、２Ｘ１０’、８Ｘ１０’Ｕ／
ｇｌ）に調製したりコンビナンドＴＦＮ−γを８７℃で
１時間反応させた混合液を加え、室温で３時間反応させ
た。反応後リン酸緩衝液でよく洗浄し、ホースラデイシ
ュペルオキシダ７ゼでラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗
体を１００μｅ加え、室温で８時間反応させた。反応終
了後、ウェルをリン酸緩衝液でよく洗浄し、１０ｇ１の
０．１ Ｍクエン酸緩衝液に２２＃のオルソフェニレン
ジアミン、１０μｅの過酸化水素を加えｔコ基質溶液」
００μｅを加えて酵素反応を室温で１５分行ない、４規
定硫酸で反応を停止させた。停止後、マルチスキャン（
タイ・本ＥＬＩＳＡ法を用いることにより８Ｘ１０’〜
５×Ｉ Ｑ３ Ｕ／鱈ｌのＩＦＮ−ｒ含有液中のＩ Ｆ
Ｎ−７−が定量されることが判明した。
実施例２０
ＥＩＡ法によるＩＦＮ−γの定量注腸
モノクローナル抗体に対する（ａ） Ｉ Ｆ Ｎ−γサ
ンプルと（ｂ）酵素標識した本発明ペプチドとの競合に
よる定量法 実施例２０−（＋＞ 参考例４で得られたりコンビナンドＩＦＮ−γを種々の
濃度（６４，８２０，１，６Ｘ１０’、８ＸＩＯ”。
ンプルと（ｂ）酵素標識した本発明ペプチドとの競合に
よる定量法 実施例２０−（＋＞ 参考例４で得られたりコンビナンドＩＦＮ−γを種々の
濃度（６４，８２０，１，６Ｘ１０’、８ＸＩＯ”。
５Ｘ １０’、 ２ｘ ｌ Ｏ’ Ｕ／ｍｌ ）に調製
し、この１００ｔｔｅを一定量（７）γ８−１１．１．
７ｓ−ｘ９２ｏ抗体含有液１００μｅと室温で２時間反
応させｔ二。これに実施例８で得られた酵素結合ポリペ
プチド誘導体を１００μｅ加え、４℃で４８時間反応さ
せた。反応終了後、この混合物を、ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ 抗ＶＦを結合させた３％セルロース溶１１００μ
ｅに加工１室温で４時間反応させた。反応後、実施例４
で記載したのと同様の方法で酵素反応を行ない、蛍光強
度を測定した。その結果、モノクローナル抗体（γ８−
１１．１．γ８−１９．２０）への酵素結合ポリペプチ
ド誘導体の結合は、８２０Ｕ／ｗｅのＩ ＦＮ−７存在
下でわずかに阻害され、 ８ Ｘ ｌＯ’Ｕ／ｇ／存在
下では、はぼ完全に阻害された〔第１０図）。従って本
方法を使用することにより、３２０〜８×１０３Ｕ／ｓ
ＺのＩＦＮ−ｒ含有液中のＩＦＮ−７の定量が可能とな
った。
し、この１００ｔｔｅを一定量（７）γ８−１１．１．
７ｓ−ｘ９２ｏ抗体含有液１００μｅと室温で２時間反
応させｔ二。これに実施例８で得られた酵素結合ポリペ
プチド誘導体を１００μｅ加え、４℃で４８時間反応さ
せた。反応終了後、この混合物を、ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ 抗ＶＦを結合させた３％セルロース溶１１００μ
ｅに加工１室温で４時間反応させた。反応後、実施例４
で記載したのと同様の方法で酵素反応を行ない、蛍光強
度を測定した。その結果、モノクローナル抗体（γ８−
１１．１．γ８−１９．２０）への酵素結合ポリペプチ
ド誘導体の結合は、８２０Ｕ／ｗｅのＩ ＦＮ−７存在
下でわずかに阻害され、 ８ Ｘ ｌＯ’Ｕ／ｇ／存在
下では、はぼ完全に阻害された〔第１０図）。従って本
方法を使用することにより、３２０〜８×１０３Ｕ／ｓ
ＺのＩＦＮ−ｒ含有液中のＩＦＮ−７の定量が可能とな
った。
実施例２０−（ＩＤ
実施例２０−（１）と原理的には同じであるが、マルチ
スキャンを用いて、自動的に迅速に多数のサンプルを測
定出来る方法として以下の変法を行つナー− ９６穴のマイｆ７０％Ｐ＋Ｐ＋＋プレート（ヌンクーウ
酸緩衝液ｐＨ８，０）２００μｅを注入し４℃で１晩放
置した。液を除いた後、１％のＢＳＡを含む０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）８００ｐｇを注入し、室温
で８時間放置後、液を除去した。
スキャンを用いて、自動的に迅速に多数のサンプルを測
定出来る方法として以下の変法を行つナー− ９６穴のマイｆ７０％Ｐ＋Ｐ＋＋プレート（ヌンクーウ
酸緩衝液ｐＨ８，０）２００μｅを注入し４℃で１晩放
置した。液を除いた後、１％のＢＳＡを含む０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）８００ｐｇを注入し、室温
で８時間放置後、液を除去した。
（２ノモノクローナル抗体γＢ−１１，１ｉ１着；’Ｌ
／ −トの作製 １５０μｅ注入した。４℃で１晩放ｔＬｔ後、液を除去
し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で８回洗浄
し、抗体段Ｎプレートを作製した。
／ −トの作製 １５０μｅ注入した。４℃で１晩放ｔＬｔ後、液を除去
し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で８回洗浄
し、抗体段Ｎプレートを作製した。
（力操作法
被検試料あるいは標準ＩＦＮ−γを緩げｊ／ｌ！Ａ（０
，１Ｍ ＮａＣＩ 、 １ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、０．１
％ＢＳＡ 。
，１Ｍ ＮａＣＩ 、 １ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、０．１
％ＢＳＡ 。
０．１％Ｎ ａ Ｎ３ を含むｐＨ７の０．０２ Ｍリ
ン酸緩衝液）で適当な濃度に希釈し、各々を＋２１で作
製したプレートの各穴に７５μｅずつ注入する。次に緩
衝液Ａ’ｔ”１８０倍に希釈した実施例８の酵素標識体
の５μｅをプレートの各穴に注入する。パラフィルムを
かけ３７℃１時間反応、引き続き室温で８時間反応させ
た。反応液を除去後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）７５μｅで４回洗浄した。
ン酸緩衝液）で適当な濃度に希釈し、各々を＋２１で作
製したプレートの各穴に７５μｅずつ注入する。次に緩
衝液Ａ’ｔ”１８０倍に希釈した実施例８の酵素標識体
の５μｅをプレートの各穴に注入する。パラフィルムを
かけ３７℃１時間反応、引き続き室温で８時間反応させ
た。反応液を除去後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）７５μｅで４回洗浄した。
発色反応のため、プレートの各穴に緩衝液Ａで調製した
１、 ５ Ｗ ／ ｍｅの４−二トロフェニルーβ−Ｄ
−ガラクトピラノシド（和光紬薬、特級）１５０μｅを
注入して、室温で１晩反応させた。０．４ Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ１０，５）１００μｅを各穴に加えて。
１、 ５ Ｗ ／ ｍｅの４−二トロフェニルーβ−Ｄ
−ガラクトピラノシド（和光紬薬、特級）１５０μｅを
注入して、室温で１晩反応させた。０．４ Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ１０，５）１００μｅを各穴に加えて。
発色反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度をマイクロタイ
トレージョンブレート用光度Ｊ１チテルテツクマルチス
キャン（フロー社〔米国）製）で測定した。
トレージョンブレート用光度Ｊ１チテルテツクマルチス
キャン（フロー社〔米国）製）で測定した。
第１１図にＩＦＮ−γの標準曲線を示した。第１０表で
ＩＦＮ−γを含む６種類の被検試料につ動を示したが、
変動係数７．４％と良好な結果を与えｔこ。
ＩＦＮ−γを含む６種類の被検試料につ動を示したが、
変動係数７．４％と良好な結果を与えｔこ。
第１０表
第１１表
実施例１８．１９および２０ （１） 、 （ＩＩ）で
使用した粗ＩＦＮ−γ含有上清は以下の参考例で示す方
法により得られた。
使用した粗ＩＦＮ−γ含有上清は以下の参考例で示す方
法により得られた。
参考例１
（１） ヒトＩ−ＩＦＮをコードするｍＲＮＡの分離ヒ
ト末梢血より調製したリンパ球を１２−０−テトラデカ
ノイルホルボール−１８−アセテート（ＴＰＡ）（１５
ｎｇ／ｇ（）とコンカナバリンＡ（４０μｇ／耐）を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％の牛胎児血清を含む
）で８７℃培養し、Ｉ−ＩＦＮを誘導させた。２４時間
後、この誘導したＩ Ｘ １ ｏ１固のヒトリンパ球を
チオグアニジン変性溶ｉ（５Ｍグアニジンチオシアネー
ト、５％メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｔｒ １ｓ
−ＨＣｅ ｐＨ７，６。
ト末梢血より調製したリンパ球を１２−０−テトラデカ
ノイルホルボール−１８−アセテート（ＴＰＡ）（１５
ｎｇ／ｇ（）とコンカナバリンＡ（４０μｇ／耐）を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％の牛胎児血清を含む
）で８７℃培養し、Ｉ−ＩＦＮを誘導させた。２４時間
後、この誘導したＩ Ｘ １ ｏ１固のヒトリンパ球を
チオグアニジン変性溶ｉ（５Ｍグアニジンチオシアネー
ト、５％メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｔｒ １ｓ
−ＨＣｅ ｐＨ７，６。
１０ｍＭ ＥＤＴＡ ）中でテフロンホモゲナイザーに
よって破壊変性した後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナ
トリウムを４％になるように加え、均質化した混合物を
５．７Ｍ塩化セシウム溶液Ｌ ５．７ Ｍ塩化セシウム
、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）６ｍｇ
上昏こ重層し、ベックマン５Ｗ２７のローターを用いて
１６℃で２４０００ｒｐｍＪｌＯ時間遠心処即を行い、
ＲＮＡ沈澱を得た。
よって破壊変性した後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナ
トリウムを４％になるように加え、均質化した混合物を
５．７Ｍ塩化セシウム溶液Ｌ ５．７ Ｍ塩化セシウム
、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）６ｍｇ
上昏こ重層し、ベックマン５Ｗ２７のローターを用いて
１６℃で２４０００ｒｐｍＪｌＯ時間遠心処即を行い、
ＲＮＡ沈澱を得た。
このＲＮＡ沈澱を０．２６％Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱させ
、８．８１１ＦのＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩浴液
Ｌ０．５ＭＮａ（１，１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（ＪｐＨ７
，６，１ｍＭＥＤＴＡ、０．８％ＳＤＳ ）中でオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（イ）を含
むｍＲＮＡを低塩溶液（１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ
ｌ ・ｐＨ７，６，１ｍＭＥＤＴＡ、０．８％ＳＤＳ
）で溶出させることにより、ポリ（２）を含むｍＲＮＡ
７００１１ｇを分取した。
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱させ
、８．８１１ＦのＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩浴液
Ｌ０．５ＭＮａ（１，１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（ＪｐＨ７
，６，１ｍＭＥＤＴＡ、０．８％ＳＤＳ ）中でオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（イ）を含
むｍＲＮＡを低塩溶液（１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ
ｌ ・ｐＨ７，６，１ｍＭＥＤＴＡ、０．８％ＳＤＳ
）で溶出させることにより、ポリ（２）を含むｍＲＮＡ
７００１１ｇを分取した。
このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０．２ｍｌ
の溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６，２ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．８％ＳＤＳ月こ溶かし、６５℃で２分
間処理して１０〜ｂ ー’Ｆマン５Ｗ２７のローターを用いて２０℃。
の溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６，２ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．８％ＳＤＳ月こ溶かし、６５℃で２分
間処理して１０〜ｂ ー’Ｆマン５Ｗ２７のローターを用いて２０℃。
２５０００ｒｐｍ で２１時冊遠心分ｓりすることによ
り分画化して２２分画を得た。この各分画につきＲＮＡ
の一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し
１合成される蛋白質中のインターフェロン活性〔ヒト羊
膜由来Ｗ Ｉ Ｓ Ｈ１ｌｌ胞に対する水泡性口内炎ウ
ィルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験を用いて測定
した。抗ウィルス活性しザインター′フエロン システ
ム、スプリンガーネ］。
り分画化して２２分画を得た。この各分画につきＲＮＡ
の一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し
１合成される蛋白質中のインターフェロン活性〔ヒト羊
膜由来Ｗ Ｉ Ｓ Ｈ１ｌｌ胞に対する水泡性口内炎ウ
ィルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験を用いて測定
した。抗ウィルス活性しザインター′フエロン システ
ム、スプリンガーネ］。
ニューヨーク、１１頁、１９７９年〕を測定し。
分画１２（沈降定数Ｓ値は１２−１４５を示した）に１
９５ユニット／μｇＲＮＡの活性を検出した。
９５ユニット／μｇＲＮＡの活性を検出した。
このようにして得た分画１２のｍＲＮＡは約２０μｇで
あった。
あった。
（１１）単鎖ＤＮＡの合成
上記で得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、Ｚｏｏ、
ｌの反応液（５μｇのｍＲＮＡ、５０ ｐ ｇオリゴ（
ｄＴ）、ｌ ＯＯユニットの逆転写酵素１１ｍＭずつの
ｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、８ｍＭ
Ｍｇｃｌ＋、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ジチオスレイ
トール、 ５０ｍＭ”ｒｒｉｓ−ＨＣＩ ｐｌ（ｓ、８
）中で４２℃、１時１’ｌｆｌインキユベートした後に
、フェノールで除蛋白し、０１ＮのＮａＯＨで７０℃、
２０分処理してＲＮＡを分解除去した。
ｌの反応液（５μｇのｍＲＮＡ、５０ ｐ ｇオリゴ（
ｄＴ）、ｌ ＯＯユニットの逆転写酵素１１ｍＭずつの
ｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、８ｍＭ
Ｍｇｃｌ＋、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ジチオスレイ
トール、 ５０ｍＭ”ｒｒｉｓ−ＨＣＩ ｐｌ（ｓ、８
）中で４２℃、１時１’ｌｆｌインキユベートした後に
、フェノールで除蛋白し、０１ＮのＮａＯＨで７０℃、
２０分処理してＲＮＡを分解除去した。
（ｉｌｌ ） 二重鎖ＤＮＡの合成
ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０ ｐ （１の
反応液ＣｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と
同じ反応液）中で４２℃２時間反応させることにより二
重鎖ＤＮＡを合成した。
反応液ＣｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と
同じ反応液）中で４２℃２時間反応させることにより二
重鎖ＤＮＡを合成した。
（ＩＶ） ｄＣテイルの付加
この二重鎖ＤＮＡＩこヌクレアーゼＳ１を５０μｅの反
応液（二重鎖ＤＮＡ０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４，５
，０，２５ＭＮａＣ＋、１．５ｍＭＺｎＳＯ４゜６０ユ
ニツトのＳｌヌクレアーゼ）中で室温８０分間作用させ
、フェノールで除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せた後、これにターミナルトランスフェラーゼを６０μ
ｅの反応液（二重鎖ＤＮＡ、０．１４Ｍカコジル酸カリ
、０．８Ｍ Ｔｒｉｓ（塩基）ｐＨ７，６，２ｍＭジチ
オスレイトール。
応液（二重鎖ＤＮＡ０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４，５
，０，２５ＭＮａＣ＋、１．５ｍＭＺｎＳＯ４゜６０ユ
ニツトのＳｌヌクレアーゼ）中で室温８０分間作用させ
、フェノールで除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せた後、これにターミナルトランスフェラーゼを６０μ
ｅの反応液（二重鎖ＤＮＡ、０．１４Ｍカコジル酸カリ
、０．８Ｍ Ｔｒｉｓ（塩基）ｐＨ７，６，２ｍＭジチ
オスレイトール。
１ｍＭＣｏＣｌ２．０．１５ｍＭ ｄＣＴＰ、８０−ｙ
−ニットターミナルトランスフェラーゼ）中で８分間８
７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの８′両端に約２０個のデ
オキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反応で
約８００ｎＨのデオキシシチジン鎖をもつた二重鎖ＤＮ
Ａを得た。
−ニットターミナルトランスフェラーゼ）中で８分間８
７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの８′両端に約２０個のデ
オキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反応で
約８００ｎＨのデオキシシチジン鎖をもつた二重鎖ＤＮ
Ａを得た。
（Ｖ） 大腸菌プラスミドの開裂ならびにｄＧテイルの
付加 一部、１０ｇｇの大腸菌プラスミドｐＢＲ８２２ＤＮＡ
に制限酵素ＰｓｔＩを５０μｅの反応液［１０１１ｇＤ
ＮＡ、５０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（１
）Ｈ７，４）、６ｍＭＭｇＣ１２，６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノール、１００μｇ／ｗ１牛血清アルフミン。
付加 一部、１０ｇｇの大腸菌プラスミドｐＢＲ８２２ＤＮＡ
に制限酵素ＰｓｔＩを５０μｅの反応液［１０１１ｇＤ
ＮＡ、５０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（１
）Ｈ７，４）、６ｍＭＭｇＣ１２，６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノール、１００μｇ／ｗ１牛血清アルフミン。
２０ユニツトのＰｓｔｌｌ中で８時間３７℃で作用させ
てｐＢＲ８２ｇ ＤＮＡ中に１ケ所存在するＰｓｔＩ認
識部位を切断し、フェノールで除蛋白した後、ターミナ
ルトランスフェラーゼを５０μｅの反応液（ＤＮＡＩＯ
μｇ、０．１４Ｍカコジル酸カリ、０３ＭＴｒｉｓ（塩
基）ｐＨ７，６，２ｍＭジチオスレイトール、１ ｍＭ
ＣＯＣｌ２．０．１５ｍＭ ｄＧＴＰ 、８０ユニツ
トターミナルトランスフエラーゼ〕中で８分間８７℃で
作用させ上記プラスミドｐＢＲ８２２ＤＮＡの８′両端
に約８４１ｉ！Ｈのデオキシグアニン鎖を延長させた。
てｐＢＲ８２ｇ ＤＮＡ中に１ケ所存在するＰｓｔＩ認
識部位を切断し、フェノールで除蛋白した後、ターミナ
ルトランスフェラーゼを５０μｅの反応液（ＤＮＡＩＯ
μｇ、０．１４Ｍカコジル酸カリ、０３ＭＴｒｉｓ（塩
基）ｐＨ７，６，２ｍＭジチオスレイトール、１ ｍＭ
ＣＯＣｌ２．０．１５ｍＭ ｄＧＴＰ 、８０ユニツ
トターミナルトランスフエラーゼ〕中で８分間８７℃で
作用させ上記プラスミドｐＢＲ８２２ＤＮＡの８′両端
に約８４１ｉ！Ｈのデオキシグアニン鎖を延長させた。
（Ｖｌ） ｃＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形質変換こ
のようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ０．１μｇと上
記プラスミドｐＢＲ８２２０，５／’ｇを０．１ＭＮａ
Ｃｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，６，１ｍＭ
ＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間
加熱しその後除冷して会合させＥｎｅａらの方法ＬＪ。
のようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ０．１μｇと上
記プラスミドｐＢＲ８２２０，５／’ｇを０．１ＭＮａ
Ｃｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，６，１ｍＭ
ＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間
加熱しその後除冷して会合させＥｎｅａらの方法ＬＪ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９６，４９５（１９７５））に従っ
て大腸菌χ１７７６を形質転換させた。
て大腸菌χ１７７６を形質転換させた。
（Ｖｆｌ）ｃＤＮＡ 含有プラスミドの単離こうして約
８５００のテトラサイクリン耐性株が単離され１これら
各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルターの上に固定
した。〔プロシーディングオブ ナショナル アカデミ
−サイエンスＵＳＡ ７２．３９６１（１９７５））一
方、ゴエデルらの報告しネイチャー、２９５゜５０８（
１９８２））のＩ−ＩＦのアミノ酸配列をもとにしてア
ミノ酸ＡＩ −５（Ｃｙｓ４ｙｒ−Ｃｙｓ・Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ ）及びアミノ酸Ａ７７−８２（Ｌｙｓ−ＧＩｒｒ
Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａｌ ）より推測できる塩
基配列ＡＣＧＴＴＣＡＴ父ＴｃＨ”ｒｃＨ’ｒ ” ）
をトリエステル法（フレアら、プロシーディング ン１
ブ ナショナル アカデミ−サイエンス ＵＳＡ 、
７５ 、５７６５（１９７８）］を用いて化学合成した
。このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチ
ドカイネースを用いて５０μｅ の反応液（オリゴヌク
１７オチド０．２μｇ、５０ｍＭＴｒｉｓ・ｌＩＣ１ｐ
Ｈ８，０，１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭメルカプトエ
タノール。
８５００のテトラサイクリン耐性株が単離され１これら
各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルターの上に固定
した。〔プロシーディングオブ ナショナル アカデミ
−サイエンスＵＳＡ ７２．３９６１（１９７５））一
方、ゴエデルらの報告しネイチャー、２９５゜５０８（
１９８２））のＩ−ＩＦのアミノ酸配列をもとにしてア
ミノ酸ＡＩ −５（Ｃｙｓ４ｙｒ−Ｃｙｓ・Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ ）及びアミノ酸Ａ７７−８２（Ｌｙｓ−ＧＩｒｒ
Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａｌ ）より推測できる塩
基配列ＡＣＧＴＴＣＡＴ父ＴｃＨ”ｒｃＨ’ｒ ” ）
をトリエステル法（フレアら、プロシーディング ン１
ブ ナショナル アカデミ−サイエンス ＵＳＡ 、
７５ 、５７６５（１９７８）］を用いて化学合成した
。このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチ
ドカイネースを用いて５０μｅ の反応液（オリゴヌク
１７オチド０．２μｇ、５０ｍＭＴｒｉｓ・ｌＩＣ１ｐ
Ｈ８，０，１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭメルカプトエ
タノール。
５０μＣｉγ−３２ＰＡＴＰ、８ユニツトＴ４ポリヌク
レオチドカイネース〕中で１時同８７℃で反応さセ、５
・末端を８２Ｆ で標識した。この標識されたオリゴヌ
クレオチドをプローブとしてＬａｗｎらの方法〔ヌクレ
イツク アシツズ リサーチ、」。
レオチドカイネース〕中で１時同８７℃で反応さセ、５
・末端を８２Ｆ で標識した。この標識されたオリゴヌ
クレオチドをプローブとしてＬａｗｎらの方法〔ヌクレ
イツク アシツズ リサーチ、」。
６１０８（１９８１））に従って上記のニトロセルロー
スフィルター上に固定したりＤＮＡに会合させ。
スフィルター上に固定したりＤＮＡに会合させ。
オートラジオグラフィーによって上記二種類のオリゴヌ
クレオチドプローブに反応する菌株を４個単離した。こ
れらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡ をアル
カリ法（［ｉｒｎｂｏｉｍ ｆ（、Ｃ，ａＤｏｌｙ、Ｊ
、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７ 、
１５１８（１９７９）） によって単離した。次にプラ
スミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔｌにより切り出
し。
クレオチドプローブに反応する菌株を４個単離した。こ
れらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡ をアル
カリ法（［ｉｒｎｂｏｉｍ ｆ（、Ｃ，ａＤｏｌｙ、Ｊ
、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７ 、
１５１８（１９７９）） によって単離した。次にプラ
スミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔｌにより切り出
し。
分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も長
い断片を含むものをえらび、このプラスミドをｐＨＩＴ
８７０９と名ずけた。
い断片を含むものをえらび、このプラスミドをｐＨＩＴ
８７０９と名ずけた。
次にこのｐＨＩＴ８７０９プラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡ配列の一次構造（塩基配列ンをジヌクレオチド合成
鎖停止法とＭａｘａｍ−Ｇｉ １ｂｅｒｔの方法によっ
て決定した。その−次構造は第５図の通りであった。ｐ
ＨＩＴ８７０９のＩＦＮ−γ暗号領域（コドンＡＳ１〜
７ｊ１．１４６）の塩基配列は公告文献しヌクレイツク
アシツズ リサーチ−０，２４８７（１９８２）中の
第８図〕に記載されたものと同一であった。
ＮＡ配列の一次構造（塩基配列ンをジヌクレオチド合成
鎖停止法とＭａｘａｍ−Ｇｉ １ｂｅｒｔの方法によっ
て決定した。その−次構造は第５図の通りであった。ｐ
ＨＩＴ８７０９のＩＦＮ−γ暗号領域（コドンＡＳ１〜
７ｊ１．１４６）の塩基配列は公告文献しヌクレイツク
アシツズ リサーチ−０，２４８７（１９８２）中の
第８図〕に記載されたものと同一であった。
参考例２
（１）発現プラスミドとして大腸菌のトリプトファン合
成のプロモータ一部分〔プロモーター、オペレーターを
含むＤＮＡ断片、２７６塩基対、ベネットら、ジャーナ
ル オブ モレキュラーノマイオロジー、１２１．１１
８（１９７８）］を含むプラスミドｐｔｒｐ６０１ （
ベクターはｐＢＲ８２２）を構築した。
成のプロモータ一部分〔プロモーター、オペレーターを
含むＤＮＡ断片、２７６塩基対、ベネットら、ジャーナ
ル オブ モレキュラーノマイオロジー、１２１．１１
８（１９７８）］を含むプラスミドｐｔｒｐ６０１ （
ベクターはｐＢＲ８２２）を構築した。
一万、プラスミドｐＢＲ８２２を制限酵素Ｅｃ ｏＲＩ
および制限酵素Ａｖａ Ｉで切断し、得られたテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲｌ−ＡｖａＩ断片の
のりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメン
トでうめた。この断片を１’４ＤＮＡリガーゼを用いて
ｐｔｙｐ６０１のＰｖｕ ｌの切断部位に結合させｐｔ
ｒｐ７０１を構築した（第６図）。
および制限酵素Ａｖａ Ｉで切断し、得られたテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲｌ−ＡｖａＩ断片の
のりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメン
トでうめた。この断片を１’４ＤＮＡリガーゼを用いて
ｐｔｙｐ６０１のＰｖｕ ｌの切断部位に結合させｐｔ
ｒｐ７０１を構築した（第６図）。
（１１）次にｐｔｒｐ７０１に２ケ所存在する制限酵素
ＣＩａＩ切断部位の一つを消去するため、 ｐｔｒｐ７
０１をＣＩａＩで部分分解して二つのＣ１ａｌ ＶＪ断
部位のうち一方のみが切断されたものを得た。生じたの
りしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント
でうめたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで１１ｊ度結合させ
てｐｔｒｐ７７１を得た（第６図）。
ＣＩａＩ切断部位の一つを消去するため、 ｐｔｒｐ７
０１をＣＩａＩで部分分解して二つのＣ１ａｌ ＶＪ断
部位のうち一方のみが切断されたものを得た。生じたの
りしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント
でうめたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで１１ｊ度結合させ
てｐｔｒｐ７７１を得た（第６図）。
（ｉｌＤ ｐＨＩＴ８７０９を制限酵素Ｐｓｔｌで切断
してＩＦＮ−γのｒＮ造遺伝子を含むＰｓｔＩ断片を得
ｊムこの断片を制限酵素ＢｓｔＮＩで部分分解し、ＩＦ
Ｎ−γ構造遺伝子内にあるＢｓｔＮＩ部位の切断された
Ｂｓ ｔＮＩ−Ｉ’ｓ ｔ ｌ断片を得た。ＢｓｔＮＩ
切断部位ののりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼ１ラージ
フラグメントでうめたのち、前述したトリエステル法に
よって化学合成した蛋白合成ｕｔＪ始コドンＡＴＧを含
むオリゴヌクレオチドアダプター ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡ
ＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。
してＩＦＮ−γのｒＮ造遺伝子を含むＰｓｔＩ断片を得
ｊムこの断片を制限酵素ＢｓｔＮＩで部分分解し、ＩＦ
Ｎ−γ構造遺伝子内にあるＢｓｔＮＩ部位の切断された
Ｂｓ ｔＮＩ−Ｉ’ｓ ｔ ｌ断片を得た。ＢｓｔＮＩ
切断部位ののりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼ１ラージ
フラグメントでうめたのち、前述したトリエステル法に
よって化学合成した蛋白合成ｕｔＪ始コドンＡＴＧを含
むオリゴヌクレオチドアダプター ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡ
ＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。
−万、上記アダプターを結合させたＩＦＮ−γ遺伝子を
ｐｔｒｐ７７１を制限酵素Ｐｓｔｌと制限酵素Ｃ１ａｌ
で切断して得た断片乞トリプトファンプロモータの下流
に挿入してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ＩＦ
Ｎ−ｒ発現プラスミドｐＨＩＴｔｒｐＨ０１を構築した
（第７図）。
ｐｔｒｐ７７１を制限酵素Ｐｓｔｌと制限酵素Ｃ１ａｌ
で切断して得た断片乞トリプトファンプロモータの下流
に挿入してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ＩＦ
Ｎ−ｒ発現プラスミドｐＨＩＴｔｒｐＨ０１を構築した
（第７図）。
（ＩＶ） ｐＨ１Ｔｔｒｐ １１０１をさらに改良して
次の通りｐＨＩＴｔｒｐ２１０１を構築した。
次の通りｐＨＩＴｔｒｐ２１０１を構築した。
まずｐｔｒｐ６０１を制限酵素Ｃ１ａｌおよび制限酵素
Ｈｐａｌで処理してｔｒｐプロモータを含むＣ１ａｌ−
Ｈｐ ａ ｌ断片０．８８Ｋｂを得た。この断片を、
Ｃ１ａＪでＷしアルカリホスファターゼ処理したｐＨＩ
ＴｔｒｐＨｏｌにＴ４ＤＮＡ リガーゼを用いて結合さ
せｔｒｐプロモーターが二つ直列に入ったｐＨＩＴｔｒ
ｐ ２１０１を得た（第８図〕。
Ｈｐａｌで処理してｔｒｐプロモータを含むＣ１ａｌ−
Ｈｐ ａ ｌ断片０．８８Ｋｂを得た。この断片を、
Ｃ１ａＪでＷしアルカリホスファターゼ処理したｐＨＩ
ＴｔｒｐＨｏｌにＴ４ＤＮＡ リガーゼを用いて結合さ
せｔｒｐプロモーターが二つ直列に入ったｐＨＩＴｔｒ
ｐ ２１０１を得た（第８図〕。
を形質転換させ、このプラスミドを”＠ ”（ｒ ｆｔ
４ Ｋ（１！：。
４ Ｋ（１！：。
ｃｏｌｉ）２９４／ｐＨＩＴ ｔｒｐ２１０１ を得ｔ
こ。
こ。
参考例８
Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４／ｐＨＩＴＬｒｐ、２１０］を８１
１ｇ／ｍｌのテトラサイクリン、０４％カザミノ酸、１
％グルコースを含むＭ９培地２００騨ｌ を分ＬＬシた
ｌｅママイヤー中８７℃で培養し、生育がＫＵ２２０に
達した時に８β−インドリ−ルアクリル酸（ＩＡＡ）を
３０μｇ／ｄになるように加えて史に４時間培養した。
１ｇ／ｍｌのテトラサイクリン、０４％カザミノ酸、１
％グルコースを含むＭ９培地２００騨ｌ を分ＬＬシた
ｌｅママイヤー中８７℃で培養し、生育がＫＵ２２０に
達した時に８β−インドリ−ルアクリル酸（ＩＡＡ）を
３０μｇ／ｄになるように加えて史に４時間培養した。
参考例４
参考例８で得られた培養液１．２ｅを遠心分１ｕｌｆ
ｔ。
ｔ。
て菌体を集め、これを６０ ｗｌの１０％シュクロース
を含む０．０５Ｍ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ ｐＨ７，
６に懸濁した。
を含む０．０５Ｍ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ ｐＨ７，
６に懸濁した。
この菌体懸濁液に０．２ Ｍフェニル−メチル−スルフ
ォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）０．８ａＪ、５ＭＮａ
Ｃ１２，４ｍｌ 、 ０．２Ｍエチレンジアミンテトラ
アセテート（ＥＤＴＡ）２．４ａＪ、１Ｍスペルミジン
２、４ ｍｌ 、 ５ ｓｐ／ ｔｌリゾチーＡ ２．
４ ｗｌを加えＯＣで１時間放置したのち、８７℃で５
分処理し、これを更にアルチック社（米国）製超音波破
砕器で０℃８０秒処理した。
ォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）０．８ａＪ、５ＭＮａ
Ｃ１２，４ｍｌ 、 ０．２Ｍエチレンジアミンテトラ
アセテート（ＥＤＴＡ）２．４ａＪ、１Ｍスペルミジン
２、４ ｍｌ 、 ５ ｓｐ／ ｔｌリゾチーＡ ２．
４ ｗｌを加えＯＣで１時間放置したのち、８７℃で５
分処理し、これを更にアルチック社（米国）製超音波破
砕器で０℃８０秒処理した。
この溶Ｍ液を１０５，０ＯＱｘＩ で１時間遠心分離し
て上演６６ｍ１を集めた。
て上演６６ｍ１を集めた。
第１図は実施例１Ｏにおける本発明のモノクローナル抗
体のＤＥＡＥセルロースカラムにおける溶出パターンを
示し、第２図は実施例ｉｏにおけるモノクローナル抗体
の市、気泳動の結果を示す。 第８図は実施例１８の後に示した本発明の精製法で得ら
れるヒト免疫インターフェロン蛋白質の電気泳動の結果
を、第４図は実施例１８の後に同様に示した分子量測定
の結果を示す。第５図は参考例１（ｖｉｉ）で得られた
ｐＨＩＴ８７０９プラスミドの一次描浩（情無ρ石１１
）ル 侑ＲＦＪｌｌ＋安安訪１１９１１）（１１〕のｐ
ｔｒｐ ７０１およびｐｔｒｐ ７７１．第７図は、参
考例２ （Ｉｌｌ）のｐＨ工Ｔ ｔｒｐ １１０１ 、
第８図は参考例２０Ｖ）のｐＨ工Ｔ ｔｒｐ ２１０１
のそれぞれ構築図を、第９図は実施例１９によるモノ
クローナル抗体に対する（ａ）リコンビナントＩＦＮ−
γサンプルと＋ｂ）固相に固定された工ＦＮ−γとの競
合を示す。第１０図および第１１図はそれぞれ実施例２
Ｏ−１１）。 ２０−（ｉｉ）によるモノクローナル抗体に対する（ａ
）工ＦＮ−γ資料と（ｂ）酵素標識された本発明のペプ
チドとの競合を示す。 第３図 第≠図 相対移動底 Ｅ リソ゛チーム （／４１．’ｌｌρ）号 ５ ｇｕ
； ｔ−ｔ リ Ｅ−０６％ と ８ 同 べ 速
ζ ト ト ８８ 琥 鑓 し Ｅ ８ 日 −＜ Ｕ 日、日 Ｃ ＜ Ｅ４ ｈｈ ５ ５ 麺 ： Ω伐属 頌 に 悴 ヨ畦 ５ １ し 詮 Ｂ ミ 旨 巴 ［ ヨ 目 ＥＷ ■ ａ ： 畦 １，１ ２ ．３ ＊ ！ −８ご ８ 急 ％ 訣 １ 第６図 第２図 第１Ｏ図 ソフンビナント１ＦＮ−ｆＬス（（Ｕ／ｍ〕）ムキソク
ク−たし♂し見−’３−１９．２０第１１図 ぜ△２〆 二 第１頁の続き ｏＩｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号／／ Ｇ
０７ Ｋ ９９：００ 優先権主張 ６１９８％目１月ｎ日［相］モナコ（ＭＣ
）［有］ＰＣＩＯ１ｇ８３手５月３１日［相］モナコ（
ＭＣ）［有］ＰＣ］’／ＪＰ８２／ ００４４４ ’／ＪＰ８３１００１７４
体のＤＥＡＥセルロースカラムにおける溶出パターンを
示し、第２図は実施例ｉｏにおけるモノクローナル抗体
の市、気泳動の結果を示す。 第８図は実施例１８の後に示した本発明の精製法で得ら
れるヒト免疫インターフェロン蛋白質の電気泳動の結果
を、第４図は実施例１８の後に同様に示した分子量測定
の結果を示す。第５図は参考例１（ｖｉｉ）で得られた
ｐＨＩＴ８７０９プラスミドの一次描浩（情無ρ石１１
）ル 侑ＲＦＪｌｌ＋安安訪１１９１１）（１１〕のｐ
ｔｒｐ ７０１およびｐｔｒｐ ７７１．第７図は、参
考例２ （Ｉｌｌ）のｐＨ工Ｔ ｔｒｐ １１０１ 、
第８図は参考例２０Ｖ）のｐＨ工Ｔ ｔｒｐ ２１０１
のそれぞれ構築図を、第９図は実施例１９によるモノ
クローナル抗体に対する（ａ）リコンビナントＩＦＮ−
γサンプルと＋ｂ）固相に固定された工ＦＮ−γとの競
合を示す。第１０図および第１１図はそれぞれ実施例２
Ｏ−１１）。 ２０−（ｉｉ）によるモノクローナル抗体に対する（ａ
）工ＦＮ−γ資料と（ｂ）酵素標識された本発明のペプ
チドとの競合を示す。 第３図 第≠図 相対移動底 Ｅ リソ゛チーム （／４１．’ｌｌρ）号 ５ ｇｕ
； ｔ−ｔ リ Ｅ−０６％ と ８ 同 べ 速
ζ ト ト ８８ 琥 鑓 し Ｅ ８ 日 −＜ Ｕ 日、日 Ｃ ＜ Ｅ４ ｈｈ ５ ５ 麺 ： Ω伐属 頌 に 悴 ヨ畦 ５ １ し 詮 Ｂ ミ 旨 巴 ［ ヨ 目 ＥＷ ■ ａ ： 畦 １，１ ２ ．３ ＊ ！ −８ご ８ 急 ％ 訣 １ 第６図 第２図 第１Ｏ図 ソフンビナント１ＦＮ−ｆＬス（（Ｕ／ｍ〕）ムキソク
ク−たし♂し見−’３−１９．２０第１１図 ぜ△２〆 二 第１頁の続き ｏＩｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号／／ Ｇ
０７ Ｋ ９９：００ 優先権主張 ６１９８％目１月ｎ日［相］モナコ（ＭＣ
）［有］ＰＣＩＯ１ｇ８３手５月３１日［相］モナコ（
ＭＣ）［有］ＰＣ］’／ＪＰ８２／ ００４４４ ’／ＪＰ８３１００１７４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）式 ％式％ （） （） （式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｉｎ ＶａｌＭｅ
ｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペ
プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
ミノ酸を有するペプチドもしくはアミへ） ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｃ） Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチド。 （２）ＹがＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎで
ある特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （３１ｘがＬｙｓ Ａｒｇである特許請求の範囲第１項
または第２項記載のポリペプチド。 （Ｃ） Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ −Ｙ−ＯＨ（１）■ （式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｌｎ ＶａｌＭｅ
ｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ Ｔｂｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペ
プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ（Ｎ） ノ酸残基ヲ示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｃ） Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残糸をボす〕で表わされるポリペプチドの一部に相
当する反応性カルボキシル基を有する原料と、（ｂ）ポ
リペプチド（＋）の残部に相当する反応性アミノ基を有
する原料とを縮合し、生成する縮合物が保護基を有する
場合はその保護基を脱旧することを特徴とするポリペプ
チド（１）の’１Ｗｆｆｉ法。 （５）ＹがＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎで
ある特許請求の範囲第４項記載の製造法。 （６）ＸがＬｙｓ Ａｒｇである特許請求の範囲第４項
または第５項記載の製造法。 （７）式 ） ％式％ （） （） 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｉｎ ＶａｌＭｅ
ｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペ
プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ■ ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ω Ｇｉｎで承れるペプチド鎖においてそのＮ末端から数え
て１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ
酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドとキャリヤー
蛋白との蛋白複合体。 （８）キャリ４白が牛サイログロブリンである特許請求
の範囲第７項記載の蛋白複合体。 （９）式 ％式％ （ （１１ ） 〔式中、Ｘは結合手まｊこはＩｌｅ Ｇｌｎ ＶａｔＭ
ｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇでホされるペ
プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ■ ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｃ） Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドを、キャリ
ヤー蛋白とカップリングすることを特徴とするポリペプ
チド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体の製造法。 叫 （ａ）式 （） ％式％ （） （１） 〔式中、Ｘは結合手まｔコはＩｌｅ Ｇｌｎ ＶａｔＭ
ｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ ＡｌａＬｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで
示されるペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜
１６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ■ ）酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｃ） Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドまたはポリ
ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体で免疫
した哺乳動物の肺臓細胞と、（ｂ）同種または異種のリ
ンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドー
マ。 ｑυ １ｌｉｔｉ乳動物がマウスである特許請求の範囲
第１０項記載のハイブリドーマ。 （２） リンパ球様細胞がミエローマである特許請求の
範囲第１Ｏ項記載のハイブリドーマ。 Ｑ：ｌ （ａ）式 ％式％ （ （５） 〔式中、Ｘは結合手またはｌｉｅ Ｇｉｎ ＶａｌＭｅ
ｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ＜０ Ｌｙｓ Ｔｈｒ、 Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示される
ペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個の
アミノ酸を有するペプチドもしくはアミ（Ｎ） ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｃ） Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドまたはポリ
ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体で免疫
した哺乳動物の肺臓細胞と、（ｂ）同種または異種のリ
ンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニングすることを
特徴とする該）膵臓細胞と該リンパ球様細胞と、からな
るクローン化されたハイブリドーマの製造法。 ａ◆式 ％式％ （） （） （式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｌｎ ＶａｔＭｅ
ｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
ＡｌａＬｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示
されるペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１
６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ製 ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｑ Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対するモ
ノクローナル抗体。 Ｏ５ヒトγ型インターフェロンと結合する特許請求の範
囲第１４項記載のモノクローナル抗体０ Ｑｆ９ オフタロニー法による検定によりＩｇＧ２ｂの
サブクラスに属する特許請求の範囲第１４項記載のモノ
クローナル抗体０ Ｏ７） オフタロニー法による検定によりＩｇＧ１のサ
ブクラスに属する特許請求の範囲第１４項記載のモノク
ローナル抗体。 斡 （ａ）式 ％式％ （１） 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｌｎ ＶａｌＭｅ
ｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ Ｔｂｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペ
プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ（へ） ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ５ｅｒ
（Ｏ Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドまたはポリ
ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体で免疫
した踊乳動物の肺臓細胞と、（ｂ）同種または異種のリ
ンハ球様細胞とからなるクローン化されたバイブリド°
了マを液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モ
ノクローナル抗体を生成。 蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするポリペプ
チド中に対するモノクローナル抗体の製造法。 αＩ ＠乳動物がマウスである特許請求の範囲第１８項
記載の製造法。 （現下余臼） （１）抗体として式 ］ ％式％（ （） 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｍ
ｅｔＡｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｙｓ ＴｈｒｔＣ） Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇで示されるペプチド鎖におりで
そのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸をチド鎖に
おいてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有す
るペプチドもしくはアミノ酸残基を示す〕で表わされる
ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いること
を特徴とするフジオイムノアッセイ法またはエンザイム
イムノアッセイ法によるヒトアノ一νインターフェロン
の検出法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1982/000381 WO1984001149A1 (fr) | 1982-09-22 | 1982-09-22 | Nouveau polypeptide et son utilisation |
| MC82/00444 | 1982-11-22 | ||
| MC83/00174 | 1983-05-31 | ||
| MC82/00381 | 1983-09-22 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58176091A Division JPS5980646A (ja) | 1982-09-22 | 1983-09-22 | ヒトγ型インタ−フェロンの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6034994A true JPS6034994A (ja) | 1985-02-22 |
Family
ID=13762331
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58176091A Granted JPS5980646A (ja) | 1982-09-22 | 1983-09-22 | ヒトγ型インタ−フェロンの精製法 |
| JP59052244A Pending JPS6034994A (ja) | 1982-09-22 | 1984-03-21 | 新規ポリペプチドおよびその用途 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58176091A Granted JPS5980646A (ja) | 1982-09-22 | 1983-09-22 | ヒトγ型インタ−フェロンの精製法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS5980646A (ja) |
| WO (1) | WO1984001149A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA837058B (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985004420A1 (fr) * | 1984-03-29 | 1985-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouvel adn et son utilisation |
| JPH0653067B2 (ja) * | 1984-09-11 | 1994-07-20 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ハイブリドーマおよびその製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA814375B (en) * | 1980-07-01 | 1982-07-28 | Hoffmann La Roche | Interferons and process for their preparation |
-
1982
- 1982-09-22 WO PCT/JP1982/000381 patent/WO1984001149A1/ja not_active Ceased
-
1983
- 1983-09-22 JP JP58176091A patent/JPS5980646A/ja active Granted
- 1983-09-22 ZA ZA837058A patent/ZA837058B/xx unknown
-
1984
- 1984-03-21 JP JP59052244A patent/JPS6034994A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA837058B (en) | 1984-04-25 |
| JPS5980646A (ja) | 1984-05-10 |
| WO1984001149A1 (fr) | 1984-03-29 |
| JPS6234760B2 (ja) | 1987-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR920002267B1 (ko) | 하이브리드 인터페론의 제조방법 | |
| KR910001726B1 (ko) | 펩티드의 제조방법 | |
| KR920001377B1 (ko) | 인체 면역 인터페론 단백질의 제조방법 | |
| US5278286A (en) | Immune interferon | |
| US4476049A (en) | Method for the extraction of immune interferon | |
| JPH11505132A (ja) | 非免疫原性ペプチドを介して結合されたインターフェロン―αと免疫グロブリンとのハイブリッド | |
| HU196460B (en) | Process for producing homogenous immune interferon fragment and pharmaceutical compositions comprising it | |
| IE872645L (en) | Lymphokine related peptides | |
| CN117327174A (zh) | 抗新型冠状病毒人源化多价结合蛋白及其应用 | |
| JPH0436185A (ja) | 融合抗原ポリペプチド | |
| JPS5980646A (ja) | ヒトγ型インタ−フェロンの精製法 | |
| EP0138087A1 (en) | Immune interferon and method for its purification | |
| WO1984004745A1 (fr) | Nouveaux polypeptides et leur utilisation | |
| JPH0653067B2 (ja) | 新規ハイブリドーマおよびその製造法 | |
| JPH0646959B2 (ja) | 新規ポリペプチドおよびその用途 | |
| CN115125215A (zh) | 分泌猪IFN-λ4单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用 | |
| WO1984002130A1 (fr) | Nouveaux polypeptides et leur utilisation | |
| JPH04128298A (ja) | 抗体、その製造法および用途 |