JPS6236040B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は消化管の配糖体ヒドロラーゼ特に膵臓
からのα−アミラーゼの新規な抑制因子に関す
る。本発明はさらに特定の微生物ストレプトミセ
ス・テンダエ（Streptomyces tendae）4158菌株
ならびにその変種および突然変異性の醗酵による
かかる抑制因子の製造、上記微生物菌株自体およ
びまた醗酵混合物からの前記抑制因子の取得法な
らびにその精製法に関する。

微生物特にアクチノミセス科の微生物からの配
糖体ヒドロラーゼの抑制因子はすでに知られてい
る。これまで詳細に調査された物質は化学的には
寡糖類あるいは多糖類の種類に属する。恐らくペ
プチド性質を有する相当する抑制因子は、熱に不
安定であり、トリプシンによりいくぶん容易に不
活性化されそしてなかんずく比較的活性が低いこ
とが報告されている。

今や、ストレプトミセス・テンダエ、4158菌株
の醗酵物中に、膵臓からのα−アミラーゼに対す
る高活性の阻止物質が見出された。この物質は化
学的にペプチドに分類される。

この抑制因子は分子量5000〜10000，276nmに
おける最大UV吸収、等電点4.4そして後記に示さ
れるようなアミノ酸組成を有することを特徴とす
る。

本発明による抑制因子は比較的高い分子量を有
する。これは拡散しないかあるいは商業上慣用の
ビスキング（Visking）（登録商標）管のような
透析膜によりせいぜい非常にわずかに拡散するの
みである。正確な分子量の測定は云うまでもなく
困難であつて種々の測定法により異なつた結果が
得られる。分子量測定に分析用超遠心分離器（バ
イオヘミツシエス・タツシエンブーフ
（Biochemischees Tacchenbuch）、第２部第746
〜767頁参照）を用いる場合には約10000という値
が得られる。他方セフアデツクス（Sephadex）
（登録商標）Ｇ−50スーパーフアインのような分
子ふるいが用いられる場合には5000あるいはそれ
以下の分子量さえ算出される。従つて、現在まで
の調査結果に基き5000〜10000の分子量が採用さ
れる。

本発明による化合物は無色の物質である。しか
しこれは紫外線を276nmで最大吸収し、281nmで
シヨルダーを示す。Ｅ^１％_１cm＝16。添付の第１図は
紫外線吸収スペクトルを示す。

この抑制因子はその化学構造によればペプチド
である。これは加水分解によりアミノ酸に分解さ
れ得る。これらアミノ酸以外のその他の構成要素
は未だ確認されていない。アミノ酸組成をムーア
（St.Moore）およびシユタイン（W.H.Stein）氏
等により記載されている方法〔メソツズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、
第巻、第819〜831頁（Colovickおよび
Kaplan）氏編、アカデミツク・プレス、ニユー
ヨーク、ロンドン、1963年参照〕を用いて測定す
ると、以下の組成が見出される。

アスパラギン酸 ５〜６ スレオニン ５〜６ セ リ ン ３〜５ グルタミン酸 ５〜６ プロリン ２〜３ アラニン ５〜６ グリシン ５〜６ システイン ３〜４ バ リ ン ５〜６ イソロイシン １〜２ ロイシン ３〜４ チロシン ４〜５ フエニルアラニン ０〜２ ヒスチジン １〜２ リ ジ ン ０〜１ アルギニン ２〜３ トリプトフアン １〜２ トリプトフアンの値は紫外線吸収から算出され
る。アミノ酸分析の結果が常に唯一の完全な量比
を意味するものではないこと、およびこのような
測定が一般にある種の誤差を伴なうものであると
いうことは自明である。それゆえ、計算に示され
ている変動限界は抑制因子の不均一性に基くので
はなく、分析法のさけられない測定上の不正確さ
に基く。本発明による抑制因子の特徴はアミノ酸
アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、グ
リシン、アラニンおよびバリンがペプチドの平均
以上に高い分子部分を占めることおよび純粋物質
中にメチオニンが全く欠落しているように見える
ことである。メチオニンは広く知られているアミ
ノ酸であるから、それが実質上存在しないことは
本発明による抑制因子の良い特徴の指標であり、
特にまた富化工程において生成物の純度測定に役
立つ。

本発明による抑制因子はペプチド試薬に対して
は陽性に反応するがフエノール−硫酸との反応は
陰性である。

本発明によるα−アミラーゼ抑制因子は何ら糖
部分を包含していない。この点において、ならび
にそのアミノ酸組成、その分子量およびその等電
点によりこれはすべての既知α−アミラーゼ抑制
因子と区別される。この抑制因子の純粋な製剤は
２〜３×10⁶AIE／ｇの活性を示す。

ペプチド性質を有する物質に対して、本発明の
アミラーゼ抑制因子は顕著な熱的安定性を示す。
中性あるいは弱酸性媒質（PH約４〜８）中で１分
間煮沸してもその配糖体ヒドロラーゼ阻止性質に
著しい影響を及ぼさない。

この抑制因子は他の蛋白と比較してペプシン、
トリプシンあるいはキモトリプシンにより非常に
徐々にのみ蛋白分解的に不活性化される。従つて
治療作用期間中消化管中において認め得る活性減
退は予期されない。

抑制因子は高い作用特異性を示す。膵臓からの
α−アミラーゼは特別に強く阻止されるのに対し
て他方細菌性α−アミラーゼ例えば枯草菌からの
それは計測され得るほどには抑制されない。同様
にβ−アミラーゼに対しては何ら作用が観察され
ない。

確かに本発明によるアミラーゼ抑制因子の極小
量は膵臓のアミラーゼの酵素的活性を完全に阻止
するに至る。この事実は、酵素触媒作用の阻止が
抑制因子と基質（でんぷん）との相対的量比に基
づく古典的阻止機構では説明されない。ところが
本発明による抑制因子により膵臓アミラーゼの不
可逆的不活性化が起こることが予想された。

本発明によれば、アミラーゼ抑制因子の製造に
はストレプトミセス・テンダエ4158株が用いられ
る。胞子は球状で直径１μを有する。この菌株の
性質は次のとおりである。

基質菌糸体の色 黄褐色、PH転移による変色なし 胞子化した気菌糸体の色 灰褐色（ISCC色表示
法によれば淡灰赤褐色） 胞子鎖の形態学 外皮皮帯 孔（RA） 胞子形態学 平均直径１μの球状胞子、平滑ない
しわずかに疣状の表面 ペプトン媒質上でのメラニン形成 陽 性 硝酸塩還元 陽 性 基質利用スペクトル グルコース ＋＋ アラビノース ＋ サツカロース ＋ キシロース ＋ イノシトール ＋＋ マンニトール ＋＋ フルクトース ＋ ラムノース ＋＋ ラフイノース ＋− セルロース − ストレプトミセス・テンダエ4158株はアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（ATCC）に寄託番号第31210号としてさらに微生
物工業技術研究所においてPHARM Ｐ−4436と
して受託されている。

醗酵は25〜35℃なかんずく28〜30℃で、振盪培
養器に浸してあるいは種々のサイズの醗酵容器中
撹拌下通気して行われ得る。

培地としては炭素源および窒素源の組み合わせ
が特に適当であることがわかつている。かかる培
地の１種は例えば微生物の培養に慣用に用いられ
る無機塩のほかに、少くとも１種の、でんぷん、
グルコース、蔗糖、フルクトース、乳糖、グリセ
リンあるいは糖密のような炭素源ならびに少くと
も１種の、大豆粉、コーンステイーブリカー、酵
母エキス、綿実粉、落花生粉、ペプトン、乳粉
末、硝酸塩あるいはアンモニウム塩のような窒素
源を包含している。

最適な組成としては（溶液中の重量％として）
可溶性でんぷん３‐５％、コーンステイーブリカ
ー0.2〜0.6％、グルコース0.5〜1.5％、
（NH₄）₂HPO₄0.5〜１％、大豆粉0.3〜0.6％、カゼ
インペプトン0.5〜1.5％が証明されている。さら
にその他のでんぷん含有栄養培地例えば落花生粉
２〜６％、ばれいしよでんぷん１〜３％、カラス
ムギ粉３〜５％、乳清末３〜５％、乳清シロツプ
１〜２％、乳糖１〜２％から成るものでもまたア
ミラーゼ抑制因子が良好な収量で得られ、その際
窒素源および緩衝液部分の選択はそれらが生理学
的な範囲である限りそれ程決定的なものではな
い。しかしながら、でんぷん含量が低減もしくは
完全に削減されると、抑制因子収量は劇的に低下
する。他方、でんぷん濃度を７％より実質的に高
くする場合には、粘度の増大のため微生物の酸素
供給が至適でなくなり、それに関連して抑制因子
の収量が低下する。

醗酵混合物中、抑制因子の形成は一般に醗酵開
始から10〜30時間ではじまり、それから20時間以
内で通常終了する。醗酵時間を長くすることは抑
制因子の収量に何ら不利な影響を及ぼさないが、
それによつて収量を著しく増大させることはな
い。従つて醗酵は約30〜70時間にわたつて行なわ
れる。

抑制因子を単離するには、醗酵溶液から遠心分
離、過あるいは吸引過により細胞塊を除去す
る。その理由は作用物質の大部分が通常澄明な培
養液体の方に存在するからである。

特別の醗酵条件のために抑制因子の一部が細胞
物質中に残留する場合、作用物質を適当な方法例
えばメタノールのような水と混和しうる有機溶媒
と撹拌することによりそこから抽出することは何
の困難もなく行われ、その場合細胞物質をさらに
離解させることが好ましい。抽出剤中に溶解して
いる作用物質は遠心分離あるいは過により不溶
性の細胞成分から分離され澄明な培養液と同様に
してさらに処理される。

抑制因子は培養液から蛋白およびペプチド化学
において自体既知の方法により単離される。従つ
てアセトン、イソプロパノールあるいはその他の
低級アルコールのような水と混和しうる有機溶媒
あるいはまた硫酸アンモニウムのような塩を用い
る沈殿が適する。

さらに、抑制因子を適当な担体例えば活性炭に
吸着させこれを過あるいは遠心分離により水溶
液から分離することも可能である。これはPH２〜
10の広い範囲で行われ得るが、なかんずくPH４〜
６を利用する。イオン交換体も同様に本発明によ
るα−アミラーゼ抑制因子の分離に使用され得
る。本発明による物質は酸性ならびに塩基性を有
する、すなわち両性体であるので、これは陽イオ
ン交換体およびまた陰イオン交換体と反応し、こ
れらの交換体により醗酵溶液から除去され得る。
その際ラウエン（H.M.Rauen）氏によりシユプ
リンガー出版（Springer−Verlag）から1964年
は出版されたバイオヘミツシエン・タツシエンブ
ーフ（Biochemischen Taschenbuch）第２部、
第808〜824頁のイオン交換体に関する章に原則的
に記載されている方法が用いられ得る。

本発明による物質を培養液中に包含している醗
酵混合物の後処理に際しては、これを濃縮するの
がしばしば合目的々である。これに加えて既知の
蒸留法、限外過法、噴霧ならびに凍結乾燥法あ
るいはその他の既知の方法が用いられ得る。こう
して得られる濃縮物から抑制因子が再び上記方法
で分離される。濃縮された培養液を意味する濃
縮物から、抑制因子はまた主要な不純物を除去す
ることにより富化され得る。こうして脂質様物質
の分離には有機溶媒を用いる抽出が良いことが判
つた。透析あるいは場合によつては限外過
〔C.J.O.R.およびモリス（P.Morris）氏著「セパ
レーシヨン・メソツズ・イン・バイオケミストリ
ー（Separation methodss in Bio chemistry）」
デイツマン（Ditman）出版、ロンドン1976年、
第944〜950頁参照〕により、この溶液から低分子
物質を除去しうる。核酸、多糖質あるいは多くの
蛋白質のような高分子物質は塩析によるかあるい
はアセトンもしくは低級アルコールのような水と
混和しうる溶媒を添加することによる分別沈殿に
より分離され得る。これらの場合、沈殿剤の添加
は100000以上の分子量を有する容易に沈殿しうる
物質が析出し、他方α−アミラーゼ抑制因子が溶
液中に残るように処方される。上記の富化工程は
任意の順序で組み合せそして変更され得る。こう
して抑制因子が高度に富化されている溶液が得ら
れる。

最終精製はゲルクロマトグラフイーおよびイオ
ン交換クロマトグラフイーのような種々の適当な
方法あるいは例えば水酸りん灰石による分離のよ
うなその分離原理が最終的にイオン交換に基いて
いない関連した方法で行われる。さらに溶媒沈殿
あるいは塩沈殿、プレパラテイブ電気泳動あるい
はその他の自体既知の方法も用いられ得る。ジエ
チルアミノエチル−（DEAE−）−基含有イオン交
換体による分離ならびに硫酸アンモニウムあるい
はエタノールを用いる分別沈殿が特に良いことが
判つた。その場合結晶性の物質さえも得られう
る。

本発明による抑制因子の性質は糖尿病および糖
尿病前期ならびに脂肪過多症に対する治療剤とし
てならびに補助食物としてのその使用に関して興
味をもたれる。

でんぷん含有食品および嗜好品は人間および動
物の血糖上昇を生起し、それによりまた膵臓のイ
ンシユリン分泌増大をもたらす。過血糖症はアミ
ラーゼおよびマルターゼの作用により消化管中の
でんぷんがグルコースに分解されることにより生
起する。

糖尿病患者ではこの過血糖症が特に著しくそし
て長期間持続する。

肥胖病では増大したインシユリン分泌が脂肪生
成に作用し脂肪融解を減少させる。

でんぷん摂取後の食餌性過血糖症ならびに過イ
ンシユリン血症は本発明によるアミラーゼ抑制因
子により減少する。この作用は薬用量に依る。従
つて、本発明によるアミラーゼ−抑制因子は糖尿
病、糖尿病前期および脂肪過多症の治療剤として
ならびに補助食物として用いられる。この目的に
は投与特に食事時の投与が好ましい。薬用量は患
者の体重ならびに個々の場合の需要によつて決め
られるが、約10000〜300000AIEである。しかし
ながら基礎となる個々の場合においてそれ以下も
しくはそれ以上であつてもよい。

本発明によるアミラーゼ−抑制因子は特に経口
投与に適している。これは純粋な物質としてある
いはまた慣用の助剤および担体物質を使用した薬
剤製剤の形で使用され得る。血糖降下物質あるい
は脂肪降下物質のような他の医薬との組み合せ使
用も好都合であり得る。高分子ペプチドはそのま
までは消火管から吸収されないかもしくは有意に
は吸収されないので、本発明による物質から何ら
毒物学的に危険な副作用は予期されない。前記の
アミノ酸組成は何ら異常なものではない故、場合
により生起しうる蛋白分解的分解生成物もまた生
理学的に危険のないものと見なされる。従つて、
アミラーゼ抑制因子を多量に実験動物に対して経
口投与しても何ら奇異な症候は認められない。マ
ウスへの静脈内投与（１ｇ／Kg）でも本発明によ
る抑制因子は24時間の観察において何ら認知しう
る毒性作用を与えなかつた。

アミラーゼ−抑制因子の薬理学的作用を試験す
るために養われた空腹状態の雄の体重200〜250ｇ
のウイスター（Wistar）−ラツトに本発明による
阻止物質を体重１Kg当り２ｇのでんぷんと同時に
経口投与し、このあと直ちに最初の血糖値測定の
ための採血をあらかじめ行う。後の採血は15分後
および30分後ならびに１，２，３および５時間後
に尾の静脈から行う。血糖測定はホフマン
（Hoffman）氏の方法により自動分析器中で行う
〔ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol，Chem.）、第120巻、第51頁
（1937）参照〕。

NZO−マウスはグルコース耐容性の乱れを示
す。それゆえこれらはそれにより血中グルコース
レベルが影響される検査に特に良く適する。実験
方法はラツトの場合と同じである。採血は眼窩静
脈叢から行われる。血糖経過は３時間にわたつて
追跡される。

同様な方法でNMRI−マウスでの作用物質証明
がなされる。採血は同様に眼窩静脈叢から行われ
血糖経過が３時間にわたつて追跡される。

この実験方法において、本発明による抑制因子
で処理された動物は未処理の動物に対して一層低
い、遅延された血糖上昇しか示さない。

アミラーゼテスト １アミラーゼ−抑制因子単位（AIE）は、テス
ト条件下で２アミラーゼ単位（AE）を50％まで
阻止し得る抑制因子量として規定される。国際的
協定によれば、１アミラーゼ単位はでんぷん中の
配糖体性結合を１分間に１μ当量分解する酵素量
である。分解された配糖体性結合のμ価は還元糖
のμ価としてジニトロサリチル酸を用いて測光的
に測定される。結果はマルトース−測定直線を用
いて測定されるマルトースのμモルとして算出さ
れる。

テストは次のようにして行われる。

豚の膵臓からのα−アミラーゼおよび被験溶液
を共に20mMりん酸塩緩衝液（PH6.9）＋10mM
NaCl1.0ml中10〜20分間37℃で予培養する。酵素
的反応はズルコフスキー（Zulkowski）氏による
可溶性でんぷん1.0ml（所定の緩衝液中0.25％）
を添加することにより開始される。正確に10分後
に反応をジニトロサリチル酸−着色試薬（ベーリ
ンガー．マンハイム（Boehringer Nannheim）
社による、バイオケミカ−インフオーメーシヨン
（Biochemica Information ）参照））2.0ml
を用いて停止させそして５分間沸騰水浴上で加熱
して発色させる。冷却後546nmにおける吸光を試
薬空値に対して測定する。種々の抑制因子量を用
いることにより、阻止されてない酵素反応と比較
した50％阻止を概算着色法により図形的に測定す
る。

実施例 １ ストレプトミセス・テンダエ4158株を以下の組
成の培養基を有する斜面試験管中に接種する。

カラスムギ小片 50 ｇ H₂O 全量100ml PH_A 7.2 接種された試験管を７日間30℃で培養し次で＋
４℃に保持する。胞子を滅菌蒸留水あるいは生理
NaCl溶液10mlを用いて斜面試験管から洗い去
る。この懸濁液1.0mlは、PH7.7を有し次の組成を
有する滅菌栄養溶液35mlを含有する300mlのエレ
ンマイヤ−フラスコの接種に用いられる。

グルコース １％ 大豆粉 １％ NaCl 0.25％ PH 7.7 このフラスコを220Upmで48時間＋30℃で振盪
器上振幅４cmで服盪する。次でこの予培養液５ml
ずつを滅菌栄養溶液35mlを含有しPH8.3を有する
数個のエレンマイヤ−フラスコに移す。この主培
養液の組成は次のとおりである。

でんぷん ４％ コーンステイーブリカー 0.4％ グルコース 1.0％ （NH₄）₂HPO₄ 0.8％ 大豆粉 0.4％ ペプトン 1.0％ PH_A 8.3 この主培養液を同様に＋30℃において220Upm
で振盪器上振幅４cmで２〜３日間振盪する。培養
第１日、第２日および第３日目にα−アミラーゼ
−抑制因子含量を前述の試験規定に従つて測定す
る。

ストレプトミセス・テンダエ4158株は上記実験
条件および培養条件下に最終PH5.2において平均
100AIE／mlを与えた。

実施例 ２ 実施例１におけると同様であるが但し以下の組
成を有する滅菌栄養溶液200を含有する合計容
量300の醗酵容器を主培養液として選択する。

でんぷん ４％ コーンステイーブリカー 0.4％ グルコース 1.0％ （NH₄）₂HPO₄ 0.8％ カゼインペプトン 1.0％ デスモ−フエン（Desmophen） 0.1％ PH_A 8.3〜8.5 このものの滅菌時間は121℃、１バールにおい
て45分であり、その場合グルコースは別に滅菌し
醗酵容器を操作温度まで冷却後に滅菌的に加えら
れる。

PH値は滅菌後に6.8とならなければならない
が、必要に応じて、滅菌された酸（２ ｎ
H₃PO₄）あるいはアルカリ液（２ ｎ NaOH）
を用いてこの値に調整される。主要段階は実施例
１に記載されているようにして合計容量30の小
醗酵容器中に調製されている、10％に相当する予
培養物20で接種する。

これを30℃で50〜70時間醗酵させる。250Upm
の撹拌および0.3バールの過剰圧力下通気は１時
間当り６m³に達する。

試料採取により、抑制因子活性、基質の減成、
細胞塊発生および培養液の物理的技術的性質（表
面張力、粘度、密度、浸透圧）に関して醗酵過程
を監視し追跡する。

抑制因子の最高活性は培養60時間内で平均
105AIE／mlに達する。次で醗酵容器の内容物を
後処理する。

実施例 ３ 実施例１および実施例２におけると同様である
が、以下の組成を有する栄養溶液2500を含有す
る合計容量4000の生物反応器を主要段階として
利用する。

でんぷん ６％ グルコース 1.0％ コーンステイーブリカー 0.4％ （NH₄）₂HPO₄ 0.8％ 大豆ペプトン 1.0％ デスモ−フエン 0.1％ PH_A 7.0〜7.3 このものに対する滅菌時間は121℃、１バール
で60分である。その場合グルコースは別に滅菌
過し、醗酵容器を操作温度に冷却後これを減菌条
件下ポンプで添加する。

PH値は、必要に応じて滅菌された酸（H₃PO₄）
あるいはアルカリ液（NaOH）を用いて最初の値
7.0〜7.3に調整する。

実施例２に記載のようにして調整されている予
培養物200を用いて接種する。

醗酵時間は70時間であり、その場合温度30℃、
１時間当り60Nm³の通気、過剰圧力0.5バールそ
して180Upmで醗酵させる。

実施例２に記載されているようにして試料採取
することによりすべての重要な過程、有機体、お
よび活性度のデータが全醗酵期間にわたつて追跡
される。

醗酵70時間後に平均活性濃度95AIE／mlに達す
る。そこで醗酵を中止し培養溶液を後処理に付
す。

実施例 ４ 効力100AIE／mlを有する過した培養液10
を噴霧乾燥器中で乾燥して400ｇの淡褐色粉末を
得る。次いでこれを脱脂のためメタノール１お
よびクロロホルム１からなる混合物と徹底的に
撹拌し吸引過する。まだ溶媒で湿つている、作
用物質含有不溶性生成物を水３中に溶解し、PH
6.5に調整しメタノール4.5を加える。その際透
明な、薄片状の沈殿が生ずるが、これを遠心分離
により除去し捨てる。これはほんの無視しうる量
のα−アミラーゼ阻止物質しか包含していないか
らである。所望の抑制因子を包含しているメタノ
ール沈殿の暗色上澄液から次に真空下メタノール
を除去し、今や2.5に濃縮された溶液を蒸留水
で透析して塩を除去する。残留物（Retenat）は
９ｇの乾燥物質（比活性96AIE／mg）を含んでい
る。続いて残留物をPH5.5において硫酸アンモニ
ウムで50％飽和する。その場合250mlに対して塩
79ｇが必要である。塩析すると沈殿が生じ、これ
は活性物質約90％を含んでいる。遠心分離の後上
澄み液を捨てる。沈殿を新たに蒸留水に溶解し、
PH８において再び硫酸アンモニウムを加えるが、
この回ははじめに15％飽和までのみとし、沈殿を
除去したのちさらに35％飽和まで加える。15％お
よび35％の間の塩析の沈殿がアミラーゼ抑制因子
の主要量を含んでいる。この分別沈殿をくり返
す。

透析および乾燥後に得られる生成物360mgであ
り比活性992AIE／mgを有する。この粗生成物350
mgを次に長さ100cm容量1.2のガラスカラム中セ
フアデツクス（Sephadex）（登録商標）Ｇ−50フ
アインで分離し富化する。膨潤および溶離剤とし
て、0.02％のナトリウムアジドが添加されている
PH８の５ミリモル−りん酸塩緩衝水溶液が用いら
れる。粗生成物を前記と同一の緩衝液15ml中に溶
解しカラム上に注ぐ。溶離は２日間に亘つて行わ
れ、その際各15mlのフラクシヨンを集める。４個
の最も活性なフラクシヨンを集め、塩がなくなる
まで透析し、凍結乾燥する。１mg当り2520AIEの
α−アミラーゼ抑制因子活性を有する白色粉末60
mgが得られる。

実施例 ５ 培養液2200を６℃に冷却し、けいそう土２％
を添加した後チヤンバー型フイルタープレスで
過する。過ケーキ（約450Kg、湿潤）を捨て、
澄明な液（活性度95AIE／mlを有する1750）
にナトリウムアジド500ｇを添加した後下向き蒸
発器で120になるまで濃縮する。得られる濃縮
物を１℃に冷却し予め冷却したアセトン120を
撹拌下徐々に加える。沈殿を完結させるためにさ
らに15分間撹拌し１Kgのけいそう土を加えたのち
シエンク・プレス（Schenk presse）で清澄化す
る。固形物質は過助剤と共に捨てる。作用物質
を包含しているアセトン性液を撹拌および冷却
下アセトン380と混合する。それにより約80％
のアセトン性懸濁液が生ずる。得られる（第２
の）沈殿は所望のアミラーゼ抑制因子を包含して
いる。

これは沈殿液を撹拌することなく放置すること
により取得される。その際沈殿は沈下し上澄み液
は吸上げられる。この第２のアセトン沈殿の上澄
み液から遠心分離によりわずかな量の沈殿が分離
され得る。この固形物質をPH７で溶解し、沈殿の
溶液（後記参照）に加える。沈殿釜に残留してい
る主沈殿をPH７において120の水に溶解し生ず
る溶液をフロー遠心分離（セパ（Cepa）：登録
商標、1700Upm）で清澄化する。その際90ｇの
不活性小浮遊片が除去される。澄明な水相を
DDS−限外過装置（膜No.800）を用いて15に
濃縮し透析する。塩の除去を完全にするために残
留物を蒸留水で希釈し新たに濃縮する。２〜３回
くり返した後ではアミラーゼ抑制因子が包含され
ている残留物は実際上塩を含まない。残留物溶液
50から阻止物質をPH5.5において硫酸アンモニ
ウム19.5Kgを添加することにより沈殿させ、遠心
分離し、そして上澄み液を捨てる。沈殿を新たに
40の水に溶解し、PH7.5において硫酸アンモニ
ウム12.5Kgを用いて沈殿させる。遠心分離管中の
澄明相を分離したのち沈殿を実施例４におけるよ
うにして分別沈殿させる。再溶解した物質40か
らPH5.5において硫酸アンモニウム3.2ｇを添加す
ることによりはじめに不活性沈殿が生ずる。これ
を分離し捨てる。次で液相をさらに硫酸アンモニ
ウム7.4Kgを用いて濃縮することにより活性体の
主要部分が液体から分離される。この沈殿を集
め、蒸留水で透析し凍結乾燥する。活性度
1100AIE／mgを有する褐色粉末114ｇが得られ
る。

さらに分離するには、直径５cm、高さ50cm（容
量約１）のガラスカラムに、予め1/30モルのPH
7.5のりん酸塩緩衝液および0.02％ナトリウムア
ジドで平衡化されているDEAE−セフアデツクス
Ａ−25（登録商標）を充てんする。物質10ｇを上
記と同一の緩衝液100ml中に溶解し前記カラムに
注ぐ。最初にカラムを前記と同じ緩衝液１で洗
い、次でこの溶離剤に食塩を徐々に連続的勾配が
得られるように混合する。カラムからの流出液を
分別捕捉すると、アミラーゼ抑制因子は、NaCl
濃度が約0.5モルであるフラクション中に存在す
る。

このフラクシヨンを集め、蒸留水で透析する。
凍結乾燥すると効力2200AIE／mgを有する淡褐色
物質5.6ｇが得られる。

ここでさらに、実施例４に記載のようにゲルク
ロマトグラフイー精製が付加されると、5.6ｇの
物質から4.1ｇの無色粉末が生じ、その活性度は
2800AIE／mgである。この生成物のアミノ酸分析
はベツクマン（Beckman）−マルチクロム
（Multichrom）分析器による20時間の塩酸加水分
解の後に以下の組成を与えた。

アスパラギン酸 7.72％ スレオニン 7.66％ セ リ ン 5.35％ グルタミン酸 10.05％ プロリン 3.43％ グリシン 4.93％ アラニン 5.84％ 1/2システイン 4.26％ バ リ ン 7.72％ メチオニン 0.41％ イソロイシン 2.30％ ロイシン 5.18％ チロシン 10.24％ フエニルアラニン 3.35％ ヒスチジン 3.01％ リ ジ ン 1.45％ アルギニン 5.16％

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明による化合物の紫外線吸収ス
ペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分子量5000〜10000，276nmにおける最大UV
   吸収、等電点4.4そして次のアミノ酸組成すなわ
   ち アスパラギン酸 ５〜６ イソロイシン １〜２ スレオニン ５〜６ ロイシン ３〜４ セ リ ン ３〜５ チロシン ４〜５ グルタミン酸 ５〜６ フエニルアラニン ０〜２ プロリン ２〜３ ヒスチジン １〜２ グリシン ５〜６ リ ジ ン ０〜１ アラニン ５〜６ アルギニン ２〜３ システイン ３〜４ トリプトフアン １〜２ バ リ ン ５〜６ を有することを特徴とする、ペプチド状配糖体ヒ
   ドロラーゼ抑制因子。 ２ ストレプトミセス・テンダエ
   （Streptomyces tendae）4158（ATCCNo.31210）
   を培養し培養物から下記の物理化学的特性を有す
   るペプチド状配糖体ヒドロラーゼ抑制因子を取得
   することを特徴とする、ペプチド状配糖体ヒドロ
   ラーゼ抑制因子の製法。 分子量5000〜10000，276nmにおける最大UV吸
   収、等電点4.4そして次のアミノ酸組成すなわち アスパラギン酸 ５〜６ イソロイシン １〜２ スレオニン ５〜６ ロイシン ３〜４ セ リ ン ３〜５ チロシン ４〜５ グルタミン酸 ５〜６ フエニルアラニン ０〜２ プロリン ２〜３ ヒスチジン １〜２ グリシン ５〜６ リ ジ ン ０〜１ アラニン ５〜６ アルギニン ２〜３ システイン ３〜４ トリプトフアン １〜２ バ リ ン ５〜６ ３ 少くとも１種の炭素源、少くとも１種の窒素
   源および有機塩を含有している培地中でストレプ
   トミセス・テンダエ4158を培養することを特徴と
   する、前記第２項による方法。 ４ 栄養培地が可溶性でんぷん３〜５％、コーン
   ステイープリカー0.2〜0.6％、グルコース0.5〜
   1.5％、（NH₄）₂HPO₄0.5〜１％、大豆粉0.3〜0.6
   ％およびカゼインペプトン0.5〜1.5％を包含して
   いることを特徴とする、前記第３項による方法。 ５ 栄養培地が落花生粉２〜６％、ばれいしよで
   んぷん１〜３％、カラスムギ粉３〜５％、乳清末
   ３〜５％、乳清シロツプ１〜２％および乳糖１〜
   ２％を包含していることを特徴とする、前記第３
   項による方法。 ６ 下記の物理化学的特性を有するペプチド状配
   糖体ヒドロラーゼ抑制因子を活性成分として含有
   することを特徴とする、血糖レベル調節用薬剤。 分子量5000〜10000，276nmにおける最大UV吸
   収、等電点4.4そして次のアミノ酸組成すなわち アスパラギン酸 ５〜６ イソロイシン １〜２ スレオニン ５〜６ ロイシン ３〜４ セ リ ン ３〜５ チロシン ４〜５ グルタミン酸 ５〜６ フエニルアラニン ０〜２ プロリン ２〜３ ヒスチジン １〜２ グリシン ５〜６ リ ジ ン ０〜１ アラニン ５〜６ アルギニン ２〜３ システイン ３〜４ トリプトフアン １〜２ バ リ ン ５〜６