JPS623799A - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、体液、例えば血清等に含まれるスーパーオキ
シドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略称　　　　−する
。）活性測定法に関する。

〔発明の背景〕

自然界に於て、微生物、植物、高等動物など好気的生物
は、分子状酸素を有効に利用して生命維持に不可欠なエ
ネルギーを効率よく得ているが、同時に種々の活性ｍ素
が生成し、これが生体にさまざまな害を及ぼすことが知
られている４例えば活性酸素の１つであるスーパーオキ
シドアニオン　（以下、０２７とする。）は炎症、発癌
、老化、また、核ｍ−酵素・脂質などの変性の原因とな
るなど、広範囲にわたり生体にとって有害である。

ＳＯＤは好気的生物のすべてに普遍的に存在し、超酸化
物不均化酵素ともよばれ、生体内の０２″の不均化反応
、即ち、２０２？＋　２Ｈ＋→０２　＋　Ｈ２Ｏ２を触
媒する酵素であり、生体を酸素毒性から守っている。

赤血球、白血球２組織切片中のＳｏＤ活性測定と臨床的
意義に関する報告は多いが、血清中のＳＯＤについては
蛋白成分をはじめ種々の成分がＳＯＤ測定値に影響を及
ぼす為、未だ充分な検討はなされていない。現在性われ
ているＳＯＤ活性測定法は、いずれの方法もＯｌを発生
させる系と０２’を検出する系とから構成され、ＳＯＤ
が６の不均化を促進することによって０２？の生成量が
減少するのを利用したものである。

ＳＯＤ活性測定法に於ける０２？の発生系には、超酸化
化合物、例えば超酸化カリウムにより０２？を生成させ
る系や還元型補酵素と電子伝達体の反応により０２？を
生成させる系等もあるが、現在、主としてキサンチンに
キサンチンオキシダーゼを作用させる方法が一般に用い
られている。この反応を次に示す。

キサンチンオキシダーゼ キサンチン＋０２　＋　Ｈ２Ｏ 尿酸＋２Ｈ＋＋０２” また、０りの検出系には、０２？の還元作用を利用した
ニトロテトラゾリウムブルー（以下、ＮＯ３−ＴＥと略
称する。）法、チトクロームＣ法、０２°の酸化作用を
利用したエピネフリン法、ピロガロール法、６−ヒドロ
キシドーパミン法などがある。

これらＳＯＤ活性測定法の原理を、０２′の発生系にキ
サンチン、午サンチンオキシダーゼを用い、０２’の検
出系にＮ０２−ＴＢ法を用いた方法を例にとり下式に示
す。

即ち、０２７発生系に於て、例えばキサンチンオキシダ
ーゼはキサンチンと分子状酸素（０２）との反応を触媒
し、Ｏｉを生じるが：この系にＳＯＤが存在すると、０
紬不均化が促進され生じた０りは０２とＨ２Ｏ２とにな
る。ここに生成する０りはチトクロームＣ，Ｎ０２−Ｔ
Ｂなどを還元自発色させ、又、エピネフリン、ピロガロ
ール、６−ヒドロキシドーパミンなどを酸化◆発色させ
る性質を有するので、この性質を利用して試薬盲検値に
対する検体吸光度の減少を測定しＳＯＤ活性値を求めて
いる。従って、これらの方法はいずれも試薬盲検値が高
い為測定精度が悪く、また、測定範囲も狭いなどの欠点
を有している。

かかる状況に鑑み、本発明者らは０２？を基質とするＳ
ＯＤ活性の測定法について鋭意研究を重ね、電子伝達体
の共存下、０２？にＳＯＤが作用して生ずる過酸化水素
（以下Ｈ２Ｏ２とする。）を定量することによりＳＯＤ
活性が測定し得ることを見出し。

先に特許出願している　　（特願昭８０−０４０５２８
号）。

この発明は、通常、０りはそれ自体の不均化反応により
次第にＨ２Ｏ２に変化するが、そこに電子伝達体が存在
すると意外なことに０♂自体の不均化反応によるＨ２Ｏ
２生成は起らず、この系にＳＯＤが存在する場合のみ、
その活性量に比例してＨ２Ｏ２が生成するという事実に
基づきなされたものである。しかしながらこの方法は、
試薬盲検値の変動があり、このため測定値に影響を及ぼ
すことがあるという欠点を有していた。

〔発明の目的〕

本発明は、電子伝達体の共存下、旺にＳＯＤが作用して
生ずるＨ２Ｏ２を定量することにより行う体。

液中のＳＯＤ活性の測定法に於て、試薬盲検値の変動が
なく、感度及び検量線の直線性にも優れたより精度の高
いＳＯＤ活性測定法を提供すること　　　　−を目的と
する。

〔発明の構成〕

本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子
伝達体の存在下、これにスーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＩ））が作用して生ずる過酸化水素を定量するこ
とにより行うＳＯＤ活性測定法に於て、マレイミド又は
マレイミド誘導体の共存下にこれを行うことを特徴とす
るＳＯＤ活性測定法、並びにスーパーオキシドアニオン
を基質とし、電子伝達体の存在下、これにスーパーオキ
シドジスムターゼ（ＳＯＤ）が作用して生ずる過酸化水
素を定量することにより行うＳＯＤ活性測定法に於て、
マレイミド又はマレイミド誘導体、及びカルボニル化合
物の共存下にこれを行うことを特徴とするＳＯＤ活性測
定法の発明である。

本発明は、ＳＯＤが存在するＯｉ生成系に電子伝連体を
共存させ、この系で生成するＨ２Ｏ２を測定することに
よってＳＯＤ活性を測定する際、０２？生成系にマレイ
ミド又はマレイミド誘導体を共存させることによって試
薬盲検値及びその変動が小さくなること、また、この系
に更にカルボニル化合物を共存させるとそれがより一層
改善されることを本発明者らが初めて見出し完成させた
ものである。

本発明に用いられるマレイミド又はマレイミド誘導体と
しては、例えばマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド　（
以下ＮＥＷと略称する。　）　Ｎ−（９−アクリジニル
）マレイミド、Ｎ−（１−アニリノナフチル−４）ヤレ
イミＦ、Ｎ−（４−アニリノフェニル）マレイミド、Ｎ
−（ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）フェニルコマレイ
ミド、Ｎ−（７−シメチルアミノー４−メチルクマリニ
ル）マレイミド、Ｎ−（３−フルオランチル）マレイミ
ド等や、特開昭５９−２０４１７１号公報で開示されて
いる一般式［Ｉ］　で表わされるＮ−置換マレイミド誘
導体など各種のものが使用できるが、なかでもＮＥＭが
水に対する溶解性が優れているという点で好ましく用い
られる。

〔式中、Ｒ１は水素、ニトロ基、ジ低級アルキルアミ７
基又はＲ３−Ｃ０Ｎ）Ｉ−なる基（但し、Ｒ３は低級ア
ルキル基又はフェニル基である。）であり、Ｒ２は水素
又はニトロ基である。また、マレ・イミド置換基はベン
ゾイル置換基のオルト又はパラ位にある。〕 本発明に於て用いられるマレイミド又はマレイミド誘導
体の濃度は、反応液中０．５ｍ＋ｉｏｌ／１以上であれ
ば有効であるが、通常は２〜４０＋ｗｍｏｌ／ｌの範囲
が好ましく用いられる。

本発明に用いられるカルボニル化合物としては、芳香族
ケトン化合物又は脂肪族ケトン化合物等が挙げられる。

これらのものを例示すると、芳香族ケトンとしてはベン
ゾフェノン、アセトフェノン、２−ヒドロキシ−４−メ
トキシベンゾフェノン−５−スルホン酸、ベンゾフェノ
ン−２−カルボン酸、３．３’　、４．４’−ベンゾフ
ェノンテトラカルポン酸、０−ヒドロキシベンゾフェノ
ン、ｐ−ヒドロキシベンゾフェノン、ベンゾフェノン−
２，４’−ジカルボン酸、２−ヒドロキシ−５−メチル
ベンゾフェノン、２′−ヒドロキシ−５−メチルアセト
フェノン、４゛−ヒドロキシ−２°−メチルアセトフェ
ノン、４′−ヒドロキシ−３′−メ−ｆ’）レアセトフ
ェノン、２°−ヒドロキシ−４′−メトキシアセトフェ
ノン、２−ヒドロキシ−４′−メトキシアセトフェノン
などが挙げられ、又脂肪族ケトンとしてはアセトン、メ
チルエチルケトン、メチル−ｎ−ブチルケトン、メチル
イソブチルケトン、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルケトン、
メチル−ｎ−アミルケトン、メチルイソアミルケトンな
どが挙げられる。使用濃度は反応液中０．５ｍｍｏｌ／
１以上であれば有効であるが、通常は１ａ＋ｍｏｌ／１
〜４０ｍｌｌ１ｏｌ／Ｉの範囲が好ましく用いられる。

本発明の方法に於て用いられる電子伝達体としては１例
えばフェナジンメトサルフェーｈ　　（ＰＭＳ）　、　
　１−メトキシ−５−メチルツェナジニウムメチルサル
フェート　（１−メトキシＦＭＳ）、９−ジメチルアミ
ノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロリ。

ド　（メルトラブル−）等が挙げられるがこれらに限定
されるものではなく、これらと同等の作用を有する電子
伝達体は全て使用可能である。これらは夫々単独で用い
ても２種以上混合して用いてもかまわない、これら電子
伝達体の使用濃度は特に限定されないが、通常０．００
１〜１ｍＭが好ましく用いられる。

本発明に用いられる０２？生成系としては、キサンチン
とキサンチンオキシダーゼとの反応により０２？を生成
させる系、超酸化化合物（例えば超酸化カリウム）によ
り０２？を生成させる系、又は還元型補酵素と電子伝達
体との反応により０りを生成させる系が主として用いら
れるが、その他の方法、例えば還元型フラピンと０２と
の反応、低原子価の遷移金属イオンによる０２の還元、
０２の電解還元などにより生成する０２？等も利用でき
ることは勿論である。

酵素反応の液性は中性からアルカリ性であればよいが、
通常Ｐ）＋　７〜１０が好ましく用いられる。

本発明の方法は、ＳＯＤの作用により一定時間内に生成
したＨ２Ｏ２量を測定することによって酵素活性を求め
る方法であり、Ｈ２Ｏ２により酸化されて発色する発色
剤を酵素反応系に存在させ、その呈色の単位時間当りの
吸光度変化量からＳＯＤ活性を求める、いわゆるレイト
法でも測定可能であるが、又、一定時間酵素反応させ反
応を停止させた後に吸光度を測定する、いわゆるエンド
法でも測定可能である。一般に、用手法で行う場合には
エンド法を用いることが多い、エンド法は、所定時間酵
素反応させた後に反応を停止させ生成したＨ２Ｏ２を定
量する方法である為、反応停止剤が必要となる。この場
合、一定時間酵素反応と発色反応を行った後反応停止剤
を加えて反応を停止させ吸光度を測定する方法でも、又
一定時間酵素反応させた後反応停止剤を加えて酵素反応
を停止させると同時に発色反応を行わせる方法でも可能
であるが、前者の方法によると発色剤により酵素反応が
阻害されることがある為、後者の、反応を停止させると
同時に発色反応を行わせる方法が好ましい。反応停止剤
としては、Ｈ２Ｏ２の定量が通常ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）と被酸化性呈色試薬とを用いて行われたり、４価
のチタン化合物と　２−（５−ブロモ−２−ピリジルア
ゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミン
）フェノール又は／及びその塩とから成る試薬を用いて
行われることを考慮すると、液性が中性付近で且つこれ
ら呈色試薬の発色に影響を与えないような反応停止剤が
要求される。

これらの要求にかなうものとして本発明者らは先の特許
出願（前述）に於てデシル硫酸又はその塩、ドデシル硫
酸又はその塩、及びドデシルベンゼンスルホン酸又はそ
の塩−から成る群より選ばれた１種又は２種以上の混合
物を反応停止剤として取り上げ、これらを用いることに
より問題点が解決し得ることを見出したが、本発明に於
てもこれらの反応停止剤が停止剤としての効果になんら
変りがなく有効に使用し得ることを確認した。

反応停止剤の濃度は、１．５ｍｍｏｌ／１以上であれば
充分その機能を発揮するが、通常３〜ｔ００ｍｍｏｌ／
１が好ましく用いられる。又液性は、最終呈色液の液性
が発色反応の至適条件に合うように自由に選択できるが
、通常はＰＯＤの安定性、被酸化性呈色試薬の安定性、
呈色に適した液性などを考慮してｐＨ４〜９が好ましく
用いられる。

・　本発明のＳＯＤ活性測定法におけるＨ２Ｏ２の定量
法及びＨ２Ｏ２定量用試薬としては、従来性われている
Ｈ２Ｏ２のいずれの定量法でも、又、従来用いられてい
るＨ２Ｏ２のいずれの定量用試薬でもよく、例えばペル
オキシダーゼと被酸化性呈色試薬との組合せでＨ２Ｏ２
を定量する方法及びこれに用いる被酸化性呈色試薬その
他の定量用試薬はすべて使用可能である。かかる被酸化
性呈色試薬としては例えば、４−アミノアンチピリンと
、フェノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置換アニリン系化
合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合
物との組合せ試薬、２．２′−アジノビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、）
リフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、０
−トリジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体、トリアリ
ルイミダゾール誘導体、０−フェニレンジアミン等が挙
げられるが、これらに限定されるものではない。この他
、ＰＯＤを用いない方　　　　−法として最近開発され
た４価のチタン化合物と２−（５−ブロモ−２−ピリジ
ルアゾ）　−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピル
アミノ）フェノール又は／及びその塩との組合せ試薬を
用いる方法等もＨ２Ｏ２の定量法として使用できる。

被酸化性呈色試薬及び酸化発色後のその呈色をより安定
化させるには、本発明者らが先の特許出願に於て述べた
ように、β−シクロデキストリン又は／及びその誘導体
、若しくはγ−シクロデキストリン又は／及びその誘導
体を溶液中に共存させればよい。

これらの濃度としてはβ−シクロデキストリンは溶液中
通常０．０１〜１．５重量／容は％、γ−シクロデキス
トリンは０．１〜３重量／容量％、β−シクロデキスト
リン誘導体は０．１〜５重量／容量％、γ−シクロデキ
ストリン誘導体は０．１〜５重量／容量％が夫々用いら
れ、又、これら２種以上の化合物を上記濃度で任意の比
率で混合して用いてもよい。

シクロデキストリン誘導体としては例えば、β−ＣＤ（
−０Ｈ）１３（ＯＮＯ２）２β−ＣＤ（−０８）１９．
２（ＯＰ０３Ｈ）　１．８β−ＣＤ（−０Ｈ）１９（Ｏ
ＳＯ３Ｈ）２β−ＣＤ（−０８）ｔＢ、５（−０−ＣＨ
２−ＣＯ２Ｈ）２．５β−ＣＤ（−０Ｈ）１３．３（−
０−ＣＨ２ＣＨ２（：Ｈ２−ＳＯ３Ｈ）　１．７β−ｃ
ｌｌ（−０）１）１ｅ、５（−０−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２
−９（１３Ｈ）２．５β−（：：Ｄ（−ＱＨ）ＩＢ、０
（−０−Ｃ：Ｈ２ＣＨ２ＣＭ２−ＳＯ３Ｈ）３．。

β−ＣＤ（−０Ｈ）？　（−０ＣＨ３）１４β−Ｇ［］
（−ＱＣ：Ｈ３）２１ 等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の方法を実施するには、例えば、キサンチンを０
．１〜２０ｍｍｏｌ／］、電子伝達体１例えば１−メト
キシＦＭＳを０．００１〜Ｉ　ＩＩ１ｍｏｌ／ｌ、？Ｌ
／イミド又はマレイミド誘導体、例えばＮＥＭを２〜４
０ｍｍｏｌ／Ｉ、カルボニル化合物を１〜４０ｍｍｏｌ
／Ｉ含むＰＨ約７〜１０の緩衝液（第１試液）の一定量
に、一定量の血清を加え、３７°Ｃに加温後、キサンチ
ンオキシダーゼの反応液中濃度が１０〜２００Ｕ／ｌに
なるようにキサンチンオキシダーゼを含むｐＨ７〜１０
の緩衝液（第２試液）の一定量を加えて３７℃で一定時
間酵素反応させる。その後、反応停止剤、ＰＯＤ、被酸
化性呈色試薬、及び要すればβ−（又は／及びγ−）シ
クロデキストリン又は／及びその誘導体を含む緩衝液（
第３試液）の一定量を加えて酵素反応を停止させると同
時に生成したＨ２Ｏ２と被酸化性呈色試薬との発色反応
を開始させ、３７℃で一定時間反応させた後呈色度を測
定する。第３試液の液性は、最終呈色液の液性が被酸化
性呈色試薬の至適発色液性になるように適宜選択すれば
よい。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。

〔実施例〕

実施例　１ ［試薬］ （１）第１試液 キサンチンを３ｍｍｏｌ／ｌ、１−メトキシＦＭＳを０
．０３０１１１１０１／ｌ、　　Ｎ　Ｅ　Ｍを８ｍｍｏ
ｌ／Ｉ、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン
−５−スルホン酸（以下ＨＭＢ　Ｐと略す）を５１１１
ｍｏｌ／Ｉの濃度になるように０．０５Ｍ　）リス・塩
酸緩衝液（ｐＨ７，８５）に溶解した。

（２）第２試液 キサンチンオキシダーゼを６０Ｕ１文の濃度になるよう
に０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，８５）に溶
解した。

（３）第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを７０ｍｍｏｌ／Ｉ、　Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−トルイジンナトリウム（以下、ＴｏＯ３と略す。）
を０．１％、４−アミノアンチピリン（以下４ＡＡＰと
略す。）を０．０１％、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤ
と略す）を５００００／文の濃度になるように０．０５
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，ｏ）に溶解した。

［試料］ Ｓｉｇｍａ社製人由来Ｓ　ＯＤ　（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎ
ｕｍｂｅｒＳ　７００Ｂ）をイオン交換水で、　５．　
ＩＱ、　１５．２０．４０゜６０、８０．１００　Ｕ／
＋ａ／になるように溶嚇し調製した。

［操作法］ 試料５０４をとり、第１試液１．０ｒＲ１を加え３７℃
恒温槽中３分間加温後、第２試液１．ｏＩＲｌを加えて
更に３７℃で２０分間加温した。次いで第３試液２．０
−を加えて混和し、３７℃で５分間加温後、試料の代り
にイオン交換水を用いて同様に操作した試薬盲検を対照
として波長５５５ｎｍの吸光度を測定した。

別にイオン交換水を対照として試薬盲検の吸光度を測定
した。第１図にＳＯＤ活性値と吸光度との関係を示す、
第１図より明らかな如く、各ＳＯＤ活性値に対してプロ
ットした吸光度も結ぶ検量線は原点を通る直線となり、
検量線は良好な定量性を示している。

実施例　２ ［試薬コ （１）第１試液 実施例１の第１試液の組成から、ＨＭＢＰを除いた組成
の試液を調製した。

（２）第２試液 実施例１と同じ。

（３）第３試液 実施例１と同じ。

［試料］ Ｓｉｇｍａ社製人由来ＳＯＤをイオン交換水で４００／
ｄになるように溶解し調製した。

［操作法］ 実施例１と同じ。

比較例　１ ［試薬］ （１）第１試液 実施例１の第１試液の組成から、ＮＥＭおよびＨＭＢ　
Ｐを除いた組成の試液を調製した。

（２）第２試液 実施例１と同じ。

（３）第３試液 実施例１と同じ。

実施例２と同じ。

［操作法］ 実施例１と同じ。

比較例　２ ［試薬］ （１）第１試液 実施例１の第１試液の組成から、ＮＥＭを除いた組成の
試液を調製した。

（２）第２試液 実施例１と同じ。

（３）第３試液 実施例１と同じ。

［試料］ 実施例２と同じ。

［操作法］ 実施例１と同じ。

実施例１、実施例２、及び比較例１、比較例２の試薬盲
検の吸光度と検体（ＳＯＤを４０Ｕ／−含有）の吸光度
を表１に示す。

表　　１ （（支）試薬盲検吸光度はイオン交換水対照、検体吸光
度は試薬盲検を対照として測定した値。

表１より明らかな如く、ＮＥＭを使用した本発明方法の
実施例２の試薬盲検吸光度はＮＥＭを使用しない比較例
１のそれと比べて約４１５と小さくなっている。また、
ＮＥＭとＨＭＢＰを併用した本発明方法の実施例１では
更にその値が１７４にまで減少しており、顕著な効果を
示している。

一方、ＮＥＭを使用せず、ＨＭＢＰだけを使用した比較
例２では試薬盲検吸光度に関しては。

ＮＥＭとＨＭＢＰを併用した実施例１と殆ど同じである
が、検体吸光度もそれに伴って小さい値が出ており、感
度が低く、実用に供せないことが解る。

実施例　３ ［試薬］ （１）第１試液 キサンチンを３ｍｍａｌ／ｌ、１−メトキシＦＭＳを０
．０３ｍｍｏｌ／ｌ、　　Ｎ　Ｅ　Ｍを８ｍｍｏｌ／ｌ
、　ＨＭＢ　Ｐを５ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるように０
．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）に溶解した。

（２）第２試液 キサンチンオキシダーゼをＦ３０Ｕ／ｌの濃度になるよ
うにＯ，ＩＭリン酸ｆ！！緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解
した。

（３）第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを３５ｍｍｏｌ／Ｉ、フェノー
ルを０．１％、４ＡＡＰを０．０１％、ペルオキシダー
ゼを１３０００　Ｕ／ｌ含む水溶液を調製した。

［試料］ 実施例１に同じ。

［操作法］ 試料　１００４をとり、以下実施例１と同様に操作し、
波長５０５ｎｍの吸光度を測定した。

別にイオン交換水を対照として試薬盲検の吸光度を測定
した。

第２図にＳＯＤ活性値と吸光度との関係を示す、第２図
より明らかな如く、各ＳＯＤ活性値に対してプロットし
た吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線
は良好な定量性を示している。

実施例　４ ［試薬〕 （１）第１試液 実施例３の第１試液の組成から、ＨＭＢＰを除いた組成
の試液を調製した。

（２）第２試液 実施例３と同じ。

（３）第３試液 実施例３と同じ。

［試料］ Ｓｉｇｍａ社製人由来ＳＯＤをイオン交換水で４０Ｕ／
−になるように溶解し調製した。

［操作法］ 実施例３と同じ。

［試薬コ （１）第１試液 実施例３の第１試液の組成から、ＮＥＭおよびＨＭＢ　
Ｐを除いた組成の試液を調製した。

（２）第２試液 実施例３と同じ。

（３）第３試液 実施例３と同じ。

［試料コ 実施例４と同じ。

［操作法］ 実施例３と同じ。

比較例　４ ［試薬コ （１）第１試液 実施例３の第１試液の組成から、ＮＥＭを除いた組成の
試液を調製した。

（２）第２試液 実施例３と同じ。

（３）第３試液 実施例３と同じ。

［試料］ 実施例４と同じ。

［操作法］ 実施例３と同じ。

実施例３、実施例４．及び比較例３、比較例４の試薬盲
検の吸光度と検体（ＳｏＤを４０Ｕ／ｍ！含有）の吸光
度を表２に示す。

表　　２ （（支）試薬盲検吸光度はイオン交換水対照、検体吸光
度は試薬盲検を対照として測゛定した値。

表２より明らかな如く、ＮＥＭを使用した本発明方法の
実施例４の試薬盲検吸光度はＮＥＭを使用しない比較例
３のそれと比べて約３０％低い値が出ている。また、Ｎ
ＥＭとＨＭＢＰを併用した本発明方法の実施例３ではそ
の値が約１／３にまで下がっており、更に顕著な効果を
示している。

一方、ＮＥＭを使用せずＨＭＢＰだけを使用した比較例
４では試薬盲検吸光度に関しては、　　ＮＥＭとＨＭＢ
　Ｐを併用した実施例３と殆ど同じであるが、検体吸光
度もそれに伴って小さい値が出ており、感度が低く実用
に供せないことが解る。

実施例　５ 実施例３に於て、ＮＥＭの代りにマレイミドを用い実施
例３と全く同様に操作し、同様の結果を得た。

〔発明の効果〕

以上に詳述した如く、本発明は、より精度の高いＳＯＤ
活性測定法を提供するものであり体液、例えば血清等に
含まれるＳＯＤの活性値を、電子伝達体の存在下、ＳＯ
Ｄの作用で０２′から生成するＨ２Ｏ２を測定すること
により求める方法に於て、マレイミド又はマレイミド誘
導体を共存させ、更にこの系にカルボニル化合物を共存
させることにより、試薬盲検値及びその変動をより小さ
くして１！１４定価に影響を及ぼさないようにした点に
顕著な効果を奏する発明であって斯業に貢献するところ
大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於て得られた検量線を表わし、第
２図は、実施例２に於て得られた検量線を表わす、いず
れも、横軸の各ＳＯＤ活性値について得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人和光純薬工業株式会社 手続補正書 １、　事件の表示 昭和６０年特許願第１４４１６８号 ２　発明の名称 スーパーオキシドジスムターゼ活性測定法３、　補正を
する者 事件どの関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連結光　特許線（東京）　　置　０３−２７０−１１５
７１４　補正命令の日付 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）明細書１５頁１７行目に記載の［０，１〜２０ｍ
ｍ０１／ｌ　Ｊを、ｒ　Ｏ，０５〜２０　ｍ　ｍｏＵＩ
Ｊ　Ｊと補正する。 以上 手続補正書 昭和６１年　６月　　２日 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１４４１６８号 ２　発明の名称 スーパーオキシｒジスムターゼ活性測定法１　補正をす
る者 事件との関係　　特許出願人　　− 郵便番号　５４１ 連絡先　特許謀（東京）　　置　０３−２７０−１１５
７１５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書１１頁３行目に記載の「Ｈ２Ｏ２によシ酸
化されて」を、「Ｈ２０□と反応して」と補正する。 （２）明細書１１頁１８行目に記載の「発色剤によシ」
を、「発色剤やＰＯＤにより」と補正する。 （３）明細書１７頁２行目に記載の「３　ｍ　ｍｏｌＪ
／ｌＪをｒ　０．３ｍ　ｍｏｌＶｌ！　Ｊと補正する。 以上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子伝達
   体の存在下、これにスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ
   ＯＤ）が作用して生ずる過酸化水素を定量することによ
   り行うＳＯＤ活性測定法に於て、マレイミド又はマレイ
   ミド誘導体の共存下にこれを行うことを特徴とするＳＯ
   Ｄ活性測定法。
2. （２）スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子伝達
   体の存在下、これにスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ
   ＯＤ）が作用して生ずる過酸化水素を定量することによ
   り行うＳＯＤ活性測定法に於て、マレイミド又はマレイ
   ミド誘導体、及びカルボニル化合物の共存下にこれを行
   うことを特徴とするＳＯＤ活性測定法。
3. （３）カルボニル化合物が、芳香族ケトン化合物又は脂
   肪族ケトン化合物である特許請求の範囲第２項に記載の
   測定法。