JPS6236006B2

JPS6236006B2 -

Info

Publication number: JPS6236006B2
Application number: JP57226682A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Hashimoto; Tomohiro Toida; Kazunori Sekine; Minoru Saito; Takuji Kawashima; Morio Kuboyama
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1982-12-27
Filing date: 1982-12-27
Publication date: 1987-08-05
Also published as: EP0116232A2; US4645667A; EP0116232B1; JPS59118712A; DE3377920D1; EP0116232A3

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、物理的及び又は化学的な菌体破壊処
理を行なつていない完全な菌体（以下完全菌体と
記載する）の状態を有する公知のビフイドバクテ
リウム属に属する微生物（以下ビフイズス菌と記
載する）から、細胞壁を破壊することなく細胞内
成分のみを除去した精製細胞壁からなる抗腫瘍剤
及びその製造法に関する。〔技術の背景及び先行技術〕近年、BCG（Bacillus Calmette−Guerin）あ
るいはノカルデイア（Nocardia）などの微生物
から分離された精製細胞壁が宿主介在性の抗腫瘍
効果を有することが見出され（Journal of
National Cancer Institute、第52巻、第1571頁、
1974年．Gann、第69巻、第19頁、1978年．
Gann、第67巻、第669頁、1976年．Cancer
Immunology and Immunotherapy第４巻、第95
頁、1978年）、より高い抗腫瘍活性を有し、かつ
臨床的に使用可能な精製微生物細胞壁の分離を目
的として、他の菌種の細胞壁からの抗腫瘍剤の製
造に関する研究が行なわれている。特に、自然界
に広く分布し、内毒素の存在の心配がないグラム
陽性菌が極めて注目されており、すでに一部のグ
ラム陽性菌からは抗腫瘍性を有する精製細胞壁が
得られている（日本癌学会総会記事、第107頁、
1981年）。グラム陽性菌の細胞壁はペプチドグリカンと、
多糖類あるいはテイコイン酸を主成分とするその
菌特有のいわゆる特殊構造物とが共有結合した袋
状の構造物であつて、細胞膜に外接し、菌体の形
状保持にあずかるとともに細胞質とその機能とを
各種の外部刺激から保護する役目を果している。
特にペプチドグリカン部分は、抗腫瘍性の活性中
心として重要であるばかりでなく、細胞壁全体の
形状維持に重要な役割を担つている。すなわち、
ペプチドグリカンは、Ｎ−アセチルグリコサミン
及びＮ−アセチルムラミン酸からなるグリカン鎖
とペプチド鎖とが網目状に結合して三次元構造を
構築し、全体として水不溶性で、かつ物理的に極
めて堅固な巨大ポリマーを形成している。従来、細菌から精製細胞壁を分離、抽出するた
めには、まず特定の条件下で菌体内部の細胞質成
分を遊離除去せしめ、しかるのち、水不溶性の残
さとして残る粗細胞壁を分離し、これにプロテア
ーゼ、ヌクレアーゼによる酵素処理をくり返して
精製する方法が行なわれている。これら一連の操
作のうち、特に菌体内部の細胞質成分を遊離除去
することは、精製細胞壁の化学的純度を高める上
で極めて重要であり、その具体的な方法について
は、細菌の種類により多くの検討がなされてい
る。例えば、グラム陰性菌であるビブリオコスチ
コラス（Vibrio costicolus）のように浸透圧の変
化（Journal of General Microbiology、第20
巻、第32頁、1959年）、大腸菌のように界面活性
剤による処理（Journal of Bacteriology、第136
巻、第723頁、1978年）のみで、比較的容易に細
胞質成分の溶出が起こるものから、グラム陽性球
菌のように非常に強烈な物理的処理で細胞壁を破
壊することにより、始めて細胞質成分の除去が可
能となる（Biken’ｓ Journal、第２巻、第143
頁、1959年）ものまで、菌種によりさまざまであ
るが、このような差異は、とりもなおさず、その
細菌に存在する細胞壁の物理的及び化学的性質に
依存している。一般にグラム陽性菌の場合は、上述のように複
雑な構成成分及び物理的に堅固な細胞壁を有する
ため、超音波などの物理的手段、酸あるいは細胞
壁溶解酵素などの化学的手段によつて、細胞壁を
破壊することが不可欠であつて、従来からこの破
壊処理がグラム陽性菌の精製細胞壁を製造するた
めの共通の手段として、多くのグラム陽性菌に対
して行なわれてきた。従つて、グラム陽性菌に関
しては、細胞壁に対する物理的及び又は化学的破
壊処理を行なうことなく、精製細胞壁のみを取り
出すという技術思想は存在しない。しかしながら、従来の破壊処理を伴う製造法で
は、細胞壁が細切されるため収率が著しく低化す
るばかりではなく、ペプチドグリカン部分に非特
異的な共有結合の切断が起こるため、抗腫瘍活性
の低下を招くという極めて重大な欠点があつた。〔発明の目的及び発明の要約〕本発明者らは、前記従来法の欠点を改良し、ビ
フイズス菌から極めて高い抗腫瘍活性を有する精
製細胞壁を高収率で製造する方法について研究を
行ない、本発明を完成した。本発明はビフイズス菌の完全菌体の細胞壁であ
つて、該細胞壁を物理的及び化学的に破壊するこ
となく、該微生物より細胞内成分を除去し、該細
胞壁を残したものであることを特徴とする抗腫瘍
剤及びビフイズス菌の完全菌体を界面活性剤で処
理した後、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素、
有機溶媒、及び希釈で処理することによつて、該
微生物の菌体の細胞壁を破壊することなく、該微
生物の菌体よりその細胞内成分を除去し、該細胞
壁を取り出すことを特徴とする抗腫瘍剤の製造法
である。本発明の目的はビフイズス菌の菌体の細胞壁か
らなる高い活性を有する抗腫瘍剤を提供すること
にある。本発明のもう１つの目的は、ビフイズス菌から
高い活性を有する抗腫瘍剤を高収率で製造する方
法を提供することにある。〔発明の具体的な説明〕本発明に使用するビフイズス菌は公知の菌株で
あり、American Type Culture Collection（以
下ATTCと略記する）のカタログ等に記載され
ていて容易に入手できる。これらの菌株を常法に
従つて培養し、得られる菌体を用いる。ビフイズ
ス菌は、水分は緩衝液に懸濁され、界面活性剤で
処理する前に加熱処理を行なうことが望ましい。
細菌には、それぞれの菌独自の自己融解酵素
（Autolytic enzyme）が存在し、細胞壁の解体を
起こすことが知られている（船津勝及び鶴大典
著「溶菌酵素」、第14頁、講談社、1977年）。した
がつて、加熱処理を行なつて、自己融解酵素を不
活性化し、細胞壁の三次元構造を保護しておくこ
とが望ましい。加熱処理の条件は、自己融解酵素
を完全に不活性化し、かつタンパク質の加熱変性
を防止するために、60〜80℃で20〜30分間あるい
は沸騰水中10〜15分などの短時間の処理が望まし
い。本発明に使用する界面活性剤は、市販の中性界
面活性剤又はアニオン性界面活性剤のいずれでも
よいが、後の工程で比較的容易に除去できる中性
界面活性剤が望ましい。例えば、トリトン
（Triton）Ｘ−100あるいはトウイーン
（Tween）80が望ましい。使用する界面活性剤の
量は0.1〜４％（ｖ／ｖ）、より望ましくは0.2〜
１％（ｖ／ｖ）の濃度が適当である。そして界面
活性剤を含む溶液に乾燥菌体を界面活性剤を含む
溶液1.5〜２に乾燥菌体100ｇの割合で懸濁し、
界面活性剤で溶出される成分を抽出する。抽出温
度は室温でもよいが、抽出効率を高めるために、
80〜90℃で30分〜１時間とすることが望ましい。
界面活性剤の処理ののち、菌体に付着している界
面活性剤を除去するために、蒸留水で遠心洗浄又
は濾過による洗浄をくり返し行なう必要がある
が、有機溶媒による処理を行なつて洗浄効率を高
めることが望ましい。従つて、この目的に使用さ
れる有機溶媒は、界面活性剤と水とに容易に混和
する溶媒、例えばメタノール、エタノール、プロ
パノールなどのアルコール系溶媒又はアセトン
等、を用い、室温で12〜24時間撹拌し、残存する
界面活性剤を除去する。本発明に使用するタンパク質分解酵素は市販品
であり、例えばトリプシン、キモトリプシン、パ
パイン、ペプシン、プロナーゼ（科研化学）等が
用いられる。酵素によるタンパク分解は、一種類
の酵素のみを使用させただけでは不充分であり、
基質特異性及び至適PHの異なる数種類の酵素を作
用させる必要がある。望ましい実施態様として
は、まずトリプシン、キモトリプシンあるいはパ
パイン等のアルカリ領域（PH７〜８）に至適PHを
持つタンパク質分解酵素を作用させ、次いでペプ
シン等の酸性領域（PH２〜３）に至適PHを有する
酵素を作用させ、さらに基質特異性の低いプロナ
ーゼを作用させる。すなわち、界面活性剤処理した菌体をトリス−
塩酸緩衝材（PH7.8）に溶解したトリプシン、キ
モトリプシンあるいはパパイン、さらに核酸分解
酵素であるリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌ
クレアーゼで37℃、14〜20時間処理する。この際
使用される酵素の濃度は、タンパク質分解酵素が
0.05〜0.2％（ｗ／ｖ）、リボヌクレアーゼが用い
られるタンパク質分解酵素の1/100〜1/200、デオ
キシリボヌクレアーゼが同じく1/1000〜1/2000で
ある。次いで処理菌体を、0.05〜0.2％（ｗ／ｖ）と
なるようにペプシンを溶解した0.01N塩酸（PH
２）に懸濁し、37℃で14〜20時間処理する。PH２
〜３の条件でトリプシン、キモトリプシン、パパ
イン、リボヌクレアーゼ、及びデオキシリボヌク
レアーゼは不活性化され、さらにペプシンによ
り、菌体内のタンパク質とともに消化される。次
にこの処理菌体を0.05Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.4）に溶解したプロナーゼで37℃、14〜20時間
処理する。この際用いられるプロナーゼは0.05〜
0.15％（ｗ／ｖ）濃度が望ましい。PH７〜８で混
在するペプシンは不活性化され、菌体に残存する
タンパク質と共に、プロナーゼにより分解され
る。この段階で懸濁液中に存在する菌体成分以外
のタンパク質は、ほとんどプロナーゼのみとな
り、菌体の洗浄を充分行なうことにより、望まし
くは、さらに透析することにより、プロナーゼを
除去する。次に有機溶媒処理を行なう。この目的は、脱脂
のためであるが、菌体にはまだ多量の水が付着し
ているため、まず初めに水と完全に混和するメタ
ノールあるいはエタノール等のアルコール系溶媒
又はアセトン等で抽出し、ついでメタノール−ク
ロロホルム混液あるいはアセトン−クロロホルム
混液等を用いて抽出し、最終的にクロロホルム、
ヘキサン等の低極性の有機溶媒を用いて脱脂操作
を完了する。次いで、この処理菌体を減圧下にほぼ恒量とな
るまで乾燥し、のち0.05Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.4）に再度懸濁し、プロナーゼを0.05〜0.15
％（ｗ／ｖ）となるように加えて37℃、14〜20時
間処理する。次いで処理菌体を充分洗浄してプロナーゼを除
去したのち、0.01N硫酸に懸濁し、沸騰水中で10
〜20分間加熱処理し、ついで蒸留水に対し48〜72
時間透析し凍結乾燥する。なお、希酸による処理
は、タンパク質分解酵素による処理工程と有機溶
媒による処理工程との間で行なつてもよい。（試験１）この試験は、本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤の収率を検討するために行なわれた。１試料の調製Ａ試料１（本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤）ビフイドバクテリウム・インフアンチス
〔Bifidobacterium infantis〕ATCC 15697か
ら後述の実施例１と同一の方法で製造した抗
腫瘍剤。Ｂ試料２（本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤）ビフイドバクテリウム・ロンガム
（Bifidobacterium longum）ATCC 15707か
ら後述の実施例１と同一の方法で製造した抗
腫瘍剤。Ｃ試料３（本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤）ビフイドバクテリウム・ロンガムATCC
15707から後述の実施例２と同一の方法で製
造した抗腫瘍剤。Ｄ試料４（従来法により製造した抗腫瘍剤）ビフイドバクテリウム・インフアンチス
ATCC 15697の凍結乾燥菌体100ｇを1.2の
蒸留水に懸濁し、超音波破砕機（Kubota社
製Model 200M）により出力200Wで20分間
処理し、菌体を破壊し、のち低速遠心
（1000G、30分間）を行なつて、未破壊菌体
を沈さとして除き、その上清を60℃で30分間
加熱処理し、ついで高速遠心（20000G、30
分間）して得た沈さに対し、実施例１と同一
条件で、トリプシン及びキモトリプシンによ
るタンパク分解処理、リボヌクレアーゼ及び
デオキシリボヌクレアーゼによる核酸分解処
理、ペプシンによるタンパク分解処理、プロ
ナーゼによるタンパク分解処理、メタノール
及びメタノール−クロロホルム混液による有
機溶媒抽出、プロナーゼＰによるタンパク分
解処理を順次行なつて製造した抗腫瘍剤。Ｅ試料５（従来法により製造した抗腫瘍剤）ビフイドバクテリウム・ロンガムATCC
15707の凍結乾燥菌体80ｇを1.2の蒸留水に
懸濁し、0.5mmのアルミナボールを入れたボ
ールミル（ユニバーサルボールミルUB−
31、ヤマト科学社製）に入れ、50〜60回転
分、４℃で２時間回転させた。ボールミル中
の菌体破壊物を生理食塩水で洗い流し、
1000G、30分間の低速遠心を２回行なつて、
未破壊菌体を残さとして除いたのち、２回目
の遠心上清を沸騰水中、10分間加熱処理し、
ついで、高速遠心（20000G、30分間）を行
なつて粗細胞壁を分離した。これをパパイン
によるタンパク分解処理、リボヌクレアーゼ
及びデオキシリボヌクレアーゼによる核酸分
解処理、プロナーゼによるタンパク分解処
理、アセトン、アセトン−クロロホルム及び
ヘキサンによる有機溶媒抽出、プロナーゼに
よるタンパク分解処理を実施例２と同一条件
で順次行なつて製造した抗腫瘍剤。２試験方法以上のごとく製造した試料１〜５を凍結乾燥
したのち、ただちに秤量して、出発材料である
凍結乾燥菌体に対する収率（％）を算出した。
上記の試料調製を、１試料について３回（実験
番号，及び）反復し、それぞれの収率を
算出するとともに平均収率を算出した。３結果試験結果を表に示した。

【表】表から明らかなように、本発明の方法によ
り製造した試料１は、従来法により製造した試
料４に比して1.6倍、また本発明の方法により
製造した試料３は、従来法により製造した試料
５に比して1.5倍の高収率で抗腫瘍剤を製造す
ることができた。一方、ビフイドバクテリウ
ム・ロンガムについて本発明の方法の２つの異
なる実施態様で製造した試料２及び試料３で
は、ほぼ同一の収率が得られた。従つて本発明
の方法は、使用する界面活性剤、タンパク質分
解酵素及び有機溶媒の種類にほとんど影響され
ず、ほぼ一定の高収率で抗腫瘍剤を製造でき
る。（試験２）この試験は本発明の方法により製造した抗腫瘍
剤の化学的組成を検討するために行なわれた。１試験方法Ａ糖の分析方法前記試験１と同一の試料１及び４をそれぞ
れ50mg秤取し、1N硫酸５mlを加え、100℃で
６時間加水分解した。加水分解液をアンバ−
ライトIRA−410（炭酸塩型、CO⁻⁻ _３form）で
脱塩し、のち減圧濃縮して50.0mlにメスアツ
プした。その一定量を常法に従つてガスクロ
マトグラフイーで定性定量を行なつた。Ｂアミノ酸及びアミノ糖の分析方法前記試験１と同一の試料１及び４をそれぞ
れ50.0mg秤取し、6N塩酸５mlを加え、105℃
で14時間加水分解した。加水分解液をロータ
リーエバポレーターで蒸発乾固して塩酸を除
去した後、50.0mlにメスアツプした。その一
定量を常法に従いアミノ酸自動分析計で定性
定量した。２結果試料１及び４の中性糖、アミノ酸及びアミノ
糖の組成及び含量を表２に示した。

【表】

【表】表２から明らかなように、本発明の方法によ
り製造した試料１は、61.5％の中性糖、15.4％
のアミノ酸及び5.2％のアミノ糖から構成され
ている。一方、従来法により製造した試料４も
ほぼ同様な化学組成を有し、68.5％の中性糖、
12.5％のアミノ酸及び7.4％のアミノ糖から構
成されている。アミノ酸組成のうち、主要なア
ミノ酸のモル比は、両者共にアラニン、グルタ
ミン酸、スレオニン酸、セリン、オルニチンが
４：１：１：１：１の割合で含まれ、他のアミ
ノ酸はほとんど含まれていない。また、中性糖
においても、両者共にグルコースとガラクトー
スが１：2.6〜2.8の割合で含まれている。アミ
ノ糖の場合もグルコサミンとムラミン酸とがほ
ぼ等モルで含まれている。以上の分析結果は、
本発明の方法で製造した抗腫瘍剤が、従来法に
より製造した抗腫瘍剤と同等の化学的均一性を
有する事を示している。特に、フエニールアラ
ニン、アルギニン、チロシン等すべてのタンパ
ク質に含まれているアミノ酸がほとんど検出さ
れず、このことは本発明の方法により菌体内部
のタンパク質が、ほぼ完全に除去されたことを
示すものである。（試験３）この試験は、本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤がビフイズス菌の破壊されていない細胞壁を
含有することを確認するために行なわれた。１試験方法前記試験１と同一の試料１及び４各100mgを
10mlの蒸留水に均一に懸濁し、等量の2.5％
（ｗ／ｖ）グルタールアルデヒド溶液を加え、
充分撹拌し、室温で12時間放置した。これを蒸
留水で３回遠心洗浄（6000G、20分間）し、５
の蒸留水に対し48時間透析した。透析内液を
遠心（6000G、20分間）して得た沈さにメタノ
ール40mlを加え、充分撹拌し、以下常法により
電子顕微鏡観察用の試料を調製した。尚、対照
としてビフイドバクテリウム・インフアンチス
ATCC 15697の完全菌体を前記と同一の方法で
処理した。２結果図１，２及び３は、それぞれ試料１、試料４
及び対照のシヤドーイングによる電子顕微鏡写
真（25000倍）である。図２から明らかなよう
に従来法により製造した抗腫瘍剤に含まれてい
るビフイズス菌は、細胞壁が完全に破壊されて
断片化し、不定形であるのに対して本発明の方
法により製造した抗腫瘍剤に含まれているビフ
イズス菌は、図１に示すように袋状の三次元構
造が保持されており完全菌体の形状をそのまま
残している。従つて、本発明の方法により製造した抗腫瘍
剤は、単に化学的に均一であるばかりでなく、
電子顕微鏡で観察される形状の面からも従来法
により製造したそれとは全く異なつている。尚、図３に示す未処理のビフイズス菌（対
照）の電子顕微鏡写真は、菌体が白く写つてお
り、これは菌体内部に細胞内成分（細胞質）が
存在することを示している。（試験４）この試験は、本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤と従来法により製造したそれとの抗腫瘍効果
を比較するために行なわれた。１試験方法試験動物としてBALB／Ｃ雄マウス（７週
令、体重22±２ｇ）を用いた。腫瘍は、
BALB／Ｃの同系腫瘍であるMeth−
Afibrosarcoma（Sloan−Kettering Institute
of Cancer Research，New York）を用い、
1.0×10⁶生細胞／c.c.となるように常法に従つて
調製し、マウスの腹部皮下に0.1c.c.移植した。
４日後に生着した腫瘍の直径をキヤリパーによ
つて計測して各グループごとの平均腫瘍直径値
が一定となるように、各投与群に分配した。腫
瘍移植後５日目から、５％マンニトール溶液に
1.0mg／c.c.となるように懸濁した試料１又は試
料４を、腫瘍内に0.1c.c.隔日に５回投与した。
対照動物には、５％マンニトール0.1c.c.を投与
した。尚、分散媒として５％マンニトール溶液
を用いた理由は、試料を均質に分散させるため
であり、この溶液そのものの浸透圧は体液と等
張（286mosm／Kg）で、かつ腫瘍の増殖に対
する影響も全く無い。効果の判定はRibi等の腫瘍退縮試験（Tumor
Regression test：Journal of National
Cancer Institute Monograph、第39巻、第115
頁、1973年）により、各投与群における腫瘍完
全退縮マウスの数を調べ、腫瘍退縮率を算出
し、効果を試験した。２結果試験結果を表３に示す。

【表】表３から明らかなように、対照の５％マンニ
トール投与群では、腫瘍の完全な退縮は全くみ
られなかつたが、試料４投与群では20匹中４匹
に腫瘍の完全退縮が認められた。一方、試料１
投与群では、さらにこの腫瘍退縮率が高く、20
匹中14匹に腫瘍の完全退縮が認められ、対照に
比し、統計学的に高度に有意（Ｐ＝4.5×
10^-9）であつた。また試料１投与群と試料４投与群とを比較し
た場合にも有意な差（Ｐ＝3.6×10^-3）が認めら
れた。従つて、本発明の方法により製造した抗腫瘍
剤は、従来法により製造した抗腫瘍剤に比し、
より強力な抗腫瘍効果を有することが判明し
た。（試験５）この試験は本発明の方法により製造した抗腫瘍
剤の最少有効投与量を決定するために行なわれ
た。１試験方法抗腫瘍剤の最少有効投与量の決定は、前記
Ribi等の腫瘍生着阻止試験（Tumor
Suppression Test）によつて行なつた。常法
により調製した1.0×10⁶生細胞／c.c.のMeth−Ａ
腫瘍の懸濁液と、試料１を５％マンニトール溶
液に1.0mg／c.c.、0.5mg／c.c.、0.25mg／c.c.、0.20
mg／c.c.または0.1mg／c.c.の割合に懸濁したもの
を無菌下にそれぞれ等量混合し、BALB／Ｃ雄
マウス（７週令、体重22±１ｇ）の腹部皮下に
それぞれ0.2c.c.ずつ投与した。対照には５％マ
ンニトールと腫瘍懸濁液を等量混合したものを
0.2c.c.投与した。試料投与後４週間観察し、腫
瘍の生着の有無を調べた。２結果試験結果を表４に示した。

【表】表４から明らかなごとく、試料１投与群の中
で、100μｇ／マウスの投与群では腫瘍の生着
は完全に阻止され、50μｇ／マウスの投与群で
も85％の阻止率を示した。更に、25μｇ／マウ
スの投与群においても著明な効果（阻止率70
％）が認められた。一方20μｇ／マウスの投与
群では、効果が著しく減少し、35％の阻止率で
あつた。従つて、本発明の方法により製造した
抗腫瘍剤は、25μｇ／マウスの投与量で著明な
効果を示し、極めて強力な抗腫瘍性を有するこ
とが判明した。（試験６）この試験は、本発明の方法により製造した抗腫
瘍剤の毒性を検討するために行なわれた。１試験方法試験動物としてＡ／Ｊ雄及び雌マウス（７週
令、体重22±２ｇ）を用いた。５％マンニトー
ル溶液に懸濁した試料１を体重１Kg当り５mg、
10mg及び50mgの各投与量で10日間、連日腹腔内
に投与した。対照には５％マンニトール溶液を
10日間連日投与した。１群10匹とし、投与後１
ケ月間観察し、死亡したマウスの数を調べた。２結果試験結果は表５に示したとおりである。

〔発明の効果〕

本発明によつて奏せられる効果は、次のとおり
である。 (1) 従来法に比し、高収率でビフイズス菌から抗
腫瘍剤を製造することができる。 (2) 化学的に均一な抗腫瘍剤が得られる。 (3) ビフイズス菌の細胞壁の破壊を行なわないた
め、完全な三次元構造を有する精製細胞壁が製
造でき、品質の一定した抗腫瘍剤が得られる。 (4) 強力な抗腫瘍性を有する抗腫瘍剤が得られ
る。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明によつて処理したビフイドバク
テリウム属に属する微生物の菌体の細胞壁（試料
１）の電子顕微鏡写真、図２は、従来法によつて
処理したビフイドバクテリウム属に属する微生物
の菌体の細胞壁（試料４）の電子顕微鏡写真、お
よび図３は、未処理のビフイドバクテリウム属に
属する微生物の菌体（対照）のシヤドー法による
電子顕微鏡写真である。

Claims

【特許請求の範囲】１ビフイドバクテリウム属に属する微生物の菌
体の細胞壁であつて、該細胞壁を物理的及び化学
的に破壊することなく、該微生物より細胞内成分
を除去し、該細胞壁を残したものであることを特
徴とする抗腫瘍剤。２ビフイドバクテリウム属に属する微生物の菌
体を界面活性剤で処理した後、タンパク質分解酵
素、核酸分解酵素、有機溶媒、及び希酸で処理す
ることによつて、該微生物の菌体の細胞壁を破壊
することなく、該微生物の菌体よりその細胞内成
分を除去し、該細胞壁を取り出すことを特徴とす
る抗腫瘍剤の製造法。３前記のタンパク質分解酵素、核酸分解酵素、
有機溶媒、及び希酸による処理が、タンパク質分
解酵素処理、核酸分解酵素処理、タンパク質分解
酵素処理、有機溶媒処理、タンパク質分解酵素処
理及び希酸処理の順序で行なわれることを特徴と
する特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍剤の製
造法。４前記のタンパク質分解酵素、核酸分解酵素、
有機溶媒及び希酸による処理が、タンパク質分解
酵素処理、核酸分解酵素処理、タンパク質分解酵
素処理、希酸処理、有機溶媒処理及びタンパク質
分解酵素処理の順序で行なわれることを特徴とす
る特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍剤の製造
法。