JPH0578312B2 - - Google Patents
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- JPH0578312B2 JPH0578312B2 JP14416885A JP14416885A JPH0578312B2 JP H0578312 B2 JPH0578312 B2 JP H0578312B2 JP 14416885 A JP14416885 A JP 14416885A JP 14416885 A JP14416885 A JP 14416885A JP H0578312 B2 JPH0578312 B2 JP H0578312B2
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
〔発明の利用分野〕
本発明は、体液、例えば血清等に含まれるスー
パーオキシドジスムターゼ（以下、SODと略称
する。）活性測定法に関する。 〔発明の背景〕 自然界に於て、微生物、植物、高等動物など好
気的生物は、分子状酸素を有効に利用して生命維
持に不可欠なエネルギーを効率よく得ているが、
同時に種々の活性酸素が生成し、これが生体にさ
まざまな害を及ぼすことが知られている。例えば
活性酸素の１つであるスーパーオキシドアニオン
（以下、O2−． とする。）は炎症、発癌、老化、ま
た、核酸・酵素・脂質などの変性の原因となるな
ど、広範囲にわたり生体にとつて有害である。 SODは好気的生物のすべてに普遍的に存在し、
超酸化物不均化酸素ともよばれ、生体内のO2−．
の不均化反応、即ち、2O2−． ＋2H+→O2＋H2O2
を触媒する酵素であり、生体を酵素毒性から守つ
ている。 赤血球、白血球、組織切片中のSOD活性測定
と臨床的意義に関する報告は多いが、血清中の
SODについては蛋白成分をはじめ種々の成分が
SOD測定値に影響を及ぼす為、未だ充分な検討
はなされていない。現在行われているSOD活性
測定法は、いずれの方法もO2−． を発生させる系
とO2−． を検出する系とから構成され、SODがO2
−． の不均化を促進することによつてO2−． の生成
量が減少するのを利用したものである。 SOD活性測定法に於けるO2−． の発生系には、
超酸化化合物、例えば超酸化カリウムによりO2
−． を生成させる系や還元型補酵素と電子伝達体の
反応によりO2−． を生成させる系等もあるが、現
在、主としてキサンチンにキサンチンオキシダー
ゼを作用させる方法が一般に用いられている。こ
の反応を次に示す。 キサンチン＋O2−． ＋H2Ｏ キサンンチオキシダーゼ −−−−−−−−−→ 尿酸＋2H+＋O2−． また、O2−． の検出系には、O2−． の還元作用を
利用したニトロテトラゾリウムブルー（以下、
NO2−TBと略称する。）法、チトクロームＣ法、
O2−． の酸化作用を利用したエピネフリン法、ピ
ロガロール法、６−ヒドロキシド−パミン法など
がある。 これらSOD活性測定法の原理を、O2−． の発生
系にキサンチン、キサンチンオキシダーゼを用
い、O2−． の検出系にNO2−TB法を用いた方法を
例にとり下式に示す。
パーオキシドジスムターゼ（以下、SODと略称
する。）活性測定法に関する。 〔発明の背景〕 自然界に於て、微生物、植物、高等動物など好
気的生物は、分子状酸素を有効に利用して生命維
持に不可欠なエネルギーを効率よく得ているが、
同時に種々の活性酸素が生成し、これが生体にさ
まざまな害を及ぼすことが知られている。例えば
活性酸素の１つであるスーパーオキシドアニオン
（以下、O2−． とする。）は炎症、発癌、老化、ま
た、核酸・酵素・脂質などの変性の原因となるな
ど、広範囲にわたり生体にとつて有害である。 SODは好気的生物のすべてに普遍的に存在し、
超酸化物不均化酸素ともよばれ、生体内のO2−．
の不均化反応、即ち、2O2−． ＋2H+→O2＋H2O2
を触媒する酵素であり、生体を酵素毒性から守つ
ている。 赤血球、白血球、組織切片中のSOD活性測定
と臨床的意義に関する報告は多いが、血清中の
SODについては蛋白成分をはじめ種々の成分が
SOD測定値に影響を及ぼす為、未だ充分な検討
はなされていない。現在行われているSOD活性
測定法は、いずれの方法もO2−． を発生させる系
とO2−． を検出する系とから構成され、SODがO2
−． の不均化を促進することによつてO2−． の生成
量が減少するのを利用したものである。 SOD活性測定法に於けるO2−． の発生系には、
超酸化化合物、例えば超酸化カリウムによりO2
−． を生成させる系や還元型補酵素と電子伝達体の
反応によりO2−． を生成させる系等もあるが、現
在、主としてキサンチンにキサンチンオキシダー
ゼを作用させる方法が一般に用いられている。こ
の反応を次に示す。 キサンチン＋O2−． ＋H2Ｏ キサンンチオキシダーゼ −−−−−−−−−→ 尿酸＋2H+＋O2−． また、O2−． の検出系には、O2−． の還元作用を
利用したニトロテトラゾリウムブルー（以下、
NO2−TBと略称する。）法、チトクロームＣ法、
O2−． の酸化作用を利用したエピネフリン法、ピ
ロガロール法、６−ヒドロキシド−パミン法など
がある。 これらSOD活性測定法の原理を、O2−． の発生
系にキサンチン、キサンチンオキシダーゼを用
い、O2−． の検出系にNO2−TB法を用いた方法を
例にとり下式に示す。
本発明は、電子伝達体の共存下、O2−．
にSOD
が作用して生ずるH2O2を定量することにより行
う体液中のSOD活性の測定法に於て、試薬盲検
値の変動がなく、感度及び検量線の直線性にも優
れたより精度の高いSOD活性測定法を提供する
ことを目的とする。 〔発明の構成〕 本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質と
し、電子伝達体の存在下、これにスーパーオキシ
ドジスムターゼ（SOD）が作用して生ずる過酸
化水素を定着することにより行うSOD活性測定
法に於て、一般式〔Ａ〕
が作用して生ずるH2O2を定量することにより行
う体液中のSOD活性の測定法に於て、試薬盲検
値の変動がなく、感度及び検量線の直線性にも優
れたより精度の高いSOD活性測定法を提供する
ことを目的とする。 〔発明の構成〕 本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質と
し、電子伝達体の存在下、これにスーパーオキシ
ドジスムターゼ（SOD）が作用して生ずる過酸
化水素を定着することにより行うSOD活性測定
法に於て、一般式〔Ａ〕
【化】
（式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
わす。）で示される化合物の共存下に該測定を行
うことを特徴とするSOD活性測定法の発明であ
る。 また、本発明は、スーパーオキシドアニオンを
基質とし、電子伝達体の存在下、これにSODが
作用して生ずる過酸化水素を定量することにより
行うSOD活性測定法に於て、一般式〔Ａ〕
わす。）で示される化合物の共存下に該測定を行
うことを特徴とするSOD活性測定法の発明であ
る。 また、本発明は、スーパーオキシドアニオンを
基質とし、電子伝達体の存在下、これにSODが
作用して生ずる過酸化水素を定量することにより
行うSOD活性測定法に於て、一般式〔Ａ〕
【化】
（式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
わす。）で示される化合物、及び一般式〔Ｂ〕
わす。）で示される化合物、及び一般式〔Ｂ〕
実施例 １
［試薬］
(1) 第１試液
キサンチンを0.3mmol／１、１−メトキシPMS
を0.03mmol／１、NEMを８mmol／１，２−ヒド
ロキシ−４−メトキシベンゾフエノン−５−スル
ホン酸（以下HMBPと略す）を５mmol／１の濃
度になるように0.05Mトリス・塩酸緩衝液（PH
7.85）に溶解した。 (2) 第２試液 キサンチンオキシダーゼを60U／の濃度にな
るように0.05Mトリス・塩酸緩衝液（PH7.85）に
溶解した。 (3) 第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを70mmol／１、Ｎ−エ
チル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−ｍ−トルイジンナトリウム（以下、TOOSと略
す。）を0.1％、４−アミノアンチピリン（以下
4AAPと略す。）を0.01％、ペルオキシダーゼ
（以下PODと略す）を5000U／の濃度になるよ
うに0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）に溶解した。 ［試料］ Sigma社製人由来SOD（Product Number Ｓ
7006）をイオン交換水で、５，10，15，20，
40，60，80，100U／mlになるように溶解し調製
した。 ［操作法］ 試料50μをとり、第１試液1.0mlを加え37℃恒
温槽中３分間加温後、第２試液1.0mlを加えて更
に37℃で20分間加温した。次いで第３試液2.0ml
を加えて混和し、37℃で５分間加温後、試料の代
りにイオン交換水を用いて同様に操作した試薬盲
検を対照として波長555nmの吸光度を測定した。
別のイオン交換水を対照として試薬盲検の吸光度
を測定した。第１図にSOD活性値と吸光度との
関係を示す。第１図より明らかな如く、各SOD
活性値に対してプロツトした吸光度を結ぶ検量線
は原点を通る直線となり、検量線は良好な定量性
を示している。 実施例 ２ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例１の第１試液の組成から、HMBPを除
いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例１と同じ。 (3) 第３試液 実施例１と同じ。 ［試料］ Sigma社製人由来SODをイオン交換水で40U／
mlになるように溶解し調製した。 ［操作法］ 実施例１と同じ。 比較例 １ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例１の第１試液の組成から、NEMおよび
HMBPを除いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例１と同じ。 (3) 第３試液 実施例１と同じ。 ［試料］ 実施例２と同じ。 ［操作法］ 実施例１と同じ。 比較例 ２ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例１の第１試液の組成から、NEMを除い
た組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例１と同じ。 (3) 第３試験 実施例１と同じ。 ［試料］ 実施例２と同じ。 ［操作法］ 実施例１と同じ。 実施例１、実施例２、及び比較例１、比較例２
の試薬盲検の吸光度と検体（SODを40U／ml含
有）の吸光度を表１に示す。
を0.03mmol／１、NEMを８mmol／１，２−ヒド
ロキシ−４−メトキシベンゾフエノン−５−スル
ホン酸（以下HMBPと略す）を５mmol／１の濃
度になるように0.05Mトリス・塩酸緩衝液（PH
7.85）に溶解した。 (2) 第２試液 キサンチンオキシダーゼを60U／の濃度にな
るように0.05Mトリス・塩酸緩衝液（PH7.85）に
溶解した。 (3) 第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを70mmol／１、Ｎ−エ
チル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−ｍ−トルイジンナトリウム（以下、TOOSと略
す。）を0.1％、４−アミノアンチピリン（以下
4AAPと略す。）を0.01％、ペルオキシダーゼ
（以下PODと略す）を5000U／の濃度になるよ
うに0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）に溶解した。 ［試料］ Sigma社製人由来SOD（Product Number Ｓ
7006）をイオン交換水で、５，10，15，20，
40，60，80，100U／mlになるように溶解し調製
した。 ［操作法］ 試料50μをとり、第１試液1.0mlを加え37℃恒
温槽中３分間加温後、第２試液1.0mlを加えて更
に37℃で20分間加温した。次いで第３試液2.0ml
を加えて混和し、37℃で５分間加温後、試料の代
りにイオン交換水を用いて同様に操作した試薬盲
検を対照として波長555nmの吸光度を測定した。
別のイオン交換水を対照として試薬盲検の吸光度
を測定した。第１図にSOD活性値と吸光度との
関係を示す。第１図より明らかな如く、各SOD
活性値に対してプロツトした吸光度を結ぶ検量線
は原点を通る直線となり、検量線は良好な定量性
を示している。 実施例 ２ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例１の第１試液の組成から、HMBPを除
いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例１と同じ。 (3) 第３試液 実施例１と同じ。 ［試料］ Sigma社製人由来SODをイオン交換水で40U／
mlになるように溶解し調製した。 ［操作法］ 実施例１と同じ。 比較例 １ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例１の第１試液の組成から、NEMおよび
HMBPを除いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例１と同じ。 (3) 第３試液 実施例１と同じ。 ［試料］ 実施例２と同じ。 ［操作法］ 実施例１と同じ。 比較例 ２ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例１の第１試液の組成から、NEMを除い
た組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例１と同じ。 (3) 第３試験 実施例１と同じ。 ［試料］ 実施例２と同じ。 ［操作法］ 実施例１と同じ。 実施例１、実施例２、及び比較例１、比較例２
の試薬盲検の吸光度と検体（SODを40U／ml含
有）の吸光度を表１に示す。
【表】
(注) 試薬盲検吸光度はイオン交換水対照、検
体吸光度は試薬盲検を対照として測定した
値。
表１より明らかな如く、NEMを使用した本発
明方法の実施例２の試薬盲検吸光度はNEMを使
用しない比較例１のそれと比べて約4/5と小さく
なつている。またNEMとHMBPを併用した本発
明方法の実施例１では更にその値が1/4にまで減
少しており、顕著な効果を示している。 一方、NEMを使用せず、HMBPだけを使用し
た比較例２では試薬盲検吸光度に関しては、
NEMとHMBPを併用した実施例１と殆ど同じで
あるが、検体吸光度もそれに伴つて小さい値が出
ており、感度が低く、実用に供せないことが解
る。 実施例 ３ ［試薬］ (1) 第１試液 キサンチンを３mmol／１、１−メトキシPMS
を0.03mmol／１、NEMを８mmol／１、HMBPを
５mmol／１の濃度になるように0.1Mリン酸塩緩
衝液（PH8.0）に溶解した。 (2) 第２試液 キサンチンオキシダーゼを60U／の濃度にな
るように0.1Mリン酸塩緩衝液（PH8.0）に溶解し
た。 (3) 第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを35mmol／１、フエノ
ールを0.1％、4AAPを0.01％、ペルオキシダーゼ
を6000U／含む水溶液を調製した。 ［試料］ 実施例１に同じ。 ［操作法］ 試料100μをとり、以下実施例１と同様に操
作し、波長505nmの吸光度を測定した。 別のイオン交換水を対照として試薬盲検の吸光
度を測定した。 第２図にSOD活性値と吸光度との関係を示す。
第２図より明らかな如く、各SOD活性値に対し
てプロツトした吸光度を結ぶ検量線は原点を通る
直線となり、検量線は良好な定量性を示してい
る。 実施例 ４ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例３の第１試液の組成から、HMBPを除
いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例３と同じ。 (3) 第３試液 実施例３と同じ。 ［試料］ Sigma社製人由来SODをイオン交換水で40U／
mlになるように溶解し調製した。 ［操作法］ 実施例３と同じ。 比較例 ３ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例３の第１試液の組成から、NEMおよび
HMBPを除いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例３と同じ。 (3) 第３試液 実施例３と同じ。 ［試料］ 実施例４と同じ。 ［操作法］ 実施例３と同じ。 比較例 ４ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例３の第１試液の組成から、NEMを除い
た組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例３と同じ。 (3) 第３試液 実施例３と同じ。 ［試料］ 実施例４と同じ。 ［操作法］ 実施例３と同じ。 実施例３、実施例４、及び比較例３、比較例４
の試薬盲検の吸光度と検体（SODを40U／ml含
有）の吸光度を表２に示す。
体吸光度は試薬盲検を対照として測定した
値。
表１より明らかな如く、NEMを使用した本発
明方法の実施例２の試薬盲検吸光度はNEMを使
用しない比較例１のそれと比べて約4/5と小さく
なつている。またNEMとHMBPを併用した本発
明方法の実施例１では更にその値が1/4にまで減
少しており、顕著な効果を示している。 一方、NEMを使用せず、HMBPだけを使用し
た比較例２では試薬盲検吸光度に関しては、
NEMとHMBPを併用した実施例１と殆ど同じで
あるが、検体吸光度もそれに伴つて小さい値が出
ており、感度が低く、実用に供せないことが解
る。 実施例 ３ ［試薬］ (1) 第１試液 キサンチンを３mmol／１、１−メトキシPMS
を0.03mmol／１、NEMを８mmol／１、HMBPを
５mmol／１の濃度になるように0.1Mリン酸塩緩
衝液（PH8.0）に溶解した。 (2) 第２試液 キサンチンオキシダーゼを60U／の濃度にな
るように0.1Mリン酸塩緩衝液（PH8.0）に溶解し
た。 (3) 第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを35mmol／１、フエノ
ールを0.1％、4AAPを0.01％、ペルオキシダーゼ
を6000U／含む水溶液を調製した。 ［試料］ 実施例１に同じ。 ［操作法］ 試料100μをとり、以下実施例１と同様に操
作し、波長505nmの吸光度を測定した。 別のイオン交換水を対照として試薬盲検の吸光
度を測定した。 第２図にSOD活性値と吸光度との関係を示す。
第２図より明らかな如く、各SOD活性値に対し
てプロツトした吸光度を結ぶ検量線は原点を通る
直線となり、検量線は良好な定量性を示してい
る。 実施例 ４ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例３の第１試液の組成から、HMBPを除
いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例３と同じ。 (3) 第３試液 実施例３と同じ。 ［試料］ Sigma社製人由来SODをイオン交換水で40U／
mlになるように溶解し調製した。 ［操作法］ 実施例３と同じ。 比較例 ３ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例３の第１試液の組成から、NEMおよび
HMBPを除いた組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例３と同じ。 (3) 第３試液 実施例３と同じ。 ［試料］ 実施例４と同じ。 ［操作法］ 実施例３と同じ。 比較例 ４ ［試薬］ (1) 第１試液 実施例３の第１試液の組成から、NEMを除い
た組成の試液を調製した。 (2) 第２試液 実施例３と同じ。 (3) 第３試液 実施例３と同じ。 ［試料］ 実施例４と同じ。 ［操作法］ 実施例３と同じ。 実施例３、実施例４、及び比較例３、比較例４
の試薬盲検の吸光度と検体（SODを40U／ml含
有）の吸光度を表２に示す。
以上に詳述した如く、本発明は、より精度の高
いSOD活性測定法を提供するものであり体液、
例えば血清等に含まれるSODの活性値を、電子
伝達体の存在下、SODの作用でO2−． から生成す
るH2O2を測定することにより求める方法に於て、
マレイミド又は特定のマレイミド誘導体を共存さ
せ、更にこの系に特定のカルボニル化合物を共存
させることにより、試薬盲検値及びその変動をよ
り小さくして測定値に影響を及ぼさないようにし
た点に顕著な効果を奏する発明であつて斯業に貢
献するところ大なる発明である。
いSOD活性測定法を提供するものであり体液、
例えば血清等に含まれるSODの活性値を、電子
伝達体の存在下、SODの作用でO2−． から生成す
るH2O2を測定することにより求める方法に於て、
マレイミド又は特定のマレイミド誘導体を共存さ
せ、更にこの系に特定のカルボニル化合物を共存
させることにより、試薬盲検値及びその変動をよ
り小さくして測定値に影響を及ぼさないようにし
た点に顕著な効果を奏する発明であつて斯業に貢
献するところ大なる発明である。
第１図は、実施例１に於て得られた検量線を表
わし、第２図は、実施例２に於て得られた検量線
を表わす。いずれも、横軸の各SOD活性値につ
いて得られた吸光度を縦軸に沿つてプロツトした
点を結んだものである。
わし、第２図は、実施例２に於て得られた検量線
を表わす。いずれも、横軸の各SOD活性値につ
いて得られた吸光度を縦軸に沿つてプロツトした
点を結んだものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子
伝達体の存在下、これにスーパーオキシドジスム
ターゼ（SOD）が作用して生ずる過酸化水素を
定量することにより行うSOD活性測定法に於て、
一般式〔Ａ〕 【化】 （式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
わす。）で示される化合物の共存下に該測定を行
うことを特徴とするSOD活性測定法。 ２ スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子
伝達体の存在下、これにSODが作用して生ずる
過酸化水素を定量することにより行うSOD活性
測定法に於て、一般式〔Ａ〕 【化】 （式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
わす。）で示される化合物、及び一般式〔Ｂ〕 【化】 （式中、R1，R2及びR3は夫々独立して水素原
子、低級アルキル基、水酸基、スルホン酸基又は
低級アルコキシ基を表わす。）で示されるカルボ
ニル化合物の共存下に該測定を行うことを特徴と
するSOD活性測定法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14416885A JPS623799A (ja) | 1985-06-29 | 1985-06-29 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 |
| CA000502824A CA1272943A (en) | 1985-03-01 | 1986-02-27 | Process for determining superoxide dismutase activity |
| US06/834,971 US4801538A (en) | 1985-03-01 | 1986-02-28 | Process for determining superoxide dismutase activity |
| EP86102657A EP0193204B1 (en) | 1985-03-01 | 1986-02-28 | Process for determining superoxide dismutase activity |
| DE8686102657T DE3672272D1 (de) | 1985-03-01 | 1986-02-28 | Verfahren zur bestimmung der superoxid-dismutase-aktivitaet. |
| AT86102657T ATE54169T1 (de) | 1985-03-01 | 1986-02-28 | Verfahren zur bestimmung der superoxid-dismutase- aktivitaet. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14416885A JPS623799A (ja) | 1985-06-29 | 1985-06-29 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS623799A JPS623799A (ja) | 1987-01-09 |
| JPH0578312B2 true JPH0578312B2 (ja) | 1993-10-28 |
Family
ID=15355779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14416885A Granted JPS623799A (ja) | 1985-03-01 | 1985-06-29 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS623799A (ja) |
-
1985
- 1985-06-29 JP JP14416885A patent/JPS623799A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS623799A (ja) | 1987-01-09 |
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