JPS6241214B2 - - Google Patents
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- JPS6241214B2 JPS6241214B2 JP53026519A JP2651978A JPS6241214B2 JP S6241214 B2 JPS6241214 B2 JP S6241214B2 JP 53026519 A JP53026519 A JP 53026519A JP 2651978 A JP2651978 A JP 2651978A JP S6241214 B2 JPS6241214 B2 JP S6241214B2
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明はミコバクテリウム属に属する微生物の
菌体から得られる抗腫瘍活性物質およびその製造
法に関する。 結核菌が強い抗腫瘍活性をもつことは古くより
知られており、結核菌の生菌体を担癌患者に投与
する試みもなされている。しかし、結核菌の生菌
を投与した場合、感染の危険が大きいことと、潰
瘍、発熱等の強い副作用がみられる。そこで感染
の危険を避けるため、結核菌から抗腫瘍活性物質
を抽出する試みもなされてきた。現在までに調製
された結核菌由来の活性物質としては結核菌の熱
水抽出物、水溶性アジユバント、ワツクス、リボ
核酸、細胞壁骨格、有機溶媒抽出残査等が挙げら
れる。 しかし、これらの結核菌由来の抽出物にも未だ
改良を要する幾多の点が残されている。すなわ
ち、これらの抽出物のうちで副作用の少いもの
は、必ずしも抗腫瘍活性が高くなく、他方抗腫瘍
活性の高いものには、肝臓、腎臓障害、発熱、嘔
吐、潰瘍の発生等の強い副作用がみられる。ま
た、抽出物の種類によつては、調製法が難しく、
得られる抽出物の抗腫瘍活性の再現性が低い。 本発明者は結核菌またはその類縁菌の菌体より
得られる抽出物について鋭意研究の結果、全く意
外にも極めて簡単な処理方法により、高い抗腫瘍
活性を有しかつ毒性の極めて低い活性物質を、良
好な再現性の下で収率よく製造することに成功し
本発明を完成するに至つた。 本発明の抗腫瘍活性を有する物質（以下これを
Ｎ−１物質と略称する）は、ミコバクテリウム
（Mycobacterium）属に属する微生物の菌体を破
砕して得られる無細胞抽出液に凝集剤を加えるこ
とにより、沈殿物として得ることができる。以下
その製造法を詳述する。 Ｎ−１物質の製造に使用する微生物はミコバク
テリウム属に属するものより選定するが、特に好
適なものとしてたとえば、ウシ型結核菌
（Mycobacterium bovis）BCG日本株、ヒト型結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）青山Ｂ
株、もしくはH37Ra株、トリ型結核菌
（Mycobacterium avium）IFO 3153または恥垢
菌（Mycobacterium smegmatis）ATCC607など
が挙げられる。 微生物の培養方法や菌体から活性物質を抽出す
る方法は特に限定の必要はなく使用する微生物に
応じこれに適した通常の方法に従つて差支えな
い。たとえばウシ型結核菌の場合にはソートン培
地、肉エキスグリセリン培地などを用い、37℃程
度の温度で５ないし８週間程度静置培養すること
により良好な培養物が得られ、これをろ過して菌
体を得ることができる。得られた菌体を水、好ま
しくは適当な緩衝液（たとえば10ｍＭリン酸緩衝
液（PH7.0）と十分混合し、氷冷しながらダイノ
ミル（Dyno−Mill）、フレンチ（Ffench）プレス
などにより菌体を破砕して、破砕菌体懸濁液を
得、次いでこの液を過または遠心分離して原料
に適した無細胞抽出液を得ることが出来る。 本発明における無細胞抽出液とは、破砕菌体懸
濁液からろ過または遠心分離により未破砕菌体、
細胞壁画分等を出来るだけ除いた画分のことであ
る。 無細胞抽出液よりＮ−１物質を沈殿させる目的
で使用する凝集剤はかなり広い範囲において選定
することができる。たとえば、硫酸アルミニウ
ム、塩化カルシウム、塩化第二鉄、塩化マンガン
などの無機塩、ポリアクリルアミド、ポリアミン
などの合成高分子物質、アルギン酸ソーダ、キト
ーザン、硫酸プロタミンなどの天然高分子物質、
ストレプトマイシン、カナマイシンなどの抗生物
質またはその塩などが好適である。凝集剤の使用
量はその種類により適宜選択するが、たとえば無
機塩では0.1〜10％好ましくは0.1〜３％、合成高
分子物質では0.01〜１％好ましくは0.01〜0.1％、
天然高分子物質では0.01〜10％好ましくは0.01〜
１％、抗生物質では0.1〜10％好ましくは0.1〜１
％を抽出液に対して使用するのが適当である。 これらの凝集剤を抽出液に加えＮ−１物質を沈
殿せしめる。操作方法としては、たとえば前記凝
集剤を所定量を要すれば水溶液として抽出液に加
え、十分にかきまぜた後静置して沈殿を生成せし
める。この沈殿をろ過または遠心分離などの方法
で母液より分離して採取し、これを水または適当
な緩衝液に溶解または懸濁させ、さらに要すれば
透析、ゲルろ過、限外ろ過などにより凝集剤を除
去した後凍結乾燥してＮ−１物質を得ることがで
きる。操作は室温以下の温度で沈殿生成には０〜
10℃で１晩静置するのが好ましい。 Ｎ−１物質は主として糖質、タンパク質、脂質
および核酸よりなる複雑な組成の物質である。使
用する凝集剤の種類が大きく異なるにもかかわら
ず、得られるＮ−１物質の組成には大きな差はな
く、いずれも高い抗腫瘍活性を有し、毒性や副作
用も少なく、抗腫瘍剤の有効成分として用いるこ
とができる。しかもその製造方法も極めて簡単で
収率も良く極めて有用な物質である。 Ｎ−１物質は、主に注射剤として単独にもしく
は抗原物質とともに動物に投与されるがＮ−１物
質は水あるいは油のいずれにも乳濁化出来る性格
をもつている。 例えばＮ−１物質は生理食塩水に乳濁した懸濁
液、あるいはこの懸濁液をさらに植物油もしくは
鉱物油に懸濁した懸濁液（油中水型）、あるいは
Ｎ−１物質を直接植物油もしくは鉱物油に懸濁し
た後さらにこの懸濁液を生理食塩水に懸濁した懸
濁液（水中油型）として用いられる。 Ｎ−１物質の用量は動物種および投与経路およ
び投与計画により適宜選択されるがマウスに対し
て復腔内投与の場合は１〜50mg／Kg、皮下では２
〜200mg／Kg、モルモツトに対しては復腔内投与
の場合は１〜100mg／Kg、皮下では0.05〜100mg／
Kgである。 Ｎ−１物質の投与部位は、腫瘍内もしくは腫瘍
から離れた部位のいずれでも良い。 各種腫瘍系に対するＮ−１物質の投与量は、
BCG生菌と同量ないしは十分の一量でBCG生菌
と同じ抗腫瘍効果を示す。 例えばモルモツトストレイン（strain）２、ラ
イン10ヘパトーマ（Line 10 hepatoma）に対す
るＮ−１物質の好適な投与量は、100μｇ／匹で
あり、BCG生菌の投与量は１mg／匹である。 このことはBCG生菌の有効成分が、Ｎ−１物
質に濃縮されていると考えられる。 さらに、Ｎ−１物質は、固型ガンおよび復水ガ
ンの両方に対して強い抗腫瘍作用を示す。例えば
Ｎ−１物質の有効なガン種を挙げると、エールリ
ツヒ復水腫瘍あるいは固型腫瘍、ザルコーマ180
復水腫瘍あるいは固型腫瘍、メラノーマ等であ
る。さらにＮ−１物質は、モルモツト、ストレイ
ン２−ライン10ヘパトーマに対しては原発腫瘍の
増殖を抑制するだけでなく、所属のリンパ節への
腫瘍の転移も抑制し、治癒に至らしめる。 Ｎ−１物質は、BCG菌の無細胞抽出液から調
製するためＮ−１物質からの感染の危険は全くな
い。さらにＮ−１物質を動物に投与した場合、投
与部位にBCG生菌を投与した場合にみられるご
とき潰瘍の発生や、肝炎、腎炎の発生は、みられ
ない。また、Ｎ−１物質は、ツベルクリン反応感
作動物に対してアレルギー反応の惹起が軽微であ
る。 次にＮ−１物質は、BCG死菌と同じか、もし
くは、より優れたアジユバント活性を示す。近来
種々の微生物またはその菌体成分のアジユバント
活性が調べられ、種々の微生物のうちでとりわけ
結核菌がきわめて強いアジユバント活性をもつこ
とは良く知られており、免疫学の実験においてか
かかせないものとなつている。また最近腫瘍の免
疫療法において結核菌またはその菌体成分のアジ
ユバント活性を利用しようとする試みがなされて
きた。 しかし、結核菌を生体に投与した場合、潰瘍、
発熱等の強い副作用がみられ、また結核菌の菌体
成分のうちでアジユバント活性をもつものは、必
ずしも毒性が低くなく、またその調製法も困難な
ものが多い。 本発明のＮ−１物質は高いアジユバント活性を
有し、かつ毒性の極めて低い活性物質である。Ｎ
−１物質のこの性質は、担ガン動物の腫瘍特異免
疫を高める上において、その低毒性と相まつて非
常に有用である。 Ｎ−１物質をアジユバント剤として用いる場合
は、主に注射剤として抗原物質とともに動物に投
与される。前述の様にＮ−１物質は水あるいは油
のいずれにも乳濁化出来るが、アジユバント剤と
してＮ−１物質を人に投与する場合、症例に応じ
て用いる剤型を適宜選択出来るので、実用的に極
めて有用である。 例えばＮ−１物質はアジユバント剤として抗原
物質とともに生理食塩水に乳濁した、懸濁液、あ
るいはこの懸濁液をさらに植物油もしくは鉱物油
に懸濁した懸濁液（油中水型）、あるいはＮ−１
物質を抗原物質とともに直接植物油もしくは鉱物
油に懸濁した後さらにこの懸濁液を生理食塩液に
懸濁した懸濁液（水中油型）のいずれの型でも用
いられる。 Ｎ−１物質のアジユバント剤としての用量は動
物種および投与経路および投与計画により適宜選
択されるがマウスに対して皮下では0.5〜50mg／
Kg、モルモツトに対して皮下では0.05〜100mg／
Kgである。 以下にＮ−１物質の調製法とＮ−１物質を抗腫
瘍剤及びアジユバント剤として用いる場合の製剤
法を実施例により、さらにＮ−１物質の有用性を
試験例により説明する。 実施例 １ BCG菌由来活性物質 ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）BCG日
本株（予研より分譲）を下記組成の肉エキス−グ
リセリン培地を用い 肉エキス−グリセリン培地（単位ｇ） 肉エキス 20.0 リン酸 カリウム 0.5 クエン酸 2.0 クエン酸鉄アンモニウム 0.05 硫酸マグネシウム 0.5 グリセリン 60.0 水を加えて全量を1000mlとする。 37℃で５週間静置培養して得た培養物を、チー
ズクロスを用いろ過して菌体を採取し、蒸留水で
２回洗浄して湿菌体を得た。 この湿菌体2230ｇを10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）４と混合し、ワーリングブレンダーで懸
濁化し、ダイノミル（Dyno−Mill）により氷冷
しながら菌体を破砕し、得られた菌体破砕物を冷
却下で遠心分離（10000xg、20分）して菌体と細
胞壁画分を除去して無細胞抽出液5.3を得た。 この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩15.9ｇ
を加え、十分にかきまぜた後、４℃で１夜静置
し、生成した凝集物を冷却下で遠心分離
（10000xg、20分）して採取し、これを10ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH7.0）に食塩を0.5M加えた加塩緩
衝液800mlと混合し懸濁させ、この懸濁液をセロ
ハン製透析用チユーブに詰め、透析外液に前記加
塩緩衝液10を用い４℃で１日間透析、次いで透
析外液を10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）に代えて
４℃で１日間透析、さらに蒸留水に代えて４℃で
１日間透析して得た懸濁液を凍結乾燥して本発明
の活性物質75ｇを得た。 以下この活性物質をＮ−Ｂ−１とする。 実施例 ２ 各種凝集剤を用いて得られるウシ型結核菌由来
活性物質 ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）BCG日
本株を用い実施例１と同様に処理して得た無細胞
抽出液100mlに第１表に示す凝集剤の所定量を加
え、十分にかきまぜた後４℃で一夜静置し、生じ
た沈殿を冷却下で遠心分離して採取し、れに10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）10mlを加えて懸濁液と
し、凝集剤が抗生物質または無機塩の場合には蒸
留水に対して透析した後、凝集剤が天然高分子物
質または合成高分子物質の場合にはそのまま、凍
結乾燥して本発明の活性物質を得た。凝集剤の種
類、使用量および活性物質の収量を第１表に示
す。凝集剤の種類が大きく異なるにもかかわらず
得られた活性物質の収量やその組成に大きな差は
認められなかつた。
菌体から得られる抗腫瘍活性物質およびその製造
法に関する。 結核菌が強い抗腫瘍活性をもつことは古くより
知られており、結核菌の生菌体を担癌患者に投与
する試みもなされている。しかし、結核菌の生菌
を投与した場合、感染の危険が大きいことと、潰
瘍、発熱等の強い副作用がみられる。そこで感染
の危険を避けるため、結核菌から抗腫瘍活性物質
を抽出する試みもなされてきた。現在までに調製
された結核菌由来の活性物質としては結核菌の熱
水抽出物、水溶性アジユバント、ワツクス、リボ
核酸、細胞壁骨格、有機溶媒抽出残査等が挙げら
れる。 しかし、これらの結核菌由来の抽出物にも未だ
改良を要する幾多の点が残されている。すなわ
ち、これらの抽出物のうちで副作用の少いもの
は、必ずしも抗腫瘍活性が高くなく、他方抗腫瘍
活性の高いものには、肝臓、腎臓障害、発熱、嘔
吐、潰瘍の発生等の強い副作用がみられる。ま
た、抽出物の種類によつては、調製法が難しく、
得られる抽出物の抗腫瘍活性の再現性が低い。 本発明者は結核菌またはその類縁菌の菌体より
得られる抽出物について鋭意研究の結果、全く意
外にも極めて簡単な処理方法により、高い抗腫瘍
活性を有しかつ毒性の極めて低い活性物質を、良
好な再現性の下で収率よく製造することに成功し
本発明を完成するに至つた。 本発明の抗腫瘍活性を有する物質（以下これを
Ｎ−１物質と略称する）は、ミコバクテリウム
（Mycobacterium）属に属する微生物の菌体を破
砕して得られる無細胞抽出液に凝集剤を加えるこ
とにより、沈殿物として得ることができる。以下
その製造法を詳述する。 Ｎ−１物質の製造に使用する微生物はミコバク
テリウム属に属するものより選定するが、特に好
適なものとしてたとえば、ウシ型結核菌
（Mycobacterium bovis）BCG日本株、ヒト型結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）青山Ｂ
株、もしくはH37Ra株、トリ型結核菌
（Mycobacterium avium）IFO 3153または恥垢
菌（Mycobacterium smegmatis）ATCC607など
が挙げられる。 微生物の培養方法や菌体から活性物質を抽出す
る方法は特に限定の必要はなく使用する微生物に
応じこれに適した通常の方法に従つて差支えな
い。たとえばウシ型結核菌の場合にはソートン培
地、肉エキスグリセリン培地などを用い、37℃程
度の温度で５ないし８週間程度静置培養すること
により良好な培養物が得られ、これをろ過して菌
体を得ることができる。得られた菌体を水、好ま
しくは適当な緩衝液（たとえば10ｍＭリン酸緩衝
液（PH7.0）と十分混合し、氷冷しながらダイノ
ミル（Dyno−Mill）、フレンチ（Ffench）プレス
などにより菌体を破砕して、破砕菌体懸濁液を
得、次いでこの液を過または遠心分離して原料
に適した無細胞抽出液を得ることが出来る。 本発明における無細胞抽出液とは、破砕菌体懸
濁液からろ過または遠心分離により未破砕菌体、
細胞壁画分等を出来るだけ除いた画分のことであ
る。 無細胞抽出液よりＮ−１物質を沈殿させる目的
で使用する凝集剤はかなり広い範囲において選定
することができる。たとえば、硫酸アルミニウ
ム、塩化カルシウム、塩化第二鉄、塩化マンガン
などの無機塩、ポリアクリルアミド、ポリアミン
などの合成高分子物質、アルギン酸ソーダ、キト
ーザン、硫酸プロタミンなどの天然高分子物質、
ストレプトマイシン、カナマイシンなどの抗生物
質またはその塩などが好適である。凝集剤の使用
量はその種類により適宜選択するが、たとえば無
機塩では0.1〜10％好ましくは0.1〜３％、合成高
分子物質では0.01〜１％好ましくは0.01〜0.1％、
天然高分子物質では0.01〜10％好ましくは0.01〜
１％、抗生物質では0.1〜10％好ましくは0.1〜１
％を抽出液に対して使用するのが適当である。 これらの凝集剤を抽出液に加えＮ−１物質を沈
殿せしめる。操作方法としては、たとえば前記凝
集剤を所定量を要すれば水溶液として抽出液に加
え、十分にかきまぜた後静置して沈殿を生成せし
める。この沈殿をろ過または遠心分離などの方法
で母液より分離して採取し、これを水または適当
な緩衝液に溶解または懸濁させ、さらに要すれば
透析、ゲルろ過、限外ろ過などにより凝集剤を除
去した後凍結乾燥してＮ−１物質を得ることがで
きる。操作は室温以下の温度で沈殿生成には０〜
10℃で１晩静置するのが好ましい。 Ｎ−１物質は主として糖質、タンパク質、脂質
および核酸よりなる複雑な組成の物質である。使
用する凝集剤の種類が大きく異なるにもかかわら
ず、得られるＮ−１物質の組成には大きな差はな
く、いずれも高い抗腫瘍活性を有し、毒性や副作
用も少なく、抗腫瘍剤の有効成分として用いるこ
とができる。しかもその製造方法も極めて簡単で
収率も良く極めて有用な物質である。 Ｎ−１物質は、主に注射剤として単独にもしく
は抗原物質とともに動物に投与されるがＮ−１物
質は水あるいは油のいずれにも乳濁化出来る性格
をもつている。 例えばＮ−１物質は生理食塩水に乳濁した懸濁
液、あるいはこの懸濁液をさらに植物油もしくは
鉱物油に懸濁した懸濁液（油中水型）、あるいは
Ｎ−１物質を直接植物油もしくは鉱物油に懸濁し
た後さらにこの懸濁液を生理食塩水に懸濁した懸
濁液（水中油型）として用いられる。 Ｎ−１物質の用量は動物種および投与経路およ
び投与計画により適宜選択されるがマウスに対し
て復腔内投与の場合は１〜50mg／Kg、皮下では２
〜200mg／Kg、モルモツトに対しては復腔内投与
の場合は１〜100mg／Kg、皮下では0.05〜100mg／
Kgである。 Ｎ−１物質の投与部位は、腫瘍内もしくは腫瘍
から離れた部位のいずれでも良い。 各種腫瘍系に対するＮ−１物質の投与量は、
BCG生菌と同量ないしは十分の一量でBCG生菌
と同じ抗腫瘍効果を示す。 例えばモルモツトストレイン（strain）２、ラ
イン10ヘパトーマ（Line 10 hepatoma）に対す
るＮ−１物質の好適な投与量は、100μｇ／匹で
あり、BCG生菌の投与量は１mg／匹である。 このことはBCG生菌の有効成分が、Ｎ−１物
質に濃縮されていると考えられる。 さらに、Ｎ−１物質は、固型ガンおよび復水ガ
ンの両方に対して強い抗腫瘍作用を示す。例えば
Ｎ−１物質の有効なガン種を挙げると、エールリ
ツヒ復水腫瘍あるいは固型腫瘍、ザルコーマ180
復水腫瘍あるいは固型腫瘍、メラノーマ等であ
る。さらにＮ−１物質は、モルモツト、ストレイ
ン２−ライン10ヘパトーマに対しては原発腫瘍の
増殖を抑制するだけでなく、所属のリンパ節への
腫瘍の転移も抑制し、治癒に至らしめる。 Ｎ−１物質は、BCG菌の無細胞抽出液から調
製するためＮ−１物質からの感染の危険は全くな
い。さらにＮ−１物質を動物に投与した場合、投
与部位にBCG生菌を投与した場合にみられるご
とき潰瘍の発生や、肝炎、腎炎の発生は、みられ
ない。また、Ｎ−１物質は、ツベルクリン反応感
作動物に対してアレルギー反応の惹起が軽微であ
る。 次にＮ−１物質は、BCG死菌と同じか、もし
くは、より優れたアジユバント活性を示す。近来
種々の微生物またはその菌体成分のアジユバント
活性が調べられ、種々の微生物のうちでとりわけ
結核菌がきわめて強いアジユバント活性をもつこ
とは良く知られており、免疫学の実験においてか
かかせないものとなつている。また最近腫瘍の免
疫療法において結核菌またはその菌体成分のアジ
ユバント活性を利用しようとする試みがなされて
きた。 しかし、結核菌を生体に投与した場合、潰瘍、
発熱等の強い副作用がみられ、また結核菌の菌体
成分のうちでアジユバント活性をもつものは、必
ずしも毒性が低くなく、またその調製法も困難な
ものが多い。 本発明のＮ−１物質は高いアジユバント活性を
有し、かつ毒性の極めて低い活性物質である。Ｎ
−１物質のこの性質は、担ガン動物の腫瘍特異免
疫を高める上において、その低毒性と相まつて非
常に有用である。 Ｎ−１物質をアジユバント剤として用いる場合
は、主に注射剤として抗原物質とともに動物に投
与される。前述の様にＮ−１物質は水あるいは油
のいずれにも乳濁化出来るが、アジユバント剤と
してＮ−１物質を人に投与する場合、症例に応じ
て用いる剤型を適宜選択出来るので、実用的に極
めて有用である。 例えばＮ−１物質はアジユバント剤として抗原
物質とともに生理食塩水に乳濁した、懸濁液、あ
るいはこの懸濁液をさらに植物油もしくは鉱物油
に懸濁した懸濁液（油中水型）、あるいはＮ−１
物質を抗原物質とともに直接植物油もしくは鉱物
油に懸濁した後さらにこの懸濁液を生理食塩液に
懸濁した懸濁液（水中油型）のいずれの型でも用
いられる。 Ｎ−１物質のアジユバント剤としての用量は動
物種および投与経路および投与計画により適宜選
択されるがマウスに対して皮下では0.5〜50mg／
Kg、モルモツトに対して皮下では0.05〜100mg／
Kgである。 以下にＮ−１物質の調製法とＮ−１物質を抗腫
瘍剤及びアジユバント剤として用いる場合の製剤
法を実施例により、さらにＮ−１物質の有用性を
試験例により説明する。 実施例 １ BCG菌由来活性物質 ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）BCG日
本株（予研より分譲）を下記組成の肉エキス−グ
リセリン培地を用い 肉エキス−グリセリン培地（単位ｇ） 肉エキス 20.0 リン酸 カリウム 0.5 クエン酸 2.0 クエン酸鉄アンモニウム 0.05 硫酸マグネシウム 0.5 グリセリン 60.0 水を加えて全量を1000mlとする。 37℃で５週間静置培養して得た培養物を、チー
ズクロスを用いろ過して菌体を採取し、蒸留水で
２回洗浄して湿菌体を得た。 この湿菌体2230ｇを10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）４と混合し、ワーリングブレンダーで懸
濁化し、ダイノミル（Dyno−Mill）により氷冷
しながら菌体を破砕し、得られた菌体破砕物を冷
却下で遠心分離（10000xg、20分）して菌体と細
胞壁画分を除去して無細胞抽出液5.3を得た。 この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩15.9ｇ
を加え、十分にかきまぜた後、４℃で１夜静置
し、生成した凝集物を冷却下で遠心分離
（10000xg、20分）して採取し、これを10ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH7.0）に食塩を0.5M加えた加塩緩
衝液800mlと混合し懸濁させ、この懸濁液をセロ
ハン製透析用チユーブに詰め、透析外液に前記加
塩緩衝液10を用い４℃で１日間透析、次いで透
析外液を10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）に代えて
４℃で１日間透析、さらに蒸留水に代えて４℃で
１日間透析して得た懸濁液を凍結乾燥して本発明
の活性物質75ｇを得た。 以下この活性物質をＮ−Ｂ−１とする。 実施例 ２ 各種凝集剤を用いて得られるウシ型結核菌由来
活性物質 ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）BCG日
本株を用い実施例１と同様に処理して得た無細胞
抽出液100mlに第１表に示す凝集剤の所定量を加
え、十分にかきまぜた後４℃で一夜静置し、生じ
た沈殿を冷却下で遠心分離して採取し、れに10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）10mlを加えて懸濁液と
し、凝集剤が抗生物質または無機塩の場合には蒸
留水に対して透析した後、凝集剤が天然高分子物
質または合成高分子物質の場合にはそのまま、凍
結乾燥して本発明の活性物質を得た。凝集剤の種
類、使用量および活性物質の収量を第１表に示
す。凝集剤の種類が大きく異なるにもかかわらず
得られた活性物質の収量やその組成に大きな差は
認められなかつた。
【表】
第１表に用いた凝集剤の製品名は次の通りであ
る。 アルギン酸ソーダ（純正化学製）、キトーザン
（chitosan東京化成工業製）、硫酸プロタミン（シ
グマ社製（Sigma Chemical Co.）ポリアクリル
アミド（三井サイアナミツド製、アコフロツクＮ
−700）、ポリアミン（三井サイアナミツド製、ア
コフロツクｃ−577） 実施例 ３ 人型菌由来活性物質 人型菌（Mycobacterium tuberculosis）青山
Ｂ株（予研より分譲）を実施例１と同じ組成の肉
エキス−グリセリン培地を用い、37℃で８週間静
置培養して得た培養物を120℃で20分間加熱殺菌
した後チーズクロスを用い、ろ過して菌体を採取
し、蒸留水で２回洗滌して湿菌体を得た。 この湿菌体267ｇに10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）1.3を加え、懸濁した後ダイノミルを用い
氷冷しながら菌体を破砕し、得られた菌体破砕物
を冷却下で遠心分離（20000xg、20分）して無細
胞抽出液1.1を得た。 この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩3.3ｇ
を加え、十分に混合した後４℃で１晩静置し、生
成した凝集物を冷却下で遠心分離（10000xg、20
分）して採取し、これを10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）に食塩を0.5M加えた加塩緩衝液100mlに懸
濁し、この懸濁液をセロハンチユーブに詰め、前
記加塩緩衝液２に対して４℃で１日間透析、次
いで10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２に対し
て、さらに蒸留水に対して４℃で１日間透析して
得た懸濁液を凍結乾燥して本発明の活性物質6.2
ｇを得た。 以下この活性物質をＮ−Ｔ−１とする。 実施例 ４ 恥垢菌由来活性物質 恥垢菌（Mycobacterium smegmatis）ATCC
607株を実施例１と同じ組成の肉エキス−グリセ
リン培地を用い、37℃で３日間間振とう培養して
得た培養物を遠心分離して菌体を採取し、蒸留水
で２回洗浄して湿菌体を得た。 この湿菌体350ｇに10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）1.75を加えかきまぜた後ダイノミルを用
い氷冷しながら菌体を破砕し、得られた菌体破砕
物を冷却下で遠心分離（10000xg、20分）して上
清無細胞抽出液1.5を得た。 この抽出液100mlに凝集剤の所定量を加え、以
下実施例２と同様に処理して本発明の活性物質を
得た。使用した凝集剤の種類、使用量および活性
物質の収量を第２表に示す。 凝集剤の種類が大きく異なるにもかかわらず得
られた活性物質の収量やその組成に大きな差は認
められなかつた。
る。 アルギン酸ソーダ（純正化学製）、キトーザン
（chitosan東京化成工業製）、硫酸プロタミン（シ
グマ社製（Sigma Chemical Co.）ポリアクリル
アミド（三井サイアナミツド製、アコフロツクＮ
−700）、ポリアミン（三井サイアナミツド製、ア
コフロツクｃ−577） 実施例 ３ 人型菌由来活性物質 人型菌（Mycobacterium tuberculosis）青山
Ｂ株（予研より分譲）を実施例１と同じ組成の肉
エキス−グリセリン培地を用い、37℃で８週間静
置培養して得た培養物を120℃で20分間加熱殺菌
した後チーズクロスを用い、ろ過して菌体を採取
し、蒸留水で２回洗滌して湿菌体を得た。 この湿菌体267ｇに10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）1.3を加え、懸濁した後ダイノミルを用い
氷冷しながら菌体を破砕し、得られた菌体破砕物
を冷却下で遠心分離（20000xg、20分）して無細
胞抽出液1.1を得た。 この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩3.3ｇ
を加え、十分に混合した後４℃で１晩静置し、生
成した凝集物を冷却下で遠心分離（10000xg、20
分）して採取し、これを10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）に食塩を0.5M加えた加塩緩衝液100mlに懸
濁し、この懸濁液をセロハンチユーブに詰め、前
記加塩緩衝液２に対して４℃で１日間透析、次
いで10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２に対し
て、さらに蒸留水に対して４℃で１日間透析して
得た懸濁液を凍結乾燥して本発明の活性物質6.2
ｇを得た。 以下この活性物質をＮ−Ｔ−１とする。 実施例 ４ 恥垢菌由来活性物質 恥垢菌（Mycobacterium smegmatis）ATCC
607株を実施例１と同じ組成の肉エキス−グリセ
リン培地を用い、37℃で３日間間振とう培養して
得た培養物を遠心分離して菌体を採取し、蒸留水
で２回洗浄して湿菌体を得た。 この湿菌体350ｇに10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）1.75を加えかきまぜた後ダイノミルを用
い氷冷しながら菌体を破砕し、得られた菌体破砕
物を冷却下で遠心分離（10000xg、20分）して上
清無細胞抽出液1.5を得た。 この抽出液100mlに凝集剤の所定量を加え、以
下実施例２と同様に処理して本発明の活性物質を
得た。使用した凝集剤の種類、使用量および活性
物質の収量を第２表に示す。 凝集剤の種類が大きく異なるにもかかわらず得
られた活性物質の収量やその組成に大きな差は認
められなかつた。
【表】
第２表に用いた凝集剤の製品名は、第１表と同
じである。 実施例 ５ 鳥型結核菌由来活性物質 鳥型結核菌（Mycobacterium avium）IFO
3153株を実施例１と同じ組成の肉エキス−グリセ
リン培地を用い37℃で６週間静置倍養して得た培
養物をチーズクロスを用い、ろ過して菌体を採取
し、蒸留水で２回洗滌して湿菌体を得た。 この湿菌体293ｇに10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）1.5を加え、懸濁した後ダイノミルを用い
氷冷しながら菌体を破砕し得られた菌体破砕物を
冷却下で遠心分離（20000xg、20分）して無細胞
抽出液1.2を得た。 この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩3.6ｇ
を加え、以下実施例３と同様に処理して本発明の
活性物質8.7ｇを得た。 以下この活性物質をＮ−Ａ−１とする。 実施例 ６ Ｎ−１物質製剤 Ｎ−Ｂ−１ 10mgに生理食塩水0.5mlを加え乳
鉢中で十分磨砕、懸濁した後、25mlの生理食塩水
を加えて良く混合してＮ−１物質の生理食塩水懸
濁液を得た。 Ｎ−１物質は、生理食塩水にも乳濁状に懸濁し
た。 実施例 ７ Ｎ−１物質製剤 10mgのＮ−Ｂ−１に微量のドラケオール6VR
（Drakeol、Pennsylvania Refining Co.）を加え
ホモジナイザーで懸濁させた後0.2％のツイーン
80を含む生理食塩水５mlを加えホモジナイズして
水中油型のＮ−１物質製剤を得た。 実施例 ８ Ｎ−１物質製剤 10mgのＮ−Ｂ−１に生理食塩水2.5mlを加え、
乳鉢中で十分磨砕、懸濁した後15％アーラセルＡ
（Arlacel Ａ、Atlas Chemical Industries Co.）
を含む流動パラフイン2.5mlを加えホモジナイズ
して油中水型のＮ−１物質製剤を得た。 実施例 ９ Ｎ−１物質製剤 ５mgのＮ−Ｂ−１に15％のツイーン80を含む流
動パラフイン５mlを加えホモジナイザーで懸濁し
てＮ−１物質アジユバントを得た。 試験例 １ Ｎ−１物質の組成 本発明のＮ−１物質の若干についてその組成を
第３表に示す。組成分析は次の各方法による。 (1) 糖 質 フエノール硫酸法（生化学研究法
．258頁．朝倉書店） (2) タンパク質 ローリー法（Ｃ、Ｄ、Stau−
ffer、Analytical Biochemistry 69巻、646頁
1975） (3) 脂 質 渋谷法（化学と生物、10巻、672
頁、1972）により抽出して秤量 (4) 核 酸 シユミツト・タンハウザー法（生化
学研究法、696頁、朝倉書店）により分画
し、ジフエニルアミン法（生化学実験講座２核
酸の化学、14頁、東京化学同人）とオルシノ
ール法（生化学研究法、694頁．朝倉書店）
により定量 試験例１から本発明によつて選択される凝集剤
を用いることにより糖、タンパク質、脂質、核酸
の組成がほぼ一定のＮ−１物質が得られることが
明らかである。
じである。 実施例 ５ 鳥型結核菌由来活性物質 鳥型結核菌（Mycobacterium avium）IFO
3153株を実施例１と同じ組成の肉エキス−グリセ
リン培地を用い37℃で６週間静置倍養して得た培
養物をチーズクロスを用い、ろ過して菌体を採取
し、蒸留水で２回洗滌して湿菌体を得た。 この湿菌体293ｇに10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）1.5を加え、懸濁した後ダイノミルを用い
氷冷しながら菌体を破砕し得られた菌体破砕物を
冷却下で遠心分離（20000xg、20分）して無細胞
抽出液1.2を得た。 この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩3.6ｇ
を加え、以下実施例３と同様に処理して本発明の
活性物質8.7ｇを得た。 以下この活性物質をＮ−Ａ−１とする。 実施例 ６ Ｎ−１物質製剤 Ｎ−Ｂ−１ 10mgに生理食塩水0.5mlを加え乳
鉢中で十分磨砕、懸濁した後、25mlの生理食塩水
を加えて良く混合してＮ−１物質の生理食塩水懸
濁液を得た。 Ｎ−１物質は、生理食塩水にも乳濁状に懸濁し
た。 実施例 ７ Ｎ−１物質製剤 10mgのＮ−Ｂ−１に微量のドラケオール6VR
（Drakeol、Pennsylvania Refining Co.）を加え
ホモジナイザーで懸濁させた後0.2％のツイーン
80を含む生理食塩水５mlを加えホモジナイズして
水中油型のＮ−１物質製剤を得た。 実施例 ８ Ｎ−１物質製剤 10mgのＮ−Ｂ−１に生理食塩水2.5mlを加え、
乳鉢中で十分磨砕、懸濁した後15％アーラセルＡ
（Arlacel Ａ、Atlas Chemical Industries Co.）
を含む流動パラフイン2.5mlを加えホモジナイズ
して油中水型のＮ−１物質製剤を得た。 実施例 ９ Ｎ−１物質製剤 ５mgのＮ−Ｂ−１に15％のツイーン80を含む流
動パラフイン５mlを加えホモジナイザーで懸濁し
てＮ−１物質アジユバントを得た。 試験例 １ Ｎ−１物質の組成 本発明のＮ−１物質の若干についてその組成を
第３表に示す。組成分析は次の各方法による。 (1) 糖 質 フエノール硫酸法（生化学研究法
．258頁．朝倉書店） (2) タンパク質 ローリー法（Ｃ、Ｄ、Stau−
ffer、Analytical Biochemistry 69巻、646頁
1975） (3) 脂 質 渋谷法（化学と生物、10巻、672
頁、1972）により抽出して秤量 (4) 核 酸 シユミツト・タンハウザー法（生化
学研究法、696頁、朝倉書店）により分画
し、ジフエニルアミン法（生化学実験講座２核
酸の化学、14頁、東京化学同人）とオルシノ
ール法（生化学研究法、694頁．朝倉書店）
により定量 試験例１から本発明によつて選択される凝集剤
を用いることにより糖、タンパク質、脂質、核酸
の組成がほぼ一定のＮ−１物質が得られることが
明らかである。
【表】
試験例 ２
マウスザルコーマに対する抗腫瘍活性
１群６匹のICR系雌性マウスの腹腔内に本発明
の活性物質を用い実施例６の方法により製剤した
抗腫瘍剤0.5mlを投与し、３日後にマウスザルコ
ーマ（sarcoma）−180腫瘍細胞を２×104個づつ
腹腔内に接種し、さら３日後に前記抗腫瘍剤の所
定量を腹腔内に投与した。腫瘍細胞接種後30日目
の生存数を調査し第４表に示す結果を得た。 本発明の活性物質はいずれも腫瘍細胞の生着阻
止、増殖抑制および延命に効果があり、副作用も
認められなかつた。 対照としては本発明の活性物質を含まない同様
の組成の製剤を用いた。
の活性物質を用い実施例６の方法により製剤した
抗腫瘍剤0.5mlを投与し、３日後にマウスザルコ
ーマ（sarcoma）−180腫瘍細胞を２×104個づつ
腹腔内に接種し、さら３日後に前記抗腫瘍剤の所
定量を腹腔内に投与した。腫瘍細胞接種後30日目
の生存数を調査し第４表に示す結果を得た。 本発明の活性物質はいずれも腫瘍細胞の生着阻
止、増殖抑制および延命に効果があり、副作用も
認められなかつた。 対照としては本発明の活性物質を含まない同様
の組成の製剤を用いた。
【表】
試験例 ３
マウスザルコーマに対する抗腫瘍活性
試験例２と同様の方法により、第５表に示した
活性物質のザルコーマ180に対する抗腫瘍作用を
調べた。その結果を第５表に示した。 種々の凝集剤を用いて得られた本発明の活性物
質は、いずれもすぐれた抗腫瘍作用を示した。
活性物質のザルコーマ180に対する抗腫瘍作用を
調べた。その結果を第５表に示した。 種々の凝集剤を用いて得られた本発明の活性物
質は、いずれもすぐれた抗腫瘍作用を示した。
【表】
試験例 ４
モルモツト ヘパトーマに対する抗腫瘍活性
１群５匹のストレイン（strain）２モルモツト
に同系腫瘍ライン10ヘパトーマ（Line 10
hepatoma）の腫瘍細胞を１×106個各匹に皮内接
種し、腫瘍の直径が約10mmに達した時、本発明の
活性物質を用い実施例７の方法で製造した抗腫瘍
剤の所定量を腫瘍内に注射により投与した。腫瘍
細胞を接種して６週間経過後原発腫瘍の平均径と
所属リンパ節に転移した腫瘍の平均径を測定し、
８週経過の生存匹数を検査し第６表の結果を得
た。 本発明の活性物質はいずれも腫瘍の増殖抑制、
転移阻止および延命に効果があり、しかも副作用
は認められなかつた。 対照として本発明の活性物質を含まない同様の
組成の製剤と比較として本発明の活性物質の製造
に用いた微生物の生菌体（WCと略記）を用いた
試験した。
に同系腫瘍ライン10ヘパトーマ（Line 10
hepatoma）の腫瘍細胞を１×106個各匹に皮内接
種し、腫瘍の直径が約10mmに達した時、本発明の
活性物質を用い実施例７の方法で製造した抗腫瘍
剤の所定量を腫瘍内に注射により投与した。腫瘍
細胞を接種して６週間経過後原発腫瘍の平均径と
所属リンパ節に転移した腫瘍の平均径を測定し、
８週経過の生存匹数を検査し第６表の結果を得
た。 本発明の活性物質はいずれも腫瘍の増殖抑制、
転移阻止および延命に効果があり、しかも副作用
は認められなかつた。 対照として本発明の活性物質を含まない同様の
組成の製剤と比較として本発明の活性物質の製造
に用いた微生物の生菌体（WCと略記）を用いた
試験した。
【表】
試験例 ５
毒 性
１群６匹の５週令ddy系雄性マウスに生理食塩
水に懸濁したＮ−１物質を腹腔内投与しLD50値
（50％致死量、mg／体重Kg）を求め、これを第７
表に示す。 Ｎ−１物質の毒性はいずれも極めて少ない。
水に懸濁したＮ−１物質を腹腔内投与しLD50値
（50％致死量、mg／体重Kg）を求め、これを第７
表に示す。 Ｎ−１物質の毒性はいずれも極めて少ない。
【表】
【表】
試験例 ６
遅延型皮膚反応に対するアジユバント作用
実施例９と同様に処理して得られるアジユバン
ト５mlに牛血清アルブミン100mgを溶解した生理
食塩水５mlを滴下して加え、ホモジナイズして得
られる油中水型混合物を１群４匹の５週令ハート
レー系雌性モルモツトに対し１匹当り0.5mlづ
つ、２ケ所に分けて筋肉内注射した。注射後４週
間目に牛血清アルブミン100μｇを生理食塩液
0.05mlに溶解した溶液を背部皮内に注射し、48時
間後の局所の発赤の大きさ（長径と短径）を測定
した。発赤の大きさ（単位mm）の各群の平均値を
第８表に示す。 対照群にはＮ−１物質を用いないで、比較群に
はＮ−１物質に代えてBCG日本株の死菌体を用
いてそれぞれ前記同様に調製した水中油型混合物
を用いた。 本発明の活性物質はいずれも明らかなアジユバ
ント作用を示した。
ト５mlに牛血清アルブミン100mgを溶解した生理
食塩水５mlを滴下して加え、ホモジナイズして得
られる油中水型混合物を１群４匹の５週令ハート
レー系雌性モルモツトに対し１匹当り0.5mlづ
つ、２ケ所に分けて筋肉内注射した。注射後４週
間目に牛血清アルブミン100μｇを生理食塩液
0.05mlに溶解した溶液を背部皮内に注射し、48時
間後の局所の発赤の大きさ（長径と短径）を測定
した。発赤の大きさ（単位mm）の各群の平均値を
第８表に示す。 対照群にはＮ−１物質を用いないで、比較群に
はＮ−１物質に代えてBCG日本株の死菌体を用
いてそれぞれ前記同様に調製した水中油型混合物
を用いた。 本発明の活性物質はいずれも明らかなアジユバ
ント作用を示した。
【表】
試験例 ７
血清抗体産生に対するアジユバント作用
１群４匹の５週令ハートレー系雌性モルモツト
に対し、試験例６と同様に調製した水中油型の混
合物を１匹当り0.5mlづつ、２ケ所に分けて筋肉
内注射した。注射後４週間目に採血し遠心分離し
て血清を得た。この血清中の牛血清アルブミンに
対する抗体価を定量沈降反応法（免疫実験操作法
Ａ、．．．合本、抗体の２、152〜157
頁、日本免疫学会）により測定した。 比較群にはＮ−１物質に代えてCBG日本株の
死菌体を同量用い対照群には活性物質を用いずに
それぞれ調製した油中水型混合物を用いた。その
結果を第９表に示す。 本発明の活性物質はいずれも明らかなアジユバ
ント作用を示した。
に対し、試験例６と同様に調製した水中油型の混
合物を１匹当り0.5mlづつ、２ケ所に分けて筋肉
内注射した。注射後４週間目に採血し遠心分離し
て血清を得た。この血清中の牛血清アルブミンに
対する抗体価を定量沈降反応法（免疫実験操作法
Ａ、．．．合本、抗体の２、152〜157
頁、日本免疫学会）により測定した。 比較群にはＮ−１物質に代えてCBG日本株の
死菌体を同量用い対照群には活性物質を用いずに
それぞれ調製した油中水型混合物を用いた。その
結果を第９表に示す。 本発明の活性物質はいずれも明らかなアジユバ
ント作用を示した。
【表】
試験例 ８
Ｎ−１物質の結核菌検査
Ｎ−１物質の結核菌検査を「結核菌検査指針
（1972）」（厚生省監修）に従つて実施した。 検体の無菌生理食塩水懸濁液に１％NaOH溶液
を加え37℃で30分間放置した後15％硫酸で中和し
た。得られた処理物の0.1mlを１％小川倍地スラ
ント（栄研化学製）に流し込みスラントの斜面に
拡散させた後、37℃で３週間培養し培地上の集落
の有無を調べて、結果を第10表に示した。
（1972）」（厚生省監修）に従つて実施した。 検体の無菌生理食塩水懸濁液に１％NaOH溶液
を加え37℃で30分間放置した後15％硫酸で中和し
た。得られた処理物の0.1mlを１％小川倍地スラ
ント（栄研化学製）に流し込みスラントの斜面に
拡散させた後、37℃で３週間培養し培地上の集落
の有無を調べて、結果を第10表に示した。
【表】
本発明の活性物質は結核菌の生菌を含まないこ
とは明らかである。 試験例 ９ ムラミン酸含量 Ｎ−Ｂ−１、Ｎ−Ｂ−６、BCG菌の細胞壁お
よびBCG菌可溶画分を６規定塩酸で100℃、５時
間加水分解した後カセイソーダで中和し、O.
Hadzijaの方法（Analytical Biochemistry60巻
512頁 1974年）によりムラミン酸を定量し、結
果を第11表に示した。 BCG菌の細胞壁は実施例１と同様に処理して
得られるBCG菌のダイノミル破砕物を800×ｇで
20分間遠心し、その上清をさらに10000×ｇで20
分間遠心して得られた沈査を蒸溜水で２回洗滌
し、凍結乾燥したものである。 BCG菌可溶画分は実施例１と同様に処理して
得られるBCG菌のダイノミル破砕物を105000×
ｇで１時間遠心し、その上清を蒸溜水に対して透
析し、凍結乾燥したものである。
とは明らかである。 試験例 ９ ムラミン酸含量 Ｎ−Ｂ−１、Ｎ−Ｂ−６、BCG菌の細胞壁お
よびBCG菌可溶画分を６規定塩酸で100℃、５時
間加水分解した後カセイソーダで中和し、O.
Hadzijaの方法（Analytical Biochemistry60巻
512頁 1974年）によりムラミン酸を定量し、結
果を第11表に示した。 BCG菌の細胞壁は実施例１と同様に処理して
得られるBCG菌のダイノミル破砕物を800×ｇで
20分間遠心し、その上清をさらに10000×ｇで20
分間遠心して得られた沈査を蒸溜水で２回洗滌
し、凍結乾燥したものである。 BCG菌可溶画分は実施例１と同様に処理して
得られるBCG菌のダイノミル破砕物を105000×
ｇで１時間遠心し、その上清を蒸溜水に対して透
析し、凍結乾燥したものである。
【表】
この結果は、本発明物質が、細胞壁をほとんど
含まないことを示す。 試験例 10 細胞壁骨格の含量 東らの細胞壁骨格の調製方法（I.Azuma etal.
、J.Natl.Can.Inst.、52巻95頁1974年）に従つて
５ｇのＮ−Ｂ−１を処理したところ、0.22ｇの細
胞壁骨格類似物質を得た。Ｎ−Ｂ−１から細胞壁
骨格類似物質の収率は4.4％であつた。この結果
は、本発明物質が、細胞壁をほとんど含まないこ
とを示す。 試験例 11 マウスエールリツヒ腫瘍に対する抗腫瘍活性 １群６匹のddY系雌性マウスの腹腔内に本発明
の活性物質を用いて実施例６の方法により製剤し
た抗腫瘍剤0.5mlを投与し、３日後にマウスエー
ルリツヒ腫瘍細胞を２×104個づつ腹腔内に接種
し、さらに３日後に前記抗腫瘍剤0.5mlを腹腔内
に投与した。腫瘍細胞接種後30日目の生存数を調
査し、第12表に示した。 本発明の活性物質はいずれも腫瘍細胞の増殖抑
制および担癌マウスの延命に効果があつた。
含まないことを示す。 試験例 10 細胞壁骨格の含量 東らの細胞壁骨格の調製方法（I.Azuma etal.
、J.Natl.Can.Inst.、52巻95頁1974年）に従つて
５ｇのＮ−Ｂ−１を処理したところ、0.22ｇの細
胞壁骨格類似物質を得た。Ｎ−Ｂ−１から細胞壁
骨格類似物質の収率は4.4％であつた。この結果
は、本発明物質が、細胞壁をほとんど含まないこ
とを示す。 試験例 11 マウスエールリツヒ腫瘍に対する抗腫瘍活性 １群６匹のddY系雌性マウスの腹腔内に本発明
の活性物質を用いて実施例６の方法により製剤し
た抗腫瘍剤0.5mlを投与し、３日後にマウスエー
ルリツヒ腫瘍細胞を２×104個づつ腹腔内に接種
し、さらに３日後に前記抗腫瘍剤0.5mlを腹腔内
に投与した。腫瘍細胞接種後30日目の生存数を調
査し、第12表に示した。 本発明の活性物質はいずれも腫瘍細胞の増殖抑
制および担癌マウスの延命に効果があつた。
【表】
対照としては生理食塩液を用いた。
試験例 12
亜急性毒性
１群雌雄各13匹の６週令のJCL−SD系ラツト
に生理食塩液に懸濁したＮ−Ｂ−１ 10mg／Kgお
よび100mg／Kg、BCG生菌10mg／Kgおよび100
mg／Kgをそれぞれ毎日１回腹腔内に35日間連続投
与した。動物の死亡例は、Ｎ−Ｂ−１ 10mg／Kg
投与群ではみられず、100mg／Kg投与群で３例、
BCG生菌10mg／Kg投与群で12例、100mg／Kg投与
群で全例にそれぞれみられた。投与終了時の検査
により、BCG生菌10mg／Kg投与群において明ら
かに貧血、肝障害、腹腔内臓器の癒着などがみら
れたが、Ｎ−Ｂ−１ 100mg／Kgの投与群では、
それらの程度は極めて軽微であつた。
に生理食塩液に懸濁したＮ−Ｂ−１ 10mg／Kgお
よび100mg／Kg、BCG生菌10mg／Kgおよび100
mg／Kgをそれぞれ毎日１回腹腔内に35日間連続投
与した。動物の死亡例は、Ｎ−Ｂ−１ 10mg／Kg
投与群ではみられず、100mg／Kg投与群で３例、
BCG生菌10mg／Kg投与群で12例、100mg／Kg投与
群で全例にそれぞれみられた。投与終了時の検査
により、BCG生菌10mg／Kg投与群において明ら
かに貧血、肝障害、腹腔内臓器の癒着などがみら
れたが、Ｎ−Ｂ−１ 100mg／Kgの投与群では、
それらの程度は極めて軽微であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ミコバクテリウム属に属する微生物の菌体を
破砕して得られる無細胞抽出液に凝集剤を加える
ことにより沈殿物として得られる抗腫瘍活性物
質。 ２ 微生物がミコバクテリウム・ボビス
（mycobacterium bovis）である特許請求の範囲
第１項記載の物質。 ３ 微生物がミコバクテリウム・ツベルクロシス
（mycobacterium tuberculosis）である特許請求
の範囲第１項記載の物質。 ４ 微生物がミコバクテリウム・スメグマチス
（mycobacterium smegmatis）である特許請求の
範囲第１項記載の物質。 ５ 微生物がミコバクテリウム・アビウム
（mycobacterium avium）である特許請求の範囲
第１項記載の物質。 ６ 凝集剤が無機塩である特許請求の範囲第１項
記載の物質。 ７ 無機塩が塩化マンガンである特許請求の範囲
第６項記載の物質。 ８ 無機塩が塩化カルシウムである特許請求の範
囲第６項記載の物質。 ９ 無機塩が硫酸アルミニウムである特許請求の
範囲第６項記載の物質。 １０ 無機塩が塩化第２鉄である特許請求の範囲
第９項記載の物質。 １１ 凝集剤が天然高分子物質である特許請求の
範囲第１項記載の物質。 １２ 天然高分子物質が硫酸プロタミンである特
許請求の範囲第１１項記載の物質。 １３ 天然高分子物質がアルギン酸ソーダである
特許請求の範囲第１１項記載の物質。 １４ 天然高分子物質がキトーザンである特許請
求の範囲第１１項記載の物質。 １５ 凝集剤が合成高分子物質である特許請求の
範囲第１項記載の物質。 １６ 合成高分子物質がポリアクリルアミドであ
る特許請求の範囲第１５項記載の物質。 １７ 合成高分子物質がポリアミンである特許請
求の範囲第１５項記載の物質。 １８ 凝集剤が抗生物質である特許請求の範囲第
１項記載の物質。 １９ 抗生物質がストレプトマイシン硫酸塩であ
る特許請求の範囲第１８項記載の物質。 ２０ 抗生物質がカナマイシン硫酸塩である特許
請求の範囲第１８項記載の物質。 ２１ ミコバクテリウム属に属する微生物の菌体
を破砕して得られる無細胞抽出液に凝集剤を加え
て沈殿物を生成させ、それを採取することを特徴
とする抗腫瘍活性物質の製造法。
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