JPS6236399A - ヒトｃｒｐの回収、精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 反４九」 本発明は抗ヒトＣ反応性蛋白（ＣＲｅａｃｔｉｖｅ　　
Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＣＲＰと略称）モノクローナル抗
体を用いたヒトＣＲＰの回収、精製法に関するものであ
る。

災米匁１（五美卜　　しようとする間　点ＣＲＰは肺炎
双球菌のＣ多糖体にＣａ　　存在下で結合する血清タン
パクとして１９３０年に発見され、その後、急性組織障
害に際し急激にその量が増大する等の顕著な変動を示す
事が判明し、炎症や組織障害の発見のためにＣＲＰの有
無を見る事が行なわれ、臨床的にも広く測定が行なわれ
ている。

従来はキャピラール法、レシチン凝集測定などの半定量
的測定が主体であったが、近年、５ＲＩＤ、レーザーネ
フロメトリー、免疫比濁法（ＴＩＡ）などの定量法に加
え、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩ　Ａ）と言った高感度な微量定量法が
汎用されるに至っている。

かくのどと＜、ＣＲＰが免疫学的手法により定量的測定
が一般化された今日、高純度に精製された抗原を標準品
として使用する必要性が高まっており、また、測定に用
いる抗血清は高い特異性と親和性を有する抗体を含むも
のが要求されている。

こうした高純度精製ＣＲＰ需要の高揚に反して。

臨床検査技術の著しい向上に伴い、ＣＲＰ　ＦＡ性患者
血清（もしくは腹水などの体液）を大量に得ることが困
難になりつつある。この現状に対処すべく、ＣＲＰ精製
に関する新技術の開発が望まれている。

従来、ＣＲＰの回収、精製に当っては、レシチン沈澱法
、Ｃａ”＋沈澱法、Ｃ多糖体沈澱法、硫安分画、クロマ
トグラフィーの組み合わせによって行っているが、いず
れにしても行程が３〜５以上と非常に煩雑であり、また
回収率も５０％以下と悪い。

従来法の主な欠点を更に述べると以下のようである。

■、レシチン沈沈澱 −シチンは油性で精製時にクロロホルム等により脱脂し
なければならない。この時、ＣＲＰの一部は失活する。

また水層部分を完全に採取するのは困難である。

２、Ｃ多糖体 菌体から微量しか分離できず、高価なものである。

３、Ｃａ＋＋沈澱法 Ｃａ　＋十で沈澱するＣＲＰの量は最大８０％内外で、
４０〜５０％程ノ復に止まる事も多い。

山　点を解決するた吃の手段 本発明者はすぐれたＣＲＰ回収、精製法を提供すべく研
究を重ねていたが、本発明に先立って見出された、ヒト
ＣＲＰに対する、ヒトＣＲＰと沈降反応を生じるモノク
ローナル抗体（特願昭６０−１３９１９２号）に着目し
、該抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体を用いてヒトＣＲ
Ｐを効率よく回収、精製するのに成功し、本発明を完成
したものである。

本発明者は１本発明に先立って見出された抗ヒトＣＲＰ
モノクローナル抗体ＣＲＢ　１７．ＣＲＢ１８、ＣＲＢ
　１９．ＣＲＢ　２０．ＣＲＢ２１、ＣＲＢ２３につい
て、オフタロニー（○ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法でＣＲ
Ｐとモノクローナル抗体の間で一旦、沈降反応を行い、
このゲルを様々な塩濃度、ｐＨの緩衝液に浸漬し、この
沈降線が消失するもの（抗原抗体反応が解離する）がア
フィニティークロマ１へに使用できると考えて検討した
ところ。

弱酸性下で解離したのはＣＲＢ　１８であった。

なおＣＲＰは疎水結合による５量体を形成しているが、
８Ｍ、Ｕｒ、ａなどの強イオン強度、あるいはグリシン
−ＨＣｌ、ｐＨ２，０と言った強酸性下ではこの結合が
解離し、また変性を受け、抗原性を失活するため、弱酸
性下という溶出条件を選んだものである。またポリクロ
ナール抗体からＣＲＰ特異抗体を大量に精製するのは難
かしく、これまでＣＲＰの抗体アフィニティーカラムに
よる精製は行なわれていない。

すなわち、本発明はこれらモノクローナル抗体の内のＣ
ＲＢ　Ｌ　８を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーによってヒトＣＲＰを高回収率で精製することに関す
るものである。

本発明のヒトＣＲＰに対するモノクローナル抗体はリン
パ球細胞と哺乳動物（マウスやラット等）に由来する骨
髄腫細胞との間の融合細胞から得ることができる。更に
詳しく述べるとヒトＣＲＰを用いて動物（例えばマウス
、ラット、モルモット。

またはウサギ等）を免疫化し、抗原に対し抗体を分泌す
る抗体産生細胞を増殖させるための時間を免疫系に与え
た後、動物を殺し、牌細胞の懸濁液を調製するに れらの細胞と骨髄腫細胞との融合は、融合促進剤（例え
ば、ポ、リエチレングリコール）の存在下で両者を接触
させることによって達成される。

ごく僅かの細胞だけが融合して雑種の骨髄腫細胞ができ
る。免疫化の結果、異なる抗原決定基に対してそれぞれ
抗体を分泌している複数の異なるリンパ球ができ、これ
らの形質は雑ｗ１細胞に遺伝的に伝達されてゆく。慎重
なスクリーニングを行うことによって、雑種細胞の培養
物の中から所望の特異性を持った細胞を分離することが
できる。このような細胞はクロン化して培養し得る。

本発明におけるＣＲＰは、ＣＲＰの一般的製法であると
ころの炎症性、組織破壊性疾患（リウマチ熱、慢性関節
リウマチ熱、慢性関節リウマチ。

気管支肺炎、原発性郭定型肺炎、耳下腺炎等）及び組織
崩壊をきたす疾患（心筋梗塞、癌腫、肉腫等）の患者血
清を用いて精製して得る事ができる。

本発明において人ＣＲＰを■いて免疫化する動物として
は前述の如く例えばマウス、ラット等が挙げられる。

又、抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞としては哺乳
動物（マウスやラット等）に由来する第１表のような骨
髄腫細胞株が用いられる。中でも非分泌型のＮＳ−１、
Ｐ３Ｕｌがよく用いられる。

尖巖五 本発明を下記の実験結果によって説明するが。

これらは単なる例示であり１本発明を限定するものでは
ない。

Ａ、まず抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体ＣＲＢ１８の
製造、精製について述べる。

１、ＣＲＰの精製 ＣＲＰ含有血清を８００Ｏｒｐｍ、４℃、３０分遠心し
不溶性成分を除去した。

血清１１当り３１３ｇの硫安を徐々に添加した後、室温
で３０分撹拌し８０００ｒｐｍ、２０℃、２０分の遠心
で上清を得る。沈殿物は５０％飽和硫安液にて２回洗浄
し、この上清は先のものとプールする。これらの上清１
１当り１７６ｇの硫安を徐々に添加し、４℃下で一昼夜
以上撹拌した。

８０００〜ｌ　ＯＯＯＯｒｐｍ、４℃、３０分の遠心に
より沈殿を得る。即ちアルブミン分画にした。

アルブミン分画は少量の生理食塩水に溶解し３０分〜１
時間、流水で透析した。次に１０ｍＭＴｒ　ｉｓ　　Ｉ
（ＣＩｐＨ８，０，０，２ＭＮａＣ１の緩衝液（以下Ｂ
ｆ、Ａ）に４℃下で２日間透析した。この間、緩衝液を
２〜３回取りかえた。

アルブミン分画をＢｆ、Ａで十分平衡化したＤＥＡＥ−
セルロースカラム（２，６Ｘ４０ｃｍ）に適用し、素通
り分画の０Ｄ２Ｅａが０．０３以下になるまで流した。

溶出はＢｆ、Ａに０．３Ｍ、Ｎａｃｌを添加したもので
行なった。溶出分画はＣＲＰａ度が０．５ｍｇ／ｍ１以
上になる程度にＰＥＧ２０，０００を用いて濃縮し、た
だちに０゜０１　Ｍ　、　Ｃａ　Ｃｌ　２　（０、１７
Ｍ　、　ＣＨ３ＣＯＯＨでＰＨ５，０に調製）で４°Ｃ
下２日間透析した。この間、外液は数回交換した。外液
量は５１であった。

この操作によりＣＲＰは白色の沈殿となる。沈殿は１２
，５００ｒｐｍ、４°Ｃ，３０分の遠心で得た。沈殿物
は０　、　ＯＩ　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　：　　（ｐ　Ｈ５。

０）で３〜５回洗浄した。

沈殿は０，１Ｍクエン酸緩衝液ＰＨ７，０，０゜１５Ｍ
　　ＮａＣ１，０，１％Ｎ　ａ　Ｎ　３で溶解し、不溶
成分を１２，５００ｒｐｍ、４°Ｃ３０分の遠心で除去
した後に、セファデックスＧ−２００によりゲルろ過し
た。この第２ピークを集め濃縮した（ゲルろ適法は流速
１８　ｍ　ｌ　／　ｈ　ｒ、４℃、カラムは５Ｘ１００
ｃｍを用いた。） 更に、この分画は抗人正常血清抗血清を固相化したアフ
ィニティーカラムに添加し、流速１２ｍ１　／　ｈ　ｒ
で素通り分画を得、これをＣＲＰとした。

得られたＣＲＰは１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１以上の濃度で
５ＤＳ−ＰＡＧＦ、（１５％ゲル）に２０．−１添加し
た場合でも分子１２４Ｋに単一バンドであり、また免疫
電気体動でも抗圧常人血清抗血清とは全（反応しなかっ
た。

２、免疫牌細胞の作製 ８週令のＢ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　ｃ雄マウス５匹へ精製
ＣＲＰ１００．−ｇを等量のＦＣＡ　（フロイントコン
プリートアジュバント、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　　Ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ　　Ａｄｊｕｖａｎｔ、ギフコ）とｗａｔｅｒ
　　ｉｎ　　ｏｉｌの状態にしてそけい部へ免疫した。

２週間後に同様の免疫を行ない、さらに２週間後に尾静
脈より採血し、マウス血清中の抗体価をベロナール緩衝
液を用いた１、２％アガロース（ドータイドアガロース
■）平板厚さ２ｍｍを用いた０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法
にて測定した。

抗原（ＣＲＰ）１００．”ｇ／ｍ　ｌ、１０Ｐ１と血清
の倍々希釈液１０％　ｌとを室温で一晩反応させ、３匹
が８倍希釈、残り２匹が４倍希釈以下の結果となった。

抗体価の高い３匹のマウスに追加免疫として２０．”ｇ
ｌｏ、２ｍｌの精′ＩＡｃＲＰを腹腔へ免疫し２日〜４
日後のＸ■胞融合実験に備えた。

３、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）の準備液体窒素（−１
９６°Ｃ）のタンク中へ凍結保存しておいたＰ３Ｕ１の
アンプルを取り出し、３７°Ｃの温湯中に入れ急速解凍
しＲＰＭ　Ｉ・ＦＣ３培地にて３７℃、５％炭酸ガス、
飽和水蒸気の条件下で培養し増殖させた細胞を使用した
。ＲＰＭＩ・Ｆｅ２はＲＰＭＩ−１６４０（ギフコ）に
Ｌグルタミンとピルビン酸を強化し抗生物質を含ませた
ものにＦｅ５　（Ｆｅｔａｌ　　Ｃａ１ｆ　　Ｓｅｒｕ
ｍ）を１０％に添加したものを使用した。Ｆｅ２は（株
）日本バイオテスト研究所のＮＢＬＦＣ５Ｌｏｔ１０８
を使い、培養フラスコはファルコン社製ＮＯ，３０１３
を使用した。

４、細胞融合 追加免疫の２日、３日、４日後にそれぞれ（下記Ｎｏ、
１．２．３）細胞融合を行なった。免疫したマウスを頚
椎脱臼で殺し、クリーンベンチ内にて無菌的に開腹し肺
臓を摘出した。肺臓をＲＰＭＩの入った小シャーレに入
れ軽く洗い別のシャーレに移しメスとハサミで細切りに
し更に＃１５０メツシュを使ってＲＰＭＩで婢細胞浮遊
液５０ｍ１を調製し、遠心管に入れた。増殖したＰ３Ｕ
１をピペッティングにてフラスコから集め血球計算盤で
絹胞数を数え牌細胞の数に合わせた。

細胞融合は以下のようにして行なった。

Ｐ３Ｕ１は、ＲＰＭ　Ｉを加え軽く撹拌し、１１０００
ｒｐ、５分間遠心する操作を２回行い、少量のＲＰＭＩ
に浮遊させた。牌細胞は、ＲＰＭＩを加え軽く撹拌し、
１２０Ｏｒｐｍ、１０分の遠心をする操作を３回行い、
先のＰ３Ｕ１と混合した。この細胞混合液は、１２０Ｏ
ｒｐｍ、１０分の遠心によりペレット状にし、３７℃温
浴中で５０％ＰＥＧ２０００　（和光純薬）１ｍｌを１
分かけてピペットで撹拌しながら加え、その後、更に１
分間撹拌を続けた。次にＲＰＭＩ、１ｍｌを加えピペッ
トで１分間撹拌する操作を２回繰り返した。更に、ＲＰ
Ｍ　Ｉ　、　３−７　ｍ　ｌを加え、２〜３分間ピペッ
トにて撹拌した後、１１０００ｒｐ、５分間の遠心で細
胞ペレットを得た。細胞はＲＰＭＴ　・Ｆｅ２，３０ｍ
１に浮遊させ、９６六マイクロプレ一ト３枚にまいた。

培養は９５％飽和水蒸気、５％ＣＯ，下で行った。

上記操作をフローシートで示すと次の通りである。

［Ｐ３Ｕ１）　　　　　　　　　（肺細胞〕上清をすて
る 番 １分　５０％Ｐ　Ｅ　Ｇ２０００．　１　ｍ　ｌピペッ
ト１分　そのままピペットにて撹拌 土 １分　ＲＰＭＩ、１ｍｌピペノ１−にて撹拌± １分　ＲＰＭ　ｒ　、　　１　ｍ　ｌピペットにて撹拌
上 ２〜３分Ｒ，ＰＭＩ、３〜７ｍｌピペットにて撹拌上清
すてる　　　ＲＰＭＩ　・ＦＣ３３０ｍｌ↓ ９６六マイクロプレ一ト３枚へ ↓ Ｃ○２インキュベーター ５、抗体のアッセイ 細胞融合後、５０〜７日目よりハイブリドーマの増殖開
始を認め、１２目目以後に十分増殖したハイブリドーマ
についてＥＩＡ　（酵素免疫測定法、Ｅｎｚｙｍｅ　　
Ｉｍｍｕｎｏ　　Ａｓ５ａｙ）を用いて抗体活性を検討
した。エリザプレート（住友ベークライト）の各ｗｅ１
１へ精製ＣＲＰをＰＢＳ（０゜０１Ｍリン酸緩衝液、０
．１５ＭＮａＣ１）にて２０、−　ｇ／ｍ　ｌ　ニ調製
したものを］　ＯＯ、、、ｌずっ添加し室温２時間反応
させ同相化した。抗体などのプレートへの非特異的吸着
を防ぐために０．　１％ＮａＮ３加ＰＢＳで１％に調整
したＢＳＡ（牛血清アルブミン、Ｂｏｖｉｎｅ　　Ｓｅ
ｒｕｍ　　Ａｌｂｕｍｉｎ）を２００．、、Ｉすっ添加
し室温１時間反応の後、使用時まで４°Ｃに保存した。

抗体活性は以下の操作により検出した。

ＣＲＰ固相化プレートからＢＳＡを除去し０゜９％Ｎ　
ａ　Ｃｌで洗浄した後、培養上清と対照サンプルをそれ
ぞれ２０．、、、ｌ添加し、室温１時間反応させた。０
．９％ＮａＣ１で洗浄し、アルカリフォスファテース（
ＡＬＰ）標識山羊抗マウスＩｇを２０、、ｌ添加し１．
室温１時間反応させた。０．９％ＮａＣ１で充分洗浄し
、基質液（ジノテストＡＬＰローゼ）を１００．、、ｌ
加え、室２！ｉ３０分放置後、呈色液を１００．、ｌ加
え、発色したものを抗体活性陽性とした。対照サンプル
は抗ＣＲＰマウス抗血清（細胞融合時に採血した）の１
０倍希釈液及びＲＰＭＩ・Ｆｅ２であった。

該操作のフローシートを示すと次の通りである。

抗原プレート １回洗浄　０．９％Ｎ　ａ　Ｃ１ ル 培養上清、陽性、陰性コントロール２０　、Ｉｊ　ｌ↓ 室温１時間 ↓ １回洗浄０．９％ＮａＣｌ ル ＡＬＰ標識山羊抗マウスＩｇ２０．．１φ 室温１時間 ↓ ３回洗浄　０゜９％ＮａＣ１ 、し 融合実験Ｎｏ１〜３の融合率は１００％で８６４ｗｅｌ
ｌのアッセイを行なった。その結果、偽陽性を含め４４
ｗｅｌｌ　　（５，１％）に抗体活性があり、これらに
ついてクローニングを行なった。

６、クローニング クローニングは限界希釈法で行なった。つまり増殖した
ハイブリドーマを、細胞数が３コ／　ｗ　ｅｌｌ、１コ
／ｗｅｌｌ、０．３コ／ｗｅｌｌになるように調整し、
１枚の９６穴マイクロプレー１−にまいた。

フィーダー細胞として４週令雄マウスを頚椎脱臼後無菌
的に摘出した胸腺細胞を１０’／ｗｅｌｌの濃度で用い
た。

クローニング後、１４〜１６日目にハイブリドーマの増
殖がａｉｍされ、抗体活性を調へた。抗体活性を有する
クローンを適当に選び、その内の１つを２回目目のクロ
ーニングに供し、他はｌＯ％Ｉ〕ＭＳＯ（和光純薬）含
有Ｆ　Ｃ３１ｍ　ｌにｌｌ遊させ一８０℃で凍結保存し
た。ノα初のクローニングで抗体活性陽性クローンのあ
るプレー１〜は２５枚（２，９％）であった。２回目の
クローニング及び、複数のハイブリドーマの増殖があっ
たものについては３回目のクローニングを行なったが、
これらは最初のクローニングと同様に行った。一連のク
ローニングで抗体活性があり確実に単クローンと考えら
れるハイブリドーマについては、フィーダー細胞と共に
１ｍｌのＲＰＭＩ　−Ｆａ３に浮遊させ２４穴マイクロ
プレートにまいた。以上より２５のクローンが得られ、
ＣＲＢ　１−ＣＲＢ　２５の名称を与えた。これらは８
ｍｌのＲＰＭ　Ｉ・Ｆａ８の入る小フラスコ〔ファルコ
ン（Ｆ　ａ　ｌ　ｃ　。

ｎ）３０１３］へ移し増殖させ、その半分を大フラスコ
（１００ｍ１．ＲＰＭＩ　・Ｆａ８．Ｆａ　１ｃｏｎ３
０２４）で増殖させた。この一部分は１０％ＤＭＳＯ−
ＦＣ３で凍結保存した。

７、ハイブリドーマの移植 大フラスコにて飽和になった細胞をピペッティングでは
がし遠心管に移し１０１０００ｒｐ分の遠心によって細
胞を集め、１０７コの細胞を２週間前にブリスタン（和
光）０．５ｍｌを腹腔へ投惨しておいた１０週令Ｂ　Ａ
　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雄マウスの腹腔へ移植した。移植後、
１２日から１５５回目全てのマウスより２ｍｌから１０
ｍ１の腹水を採取した。

８、セルロゲル電気泳動法 ＣＲＢ　１〜２５の腹水中抗体蛋白質は、セルロースア
セテート膜（セルロゲル）を支持体とする電気泳動によ
り検出した。この電気泳動は０．０７５Ｍベロナール緩
衝液ｐＨ８，６（、−：　０．０５）で平衡化したセル
ロゲルに、２〜３．−１の腹水を巾１ｃｍ程度塗布し、
同緩衝液を用いて２００ｖ定電圧１５分行なった。蛋白
染色はアミドブラックＩＯＢで常法に従い行った。

次にＣＲＰと各腹水（ＣＲＢ　１−ＣＲＢ　２５）の反
応を電気泳動を使って調べた（ＣＲＢＩ〜２５の泳動パ
ターンの例を第１−Ａ図に示す）。この方法としては第
１−Ｂ図に示すように、最初にＣＲＰ　　１ｍｇ／ｍｌ
を１ｃｍ巾で膜に塗布し、この上に５ｍｍ重ねて各腹水
（ＣＲＢ）を塗布し同様に泳動を行なった。第１−Ｂ図
の泳動後の図に示すように、本来ＣＲＰの移動度は１位
の遅い位置であるが、抗体バンドがＣＲＰと反応すると
本来の位置と違うところに抗原抗体反応のバンド（Ｘ　
Ｘ　Ｘ）ができた。この方法によりＣＲＢ　１７．１８
．１９．２０．２１および２３の６つのクローンで強い
反応性を認めることがわかった。第１−０図に対照例（
ＣＲＰ）、比較例（ＣＲＢ４）およびＣＲＢ　１７．Ｃ
ＲＢ　ｌ　８．ＣＲＢ　１９．ＣＲＢ２０．ＣＲＢ２１
．ＣＲＢ２３の電気泳動像の模式図を示した。比較例の
ＣＲＢ４ではＣＲＰとＣＲＢ腹水の抗体のバンドが変化
せず本来の位置にあるのに対して、ＣＲＢ　１７から２
３に関してはＣＲＰ又はＣＲＢのどちらかのバンドに変
化が見られ、抗原抗体反応が認められた。ＣＲＢ２１は
抗体のバンドかうすいがＣＲＰとは完全に反応した。

９、−元免疫拡散法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法）ＣＲ
Ｂ　１〜２５の腹水と精ＩｃＲＰの反応を。

ｕ　ｃ　ｈ　ｔ　ｅ　ｒ　ｌ　ｏ　ｎ　ｙ法によって調
べた。ベロナール緩衝液で１．２％アガロース平板厚さ
２ｍｍを作り中心に１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＣＲＰを
おき、回りに６コずつ腹水を入れて室温で一晩反応させ
た結果、ＣＲＢ　１７．１８．１９．２０．２１および
２３の６つの腹水で沈降反応が起きた。

次に沈降反応を示した５つのクローン（ＣＲＢ２１は腹
水量が少ないため未精製）を精製し精製抗原との沈降反
応をみるとＣＲＰ１ｍｇ／ｍ１１０２１に対して各クロ
ーン共に５ｍｇ／ｍ１１０．１でシャープな沈降線を形
成した。

またクローンの横にポリクロナール抗体（家兎抗ＣＲＰ
抗体）をおくとモノクロナール抗体との間に５ｐｕｒを
形成し、モノクロナール抗体がポリクロナール抗体の一
部であることを示している。

１０、単クローン抗体ＣＲＢ　１８の精製ＣＲＢ　１８
のクローンについて２０ｍ１の腹水を０．　Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　ｐＨ７，４に一晩透析し、０．Ｌ
Ｍ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣ１ｐＨ７，４に十分平衡化したＤ
ＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ５２．Ｗｈ　ａ　ｔｍａ
　ｎ）φ２．５Ｘ１５ｃｍに適用した。流速は４０ｍ　
ｌ／ｈ　ｒＯＤｚｙｏで測定し０．０５以上の吸収ある
素通り分画を集め等量の飽和硫安液を加え塩析を行なっ
た。塩析操作を３回くり返し行ない沈殿を洗った。沈殿
は少量のＰＢＳに溶解してＰＢＳにて透析を行なった。

外液は３回交換した。十分透析した抗体をセルロゲル電
気泳動で確かめ精製抗体とした。蛋白量は０Ｄ）Ｒｅ）
で１．４を１ｍｇ／ｍｌとして調製した。

Ｂ、上記Ａのようにして得られた抗ヒトＣＲＰ単クロン
抗体ＣＲＢ　１８アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーによるヒトＣＲＰの単離について述べる。

以下では精製抗体を＃ＣＲＢ　１８とする。

１．７フイニテイーカラム 蒸留水でよく洗滌した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　４Ｂ（フ
ァルマシア・ファインケミカル社製）の湿重ｆｆｉ　１
０　ｇを計り、蒸留水１００　ｍ　ｌに懸濁させた。固
形のＢ　ｒ　ＣＮ　１０　ｇを添加し、スターシーを用
いて撹拌した。この間、溶液のｐ　Ｈが１０〜１１にな
るように適宜、２　Ｎ　−Ｎ　ａ　ＯＨを添加し、所要
時間は２０分以内とした。溶液はろ過し、直ちに冷却し
た（以下では４°Ｃに冷却した緩衝液等はＣという記号
で表す）Ｏ，ＩＮ−Ｎａ）Ｉｃ○３の２１で正確に２分
間でゲルを洗滌した。ゲルは更にＣＰＢＳの１１でよく
洗滌した後、同緩衝液で平衡化した＃ＣＲＢ１８，５０
ｍｇを添加し、４°Ｃ下で一昼夜（１８時間）ゆっくり
と撹拌した。

未反応の＃（１：ＲＢ　１８をＣＰＢＳでよく洗滌した
後、１％Ｂ　Ｓ　Ａ−ｃ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｍ液を１００ｍ
１添加し、４°Ｃ，１昼夜（２４時間）反応し、未反応
の活性基を封じた。

ｃｐｓ５で充分ゲルを洗滌し、未反応のＢＳＡを洗い流
した。

カラムは１．６Ｘ１０ｃｍを使用した。

２、溶出 カラムは使用前に０．５Ｍ酢酸！０１１衝液ｐＨ５゜０
．１０％ＮａＣ１（Ａ緩衝液）、　　１．０Ｍ　Ｔｒ　
ｉ　５−ＨＣＩ　　ｐＨ７，０（Ｂ緩衝液）の夫々５０
０ｍ１を４５　ｍ　ｌ　／　ｈ　ｒ　〜５０　ｍ　ｌ　
／　ｈ　ｒで流した後、Ｏ，ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　　ｐＨ８゜０．０．２Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ＮａＮ
５（Ｃ緩衝液）で充分平衡化した。ただし、この操作は
最初の第１回だけである。

３、精製法 不溶性成分を４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分遠心、
Ｎ００１ろ紙でろ過したＣＲＰ含有血清を２０　ｍ　ｌ
　／　ｈ　ｒの流速で＃ＣＲＢ　１８カラムに適用した
。血清適用終了後、Ｃ緩衝液を同じ流速で、○Ｄ２ａＯ
が０．０５以下になるまで流した。

次にへ緩衝液が５０　ｍ　ｌ　／　ｈ　ｒの流速で流し
、ＯＤ　２ｇＯが０．０５以上の分画をプールし、直ち
にトリスペースによりｐＨを７．０に調整した。この分
画はＣＲＰを含んでおり、さらに０．０５Ｍクエン酸ナ
トリウム緩衝液、ＮａＣ１Ｏ，ＬＭ（Ｄ緩衝液）に透析
した。

カラムはＢ緩衝液で洗滌し、０Ｄ２８ｏが０．０２以下
になったところでＣＭＬ衝液で平衡化し、再使用できる
ようにした。

一方、Ｄ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム
を用意しく１．ＯＸＩ　Ｏｃｍ）、Ａ緩衝液溶出分画を
適用した（流速は４５　ｍ　ｌ　／　ｈ　ｒ　）。

Ｄ緩衝液を流し○Ｄ、？８ｏが０．０２以下になったと
ころでＤ緩衝液に０．４ＭＮａＣ１を加えた緩衝液で流
速６０　ｍ　ｌ　／　ｈ　ｒで溶出し精製ＣＲＰを得た
。　この溶出条件については、次のようにして決めたも
のである。すなわち、常法に従いＣＲＢ　１８を９６穴
マルチプレートに固相化し、２０、”ｇ／ｍｌの精製Ｃ
ＲＰを４°Ｃ１１８時間反応後、種々の緩衝液１００．
−１を添加、室温３０分放置し、同一緩衝液にて数回ピ
ペッティングし、さらにＣ緩衝液で平衡化した。ＡＬＰ
標識ＣＲＢ１８を室温１時間反応させ、ＡＬＰローゼ（
ジノテスト製）により発色、Ａ　５００で比色しく解離
しておればＡｓｏθ＝０となる）、その結果で条件を選
択した。

このようにして＃ＣＲＢ１８　５０ｍｇ固相化カラムに
対し、ＣＲＰは１０　ｍ　ｇ結合していた。

上記のような実験を３回行い、＃ＣＲ８１８アフィニテ
ィカラム１次いでＤＥＡＥセルロースカラムを通した際
の各カラム通過後の血清ＣＲＰの回収率について見た結
果を第２表に示す。なお、適用した原血清中のＣＲＰ量
を１００％として、回収率を表している。

第２表から平均回収率は９０．２％であった。

上記のようにして得た精製ＣＲＰの特性について次のよ
うな検討を行った。

１、肺炎双球菌凝集活性 ＷＩ製ＣＲＰを再度Ｃｆｉ衝液で透析し、この５゜、−
ｇ　（１ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　、　５０、−１　）をマ
イクロタイタープレートに添加し、さらにＣ緩衝液に懸
濁させた肺炎双球菌５０．．１を添加した。よく振とう
させた後、ｃ４１衝液にＯ，ＬＭ　ＣａＣｌ２．０゜０
５Ｍ　ＭｇＣｌ２　、Ｏ，０００２Ｍ　ＭｎＣｌ２を加
えた緩衝液ｌｏｏ、ｆｔを入れ、よく振とうし、室温に
て１８時間放置した。

得られたＣＲＰを添加したものはよく菌が凝集したが、
正常ヒト血清、０．９％Ｎ　ａ　Ｃｌ、Ｃ緩ｌ＃液など
は菌の凝集がｗＪｌ察されなかった。

２、分子量 高速液体クロマトグラフィー（東洋曹達ＨＬＣ−８０３
Ｄ、カラムＴＳＫｇｅ　１Ｇ３０００ｓＷ）により溶媒
を０．０１Ｍ　Ｔｒ　ｉ　５−）（Ｃ１ｐＨｓ、ｏ、ｏ
、ｔ％　ＮａＮ３．分子量マーカーをファルマシア・フ
ァインケミカル社製ゲルろ適用カリブレーションキット
により分子１１１０Ｋに鋭い単一ピークとして認めた。

１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥでは２ＭＥ還元、１％ＳＤＳ非
還元の両方で分子１２４Ｋに単一バンドとして認めた。

３、特異性 １．２％アガロースを支持体とし、ｐＨ８，６ベロナー
ル緩衝液（、−＝０．０５）を用いた免疫電気法！ＰＩ
Ｉ法において、抗正常ヒト血漬抗血清（ＤＡＫＯ，ｔｔ
Ａ２０６）とは反応せず、抗ヒトＣＲＰ抗血清（ＤＡＫ
Ｏ，＃ＡＯ７３）　と７位に単一の沈降線のみを認めた
。また精＠ｃＲＰを家兎に免疫（２００，、ｇをＦＣＡ
とともに、２回免疫）して得られた抗血清は、同上の免
疫電気泳動法を用いてＣＲＰとはγ位にｌｉ−の沈降線
を形成するが、正常ヒ１〜血清とは反応しなかった。

以上１〜３より純粋なＣＲＰと判断し、た。

Ａυ艮 本発明の抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体ＣＲＢ１８を
用いたＣＲＰ回収、精製法は多量の血清の平衡化の必要
もなく、また単にクロマトグラフィーを２回行えばよい
という簡便さに加え１回収率も８０〜９０％以上と高い
。さらに、このカラムは溶出条件が中性と弱酸性であり
、抗原（ＣＲＰ）および抗体（ＣＲＢ１８）に対するダ
メージは殆んどなく、長く再使用に耐え得るものである
。

【図面の簡単な説明】

第１−Ａ図は本発明のモノクローナル抗体産生細胞の電
気泳動像を模式的に示した図であり、第１−Ｂ図は本発
明のモノクローナル抗体産生細胞ＣＲＢとＣＲＰとの反
応の電気泳動像を模式的に示した図であり、第１−Ｃ図
は各ＣＲＢとＣＲＰとのセルロゲルでの反応の電気泳動
像を模式的に示した図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトＣ反応性蛋白（ヒトＣＲＰ）モノクローナ
   ル抗体ＣＲＢ１８を用いた吸着クロマトグラフィーによ
   ってヒトＣＲＰを回収、精製することを特徴とする、ヒ
   トＣＲＰの回収、精製法。