JPS623794A - 細胞の組織培養によるラウウオルフイア系アルカロイドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物細胞の組織培養によるラウウオルフイア系
アルカロイドの製造法に関し、詳しくはラウウオルフイ
アＲ植物の組織片の組織培養によって各型のラウウオル
フイア系アルカロイドを製造する方法に関し、さらに詳
しくは、ラウウオルフイア属植物の組織片の組ｍ培養に
よって多重のラウウオルフイア系アルカロイドを安定的
に製造する方法に関する。

〔技術の背景および従来技術の説明〕

ラウウオルフイア系アルカロイドは、キョウチクトウ科
の植物の主として根に生成し、血圧降下作用を有する他
に、神経系に働いて鎮静および催眠作用を発現し、さら
に精神安定作用を有する医薬として広く使用されている
。

これまでに、ラウウオルブイア系アルカロイドは、ラウ
ウオルフイア・セルペンチナ（インド蛇木）　　（Ｒａ
ｕｖａｌｆｉａ　５ｅｒｐｅｎｔｉｎａ）　、ラウウオ
ルフイアＣカネセンス（Ｒａｕｖａｌｆｉａ　ｃａｎｅ
ｓｃｅｎｓ　）　、うウウオルフィア番ミクランタ　（
Ｒａｕｖａｌｆｌａｍｉｃｒａｎｔｈａ　）　、ラウウ
オルフイア・ボミトリア（Ｒａｕｖａｌｆｉａ　ｖｏｍ
ｉｔｒｉａ　）等の植物の根から抽出されてきたが、最
近では原料植物の生産量が低下し、植物の採取が困難に
なっている。

近年、植物細胞の組織培養が行なわれるようになり、イ
ンド蛇木から分離選別したカルスを静置培養または通気
撹拌培養することにより、幼Ｗ物体に分化させ、それに
よってラウウオルフイア系アルカロイドを製造すること
が提案されている。

（特開昭４８−８０７８９号公報） さらに植物細胞の組１！Ｉ！養において、α−ナフタレ
ン酢酸を含む栄養培地を使用して、アルカロイドを生産
することも提案されている。（特公昭５６−２８５１５
号公報） 本発明者らは、植物細胞の組織培養について永年研究を
続けているが、ラウウォルフィア属植物の組織から誘導
したカルスの培養において、順調に生育したカルスをα
−ナフタレン酢酸、およびベンジルアデニンおよびカイ
ネチンかうなるサイトカイニン類を含む栄養培地におい
て培養して、−たんその生育を悪化させ、生育の悪化し
たカルスを再び順調に生育する培地に戻して、培養する
ことからなるラウウオルフイア系アルカロイドの製造方
法を提案した。（特願昭５８−１８７１１１号）本発明
者らはさらに研究を続け、インド蛇木の培養細胞を培養
するときに、光を照射した条件の下で培養すると、光を
遮った暗所の条件において培養した場合よりも培養細胞
増殖率は低下するが、培養細胞中のレセルピン含有量が
増加すること、およびインド蛇木の培養細胞の培養にお
いて、光を照射した条件における培養を継代的に続ける
と、代を重ねる毎に培養細胞中のレセルピン含有量が低
下するが、培養初期に光を遮った暗所における培養を行
なった後に、光を照射した条件における培養を行なうと
、培養細胞中のレセルピン含有量が増加し、また継代的
な培養を行なっても、培養細胞中のレセルピン含有量が
低下しないことを見出し、これらの知見にもとづいて本
発明に到達した。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の目的は、細胞の組織培養によるラウウオルフイ
ア系アルカロイドの製造法を提供することにあり、詳し
くは、経済的にラウウオルフイア系アルカロイドを生産
しうる細胞の組織培養によるラウウオルフイア系アルカ
ロイドの製造法を提供することにあり、さらに詳しくは
、永続的にラウウオルフイア系アルカロイドを生産しう
るラウウオルフイア系アルカロイドの製造法を提供する
ことにある。

本発明は、光を遮った暗所において継代培養したラウウ
オルフイア属植物の培養細胞を、光を照射した条件にお
いて１４〜２６日間培養し、それによってラウウオルフ
イア系アルカロイド含有量の高い培養細胞を生産するこ
と、およびこの培養細胞からラウウオルフイア系アルカ
ロイドを分離採取することを特徴とするラウウオルフイ
ア系アルカロイドの製造法である。また本発明は、ラウ
ウオルフイア属ＭＩＩ！ｌＩの培養細胞を１４〜２６日
間培養するラウウオルフイア系アルカロイドの生産にお
いて、培養細胞を光を遮った暗所において２〜１２日間
培養した後、光の照射の下に培養し、それによってラウ
ウオルフイア系アルカロイド含冑量の高い培養細胞を永
続的に生産すること、および培養細胞からラウウオルフ
イア系アルカロイドを分離採取することを特徴上するラ
ウウオルフイア系アルカロイドの製造法である。

〔発明の詳細な説明〕

本発明において、ラウウオルフイア・セルベンチナ（イ
ンド蛇木）の茎葉部位の組織を用いてカルスを誘導する
には、リンスマイヤー・スクーグ培Ｍ（ＬＳＷＪ地）に
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸１〜３ｐｐｍ（好まし
くは１．７〜２．４　ｐｐｍ　）またはインドール−３
−酢酸１〜３ｐｐｍ（好ましくは１、５〜２．　ｔ　ｐ
ｐｍ　）および寒天粉末０．８〜１％を加えた固型培地
に組織片を置床し、２５°Ｃ前後の温度においてカルス
を誘導する。

このようにして得られたカルスは、リンスマイヤー・ス
クーグ改変培地（改変ＬＳ培地）に２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸と必要に応じてカイネチンを加え、そのｐ
Ｈを５〜７にした径、寒天粉末０・８〜１％をさらに加
えて得た培地に植え付け、２５°Ｃ前後の温度および光
を遮った暗所において、約３週間毎に継代する継代培養
により保存される。

カルスの保存は、液体培地における２〜３週間毎の継代
培養によることもできる。カルスの液体培養は、一般に
使用される往復振とう培養器、遊回培養器または通気式
ジャーファーメンタ−などを用いて、固体培養と同様に
、２５℃前後の温度において行なわれるが、液体培養に
おいて、カルスは分散し、小集塊状の細胞または遊理細
胞になり、継代においてこれらを濾別して、次の液体培
地に植え付ける。

継代培養における培地に添加する２、４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸の量は０．１〜２．２　ｐｐｍとするのが好
ましく、また必要に応じて添加するカイネチンの量は０
〜０．２２　ｐｐｍとするのが好ましい。

このような継代培養によって保存されたカルス（培養細
胞）は、継代培地と同様な培地に植え付け、２５°Ｃ前
後の温度および光を照射した条件の下において１４〜２
６日間培養し、ラウウオルフイア系アルカロイド含ｑ量
の高いカルス（培養細胞）が得られる。光の照射は、昼
間は陽光であってもよいが、夜間は蛍光灯によるのが好
ましく、光の照射量を安定化するには、昼夜ともに蛍光
灯の照射によるのが好ましい。

ラウウオルフイア属植物のカルスの培養に使用する培地
は、カルスが生育しうるものであれば、いかなるもので
あっても、これを使用することができるが、２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸およびカイネチンを含むものであ
るのが好ましい。

光の照射の下における培養によって得られた培養細胞を
、新しい培地に植え付け、再び同じ条件において培養す
ると、培養細胞中のラウウオルフイア系アルカロイドの
含有量が低下するが、その培養初期に光を遮った暗所に
おける培養を行ない、その後に光の照射における培養を
行なうことによってラウウオルフイア系アルカロイド含
有量の高い培養細胞を得ることができる。光を遮った暗
所における培養は、２〜１２日間行なわれる。培養切期
に光を遮った暗所における培養を行なうことによって、
ラウウオルフイア属植物のカルスの組繊培養によるラウ
ウオルフイア系アルカロイドの製造を永続的に行なうこ
とができる。

培養細胞に含まれるラウウオルフイア系アルカロイドは
、常法によって分離し、車前される。

以下において、実験例および実施例を示して、本発明を
さらに詳細に説明する。

実験例１ インド蛇木のカルスの培養における光の照射の影響につ
いて試験を行なった。

（１）実験方法 １−１）光を遮った暗所の下における培養３０〇−容エ
ルレンマイヤーフラスコに実施例１の組成の栄養培地５
０−を入れ、これに実施例１の種培養細胞２．０ｇを植
え付け、光を遮った暗所で２５°Ｃの温度において培養
した。

第１図の横軸に示す日数の経過後に、培養細胞を取り出
し、浮世して、フラスコ当りの培養細胞の増殖倍数を算
出した。

培養細胞を凍結乾燥し、実施例１と同様にして、そのレ
セルピン含有量を算出した。

１−２）光の照射における培養 ＭＷ１養細胞の培養を、８０Ｗの蛍光灯の照射の下で行
なったこと以外は前記１−１）と同様にして、フラスコ
当りの培養細胞の増殖倍数およびレセルピン含酒量を算
出した。

（２）実験結果 実験結果は、第１図および第２図に示すとおりであった
。

第１図は、培養細胞の増殖倍数の実験結果であって、タ
テ軸は培養細胞の増殖倍数であり、またヨコ軸は培養日
数である。第１図における実線は、前記１−１）の光を
遮った暗所における培養の結果であり、また点線は１−
２）の光の照射の下における培養の結果である。

第２図は、培養細胞のレセルピン含有量の実験結果であ
って、タテ軸は培養細胞のレセルピン含有量であり、ま
たヨコ軸は培養日数である。第２図における実線は、前
記１−１）の光を遮った鴫所における培養の結果であり
、また点線は、前記１−２）の光の照射の下における培
養の結果である。

（３）実験結果の考察 第１図および第２図によると、種培養細胞の培養を、光
を遮った暗所において行なうと、レセルピンの生産は多
くないが、Ｍ培養細胞の増殖倍数が高くなるから、光を
遮った暗所における培養は、種培養細胞の生産をする種
培養細胞の継代培養に適しているのに対して、種培養細
胞の培養を光の照射の下に行なうと、種培養細胞の増殖
倍数は低いが、レセルピンの生産が多くなるので、光の
照射の下における培養は、レセルピンの生産をする生産
培養に適していることがわかる。

（以下余白） 実施例１ （１）栄養培地の組成 Ｍｇ５０　　・７ＨＯ３７０ｐＨｌｎ ＣａＣ１・２＋１０　　　　　　　　４４０　ｐｐｌｎ
ＫＮＯ６，０７０ｐｐｍ ＫｌＩ　Ｐｏ　　　　　　　　　　　　　１７０　ｐｐ
ｍＦｅＳＯ−７ＨＯ２７，８ｐｐｍ Ｎａ　ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　３７．３　ｐ
ｐｍＭｎ５Ｏ・４Ｈ０２２，３ｐｐｍ ＺｎＳＯＯ７８Ｏ８，６ｐｐｍ ＣｕＳＯｅ５ＨＯ０，０２５ｐｐｍ ＣｏＣ１・６ＨＯＯ，０２５ｐｐ璽 ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　０・８３１１ＴＩ
重ＨＢＯ６・２　ｐｐｍ Ｎａ　Ｗｏｏ　　−２ＨＯＯ，２５ｐｐｍミオイノシト
ール　　　　　　　１００　ｐｐｍ塩酸チアミン　　　
　　　　　　　１・Ｏｐｐｍシヨ別　　　　　　　　　
３０，０００　ｐｐｍ２．４−−　Ｄ　　　　　　　　
　　　　　０・２２　ｐｐｍカイネチン　　　　　　　
　　　　０・２２　ｐｐｌｎ（２）種培養細胞 インド蛇木（Ｒａｕｖａｌｆｌａ　５ｅｒｐｅｎｔｉｎ
ａＢｅｎｔｈ　）の培養細胞を上記の組成の栄養培地に
植え付け、光を遮った暗所において、２５°Ｃにおける
３週間毎の継代培養を続行して、以下の実験における種
培養細胞とした。

（３）実験方法 １０〇−容エルレンマイヤーフラスコに、２５ｒｎｉの
上記の組成の栄養培地を入れ、これに種培養細胞１．０
９を植え付け、これを第１表に示す条件および２５°Ｃ
の温度において合１ｊ２０日間培養し、培養細胞を秤量
して、フラスコ当りの培養細胞の増殖量を算出した。

（以下余白） 第１表　培養の条件 培養細胞の一部を取り、凍結乾燥し、得られた乾燥粉末
１００■を取り、これにメタノール１０−を加え、５０
℃において３時間ソックスレー抽出を行なった。メタノ
ール抽出液を１−に減圧ｍ縮し、得られた濃縮液を、ノ
ルマルヘキサン９０重置部、エタノール１０重量部、酢
酸０．５重量部およびトリエチルアミン０・３重ｆｆｉ
部の溶跪液に溶解し、得られた溶離液について高速液体
クロマトグラフィー分析を行ない、レセルピン含有量を
、標邸レセルピン溶液の検量線から算出した。

（４）実験結果 実験結果は第３図および第４図に示すとおりであった。

第３図および第４図におけるヨコ軸は第１表に示される
各実験条件であり、第３図におけるタテ軸は培養細胞の
増殖量（ｇ）であり、また第４図におけるタテ軸は培養
細胞のレセルピン含有量（％）である。

第４図によると、合計培養日数２０日のうち、光を遮っ
た暗所における培養日数（暗所培養日数）が２〜１２日
および８０Ｗの蛍光灯の照射における培養日数（明所培
養日数）が１８〜８日の条件である場合（実験番号Ｂ、
Ｃ，Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）に、レセルピン含有量の高い
培養細胞の得られることがわかる。

次に、レセルピン含有量の高い培養細胞が得られた実験
番号のうちの実験Ｂ１実験ＥおよびＧ１およびレセルピ
ン含有量の低い培養細胞が得られた実験ＡおよびＫにお
いて、培養の終った培養細胞の他の一部の１．０ｇを取
り、それぞれの実験と同じ条件の＠ＩＩを繰り返し、培
養細胞の増殖量を算出した後、その培養細胞の一部を取
り、上記と同様にしてレセルピン含有量を算出した。こ
の培養細胞の培養の繰り返しにおいて培養細胞中のレセ
ルピン含有量の低下しなかったものを「安定」と、レセ
ルピン含有量の低下したものを「不安定」と評価した。

その結果は第２表に示すとｉりであった。

（以下余白） 第２表　レセルピン生産の安定性 第２表によると、培養の全期間蛍光灯の照射を行なった
場合（実験Ａ）は、レセルピンの生産は増加するが、実
験の繰り返しにより、レセルピンの生産が低下するが、
培養の初期に、光を遮った暗所における培養を２日間行
なうことによってレセルピンの生産が安定化することが
わかる。

実施例２ （１）！培養細胞 実施例１の栄養培地に寒天１．０％の寒天を加えτ滉ナ
ー…ゼΦ着塔仙に、インド蛇木（ＲａｕｖａｌｆｉａＳ
ｅｒｐｅｎｔｉｎａ　Ｂｅｎｔｈ　）の葉起原のカルス
を植え付け、光を遮った暗所において、２５°Ｃにおけ
る３週間毎の継代培養を続行して、以下の実験における
Ｎ培養細胞とした。

（２）栄養培地の組成 Ｈｇ５Ｏ・７１１０　　　　　　　　３７０　ｐｐｍＣ
ａＣＩ　　・２１１０　　　　　　　　４４０　ｐｐｍ
ＫＮＯ６，０７０ｐｐｍ ＫＨＰｏ　　　　　　　　　　　　　１７０　ｐｐｍＦ
ｅＳ０　　・７ＨＯ２７，８ｐｐｍ Ｎａ　ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　３７．３　ｐ
ｐｍＭｎ５０　　・４Ｈ０２２，３ｐｐｍ ＺｎＳＯ会７＋Ｉ０８．６ｐｐｍ ＣｕＳＯ・５Ｈ００，０２５ｐｐｍ ＣｏＣ１・６ＨＯ０，０２５ｐｐｍ 、２２ ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　０．８３　ｐｐｍ
１１８０　　　　　　　　　　　　　６．２　ｐｐｍＮ
ａ　ＭｏＯ９２１１００，２５ｐｐｍミオイノシトール
　　　　　　　１００　ｐｐｍ塩酸チアミン　　　　　
　　　　　１．ＯｐｐのショＨ３０＋ＯＯＯＩＩｐＩ１
１ α−ナフタレン酢酸　　　　　　　２　ｐｐｍベンジル
アデニン　　　　　　　　２　ｐｐｍ寒天粉末　　　　
　　　　　　　　１・Ｏｐｐｍ（３）実験方法 ３００ｍ１容のエルレンマイヤーフラスコるこ上記の組
成の固形栄養培地を入れ、これに上記の種培養細胞２．
５ｇを植え付け、第３表の実験条件による以外は、実施
例１と同様にして、培養後の細ｊ泡の増殖量、培養後の
培養細胞のレセルピン含有量および培養の繰り返しにお
けるレセルピンの生産の安定性を求めた。

（４）実験結果 実験結果は第３表に示すとおりであった。

Ｃ以下余日） 第３表　レセルピン生産の安定性 第３表によると、培養の全期間（２１日間）蛍光灯の照
射を行なった場合（実験２）は、レセルピンの生産は若
干増加するが、実験の繰り返しによりレセルピンの生産
が低下し、不安定になり、培養の全期間、光を遮った暗
室内において培養を行なった場合（実験３）は、レセル
ピンの生産が低く、さらに培養の初期に、光を遮った暗
所における培養を行なった後に、蛍光灯の照射の下にお
ける培養を行なった場合（実験ｌ）は、レセルピンの生
産が高く、安定していることがわかる。

〔発明の効果〕

本発明によると、ラウウオルフイア系アルカロイドの生
産を永続的に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例１における培養細胞の増殖倍数の実験結
果を示す図表、第２図は実験例１における培養細胞のレ
セルピン含有量の実験結果を示す図表、第３図は実施例
１における培養細胞の増殖量の実験結果を示す７表であ
り、そして第４図は実施例１における培養細胞のレセル
ピン含有量の実験結果を示す図表である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）光を遮つた暗所において継代培養したラウウオル
   フイア属植物の培養細胞を、光を照射した条件において
   培養開始から１４〜２６日間培養すること、および培養
   細胞からラウウオルフイア系アルカロイドを分離採取す
   ることを特徴とするラウウオルフイア系アルカロイドの
   製造法。
2. （２）ラウウオルフイア属植物の培養細胞を１４〜２６
   日間培養することからなるラウウオルフイア系アルカロ
   イドの製造において、培養細胞を光を遮つた暗所におい
   て２〜１２日間培養した後、光の照射の下に培養するこ
   と、および培養細胞からラウウオルフイア系アルカロイ
   ドを分離採取することを特徴とするラウウオルフイア系
   アルカロイドの製造法。