JPS6244194A

JPS6244194A - Ｌ−ソルボ−スの製造法

Info

Publication number: JPS6244194A
Application number: JP9144786A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Kanetaka; 金高　一彦; Hiroyuki Yoshinaga; 義永　洋之; Takamasa Yamaguchi; 山口　高正
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1987-02-26
Also published as: ES8706834A1; EP0199548A2; CN86102773A; ES554207A0; EP0199548A3; DK184086A; DK184086D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は微生物によるＬ−ソルボースの製造法に関する
。

従来の技術Ｌ−ソルボースは、ビタミンＣ合成の原料として有用で
あり、本物質はＤ−ソルビットを微生物、たとえばグル
コノバクタ−属菌により酸化する方法により製造されて
いる。

発明が解決しようとする問題点従来のＬ−ソルボースの醗酵生産法によると原料である
Ｄ−ソルビットをＬ−ソルボースへ変換する収率は約９
３％程度までてあり、５−ケトフラクトース、Ｄ−フラ
クトースあるいは２−ケトグルコン酸などがかなり副生
ずる。ビタミンＣの原料コスト低減のために、その中間
製造工程におけるＤ−ソルビットのＬ−ソルボースへの
変換収率を従来以上に増大させ、上記副生物の生成をで
きるだけ抑制することが要望されている。

問題点を解決するための手段本発明者らは上記の状況に鑑み、Ｌ−ソルボースを効率
よく生産する方法につき種々検討し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明はＤ−ソルビットを微生物学的に酸化
してＬ−ソルボースを製造する方法において、利用する
微生物の増殖期における培地中の溶存酸素濃度を約１〜
４　ｐｐｍに制御しながら培養することを特徴とするＬ
−ソルボースの製造法である。

本発明製造法では、Ｄ−ソルビットを酸化してＬ−ソル
ボースを生成せしめる能力を有する微生物であればいず
れも用いることができる。その例としては、グルコノバ
クタ−属に属する微生物、たとえばグルコノバクタ−・
サブオキシダンス（Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　　
５ｕｂｏｘｙｄａｎｓ）あるいはグルコノバクタ−・オ
キシダンス（Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａ
ｎｓ）の種菌があげられ、その具体的な菌株例としては
、たとえばグルコノバクタ−・サブオキシダンスＩＦ’
０　３２５４．ＩＦＯ３２５７゜ＩＦＯ１２５２８，Ｉ
ＦＯ３２５５，ＩＦＯ３２５６、ＩＦＯ３２５８あるい
はＩＦ’０３２９１や、さらにはグルコノバクタ−・オ
キシダンス　ＩＰｏ　　３１８９などが挙げられる。

上記に例示された各菌株は、財団法人発酵研究所（Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ　　Ｆｏｒ　　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ　　０ｓａｋａ。

ＩＦＯ）発行のリスト・オブ・カルチャーズ、　１９８
４、セブンス・エディジョン（Ｌｉｓｔ　　ｏｆＣｕｌ
ｔｕｒｅｓ、　１９８４．５ｅｖｅｎｔｈ　　Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ）に掲載されており、該研究所に保管されている
。

次に、本発明でいう微生物の増殖期とは、利用する微生
物を培養する際における誘導期および増殖対数期が終わ
るまでの培養期間をいう。本増殖期間は利用する微生物
の種類や培養条件によって異なるが、常法により増殖曲
線を求めることにより容易に知ることができる。一般に
は、培地中の窒素源が消費されるまでの培養期間で、た
とえば培養開始後約９時間までがこの増殖期に相当する
ことが多い。

本発明では増殖期における培地中の溶存酸素濃度が約１
〜４　ｐｐｍに制御される。この場合、溶存酸素濃度の
変動幅をできるだけ少なくするのが有利であり、通常は
上記の濃度範囲内で選択された設定値を中心に約０　、
５　ｐｐｍ以内、さらに好ましくは約０　、３　ｐｐｍ
以内の変動幅に制御する。

溶存酸素濃度は、酸素電極を用いて常法により測定し培
地中の該濃度を連続測定しながら培養の進行と共に通気
量、内圧、攪拌条件等を調整して制御される。たとえば
、培養の進行と共に通気量を約０．１〜１．ＯＶ、Ｖ、
Ｍ、まで、内圧を０〜２　、０　ｋｇ／　ｃｍ２Ｇまで
、それぞれ段階的に組み合わせていくとにより、さらに
必要に応じて攪拌機の回転数を調整しながら本発明で特
定する所定の溶存酸素濃度に制御することができる。

次に、増殖期以後における培地中の溶存酸素濃度は特定
の水準に調整する必要はないが、通常増殖期終了時の通
気攪拌条件でもって約０，５〜４ｐｐｍ程度で培養を継
続すればよい。

本発明の特徴は増殖期における培地中の溶存酸素濃度を
約ｌ〜４　ｐｐｍに制御することにあり、その他の製造
条件は通常の方法に従かえばよく、たとえば次の方法に
よって実施される。

培地中の炭素源としては主原料のＤ−ソルビット（Ｄ　
−Ｓ　ｏｒｂｉｔｏｌ）と、それに加えてＤ−グルコー
ス、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトール、エタノール
等を添加してもよい。一般に、培地中のＤ−ソルビット
は約１０〜５０Ｗ／Ｖ％、好ましくは約３０〜５０Ｗ／
Ｖ％で培養が開始される。

また、窒素源としてはコーンステイープリカー。

綿実粉、酵母エキス、乾燥酵母、フィツシュミール。

肉エキス、ペプトン、カザミノ酸その他の含窒素有機資
源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アン
モニア水、アンモニアガスなどの無機窒素化合物の池、
グルタミン酸ソーダ、アラニンなどのアミノ酸、尿素な
どの有機窒素化合物が使用される。培地には上記の炭素
源や窒素源に加えて、微生物の生育に必要な種々の金属
、ビタミン。

アミノ酸、核酸類などが適宜添加される。

本発明において、主培地としては合成培地を有利に用い
ることができる。この場合には炭素源として主原料とし
てのＤ−ソルビトールと、それに加えてＤ−グルコース
、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトールあるいはメタノ
ールを用いてもよい。

窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムあるいはリン酸アンモニウムなどの無
機窒素源と、これに加えてグルタミン酸ナトリウムある
いはアラニンなどを併用してもよい。特に酢酸アンモニ
ウムを好ましくは使用できる。合成培地中の各種成分の
濃度（重量／容量％）は、たとえば次のような範囲から
選択し得る。

Ｄ−ソルビット　　　　　１０〜５０Ｋ　Ｈ、Ｐ　Ｏ４０，００５〜０．１Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，００５〜０．０５ＣａＣＯ３
０，００５〜０．０５酢酸アンモニウム　　　０．０２〜０．０５グルタミン
酸ソーダ　　　０．０５〜０．２Ｆ　ｅＳ　Ｏ４・７　
ＨｔＯＯ，００００５〜０．０００５ＭｎＳ　Ｏ４・ｍ
Ｈｔｏ　　　　　Ｏ，００００００５〜０．００００５
ニコチン酸アミド　　　　０．０００１〜０．０１パン
トテン酸カルシウム０．００００１〜０．０１パラアミ
ノ安息香酸　　０．０００００１〜ｏ、ｏｏｏｔビタミ
ンＢ　、　　　　　　　　０．００００１〜０．０ＯＬ
本発明において、溶存酸素濃度以外の培養条件は、通常
の条件と同様でよく、特に限定されない。すなわち、培
養温度は、一般的には約１５°Ｃないし４５°Ｃで、好
ましくは２５°Ｃないし４０℃であり、培地のｐＨは一
般的には約３．０ないし８．０で、好ましくは約３．５
ないし６．５である。また培養時間は一般的には約ＩＯ
ないし１００時間であり、好ましくはＩ５ないし４０時
間である。

かくして、培養を終了した培養物中からし一ンルボース
を常法により、たとえば培養物をろ過して除菌後、活性
炭を用いて脱色し、減圧濃縮を経て、メタノール、エタ
ノール、アセトンなどでＬ−ソルボースを晶出させて得
ることができる。

実施例以下に、実験例と共に実施例を挙げて本発明をさらに具
体的に説明する。

実験例！後述の実施例Ｉと同様の微生物および培地を用いて、増
殖期における培地中の溶存酸素濃度を種々変化させた以
外は、実施例１と同様の培養条件で培養を行なった。培
養終了後のＬ−ソルボース。

Ｄ−フラクトース、２−ケトグルコン酸、５−ケトフラ
クトースのＤ−ソルビットに対する収率を表−１に示す
。

表−１トフ表−１において、Ｌ−ソルボース、Ｄ−フラクトース、
５−ケトフラクトース、２−ケトグルコン酸は、いずれ
も高速液体クロマトグラフィーにょって測定した。すな
わち、Ｌ−ソルボースは、ウォーターズンユガーバッタ
ーをカラムとしてｌｏ−４モル濃度ＥＤＴＡカルシウム
塩水溶液を移動相に検出器として高感度示差屈折計を使
用した。Ｄ−フラクトース及び５−ケトフラクトースは
ｌ５Ａ−０７／５２５０４（島原製作所（株）製）をカ
ラムとして３ホウ酸（１）Ｉ−４８，０）を移動相にし
てアルギニン発色法を用いて蛍光分析器によって測定し
た。

また２−ケトグルコン酸はショウデックスイオンバック
Ｃ−８１１（昭和電工（株）製）をカラムとして０．８
５％リン酸を移動相にして紫外部吸収（２１０ｎｍ）で
測定した。

表１の結果に示されるように、増殖期における培地中の
溶存酸素濃度を本発明で特定するように制御し、培養す
ると（Ｎｏ、１．２および３参照）、これらよりも溶存
酸素濃度が高い場合（Ｎｏ、４゜５および６参照）に比
較して、５−ケトフラクトース、Ｄ−フラクトースある
いは２−ケトグルコン酸などの副生物量が減少し、目的
物であるＬ−ソルボースの収率を増大させることができ
る。

実験例２実験例１におけると同様の微生物および培地を用いて、
増殖期における溶存酸素濃度を表−２のように調整した
以外は実験例１と同様の方法により培養してＬ−ソルボ
ースを製造した。

表−２表−２の結果に示されるように、溶存酸素濃度の変動幅
が±０．３内に制御されるとき、Ｌ−ソルボースの収率
が高くなる。

実施例１グルコノバクタ−・サブオキシダンスＩＦＯ３２５４を
Ｄ−ソルビット２０％、グルタミン酸ソーダ０．２％、
炭酸カルシウム０．０１８％、ニコチン酸アミド０．０
０３％、パントテン酸カルシウム０．０００３％、ビタ
ミンＢ２　０．０００１％。

パラアミノ安息香酸０．０００１％、リン酸−カリウム
０．０４７％、酵母エキス０．０３％、硫酸マグネシウ
ム０．０１％、硫酸第一鉄０．０００１５％。

硫酸マンガン０．００００１％、アクトコール０．００
０５％からなる培地１（Ｈ２に接種し、３０℃、２４時
間培養し、これを種としてＤ−ソルビット３０％、酢酸
アンモニウム００３９％、炭酸カルシウム０．０１８％
、ニコチン酸アミド０．００３％、パントテン酸カルシ
ウム０．０００２５％、ビタミン８２０．０００１％。

パラアミノ安息香酸０．００００１％、リン酸−カリウ
ム０．０２％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸第一
鉄０．０００１５％、硫酸マンガン０．００００１％か
らなる培地１００Ｑに移植した。

これを３０℃で培養し、培養開始後９時間、溶存酸素濃
度を２．５±０　、５　ｐｐｍになるように通気量を０
．１〜０．６Ｖ、Ｖ、Ｍ、及び内圧を０．１〜１　、５
　ｋｇ／　ｃｍ’　Ｇの範囲で調整し、次いで増殖期以
後は通気ｆｉｌ　　０．６Ｖ、Ｖ、Ｍ、、内圧１．５ｋ
ｇ／ｃｍ”Ｇで培養し、合計２０時間培養した。このと
きの、溶存酸素濃度（ＤＯ）、Ｄ−ソルビットおよびＬ
−ソルボースの濃度変化と培養時間の関係を第１図に示
す。本培養法により、Ｌ−ソルボースが対ソルビット収
率９６１％で蓄積された。

実施例２グルコノバクタ−・サブオキシダンスＩＦＯ３２５７を
Ｄ−ソルビット２０％、グルタミン酸ソーダ０２％、炭
酸カルシウム０．０１８％、ニコチン酸アミド０．００
３％、パントテン酸カルシウム０．０００３％、ビタミ
ンＢ、　　０．０００１％。

パラアミノ安息香酸ｏ、ｏｏｏｔ％、リン酸−カリウム
０．０４７％、酵母エキス０．０３％、硫酸マグネシウ
ム０．０１％、硫酸第一鉄０．０００１５％。

硫酸マンガン０．００００１％、アクトコール０．００
０５％からなる培地１０ｆ２に接種し、３０℃２４時間
培養し、これを種にして、Ｄ−ソルビット３０％、酢酸
アンモニウム０．０２９％、炭酸カルシウム０．０１８
％、ニコチン酸アミド０．００３％、パントテン酸カル
シウム０．０００２５％、ビタミンＢ、　　０．０００
１％。

パラアミノ安息香酸０．００００１％、リン酸−カリウ
ム０．０２％、硫酸マグネノウム０．Ｏ１％、硫酸第−
鉄０．０００１５％、硫酸マンガンｏ、ｏｏｏｏｉ％か
らなる培地１００Ｑに移植し、これを３０℃で２０時間
培養した。この培養期間中、培養開始後、９時間までの
溶存酸素濃度を３．５±０　、５　ｐｐｍになるように
通気量を０．２〜０．６Ｖ、Ｖ、Ｍ、、内圧を０　、２
〜１　、５　ｋｇ／ｃｍ２Ｇ　。

攪拌を２３０〜３００　ｒｐｍまで変更して培養し、増
殖期以後は通気量　０．６Ｖ、Ｖ、Ｍ、、内圧１．５ｋ
ｇ／ｃｍ”Ｇ、Ｑ拌３００　ｒｐｍで培養したところＬ
−ソルボースが対Ｄ−ソルビット収率９５．７％で蓄積
された。

実施例３グルコノバクタ−・ザブオキシダンスＩＦＯ１２５２８
をＤ−ソルビット２０％、グルタミン酸ソーダ０．２％
、炭酸カルシウム０．０１８％、ニコチン酸アミド０．
００３％、パントテン酸カルシウム０．０００３％、ビ
タミン８２０．０００１％。

硫酸マンガン０．００００１％、アクトコール０．００
０５％からなる培地１００Ｑに移植し、３０℃２４時間
培養し、これを種としてＤ−ソルビット３０％、酢酸ア
ンモニウム０．０３９％、炭酸カルシウム０．０１８％
、ニコチン酸アミド０．００３％、パントテン酸カルシ
ウム０．０００２５％、ビタミンＢ、　　０．０００１
％。

バラアミノ安息香酸ｏ、ｏｏｏｏｔ％、リン酸−カリウ
ム０．０２％、硫酸マグネシウム０．０１．％、硫酸第
−鉄０．０００１５％、硫酸マンガン０．００００１％
、からなる培地１，０ＯＯｉ２１：移植し、これを３０
℃２０時間培養した。この培養期間中、培養期間中開始
後９時間溶存酸素濃度が１．５±０　、５　ｐｐｍにな
るように通気量を０．１〜０．５Ｖ、Ｖ、Ｍ、、内圧を
Ｏ〜１　、５　ｋｇ／ｃｍ’Ｇまで変更して培養し増殖
期以後通気ｆｉｏ、５Ｖ、Ｖ。

Ｍｌ、内圧１　、５　ｋｇ／ｃｍ”Ｇで培養したところ
し−ソルボースが対Ｄ−ソルビット収率９６．３％で蓄
積された。

発明の効果本発明によると、Ｄ−ソルビットを微生物学的に酸化し
てＬ−ソルボースを製造する方法において従来法に比較
して、Ｌ−ソルボースの収率を増大させることができる
。すなわち、従来法ではＤ−ソルビットに対するＬ−ソ
ルボースの収率は高くても約９３％程度までであったが
、本発明によると従来法よりも２〜３％以上収率を上げ
ることができ、しかもＤ−フラクトース、２−ケトグル
コン酸、５−ケトフラクトースなどの副生物の生成を少
なくすることができる。この結果、ビタミンＣ製造にお
ける原料コスト中、その占める割合がきわめて高いＬ−
ソルボースを従来法よりも安価に供給することができ、
医薬、食品等において幅広い用途を有するビタミンＣの
製造コストが低減される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に従って本発明を実施したときの培養
時間と培養液中の溶存酸素、Ｄ−ソルビットおよびＬ−
ソルボースの濃度の関係を示す。図中、−０−は溶存酸
素濃度を、−・−はＤ−ソルビット濃度を、また−〇−
はＬ−ソルボース濃度をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

Ｄ−ソルビットを微生物学的に酸化してＬ−ソルボース
を製造する方法において、利用する微生物学的の増殖期
における培地中の溶存酸素濃度を約１〜４ｐｐｍに制御
しながら培養することを特徴とするＬ−ソルボースの製
造法