JPS6240360B2 - - Google Patents
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- JPS6240360B2 JPS6240360B2 JP57079292A JP7929282A JPS6240360B2 JP S6240360 B2 JPS6240360 B2 JP S6240360B2 JP 57079292 A JP57079292 A JP 57079292A JP 7929282 A JP7929282 A JP 7929282A JP S6240360 B2 JPS6240360 B2 JP S6240360B2
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- dye
- precipitate
- azo dye
- protein
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- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0063—Ascorbate oxidase (1.10.3.3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12Y110/03003—L-ascorbate oxidase (1.10.3.3)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的活性蛋白質の精製−ないし濃
縮法及びそのために適する薬剤に関する。
縮法及びそのために適する薬剤に関する。
生物学的活性蛋白質を濃縮するための種々の濃
縮剤ないし濃縮法が公知である。適当な濃縮剤の
例は塩例えば硫酸アンモニウム、有機溶剤例えば
アセトン、無機ゲル、活性炭、交換クロマトグラ
フイ、モレキユラーシーブ、ポリエチレンイミン
等である。しかし天然の活性蛋白質及び随伴する
不純物が極めて多様であることを考えれば、分離
ないし精製を行うに当つて多様な適用可能性がな
いことは非常に不利であることが多い。蛋白質を
精製及び濃縮するための限られた数の方法及び薬
剤の中非常に僅かなものだけが特殊な場合に使用
可能であるにすぎない。その結果、不純物からの
分離を幾分かでも満足のゆく程度に行うために
は、しばしば同じ精製工程を繰返さなければなら
ない。その上殆どの場合に、達成される濃縮度が
低く、又濃縮に使用した薬剤を後から除去するた
めに特別な手段、例えば大量の液体の蒸発等が必
要である。従つて生物学的活性蛋白質を精製ない
し濃縮するための種々の公知法は大体において常
に同じ作業工程を包含し、たとえその規定は様々
であつても、非常に類似したやり方で行われる。
縮剤ないし濃縮法が公知である。適当な濃縮剤の
例は塩例えば硫酸アンモニウム、有機溶剤例えば
アセトン、無機ゲル、活性炭、交換クロマトグラ
フイ、モレキユラーシーブ、ポリエチレンイミン
等である。しかし天然の活性蛋白質及び随伴する
不純物が極めて多様であることを考えれば、分離
ないし精製を行うに当つて多様な適用可能性がな
いことは非常に不利であることが多い。蛋白質を
精製及び濃縮するための限られた数の方法及び薬
剤の中非常に僅かなものだけが特殊な場合に使用
可能であるにすぎない。その結果、不純物からの
分離を幾分かでも満足のゆく程度に行うために
は、しばしば同じ精製工程を繰返さなければなら
ない。その上殆どの場合に、達成される濃縮度が
低く、又濃縮に使用した薬剤を後から除去するた
めに特別な手段、例えば大量の液体の蒸発等が必
要である。従つて生物学的活性蛋白質を精製ない
し濃縮するための種々の公知法は大体において常
に同じ作業工程を包含し、たとえその規定は様々
であつても、非常に類似したやり方で行われる。
従つて改善された多様な適用可能性を有し、よ
り有効な蛋白質濃縮を行う生物学的活性蛋白質の
精製及び濃縮法が求められた。
り有効な蛋白質濃縮を行う生物学的活性蛋白質の
精製及び濃縮法が求められた。
本発明の課題は、蛋白質の生物学的活性を出来
るだけ損わず、より広い適用可能性を有する、生
物学的活性蛋白質の精製−ないし濃縮法及びその
ための薬剤を開発することである。
るだけ損わず、より広い適用可能性を有する、生
物学的活性蛋白質の精製−ないし濃縮法及びその
ための薬剤を開発することである。
この課題は本発明により、少なくとも１個のＮ
＝Ｎ二重結合を含む８〜10個の共役二重結合を間
に介した２個のスルホン基を有するアリールスル
ホン酸アゾ染料を、所望の蛋白質の生物学的活性
の少なくとも大部分を沈殿させる量で、所望の蛋
白質の水溶液とその等電点以下のPH値において混
合し、同沈殿物を分離し、同活性蛋白質をその等
電点以上のPH値において再び溶解することを特徴
とする、選択的沈殿剤の添加による生物学的活性
蛋白質の精製ないし濃縮法により解決される。
＝Ｎ二重結合を含む８〜10個の共役二重結合を間
に介した２個のスルホン基を有するアリールスル
ホン酸アゾ染料を、所望の蛋白質の生物学的活性
の少なくとも大部分を沈殿させる量で、所望の蛋
白質の水溶液とその等電点以下のPH値において混
合し、同沈殿物を分離し、同活性蛋白質をその等
電点以上のPH値において再び溶解することを特徴
とする、選択的沈殿剤の添加による生物学的活性
蛋白質の精製ないし濃縮法により解決される。
多くの染料が蛋白質と交互作用を行うことは公
知である。しかしそれによつて沈殿が生じると、
沈殿した錯体中に含有される蛋白質の生物学的活
性は通常完全に失われる。意想外にも本発明によ
り定義されるアゾ染料を使用する場合にはこの変
性は起らず、その上様々な蛋白質の沈殿が非常に
選択的に行われ、従つて極めてすぐれた精製−及
び濃縮効果が達成される。本発明方法が不純物と
しての塩に殆ど影響されずに行われ、従つて粗細
胞抽出物への適用に適していることは特に意想外
なことである。そのため多くの場合に、粗細胞抽
出物から所望の生物学的活性蛋白質を選択的に沈
殿させ、不純物としての異種の蛋白質の大部分及
び細胞抽出物中のその他の物質から分離すること
が可能である。醗酵液からの直接沈殿も同様に可
能である。沈殿剤のスルホン基はほぼPH２にまで
完全にイオン化されるから、沈殿に最適なPH値は
実際上専ら被精製活性蛋白質のイオン化性及びPH
安定性に依存する。一般に本発明方法は、等電点
以下でもその生物学的活性を保持する蛋白質の精
製に適する。活性蛋白質が陽イオン交換体に活性
を著しく失うことなく吸着され得るならば、一般
に上記の前提条件がみたされる。これは簡単な予
備実験で速やかに確認することが出来る。
知である。しかしそれによつて沈殿が生じると、
沈殿した錯体中に含有される蛋白質の生物学的活
性は通常完全に失われる。意想外にも本発明によ
り定義されるアゾ染料を使用する場合にはこの変
性は起らず、その上様々な蛋白質の沈殿が非常に
選択的に行われ、従つて極めてすぐれた精製−及
び濃縮効果が達成される。本発明方法が不純物と
しての塩に殆ど影響されずに行われ、従つて粗細
胞抽出物への適用に適していることは特に意想外
なことである。そのため多くの場合に、粗細胞抽
出物から所望の生物学的活性蛋白質を選択的に沈
殿させ、不純物としての異種の蛋白質の大部分及
び細胞抽出物中のその他の物質から分離すること
が可能である。醗酵液からの直接沈殿も同様に可
能である。沈殿剤のスルホン基はほぼPH２にまで
完全にイオン化されるから、沈殿に最適なPH値は
実際上専ら被精製活性蛋白質のイオン化性及びPH
安定性に依存する。一般に本発明方法は、等電点
以下でもその生物学的活性を保持する蛋白質の精
製に適する。活性蛋白質が陽イオン交換体に活性
を著しく失うことなく吸着され得るならば、一般
に上記の前提条件がみたされる。これは簡単な予
備実験で速やかに確認することが出来る。
本発明において生物学的活性蛋白質というの
は、有利に酵素活性及び免疫活性を有する蛋白質
をいう。
は、有利に酵素活性及び免疫活性を有する蛋白質
をいう。
しかし本発明方法は他の生物学的活性蛋白質、
例えばホルモン、毒素、免疫グロブリン等に対し
ても適する。
例えばホルモン、毒素、免疫グロブリン等に対し
ても適する。
本発明方法を有利に適用出来る酵素活性蛋白質
の例は、肝臓からのADH、アルドラーゼ、菌な
いし膵液からのα−アミラーゼ、アスコルバート
オキシダーゼ、ブロムエライン、α−ブンガロト
キシン、β−ブンガロトキシン、コレステリンエ
ステラーゼ、コレステリンオキシダーゼ、カルボ
キシペプチダーゼ−Ｂ、キモトリプシン、ジアフ
オラーゼ、フマラーゼ、コーヒー豆又は酵母から
のα−ガラクトシダーゼ、酵母からの６燐酸グル
コース脱水素酵素、グルタチオン還元酵素、３燐
酸グリセリン脱水素酵素、オキサラートオキシダ
ーゼ、パパイン、ホスフオリパーゼA2、ペルオ
キシダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、６−ホスフ
オグルコナート脱水素酵素、トリプシン、三炭糖
燐酸塩イソメラーゼ及びウリジン−ジホスフオグ
ルコース−ピロホスフオリラーゼである。多くの
別の酵素にも同様によく適用出来る。
の例は、肝臓からのADH、アルドラーゼ、菌な
いし膵液からのα−アミラーゼ、アスコルバート
オキシダーゼ、ブロムエライン、α−ブンガロト
キシン、β−ブンガロトキシン、コレステリンエ
ステラーゼ、コレステリンオキシダーゼ、カルボ
キシペプチダーゼ−Ｂ、キモトリプシン、ジアフ
オラーゼ、フマラーゼ、コーヒー豆又は酵母から
のα−ガラクトシダーゼ、酵母からの６燐酸グル
コース脱水素酵素、グルタチオン還元酵素、３燐
酸グリセリン脱水素酵素、オキサラートオキシダ
ーゼ、パパイン、ホスフオリパーゼA2、ペルオ
キシダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、６−ホスフ
オグルコナート脱水素酵素、トリプシン、三炭糖
燐酸塩イソメラーゼ及びウリジン−ジホスフオグ
ルコース−ピロホスフオリラーゼである。多くの
別の酵素にも同様によく適用出来る。
本発明方法においてはアゾ染料として有利に、
３・3′−（４・4′−ビフエニリレン−ビス（ア
ゾ））−ビス（４−アミノ−１−ナフタリンスルホ
ン酸）又は、１個又は複数個の低級アルキル−又
は低級アルコキシ基により置換されているその誘
導体が使用される。
３・3′−（４・4′−ビフエニリレン−ビス（ア
ゾ））−ビス（４−アミノ−１−ナフタリンスルホ
ン酸）又は、１個又は複数個の低級アルキル−又
は低級アルコキシ基により置換されているその誘
導体が使用される。
上記の有利な群の化合物は以下の一般式を有す
る： 〔式中：各Ｒは相互に無関係に水素原子、C1-4−
アルキル基又はC1-4−アルコキシ基を表わす〕。
る： 〔式中：各Ｒは相互に無関係に水素原子、C1-4−
アルキル基又はC1-4−アルコキシ基を表わす〕。
それら有利な群の一般的な例は市販の染料、コ
ンゴーレツド（C.I.22120）及びベンゾプルプリ
ン10B（C.I.23560）である。
ンゴーレツド（C.I.22120）及びベンゾプルプリ
ン10B（C.I.23560）である。
アゾ染料の更に別の有利な群は２・2′−〔（ジア
ゾアミノ）−ジ−ｐ−フエニレン〕−ビス（７−ベ
ンゾチアゾールスルホン酸）及び、１個又は複数
個の低級アルキル−及び／又は低級アルコキシ基
を有するその誘導体である。
ゾアミノ）−ジ−ｐ−フエニレン〕−ビス（７−ベ
ンゾチアゾールスルホン酸）及び、１個又は複数
個の低級アルキル−及び／又は低級アルコキシ基
を有するその誘導体である。
それら有利な群の化合物は以下の一般式を有す
る： 〔式中：各Ｒは相互に無関係に水素原子、C1-4−
アルキル基又はC1-4−アルコキシ基を表わす〕。
る： 〔式中：各Ｒは相互に無関係に水素原子、C1-4−
アルキル基又はC1-4−アルコキシ基を表わす〕。
それら有利な群の一般的な例はチアゾールイエ
ローＧ（C.I.19540）である。
ローＧ（C.I.19540）である。
染料は溶解した形で添加される。0.05〜５％溶
液（使用されるアゾ染料の溶解性に依存して）が
良く適することが立証されたが、稀釈度のより大
きい溶液を使用することも可能である。しかしそ
の場合には通常不必要に多量の水が導入されるこ
とになる。適当な染料の量は沈殿させるべき蛋白
質の量に依存する。一般にその量は約0.01〜約
2.0％ｗ／ｖ、有利には0.05〜0.2％染料ｗ／ｖ溶
液の範囲である。
液（使用されるアゾ染料の溶解性に依存して）が
良く適することが立証されたが、稀釈度のより大
きい溶液を使用することも可能である。しかしそ
の場合には通常不必要に多量の水が導入されるこ
とになる。適当な染料の量は沈殿させるべき蛋白
質の量に依存する。一般にその量は約0.01〜約
2.0％ｗ／ｖ、有利には0.05〜0.2％染料ｗ／ｖ溶
液の範囲である。
上記した様にPH条件は活性蛋白質の等電点に依
存する。一般に約２〜約９のPH値が該当する。
存する。一般に約２〜約９のPH値が該当する。
上記した様に、沈殿物を溶解するためにはPH値
を等電点以上に上げることが必要である。従つて
一般に、分離した沈殿物をPH値が約４〜約10の緩
衝液を用いて再溶解する。次いでその様に得られ
た溶液から染料を常法で除去することが出来る。
染料除去法の例は、多陽イオンを使用する染料の
沈殿、塩例えば硫酸アンモニウム又は有機溶剤例
えばアセトンの添加による活性蛋白質の沈殿、陰
イオン交換体例えばジエチルアミノエチル基を含
有する炭水化物重合体又は疎水性重合体例えばポ
リビニル−ポリピロリドンへの染料の吸着、透析
又は限外濾過である。適当な多陽イオンの例はポ
リエチレンイミンである。
を等電点以上に上げることが必要である。従つて
一般に、分離した沈殿物をPH値が約４〜約10の緩
衝液を用いて再溶解する。次いでその様に得られ
た溶液から染料を常法で除去することが出来る。
染料除去法の例は、多陽イオンを使用する染料の
沈殿、塩例えば硫酸アンモニウム又は有機溶剤例
えばアセトンの添加による活性蛋白質の沈殿、陰
イオン交換体例えばジエチルアミノエチル基を含
有する炭水化物重合体又は疎水性重合体例えばポ
リビニル−ポリピロリドンへの染料の吸着、透析
又は限外濾過である。適当な多陽イオンの例はポ
リエチレンイミンである。
作業工程中に生成する活性蛋白質−アゾ染料−
錯体はすべての試験例において良好な濾過性を有
することが立証された。本発明方法が高度の選択
性を有するために、多くの場合所望の被精製活性
蛋白質の沈殿の前に別の蛋白質及び不純物質の沈
殿が先行し、従つて容易に分離可能である。これ
が本発明による濃縮の特別な利点である。被精製
蛋白質の前に沈殿する物質はその性質のために容
易に又完全に分離出来る。同じことが精製される
べき活性蛋白質自体の沈殿に対しても言える。同
被精製活性蛋白質も濾過又は遠心分離により、溶
液中になお存在する不純物から容易に分離するこ
とが出来る。
錯体はすべての試験例において良好な濾過性を有
することが立証された。本発明方法が高度の選択
性を有するために、多くの場合所望の被精製活性
蛋白質の沈殿の前に別の蛋白質及び不純物質の沈
殿が先行し、従つて容易に分離可能である。これ
が本発明による濃縮の特別な利点である。被精製
蛋白質の前に沈殿する物質はその性質のために容
易に又完全に分離出来る。同じことが精製される
べき活性蛋白質自体の沈殿に対しても言える。同
被精製活性蛋白質も濾過又は遠心分離により、溶
液中になお存在する不純物から容易に分離するこ
とが出来る。
本発明の更なる目的は、生物学的活性蛋白質を
その水溶液から、生物学的活性の損失なく選択的
に沈殿させるための薬剤である。同薬剤は少なく
とも１個のＮ＝Ｎ二重結合を含む８〜10個の共役
二重結合を間に介した２個のスルホン基を有する
アリールスルホン酸アゾ染料を含有するか又はそ
れから構成されていることを特徴とする。この種
の有利な薬剤はアゾ染料として３・3′（４・4′−
ビフエニリレン−ビス（アゾ））−ビス（４−アミ
ノ−１−ナフタリンスルホン酸）及び／又は１個
又は複数個の低級アルキル−又は低級アルコキシ
基により置換されているその誘導体を含有する。
更に別の有利な薬剤は２・2′−〔（ジアゾアミノ）
−ジ−ｐ−フエニレン〕−ビス（７−ベンゾチア
ゾールスルホン酸）及び／又は１個又は複数個の
低級アルキル−及び／又は低級アルコキシ基を有
するその誘導体を含有する。
その水溶液から、生物学的活性の損失なく選択的
に沈殿させるための薬剤である。同薬剤は少なく
とも１個のＮ＝Ｎ二重結合を含む８〜10個の共役
二重結合を間に介した２個のスルホン基を有する
アリールスルホン酸アゾ染料を含有するか又はそ
れから構成されていることを特徴とする。この種
の有利な薬剤はアゾ染料として３・3′（４・4′−
ビフエニリレン−ビス（アゾ））−ビス（４−アミ
ノ−１−ナフタリンスルホン酸）及び／又は１個
又は複数個の低級アルキル−又は低級アルコキシ
基により置換されているその誘導体を含有する。
更に別の有利な薬剤は２・2′−〔（ジアゾアミノ）
−ジ−ｐ−フエニレン〕−ビス（７−ベンゾチア
ゾールスルホン酸）及び／又は１個又は複数個の
低級アルキル−及び／又は低級アルコキシ基を有
するその誘導体を含有する。
本発明は多くの利点を有する。上記した様に本
発明方法においては、溶液中の塩による沈殿への
影響が比較的僅少であり、従つて不純物を非常に
多く含有する溶液、例えば醗酵液及び細胞抽出溶
液も本発明方法により直接処理することが出来
る。更に本発明方法で要する沈殿剤の量は僅少で
あり、そのため多くの場合、従来必要であつた大
量の有機溶剤が節約される。ある典型的な事例に
おいて、従来は粗抽出物の予備精製のために60％
のアセトンないしメタノール濃度を必要とした。
これは粗抽出物1000に対し有機溶剤1500を要
することになる。これに対して本発明によれば染
料１Kgで沈殿が行われ、同時に著しく改善された
精製、すなわち随伴不純物からの分離を達成する
ことが出来る。
発明方法においては、溶液中の塩による沈殿への
影響が比較的僅少であり、従つて不純物を非常に
多く含有する溶液、例えば醗酵液及び細胞抽出溶
液も本発明方法により直接処理することが出来
る。更に本発明方法で要する沈殿剤の量は僅少で
あり、そのため多くの場合、従来必要であつた大
量の有機溶剤が節約される。ある典型的な事例に
おいて、従来は粗抽出物の予備精製のために60％
のアセトンないしメタノール濃度を必要とした。
これは粗抽出物1000に対し有機溶剤1500を要
することになる。これに対して本発明によれば染
料１Kgで沈殿が行われ、同時に著しく改善された
精製、すなわち随伴不純物からの分離を達成する
ことが出来る。
以下の実施例は本発明を詳述するものである。
例 １
市販の親液化粗リパーゼを0.01モルの酢酸ナト
リウム（PH3.6）中に活性量約650U／mlで溶か
す。同溶液にコンゴーレツド0.3mg／mlを２％水
溶液の形で添加する。出発活性の約70％を含有す
る沈殿物を得る。液中に確認される残余活性量は
僅少である。同沈殿物を濾別し、同じ緩衝液で後
洗浄し、PH5.0の緩衝液に再び溶解する。10％の
ポリエチレンイミン溶液を滴加することにより染
料が定量的に沈殿する。その場合上記沈殿物中の
全活性量は液中に存在する。
リウム（PH3.6）中に活性量約650U／mlで溶か
す。同溶液にコンゴーレツド0.3mg／mlを２％水
溶液の形で添加する。出発活性の約70％を含有す
る沈殿物を得る。液中に確認される残余活性量は
僅少である。同沈殿物を濾別し、同じ緩衝液で後
洗浄し、PH5.0の緩衝液に再び溶解する。10％の
ポリエチレンイミン溶液を滴加することにより染
料が定量的に沈殿する。その場合上記沈殿物中の
全活性量は液中に存在する。
この実験をベンゾプルプリン10Bで繰返すと、
実際上同じ結果が得られる。
実際上同じ結果が得られる。
例 ２
0.01モルの燐酸カリウム／酢酸塩−緩衝液（PH
4.6）中のアスコルバートオキシダーゼ含有粗抽
出物（液中のアスコルバートオキシダーゼ含有量
約20U／ml）を２％水溶液の形のコンゴーレツド
0.4mg／mlと混合する。生成した沈殿物を分離す
る。液中の残余活性量は１％である。同沈殿物を
0.05モルの燐酸カリウム−緩衝液（PH7.6）に溶
かす。その様にして出発活性量の約60％を溶液中
に得る。染料は例１に記載の方法で分離すること
が出来る。
4.6）中のアスコルバートオキシダーゼ含有粗抽
出物（液中のアスコルバートオキシダーゼ含有量
約20U／ml）を２％水溶液の形のコンゴーレツド
0.4mg／mlと混合する。生成した沈殿物を分離す
る。液中の残余活性量は１％である。同沈殿物を
0.05モルの燐酸カリウム−緩衝液（PH7.6）に溶
かす。その様にして出発活性量の約60％を溶液中
に得る。染料は例１に記載の方法で分離すること
が出来る。
例 ３
精製したコレステリンエステラーゼを0.05モル
の燐酸カリウム−緩衝液（PH４）中に約75U／ml
の活性濃度で溶かす。その様に得られた溶液にコ
ンゴーレツド１mg／ml溶液を添加し、生成した沈
殿物を分離する。液中の活性量は出発量の１％で
あり、沈殿物中のそれは99％である。同沈殿物を
0.1モルの燐酸カリウム−緩衝液（PH６）中に溶
かすことにより、沈殿物中に含有されていた活性
量100％を再び溶液中に得る。
の燐酸カリウム−緩衝液（PH４）中に約75U／ml
の活性濃度で溶かす。その様に得られた溶液にコ
ンゴーレツド１mg／ml溶液を添加し、生成した沈
殿物を分離する。液中の活性量は出発量の１％で
あり、沈殿物中のそれは99％である。同沈殿物を
0.1モルの燐酸カリウム−緩衝液（PH６）中に溶
かすことにより、沈殿物中に含有されていた活性
量100％を再び溶液中に得る。
出発溶液に0.3モルの塩化ナトリウムを添加す
る以外は上記の方法を繰返す。結果は同様であ
る。
る以外は上記の方法を繰返す。結果は同様であ
る。
例 ４
約100U／mg親液物質の比活性を有する予備精
製されたペルオキシダーゼを0.02モルの酢酸ナト
リウム−緩衝液（PH3.5）中に100U／mlの濃度で
溶かす。同溶液にベンゾプルプリン１mg／mlを１
％水溶液の形で添加する。生成した沈殿物を分離
する。液中にはPODの出発活性の５％が残留す
る。同沈殿物を0.1モルの燐酸カリウム−緩衝液
（PH7.6）に再び溶かす。溶液中には出発活性量の
86％が存在する。
製されたペルオキシダーゼを0.02モルの酢酸ナト
リウム−緩衝液（PH3.5）中に100U／mlの濃度で
溶かす。同溶液にベンゾプルプリン１mg／mlを１
％水溶液の形で添加する。生成した沈殿物を分離
する。液中にはPODの出発活性の５％が残留す
る。同沈殿物を0.1モルの燐酸カリウム−緩衝液
（PH7.6）に再び溶かす。溶液中には出発活性量の
86％が存在する。
例 ５
塩含有約0.1モルの膵液からの粗抽出物の形の
ホスフオリパーゼA2を酢酸でPH4.3に調整する。
同溶液は活性量110U／ml（比活性約15U／mg蛋
白質）を含有する。同溶液を２％溶液の形のコン
ゴーレツド2.2mg／mlと混合し、生成した沈殿物
を遠心分離する。液中に残留する活性量は７％で
ある。同沈殿物を0.1モルの燐酸カリウム−緩衝
液（PH7.0）に溶かし、ポリエチレンイミンを用
いて染料を沈殿させる。染料沈殿物の遠心分離後
に液中には出発活性量の92％（比活性：55U／mg
蛋白質）が含まれる。
ホスフオリパーゼA2を酢酸でPH4.3に調整する。
同溶液は活性量110U／ml（比活性約15U／mg蛋
白質）を含有する。同溶液を２％溶液の形のコン
ゴーレツド2.2mg／mlと混合し、生成した沈殿物
を遠心分離する。液中に残留する活性量は７％で
ある。同沈殿物を0.1モルの燐酸カリウム−緩衝
液（PH7.0）に溶かし、ポリエチレンイミンを用
いて染料を沈殿させる。染料沈殿物の遠心分離後
に液中には出発活性量の92％（比活性：55U／mg
蛋白質）が含まれる。
例 ６
沈殿のために３・3′−［３・3′−ジメチル−
４・4′−ビフエニレン−ビス（アゾ）］−ビス（４
−ビロキシ−ナフタリンスルホン酸）（式Ｉ：共
役二重結合10個を有する）のNa塩を使用する： この染料の製造は常法により行われる。このた
めに第１段階で酸中の亜硝酸ナトリウムを用いて
トロイジンにテトラアゾ化を実施する。次に常法
でナフトールスルホン酸のNa塩でカツプリング
を行う。
４・4′−ビフエニレン−ビス（アゾ）］−ビス（４
−ビロキシ−ナフタリンスルホン酸）（式Ｉ：共
役二重結合10個を有する）のNa塩を使用する： この染料の製造は常法により行われる。このた
めに第１段階で酸中の亜硝酸ナトリウムを用いて
トロイジンにテトラアゾ化を実施する。次に常法
でナフトールスルホン酸のNa塩でカツプリング
を行う。
GOD（グルコースオキシダーゼ）の精製
GOD13U／mlを有するアスペルギルス・ニゲル
（Aspergillus niger）からの粗抽出物を式の染
料0.5mg／mlと混合する。PH3.7での沈殿後の液中
にはGOD約１％が残存している。同沈殿物を
0.03モルの燐カリウム（PH７）に溶かす。過剰染
料の分離後にGODの出発活性量のなお73％が得
られる。
（Aspergillus niger）からの粗抽出物を式の染
料0.5mg／mlと混合する。PH3.7での沈殿後の液中
にはGOD約１％が残存している。同沈殿物を
0.03モルの燐カリウム（PH７）に溶かす。過剰染
料の分離後にGODの出発活性量のなお73％が得
られる。
例 ７
この場合には式（共役二重結合８個を有す
る）： で示される染料を使用する。
る）： で示される染料を使用する。
同染料の製造は、常法により例６で記載したよ
うに行う。例６と同じ条件下で式の染料0.15
mg／mlを加えてGOD活性量が沈殿されうる（PH
3.7）。沈殿物を0.03モル燐酸カリウム（PH７）に
溶かすと、GODの活性量のなお91％が得られ
る。
うに行う。例６と同じ条件下で式の染料0.15
mg／mlを加えてGOD活性量が沈殿されうる（PH
3.7）。沈殿物を0.03モル燐酸カリウム（PH７）に
溶かすと、GODの活性量のなお91％が得られ
る。
例 ８
31U／mlのGODを含有するアスペルギルス・ニ
ゲルからの粗抽出物を、0.1％水溶液の形のベン
ゾプルプリン−10B 0.12mg／mlと混合する。遠心
分離後の上澄み液中にはPH3.5でなお７％のGOD
が検出される。沈殿物を0.05モルの燐酸カリウム
（PH７）で溶かし、例１で記載したようにして過
剰の染料を分離する。液中にはGODの出発活性
量の90％が得られる。
ゲルからの粗抽出物を、0.1％水溶液の形のベン
ゾプルプリン−10B 0.12mg／mlと混合する。遠心
分離後の上澄み液中にはPH3.5でなお７％のGOD
が検出される。沈殿物を0.05モルの燐酸カリウム
（PH７）で溶かし、例１で記載したようにして過
剰の染料を分離する。液中にはGODの出発活性
量の90％が得られる。
例 ９
GOD49U／mlを有するアスペルギルス・ニゲル
からの粗抽出物を、１％溶液の形のチアゾールイ
エローG0.2mgと混合する。上澄み液中にはPH3.5
でなお10％のGOD活性量が検出される。0.1モル
の燐酸カリウム緩衝液（PH７）で溶かした状態は
GODの出発活性量の約75％を含む。
からの粗抽出物を、１％溶液の形のチアゾールイ
エローG0.2mgと混合する。上澄み液中にはPH3.5
でなお10％のGOD活性量が検出される。0.1モル
の燐酸カリウム緩衝液（PH７）で溶かした状態は
GODの出発活性量の約75％を含む。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 選択的沈殿剤の添加により生物学的活性蛋白
質を精製ないし濃縮するに当り、少なくとも１個
のＮ＝Ｎ二重結合を含む８〜10個の共役二重結合
を間に介した２個のスルホン基を有するアリール
スルホン酸アゾ染料を、所望の活性蛋白質の生物
学的活性の少なくとも大部分を沈殿させる量で、
所望の蛋白質の水溶液とその等電点以下のPH値に
おいて混合し、生成した沈殿物を分離し、活性蛋
白質をその等電点以上のPH値において再び溶解す
ることを特徴とする、生物学的活性蛋白質を精製
ないし濃縮するための方法。 ２ アゾ染料として、３・3′−（４・4′−ビフエ
ニリレン−ビス（アゾ））−ビス（４−アミノ−１
−ナフタリンスルホン酸）又は、１個又は複数個
の低級アルキル−又は低級アルコキシ基により置
換されているその誘導体を使用する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３ コンゴーレツド（C.I.22120）又はベンゾプ
ルプリン−10B（C.I.23560）を使用する特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ４ アゾ染料として、２・2′−〔（ジアゾアミノ）
−ジ−ｐ−フエニレン〕−ビス（７−ベンゾチア
ゾールスルホン酸）又は、１個又は複数個の低級
アルキル−及び／又は低級アルコキシ基を有する
その誘導体を使用する特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ５ チアゾールイエローＧ（C.I.19540）を使用
する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 染料を0.01〜2.0％ｗ／ｖの量で添加する特
許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記
載の方法。 ７ アゾ染料を0.05〜５％溶液の形で添加する特
許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記
載の方法。 ８ ２〜９のPH値において沈殿を行う特許請求の
範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方
法。 ９ 分離した沈殿物をPH4.5〜10の緩衝液に溶か
す特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項
に記載の方法。 １０ 沈殿物を溶かして得られた溶液に多陽イオ
ン又は吸着剤を添加することによるか、有機溶剤
又は塩を用いて活性蛋白質を沈殿させることによ
るか、又は透析ないしは限外濾過により染料を活
性蛋白質から分離する特許請求の範囲第１項〜第
９項のいずれか１項に記載の方法。 １１ 生物学的活性蛋白質をその水溶液から、生
物学的活性の損失なく、選択的に沈殿させるため
の薬剤において、少なくとも１個のＮ＝Ｎ二重結
合を含む８〜10個の共役二重結合を間に介した２
個のスルホン基を有するアリールスルホン酸アゾ
染料を含有するか又はそれから構成されることを
特徴とする、生物学的活性蛋白質を精製ないし濃
縮するために適する薬剤。 １２ アゾ染料として３・3′−（４・4′−ビフエ
ニリレン−ビス（アゾ））−ビス（４−アミノ−１
−ナフタリンスルホン酸）又は、１個又は複数個
の低級アルキル−及び／又は低級アルコキシ基に
より置換されているその誘導体を使用する特許請
求の範囲第１１項記載の薬剤。 １３ アゾ染料として２・2′−〔（ジアゾアミノ）
−ジ−ｐ−フエニレン〕−ビス（７−ベンゾチア
ゾールスルホン酸）又は、１個又は複数個の低級
アルキル−及び／又は低級アルコキシ基を有する
その誘導体を使用する特許請求の範囲第１１項記
載の薬剤。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813119453 DE3119453A1 (de) | 1981-05-15 | 1981-05-15 | Verfahren zum reinigen bzw. anreichern von biologisch aktiven proteinen und hierzu geeignetes mittel |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57193494A JPS57193494A (en) | 1982-11-27 |
| JPS6240360B2 true JPS6240360B2 (ja) | 1987-08-27 |
Family
ID=6132447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57079292A Granted JPS57193494A (en) | 1981-05-15 | 1982-05-13 | Method of purifying or concentrating biologically active protein and drug therefor |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4451487A (ja) |
| EP (1) | EP0065286B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57193494A (ja) |
| AT (1) | ATE22651T1 (ja) |
| DE (2) | DE3119453A1 (ja) |
| DK (1) | DK164916C (ja) |
| ZA (1) | ZA823339B (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02132163U (ja) * | 1989-04-10 | 1990-11-02 | ||
| JPH0311159U (ja) * | 1989-06-20 | 1991-02-04 | ||
| JPH0464651U (ja) * | 1990-10-17 | 1992-06-03 | ||
| JPH07217721A (ja) * | 1994-02-04 | 1995-08-15 | Shinano Kenshi Co Ltd | 歯車とその取付構造 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743550A (en) * | 1985-04-29 | 1988-05-10 | Union Carbide Corporation | Method for improving the partition coefficient in enzyme-containing systems having at least two phases |
| NZ216094A (en) * | 1985-05-15 | 1989-06-28 | Commw Serum Lab Commission | Method for purification of an immunoglobulin |
| US5597485A (en) * | 1988-05-13 | 1997-01-28 | Vilmax S.A. | Process for separating proteins |
| US5182369A (en) * | 1990-02-28 | 1993-01-26 | Monsanto Company | Method for purifying somatotropin monomers |
| JP3321984B2 (ja) * | 1994-05-17 | 2002-09-09 | 味の素株式会社 | 蛋白塩酸加水分解物製造工程での改善された食塩分離法 |
| DE102005001362A1 (de) * | 2005-01-11 | 2006-07-20 | Protagen Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung von Proteinen |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3098015A (en) * | 1961-01-21 | 1963-07-16 | Kabi Ab | Enzyme purification |
| US3580840A (en) * | 1969-03-18 | 1971-05-25 | Litton Systems Inc | Process for treating sewage and other contaminated waters |
| US3728224A (en) * | 1970-11-12 | 1973-04-17 | Miles Lab | Enzyme purification process |
| SE356735B (ja) * | 1970-12-02 | 1973-06-04 | Svenska Cellulosa Ab | |
| DE2966596D1 (en) * | 1978-01-24 | 1984-03-08 | Secr Defence | Improvements in or relating to media for affinity chromatography |
| DK151634C (da) * | 1978-09-29 | 1988-06-20 | Mitsubishi Chem Ind | Fremgangsmaade til rensning af langkaedet acyl-coenzym-a-syntetase |
-
1981
- 1981-05-15 DE DE19813119453 patent/DE3119453A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-05-12 EP EP82104186A patent/EP0065286B1/de not_active Expired
- 1982-05-12 DE DE8282104186T patent/DE3273606D1/de not_active Expired
- 1982-05-12 US US06/377,277 patent/US4451487A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-05-12 AT AT82104186T patent/ATE22651T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-05-13 JP JP57079292A patent/JPS57193494A/ja active Granted
- 1982-05-14 DK DK218582A patent/DK164916C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-05-14 ZA ZA823339A patent/ZA823339B/xx unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02132163U (ja) * | 1989-04-10 | 1990-11-02 | ||
| JPH0311159U (ja) * | 1989-06-20 | 1991-02-04 | ||
| JPH0464651U (ja) * | 1990-10-17 | 1992-06-03 | ||
| JPH07217721A (ja) * | 1994-02-04 | 1995-08-15 | Shinano Kenshi Co Ltd | 歯車とその取付構造 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0065286A2 (de) | 1982-11-24 |
| ZA823339B (en) | 1983-04-27 |
| DE3273606D1 (en) | 1986-11-13 |
| DK218582A (da) | 1982-11-16 |
| DK164916C (da) | 1993-02-01 |
| DK164916B (da) | 1992-09-07 |
| EP0065286B1 (de) | 1986-10-08 |
| EP0065286A3 (en) | 1984-06-13 |
| DE3119453A1 (de) | 1982-12-09 |
| JPS57193494A (en) | 1982-11-27 |
| US4451487A (en) | 1984-05-29 |
| ATE22651T1 (de) | 1986-10-15 |
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