JPS62500073A

JPS62500073A - エシェリキア・コリｌｔ−ｂエンテロトキシンサブユニットの製造

Info

Publication number: JPS62500073A
Application number: JP60503149A
Authority: JP
Inventors: クレメンツ，ジヨン　デイー
Original assignee: プラクシス　バイオロジツクス，インコ−ポレ−テツド
Priority date: 1984-07-09
Filing date: 1985-07-03
Publication date: 1987-01-16
Also published as: ATE62270T1; DK311485D0; EP0168322B1; ES544967A0; IE851710L; CA1340372C; AU598725B2; IE59393B1; DK311485A; AU4458785A; EP0168322A2; EP0168322A3; ES8703526A1; WO1986000647A1; DE3582373D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

エシェリキア・コリＬ丁−Ｂエンテロトキシンサブユニットの製造１、序論本発明は、エシェリキア・コリ（大腸菌［Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ並旦コ）のエンテロトキシン（腸管毒）産生性株のヒト単離体からの、熱不安定性エンテロトキシンの非毒性Ｂサブユニット（ＬＴ−Ｂ）の製造するためのプロセスに関するものである。このプロセスは、必須遺伝子配列が適当なりＮＡベクター（媒介体）によって非病原性微生物株中へ挿入される組換型ＤＮＡテクニックを利用するものである。本発明はさらに、ＬＴ−Ｂタンパク質の単離および精製ならびに免疫学的予防法および療法へのその使用に関するものである。ＬＴ−８に対して製造された抗血清は、エンテロトキシン誘発性下痢症に対する受身免疫処置に利用され得るものである。あるいはまた、このような抗血清は、エシェリキア・コリのまたはビブリオ・コレラ［Ｖ　１ｂｒｉ２、発明の背景２．１　エンテロトキシン産生性細菌および下痢症ある細菌のエンテロキシン産生性株による小腸の一時性集落形成に帰因する急性下痢症は、世界的な重要事象の主要な健康的問題である。責任のある細菌の中で・恐らく最も広く認識されているものは、ビブリオ・コレラである・よく知られている程度は低いが、実際的により重要なものは、エシェリキア・コリ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）コであり、これは、発展途上の熱帯の国々に住む１０００万人と見積られた幼児に各年致命的である急性下痢症の事象を、ロタウィルス（動物ＲＮＡウィルス）と共にもたらすものである〔ブラックら、ランセト　ｉ　：１４１　（１９８１年＞　［ＢＩａｃｋｅｔ　ａｔ、、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　：　１４１　（１９８１）コ　〕　。これらのエシェリキア・コリ株はまた一般に、熱帯への旅行者を悩ます急性下痢症の高い範囲の原因となるものである。さらにまた、コーラ−［Ｋｏｈｌａｒ　］　（ジエイ、アン。８）］〕が、乳離れした動物の子、特に子ウシ、子ヒツジおよび子ブタは同様に冒され得ることを報告しているゆえに、これらは、家畜への大なる影響も有している。ビブリオ・コレラおよびエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリはいずれも、これらの下痢症性効果をエンテロトキシンの産生を通して生じるものである。コレラエンテロトキシンは、フィンケルシュティン［Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｏｎ］（クリト、レブ、ミクロパイオル、２：５５３　（１９７３年）　［Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ、　１ｖｌｉｃｒｏｂｉｏ１．２　：　５５３　（１９７３）　］〕によって単離されそして均質性へと精製されている。さらにまた、フィンケルシュティンとロスバリュート［Ｆｉｎｋｅｌａｔｅｉｎ　ａｎｄ　１−ｏｓｐａｌｌｕｔｏ　］　（ジエイ、エクスプ、メト。１３０：１８５　（１９６９年＞　［Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１３０：１８５　（１９６９）］　）は、生物学的活性が低減されたコレラ毒素からタンパク質サブユニットを分離している。これらよりあるいはその伯の研究より明らかになったことは、コレラエンテロトキシンは、ＡおよびＢサブユニットからなる８４，０００ドルトンのタンパク質であるという発見である。Ａサブユニット（２８，０００ドルトン）は、毒素の生物学的効果に関し原因となるものであるが、それのみで標的レセプターに結合することができない。Ａサブユニットは、ＳＨ試薬（スルフヒドリル試薬）の作用によって、７．。ＯＯＯドルトンおよび２１．０００ドルトンの分子サイズを有する２つのポリペプチド鎖に開裂される。Ａ１と呼ばれる、これらの鎖のうちの大きい方のみが活性なものである。５６．０００ドルトンのサイズを有するＢザブユニットは、Ａサブユニットの活性の表現に必須のものである。おそらくは、これは標的ｍ胞へ結合によって作用し、そして次に活性なＡサブユニットによる侵入を促進する。フィンケルシュティンら［Ｆ　１ｎｋｅｌｓｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、コ　〔ジエイ、イムツル、１１３：１４５　（１９７４年＞　［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ユニユニ１４５　（１９７４）］）は、Ｂサブユニットが、ドデシル硫酸ナトリウムでのあるいは低いｐＨにおいて尿素での活発な処理膜より５つのポリペプチド鎖に解離し得る非共有的に会合したサブユニットから構成されることを示している。コレラ毒素の効果は、シアーら［５ｈｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｌ　（ガストロエンテルオロジイ　且：８９５　（１９７３年）［Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｉｏＱｙ　６５　：　８９５　（１９７３）　］　）によってウサギの空腸において示されている。この系において、該毒素は、内腟への血液にナトリウムの一定方向の流れをなさせる。結果として、腸液は、標準血清レベルと比較して、タンパク質、Ｍ（１、およびＣａ　において低いものと、またに、Ｎａ　およびＨＣＯ３ −において高いものとなる。このようなイオン変化で、血漿との浸透圧平衡維持のために、内腟への水の付随した流出がある。コレラ毒素レセプターの正確な構造は不明であるが、糖脂質であると思われる。この観察結果は、膜へのコレラ毒素の結合が種々のグリコスフィンゴリピドによって阻止されるというキングとバンハイニンゲン［Ｋｉｎｇ　ａｎｄ　ｖａｎ　Ｈ４３（１９７５年＞　［Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１３１　：６４３（１９７５）］）による発見に基づくものである。調べられたこのタイプの化合物の中で、ＧＨｌ（ガラクトシル−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−（シアニル） −ガラクトシルグルコシルセラミド）が最も効力のあるものである。コレラ毒素の結合が起こると、アデニル酸シクラーゼ活性の刺激がありそして活性化状態にあけるその酵素のロッキングがある。この結果は、ある点において上記のイオン変化に上昇を与えるＣＡＭＰ（サイクリックアデノシン３°、５°　 −−リン酸）の細胞内レベルにおける増加である。エシェリキア・コリのエンテロトキシン性株はまた、エンテロトキシンの産生を通じて下痢症効果を媒介する。これらの毒素は、２つのタイプのものがあり、その一方は、２゜ＯＯＯドルトンの比較的低分子量種である。これは１００℃での処理にも生残るので、この種は熱安定性毒素（ＳＴ）と呼ばれる。熱不安定性な使方の毒素（ＬＴ）は、コレラ毒素と著しく似たものである。９８１＞］　）によって示されるように、エシェリキア・コリＬＴは、コレラ毒素と同様なタイプおよび数のサブユニットから構成されてあり、この相当するサブユニットはほぼ同様の分子量を有している。コレラ毒素の場合のように、ＬＴの８サブユニツトは、腸管粘膜糖脂質レセプターに付看し、これゆえに、生物学的活性Ａサブユニットによる細胞の侵入が許容される。その時点）爽の事象の連続もまた同様のものである。最も重要なこととしては、クレメンッとフィンケルシュティン［ＣＩｅｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｆ　１ｎｋｅｌｓｔｅｉｎ］（インフエクト、イムノ、２１　：１０３６　（１９７８年）Ｎｎｌ’ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　２１　：　１０３６　（１９７８＞　１　）は、エシェリキア・コリＬＴがコレラエンテロトキシンのＡおよびＢサブユニットの双方に免疫学的に関連していることを示している。２．２．エンテロトキシン性下痢症の予防および治療に対する免疫学的アプローチ微生物性毒素誘発性下痢症を原因とする蔓延した患者数および死亡数に闘争するための最も実践的手段は、防御的予防接種であろう。エンテロトキシン産生性エシェリキア・］り株の場合において、３３つのアプローチを取り得る。第１に、菌体抗原が免疫処置に用い１うれ得る。比化ないし弱毒化された■Ｉ菌が、この目的のために用いられ得るが、このアプローチは、いくらかの危険性を伴なうものでおり、また限定された効果のものとなりがちである。細胞のタヒ化ないし弱毒化が不完全であると、臨床的疾患が発展してくる。これが起こらなかったとしても、抗原性的に非類似な菌体血清型が認識されないだろうゆえに、防御は不完全なものとなるでおろう。第２に、アキレスら［Ａｃｒｅｓ　ｅｔ　ａ！、Ｊ　Ｃインフエクト。イム人２５：　１２１　（１９７９＞　［Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　２互：１２１　（１９７９）］　）は、線毛（ピリ）仲介固定がエンテロトキシン分泌性エシェリキア・コリのある株による下痢症の誘発に必須条件であることを示している。これゆえ、細胞接着での干渉は予防効果を有するものであろう。このような干渉は、線毛抗原での予防接種により生じさせることができるが、このように授与された防御は再び、抗原性的に同類な細菌にのみ適用できるものである。モーガンら［Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｔ、　］　（インフフラクト。ムノ、Ｚλニア７１　（１９７８年）　［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２２　：　７７１（１９７８）］　）は、動物およびヒトエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株の中に多数の抗原性的に非類似な線毛抗原を見つけている。最債に、エンテロトキシンそれ自体で動物を予防接種することが可能である。このように確立された免疫は、毒素を産生する任意の関連エシェリキア・コリでの能動攻撃に対する防御を与える。その理由は明らかに理解されていないが、Ｌ丁毒素での免疫処置は、ＬＴおよび８丁の双方を産生する株に対する防御を与えるものであるらしい。８丁のみを産生する株に対する防御はないでおろうが、これらの株は、少数派に属するものである。クリブシュティンとエンガート［ＫＩｉｐｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｅｎｇｅｒｔ　］　Ｃインフエクト。５９２　（１９７９）］　）は、精製された！、−Ｔタンパク質でのラッ１〜の能動免疫を述べている。免疫は、ＬＴそれ自体の使用によって達せられ得るが、生物学的に不活性なりサブユニット（ＬＴ−８＞のみの使用は、はとんど同様に効果的であり、またもちろんより安全である。このアプローチの効能は、ラットにおいて、クリブシュティンと一丁ンガー１〜［ＫＩｉｐｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｅｎｇｅｒｔ　］示されている。このような免疫はまた、上記に述べたＬＴとコレラエンテロトキシンとの間の免疫学的関係ゆえに、コレラ誘発性下痢症的侵襲に対する防御も授与するものである。クリアシコープインら［Ｋ１１ｐｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、］はまた、ＬＴ９８１）１）あるいはＬＴ−８タンパク質に結合したＳＴ８　（１９８３）］　）ラットを免疫処置している。このような抱合体［ｃｏｎｊｕｇａｔｃ］およびこれらのワクチンとしての使用に基づく特許が、クリアシコーチインら［Ｋ　１ｉｐｓｔｅｉｎ　ｅｔａｌ、］に対して発行されている〔米国特許第４．４１’ｌ。８８８？ｊ）Ｑ２．３１組換え型ＤＮＡ技術現在における組換え型ＤＮＡ法は、宿主細胞中に複製し得る組換え型ＤＮＡ分子を形成するために、特定のＤＮＡ配列が、適当なりＮＡベヒクル（伝播体）あるいはベクター（媒介体）中に挿入されるもので必る。プラスミドと呼ばれる環状二重鎖ＤＮＡがベクターとして頻繁に用いられており、そしてこのような組換え型ＤＮＡ形態の調製は、ＤＮＡを特定の塩基配列部位で切断し得る制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用を伴うものである。プラスミドにおいておよび挿入されるべき外来のＤＮＡのセグメントにおいて制限酵素による切断が行なわれると、２つのＤＮＡ分子はりガーゼとして知られる酵素により共有結合される。このような組換え型ＤＮＡ分子の調製に関する一般的方法は、コーエンとボイヤー［Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂ　ｏｙｅｒコによって米国特許第４，２３７，２２４号中に述べられている。その他の有用な一般的方法が、コリンズとホーン［Ｃｏ１１ｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈｏｈｎｌによって米国特許第４，３０４，８６３号中に述べられている。これらの広い利用性ゆえに、これらの特許は、関連により水明側書中に組込まれる。ひとたび調製されると、組換え型ＤＮＡ分子は、幾らかの条件が合致された場合のみに、挿入された遺伝子配列により特異とされる産物を産生することに、用いられ得る。第１には、組換え型分子が宿主細胞と適合し得るものでおり、そしてそれゆえに宿主細胞中に自律複製し得る要件である。最近の研究の多くは、エシェリキア・コリが広範な組換え型プラスミドと適合し１ｄるゆえにエシェリキア・コリを宿主微生物として用いている。用いられたベクター／宿主細胞系に依存して、組換え型ＤＮＡ分子は・形質転換・形質導入あるいはトランスフェクションによって宿主中へ持込まれる。宿主細胞中における組換え型プラスミドの存在の検知は、例えば抗生物質耐性などのような、プラスミド標識活性の使用により周知的に達せられ得る。これゆえ、アンピシリン分解酵素の産生に関しコードするプラスミドを負う宿主は、アンピシリンを含有する培地中で宿主を成長させることによって、非変容細胞から選び出すことができる。さらに利点は、選択された制限酵素が切断し、そして外来の遺伝子配列が挿入された部位において、プラスミドが第２の抗生物質分解活性に関しコードする抗生物質耐性標識でなされ得る。粗換え型プラスミドを適当に含有する宿主細胞は、そして、最初の抗生物質に対する耐性および第２の抗生物質に対する感受性により特徴づけられる。宿主細胞への組換え型プラスミドの単なる挿入および修飾宿主の単離は、望まれる遺伝子産物の重要な量が産生きれることをそれ自体において保証するものではない。これを起こずためには、外来の遺伝子配列は、プロモーターと呼ばれるＤＮＡ転写のためのプラスミド中のシグナル領域に、特有の関係において融合されなければならない。あるいはまた、外来のＤＮＡは、宿主によって認識される間、それと共にそれ白身のプロモーターを運ぶこともできる。その起源が何であっても、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導＜ＤＮＡ配列であり、そしてそれゆえＤＮＡのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ＞への転写を「プロモートする」ものである。大量のｍＲＮＡを提供し得る強力なプロモーションを与えると、望まれる遺伝子産物の終局の産生は、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の効果に依存したものとなる。これは、いいかえれば、ｍＲＮＡへのリポソーム結合の効率に依存するものである。エシェリキア・コリにおいて、ｍＲＮＡ上のリポソーム結合部位は、開始コドン（ＡＵＧ）および上流のシャインーダルガルノ（ＳＤ）配列を含むものである。３〜９の長さのヌクレオチドを含み、そしてＡＵＧから３〜１１の長さのヌクレオドに位置されたこの配列は、エシェリキア・コリ１６３リポソームＲＮＡ（ｒＲＮ△）の３°末端に相補的でおる〔シャインとダルガルノ、ａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ　２５４　：　３４　（１９７５）　］　）。ｍＲＮＡへのリポソーム結合は、おそらく、ｍＲＮＡ中のＳＤ配列と１６３ｒＲＮＡの３ ″末端での配列との間での塩基対合により促進されているらしい。形質発現を最大化するための観察に関しては、ロバーツとローア−、メンツズ　イン　エンザイモロジイ　支足：４７３　（１９７９＞　［Ｒｏｂｅｒｔｓ　ａｎｄ　１−ａｕｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６旦：４７３　（１９７９）］を参照のこと。ヒトおよびブタ起源性のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリからのＬＴプラスミドの他の微生物中への導入が最近ネイルら［Ｎｅ１ｌｌ　ｅｔ　ａｌ、］　（インフエクト、イム人旦：　１０５６　（１９８３）　［Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、旦：１０５６　（１９８３）］　）によって示されている。この研究において、エシェリキア・コリからのＬ丁プラスミドは、エシェリキア・コリに−１２［旦、Ｃｏ１１Ｋ−１２コ株中への、ならびにシゲラ・フレクスネリ［５ｈｉｇｅｌｌａ　ｆ’１ｅｘｎｅｒｉ］、シゲラ・ソンネイ［Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｉ］　、シトロバクタ−・フロインデーｒ　［Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉｌ、エンテロバクタ−Φクロアカニ［Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅｌ、クレブシェラ赤ニューモニエ［Ｋ　Ｉｅｂｓｉｅｌ　ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＪおよびサルモネラ◆チフィムリウム［３ａ１ｍＯｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍＵｒｉＵｍ］の株中への接合により移植されている。このトランスコンシュガント（被接合体）の分析は、すべての場合において、伝達されたプラスミドはこれらの宿主において安定に維持されていたことを示した。同相ラジオイムノアッセイによって計測されたＬＴ形質発規は、広く変化したが、エシェリキア・コリにおいて生起する最大のＬＴ産生を有するものであった。遺伝子工学技術がまた、ＬＴのＢサブユニットを製造するために用いられることができる。ダラス［Ｄａｌｌａｓｌ　（１＆州特許出願一連番号第００６０１２９号〕は、ブタ起源の単離エシェリキア・コリからのＬＴ−Ｂに関するクローニングおよび遺伝子コードづけを述べている。ＬＴのＢサブユニットをコード化するシストロンは、ＥＷＤ２９９をＥＣＯＲｌで切断し、そして１亜ＲＩ切断されたＩ）Ｊ　Ｊ　Ｓ　５００にこのＤＮＡを連結反応させることによりベクター１）ＪＪＳ５００中にクローニングされる。この出願は、明白なＬＴ−へ汚染のないプラスミド特異化り丁−Ｂ産物がこのように得られたこと述べている。この遺伝子産物に基づいた、この請求の範囲を支持する証拠が何ら示されていないこと、生体内［堕血コまたは試験管内［ｉｎ　ＶｉｔｒＯ］研究を何らあげていないこと、および成功した抗体産生の開示がないことを指摘すべきである。ヤマモトら［Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、］　（ジエイ、バクチリオル、１４８：９８３　（１９８１年＞　［Ｊ、　３ａｃｔｅｒｉｏ１．ユ土旦：９８３　（１９８１）］　）は、ヒト　エシェリキア・コリ単離体からのＬＴ−ＢＪｊｌ伝子のプラスミドｐＢＲ３２２中へのクローニングを述べている。遺伝子産物のいくらかの発現は、放射線標識化アミノＭ混合物中に修飾細菌を成長させ、そして次に５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により粗細胞溶解物を分析することによって検知された。しかしながら、ＬＴ−８タンパク質を精製するないし特徴ずける努力が何らなされておらず形質発現のレベルその他の研究において、サンチェズら［３ａｎｃｈｅｚ　ｅｔ　ａｌ、１（エフイーエムニス　ミクロパイオル、レット、１４：１　（１９８２年）　［ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌ　ｅｔｔ、１４　：１　（１９８２＞］）はヒト単離体からベクターｐＡ　ＣＹ　Ｃ１８４中へＬＴ−８遺伝子をクローニングした。これもまた、遺伝子産物を精製することも特徴ずけることも行なっていないものでめった。３、発明の概粟方法Ｊ３よび組成物は、エンテロトキシン産生性王シ工１ツキｉ）・］り株の熱不安定性エンゾロトキシンの非毒性ザブＪ−ニット（ＬＴ−８）に関してコード覆る遺伝子の単細胞宿主有機体におけるクローニングおよび発現を提供するものである。Ｌｔ−Ｂ＠産生するための修飾宿主の選択および培６の方法、ならびにこの産物の単離および精製の方法もまた述べられる。このように産生された１−ｒ−Ｂは、いくつかの重要な免疫学的ブ［１セスに関する本発明の方法によって利用され得る。それ

【Ｊｏ、家畜および人類医学にあける利用性を有するツクチンのｙＩ造に関し処方され得る。受動的投与によって、このような「ツクチンからの抗体は、人類におけるおよびその他の吐乳類種におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症の予防およ（ｆ／または治療に用いられ得るものでおる。免疫学的診断試験における利用によって、同様の抗血清が、コレラ様エンテロトキシンの検知に適用され得る。本明細書中に用いるように、「コレラ様エンテロトキシン」なる用ｎｎは、コレラ毒素およびＬＴ、ならびにエシェリキア・コリ、ビブリオ・コレラもしくはその他のグラム陰性腸内細菌によって自然産生された免疫学的に関連したエンテロトキシンないしサルモネラ［Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌ　ＩａＪ、エルシニア［Ｙ　ｅｒｓｉｎｉａｌ、シュードモナス［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］　、シゲラ［３ｈｉｇｅｌ　ＩａＪ、シトロバクタ−［Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ］　、クレブシェラ［Ｋ　１ｅｂｓｉｅｌ　ｌａｌおよび同様なものの株を包括する意味での任意の微生物中においてコレラ毒素、１−丁あるいはこのような関連したエンテロキシンをコード化する遺伝子の発現によって産生された免疫学的に関連したエンテロキシンを意味するものである。完全なＬ丁エンテロトキシンのそのＡおよびＢサブユニットへの化学的分離よりあるいは遺伝子クローニングより誘導された、今までに考察されてきたすべてのその他のＬＴ−Ｂタンパク質と異なり、本発明の産物は、非毒性である。この毒性効果からの一般的でない解放は、免疫処置法にあける使用に本発明が唯−好ましいものであることを与えるものである。本発明のＬＴ−８をその他の方法によって産生された毒性形態と区別するために、これを非毒性ＬＴ−Ｂ　（ＬＴ−ＢＮＴ＞と呼称する。４、【図面の簡単な説明】本発明【、土、以下の図面に関連させることによってより容易に（化１与を縮少することなく）理解されるであろう。第１図は、エシェリキア・］りのヒト単離体のＥｎｔプラスミドからのＬＴ）Ｍ信子を含有する５、２ｋｂ　フラグメン１へが挿入されている、１）ＢＲ３２２から誘導されたＬＴ発現プラスニミドであるＩ）Ｄ）８２の製造の図式的表現である。第２図は、Ｌ−「−Ｂ遺伝子を含みかつ−）１ｉｎｄｌＩＩ切断によってプラスミドｐｆ）　Ｆ　８２から誘導されたＱ、８Ｋｂフラグメントのｐｕｅａのシングル）−１ｉｎｄＩＩＩ部位への挿入によるプラスミドｐＤＦ８７の溝築の図式的表現である。第３図は、ＩＴ−Ｂｍ伝信子含みかつプラスミドＤＤＦ８７から誘導された０、８ＫｂフラグメントのｐＵＣのシン５、発明の詳細な説明本発明は、エンゾロトキシン産生性細菌株の完全に非毒性の生物学的不活性サブ −ユニットを産生するための遺伝子スプライシング方法論の使用に関するものである。本発明はさらに多価抗血清の製造のための免疫原としての精製サブユニットの使用に関するものでおる。このような抗血清は、人類にｊ３けるあるいはその他の哺乳類種にあける、エシェリキア・コリ、ビブリオ・コレラあるいはコレラ様エンアロトキシンを産生ずるその他の細菌の株による腸感染をその原因として有する下痢症の予防および治療への適用性を有するものである。この抗血清はまた、これらの微生物のコレラ様エンテロトキシンの存在に関する診断試験の準備に有用である。例示の目的のために、本発明の方法は、１つの実施例としてエシェリキア・］りの１つの特定のエンテロトキシン産生性株を用いて詳述される。この微生物がヒト！ｔ［体でおるという事実は、人類における使用により有効な抗血清を導くものでおる。しかしながら、ヒトの、ブタのおるいは他の起源のものであろうとなかろうと、多くのエンテロトキシン産生性株の毒素の匹敵するサブユニット間の強力な交差反応性があることを強調しなければならない。これゆえ、本発明は、この目的のためのこれらの任意のものの潜在的使用を期待するもので市り、そして本明細書中に述べられた方法はこれらすべてに均等に適用できるものでおる。本発明の方法は、論理的筋道において、（１）ＬＴ−８をコード化する遺伝子またはそのフラグメントの同定およびｌ、（２）この遺伝子またはそのフラグメントの適当なりローニングベヒクル中への挿入、（３）この遺伝子学的に変性されたクローニングベヒクルの適合性単細胞宿主有機体中への移植、（４）挿入された遺伝子配列を複製しかつ発現し得る適当に修飾されたクローニングベヒクルの選択および成長、（５）Ｍ信子産物の同定および精製、（６）抗体産生のための遺伝子産物の使用、および（ア）治療学的、予防学的および診断学的目的への特定の抗体の使用を含むいくつかの段階を伴うものである。５．１．１丁遺伝子の同定および単離ＬＴの産生に関する遺伝子およびそのサブユニットは、エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株のプラスミド（Ｅ　ｎｔ　プラスミド）上に担持される。これゆえ、エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされている人類おるいは他の哺乳類種からの糞便試料は、必須な遺伝子配列の粗製の源として与えられ得る。これらの源からの単離体は、当業者に十分公知である標準的微生物学的技術を用いて十分な量で増殖され得る。不適当なことには、エンテロトキシンを生成する能力は、Ｅｎｔ　プラスミドを担持し、かつエンテロトキシンを産生するエシェリキア・コリの株における選択価を何ら授与しない。エシェリキア・コリに−１２のような安定な研究室型株中へのＥｎｔ　プラスミドの移植を監視するために、望まれる第１段階として、おる方法においてプラスミドを標識することがこれゆえに必要である。本発明の例示される実施態様において、エシェリキア・コリＨ１０４０７［旦、Ｃｏ１１　Ｈ１０４０７コのヒト単離体のプラスミドは、サンソネッティら［５ａｎｓｏｎｅｔｔｉ　ｅｔａｔ、］　（インフエクト、　イム／、３４　：　７５　（１９８１年＞［Ｊｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３４ニア５　（１９８１）］）によって述べられたようなＦ″ｔｓｌａｃ：　：丁ｎ５プラスミドからの転位によって表現型的に標識をつけられた。この標識されたプラスミドは、次に、Ｋ−１２株７１１への接合によって移植され、そしてＬＴ−産生トランスコンシュガントが選択された。このトランスコンシュガントは、ガイルスら○（１９７４）］　）がＨ１０４０７においてエンテロトキシンを産生するプラスミドに特有なものであることを示している１つのサイズ（６Ｘ１０７ドルトン）の２つの大きなプラスミドを含むものであった。トランスコンシュガントがＬＴを産生じた事実の証明は、ＬＴに対して産生きれた抗体を用いて、酵素結合免疫吸着剤検定法によって、および培養マウスＹ−１副腎細胞における形態学的変化のＭ導により測定されるような生物学的活性によってなされた。このように移植されたプラスミドは、ポリバーとバックマン［３ｏ１ｉｖａｒａｎｄ　Ｂａｃｋｍａｎ］の−２６７（１９７９）］　）によって単離され、特定のＬＴ遺伝子配列は、制限エンドヌクレアーゼ切断によって単離された。例示される実施態様においては、精製されたＥＮＴプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼｐｓｔ　１で切断されたが、ＬＴ産生（および続くＬＴ−Ｂ産生）が臨界遺伝子領域における切除によって破壊されない限り、いかなる制限酵素ないしこれらの組合せも用いられ得る。選択された特定の酵素は、用いられたクローニングベヒクルにおける単一切断を行なうものであることが好ましい。この第２の要求を満たすことは、多くの通常用いられるクローニングベヒクルの詳細な制限マツプが得られうるゆえに、容易に達せられる。適当な切断が、ＥＮＴプラスミドにおいておよびクローニングベヒクルにおいて（木実施例においてはプラスミドｐＢＲ３２２）Ｐｓｔ　Ｉによってなされると、しＴ遺伝子フラグメントは、適当な結合酵素の使用によってクローニングベヒクルに結合された。結合酵素の代表物は、エシェリキア・コリからのおよびバクテリオファージＴ４からのＤＮＡリガーゼである。このような酵素は補因子としてのＡＴＰあるいはＮＡＤ　と共に、リン酸ジエステル結合を形成する。ＬＴ　ＤＮＡ　フラグメントを含むこれらの組換え型ＤＮＡ分子での宿主細菌細胞の形質転換は、必須のＤＮＡの複製の発生を与え、そしてこれは次に上記したようなＬＴの産生に関して分析され得、あるいはＬＴ−Ｂのみの産生に関しコードづけされる特定の遺伝子フラグメントのこれに続く単離に関するプラスミドＤＮＡの源として使用され得る。ＬＴ　ＤＮＡ制限フラグメントのクローニングベヒクル中への挿入は、ＥＮＴプラスミドおよび上述のクローニングベヒクルが同じ制限酵素で切断された場合に、相補的ＤＮＡ末端がこれにより産生きれるゆえに容易に達成され得る。これが達成され得なかったとすると、プラント末端を産生するために一本鎖ＤＮへを消化し返すことによって、あるいは一本鎖末端を適当なりＮＡポリメラーゼで満たすことにより同様の結果を達成することによって、産生きれる切断末端を修飾する必要がある。この方法において、Ｔ４リガーゼなどのような酵素とのプラント末端の連結反応が行なわれる。あるいはまた、望まれる任意の部位が、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカ−）を連結させることによって産生される。このようなリンカ−は、制限部位認識配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列から構成される。切断されたベクターとＬＴ　ＤＮＡ　フラグメントはまた、モロ−［Ｍｏｌｌｏｗ　］　（メソツズ　インエンザイモロジー　昼旦：３　（１９７９年＞　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍＯｌｏｇｙ　６８　：３　（１９７９）コ〕によって述べられるような単独重合性ティリング［ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ］によっても修飾され得る。ＬＴＷ伝子信子るいはそのフラグメントの単離の代用手段としては、遺伝子配列く公知である場合）の化学的合成あるいはＬＴ遺伝子をコード化するメツセンジャーＯＮΔに相補的であるＤＮＡの調製などが含まれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。５．２．ＬＴ−８遺伝子の同定および単離ＬＴ−８の産生に関してコードする遺伝子フラグメントは、ＬＴ−Ａの産生に関してコードする遺伝子フラグメントに隣接しそして下流に位置する。これらの特定の遺伝子フラグメントを側面に持つＬ丁遺信子の内にいくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位が必る。これゆえ、制限酵素は、研究（１−ＴｍＢ）下のフラグメントに関する溝造遺信子中へ切断しないものが選ばれる。同定されそして中離されると、ＬＴ−ＢＪ伝信子いしは遺伝子ノラグメン１へは、挿入された遺伝子配列の転写および翻訳に関する必須Ｊレメン１−を含む適当な発現ベクター中へ挿入される。１丁−Ｂサブユニットに関するプロモーター領域は、通常Ａザブユニット遺伝子によって供給され、そ１ノでこの毒性産物はなくされるへきであるゆえに、発現ベクターは、１丁−Ｂ遺伝子を有する配列において読まれ得るそれ自信のプロモーターを含むべきで必る。１丁−Ｂ遺伝子が挿入され得るプラスミドの多くは、このようなプロモーター領域、例えばわずか２つの例ではあるがプラスミドｐＢＲ３２２のテｊ〜ラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミドｐｕｃａのラクトース遺伝子など、を含むものである。１丁−Ｂ遺伝子ないし遺伝子フラグメントの十分な転写は、さらに特定の開始信号の存在に依存する。通常用いられる１つの信号は、ＡＴＧ配列である。ＡＴＧ配列の源は、大腸菌ファージ　λ　［ｃｏｌｉｐｈａｇｅ　Ｉａｍｂｄａｌの旦もしくはＮｊｊｔ伝子お信子エシェリキア・コリ　トリプトファンＦ、Ｄ、Ｃ，ＢもしくはＡＩ伝信子どを含むが、もちろん何らこれらに限定されるものではない。このような開始配列は、ＬＴ−８遺伝子ないしフラグメントが挿入され得る他の遺伝子配列の多くの中に見出され１弾、そしてこれらは、また合成的に製造され得る。強力な翻訳は、十分なリポソーム付６を容易とするシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列の有効性に結びつけられる。このようなＳＤ配列は、十分なメツセージ読み出り、のために、プロモーターと開始信号の間にさしはざまれな（ブればならない。ＬＴ−８タンパク質の目的とする高レベルの産生は、これゆえ、プロモーター、ＳＤおよび開始配列より下流のし゛ｒ−ＢＭ伝子配列信子入に依存する。これらの要求に合致する故多くのクローニングベヒクルが用いられ得、ＳＶ４０、アデノウィルス、酵母、λ　ｑｔ−ＷＥＳ−λＢ　シャロン４Ａおよび２８［１ａｍｂｄａ　ｇｔ　−ＷＥＳ　−ｌａｍｂｄａ　Ｂ　Ｃｈａｒｏｎ　４△ａｎｄ２８］、λ−ｇｔ−１−λＢ１例えばｐｕｃａ、ＤｔＪＣ９、ｐＵｃ１８およびＤＵＣ１９、ｐＢＲ３１３、ＤＢＲ３２２および１）ＢＲ３２５、ｐΔＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＡＣＹ１７７、ｐＫ　ｌ−１４７、Ｉ）ＡＣＹ１８４、ｐｌＪＢｌｌｏ、ρＭＢ９、Ｃ０１Ｅ　１、Ｉ）ＳＣＩＯＩ、ＯＭ　ｌ−２１、Ｒ３Ｆ２１２４、ｐＣＲゴまたはＲＰ４などのようなＭ１３由来ベクターなどがこれに含まれるが、もちろんこれらに何ら限定されるものではない。これらのり１」−ニングベヒクルの多くは、ｐＢＲ３２２におりるアンピリジンおよびテトラザイクリン耐性ならびにｐｕｃｓにおけるアンピリジン耐性および β−ガラクトシグーゼ活性などのような、望まれたトランスフォーマン１〜（被形質転換体）のために選択することに用いられ得る１ないしそれ以上の標識活性を含んでいる。選択は、このようなベクターが挿入される宿主細胞が、このような活性を全く含んでいない場合、および活性の１つがＬ　Ｔ　−８遺伝子ないしは遺伝子フラグメントの挿入によって失なわれた場合に慢めて単純化される。粗換えクローニングベクターの宿主細胞中への移植は、種々の方法において実行され得る。選ばれた特定のベクター／宿主細胞系に依存して、このような移植は、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによってもたらされる。産生されたしＴ−Ｂサブユニツ１〜の質および呈に依存して、１ないしそれ以上のクローンが調製すれるべきで市る。本発明の例示される実施態様においては、ＬＴ−Ｂｍ伝信子連続して２つのプラスミドル８Ｒ３２２中にそして最終的にプラスミドｐｕｃａ中に移植すること必要であった。この複数のクローニング連続は、すべてのクローンが１丁−８タンパク質を産生する一方、ｏＢＲ３２２組換え体がＬＴ−８の低いレベル（およそ１ｍぴ／、Ｑ）を産生じそして毒性遺伝子産物をもたらしたという事実によって必要とされた。この毒性は、上記第６．２．２節において詳述されるＹ１副腎細胞検定系にあける分析によって明らかにされた。この毒性の根拠は理解されていないが、毒性ＬＴ−八サへユニットは調製物中に検知されなかった。本明細書中に述べる特定の実施態様においては、野生型エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株中に存在するより５０４ｇ高いレベルで最終り丁−ＢＮ丁産生が達せられた。５．３．ＬＴ−ＢＮＴの精製エシェリキア・コリに−１２において産生きれるように、ＬＴ−ＢＮＴはペリプラスム間隙にとどまる。本発明の望まれるサブユニット産物を遊離するために、外膜を破壊することがこれゆえ必要とされる。これは好ましくは、音波処理によって、あるいは、フレンチプレッシャーセル［Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌｌなどのような他の機械的破壊手段によって達せられる。細胞破壊はまた、化学的または酵素的手段によっても達成され得る。２価カチオンが細胞膜完全性にしばしば要求されるゆえに、ＥＤＴＡヤＥＧ丁Ａなどのような適当なキレート化剤での処理は、細胞よりのＬＴ−ＢＮＴの漏洩を容易とするのに十分な破壊を与えるであろう。同様に、リゾチームなどのような酵素が、ＬＴ−ＢＮＴ以外のタンパク質で同様の結果をもたらすために用いられている。この酵素は、細胞壁のペプチドグリカンでの中心的支持力を加水分解する。しかしながら、以下に述べる本発明の特定の例示においては、リゾチームは回収され得るＬＴ−ＢＮＴの６０％損失をもたらした。浸透圧衝撃の適用がまた用いられ得る。簡単に言えば、これは、水を損失するおよび収縮することを細胞になさせる高張液中への細胞の第１の配置によって達せられる。これに続く低張「衝撃Ｊ液中への配置は、次に望まれるＬＴ−ＢＮＨの排除を伴なう細胞中への水の迅速な流入を導く。細胞から遊離されると、ＬＴ−ＢＮＴは、硫酸ナトリウムあるいは硫酸アンモニウムなどのような塩を用いての沈降反応、限外濾過あるいは当業者に公知であるその他の方法によって濃縮され得る。さらに精製は、ゲル濾過法、イオン交換クロマ１へグラフィー法、分離用ディスク−グルあるいはカーテン電気泳動法、等電点分画電気泳動法、低温有機溶媒分画法または向流分配法などを含む（もちろんこれらに限定されるわけではない。）周知のタンパク質精製技術によって達成され得る。しかしながら精製は、好ましくは、アガロースに結合する親和性である、ＬＴ、ＬＴ−ＢおよびＬＴ−ＢＮＴの固有の特性の利己的利用によって行なわれる。完全毒素と８サブユニツトの双方が、アガロースのガラクトシル残余物に、強固に結合する。これゆえ、ＬＴ−ＢＮＴは、ＬＴ−ＢＮＴを含む溶液のアガロースカラムを通しての通過に伴なう該サブユニットの選択的保持によって最もよく精製される。結合させそして、緩＠液でカラムを洗浄して他のタンパク質を除去すると、該サブユニットは、カラムを通してのガラクトース含有溶液を通過させることにより遊離される。このアフィニティークロマトグラフィー的な技術は、エシェリキア・コリに−１２が、ラフ型細菌株であるゆえに、これを用いて」−分に作用する。野生型株は、それらの外膜中のガラクトシル残余物に産生されたＬＴ−ＢＮＴを結合し、そして該サブユニットの非常にわずかの量がこれらの株よりアガロースカラム上に回収され得る。これゆえ、この技術が野生型株を用いて特別な場合に首尾よく用いられ得るが、最良の結果は、ＬＴ−ＢＮＴ遺伝子が挿入されたエシェリキア・コリに−１２で得られ。る。５．４．ＬＴ−８に対する抗体の調製および使用本発明の１つの目的は、組換えＤＮＡ技術による、エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌の熱不安定性エンテロトキシンの非毒性サブユニットの産生である。このようなサブユニットは、次にヒトにおけるあるいは他の動物におけるコレラ様細菌誘発性下痢症感染に対する防御免疫学的応答を生むためのワクチンにおける免疫原として用いられ得る。ＬＴ−ＢＮ丁サブユニットが、すべてのエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株のおよびビブリオ・コレラの熱不安定性エンテロトキシンに抗原性的に関係するゆえに、このような予防接種は広範な免疫を与える。本発明の産物が生物学的に不活性でかつ完全に非毒性であるという事実は、完全毒素あるいは微生物を用いては、たとえ後者が殺されたあるいは弱毒化されたものであったとしても得ることのできない安全性の度合を有して用いられ得るということを保証するものである。上記の第５．３節において述べたような精製の後に、単離ＬＴ−ＢＮＴサブユニットは、ワクチンとして直接に用いることができ、また適当な濃度で予防接種のためのアジュバント中に取込ませることもできる。このような適当な濃度は、当業者に公知であるか、または定型的な実験によって決定できるものである。動物の予防接種に適当なアジュバントは、フロイント完全もしくは不完全アジュバント（ヒトもしくは家畜使用には適さない。）、アジュバント６５（ビーナツツ油、マンニドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバンなどのようなミネラルゲル；例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ１−Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’　−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよび深成多価アルコール類［ｐｌｕｔｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌＳ］などのような界面活性剤；例えば、ピラン、デギストラン硫酸、ポリ■Ｃ１ポリアクリル酸、カルボポル［ＣａｒｂＯＤｏｌｌなどのようなポリアニオン；例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンなどのようなペプチド；ならびに油エマルジョンを含むが、もちろんこれらに限定されるわけではない。しＴ−ＢＮＴはまた、リポソームもしくは他のマイクロキャリアー中への取込みに続いて、またはポリサッカライド、その他のタンパク質もしくはその他のポリマーへの接合の後に投与され得る。本発明の例示する実施態様は、非常に免疫原性であると判明したので、高い抗体力価はマウスにおいてアジ１バンドの使用なしに得られた〔下記、第６．６．１節参照のこと。〕。この様式における能動免疫によって、家畜、その他の飼育動物および人類の防御が達成され得る。このような防御は、主として十分な分泌型１（ＩＡ不応答発生に依存するものである。この理由のため、および最も下痢症感染を受けやすい場合、ヒトおよび他の哺乳類新生児が、かなり免疫学的不適格者であるゆえに、受動的免疫アプローチがとられることが好ましい。従って、抗ＬＴ−ＢＮＴ抗血清は、ヤギ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ウマなどのような広範な哺乳類種において、あるいは鳥類様において製造され得、そしてＩｇＧ分画が血漿分離交換法あるいは他の手段によって単離された。この分画は、次に適当な担体あるいは例えば幼児処方または幼児穀物などのような幼児食物を介してヒ１へ幼児に投与されることができた。家畜に関しては、免疫グロブリンは、家畜飼料あるいは適当な薬理学的賦形剤中への混合の後に与えられることができた。特別の利益の家畜は、新生子ブタ、子ウシおよび子ヒツジである。本発明の免疫グロブリンは、液体または固体の薬理学的担体のいずれとも混合されることができ、また、この組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、懸濁液または溶液の形態であり得る。この組成物はまた、適当な保存桑、着色ｉｊ５よび風味剤、あるいは徐放をもたらす試薬を含むことがでさる１１本発明の桑理学的粗成物の調装置４＝用いられｉｑる可能性のある担体としては、ゼラチンカプセル、糖、カルボギシメチルセルロースナＩ・リウム塩などのようなセルロースＭ４体、ゼラチン、タルク、ステアリン酪マグネシウム、ビーナツツ油などのような野菜油、グリセリン、ソルビトール、寒天Ｊ５　、Ｊ：び水などが含まれるが、もちろんこれらに限定されるわけではない。担体は、また便利な口中投与のための組成物の錠剤化を容易とするために結合剤として与えられる。もちろん、単クローン性抗体も、同様の結果を達成するためにこの技術によって製造され得る。ＢＩＩＩＩ胞などのような、抗体を産生する能力を有する体細胞が、ハイブリドーマ細胞を産生するために、Ｂ細胞骨髄腫系細胞と融合される。このような細胞は、試験管内であるいは腹水腫瘍として、大半の特異的抗体を産生ずるために定Ｎ（なくｊ？ｉ養された。ハイブリドーマ細胞は容易にクローン化されるゆえ、数多くの細胞を迅速に産生することができ、この細胞のすべてが、共通抗原決定基に指向した同様の特異的抗体分子を産生ずるものである。抗体産生にお【ブるこの例外的な均一性は、抗体が特異的診断学試験において用いられなければならない場合に有利である。抗原の注射によって準備された動物のリンパ節および稗臓は、Ｂ細胞の有効な源で必り、一方、これらの細胞を感作されていない動物から除去し、これを単離の後に試験管内で準備することも等しく可能である。マウスおよびラットのＢリンパ球がバイブリド−７産生にもつとも煩繁に用いられるが、ウサギ、ヒト、カエルまたはその伯の動物からの細胞が代わって用いられ得る。多くの特殊骨髄腫細胞系が、ハイブリドーマ産生における使用に関して、リンパ球性腫瘍より発展してきている〔コーラ−とミルスティン、ユーロツブ、ジエイ、イムツル、６：５１１〜５１９　（１９７６年）：シュールマンら、ネイチャー　２７６　：　２６９〜２７０　（１９７８年）　［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅ、Ｊ、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、６　：　５１１−５１９　（１９７６）　；Ｓｈｕｌｍａｎｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９−２７０　（１９７８）］　）。産生された多くのこのようイγ釧胞系の中で、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ３、Ｐ３／ＮＳＩ／　１−ＡＯ４−１、ＳＯ２１０− Ａｇ１４および３１９４１５、ＸＸＯ，ＢＵ、’ｌが類繁に用いられている。本発明の実施例においでは、Ｘ６３−Ａｇ３．６５３と呼称されるマウス骨髄ＩＩ！細胞系が好ましい。ハイブリドーマを産生ずるための、抗体産生ずる牌繊ａるいはリンパ節細胞の、骨髄腫細胞との融合は、代表的には、より低い割合が用いられるが２０：１程度の高さでありうる骨髄腫細胞よりも牌細胞またはリンパ球過剰な状態において通常行なわれる。融合は、紫外線不活化センダイウィルスまたはポ１ノ丁チレングリコール（ＰＥＧ）などのような融合促進剤の使用によって容易とされる。ゲッターら［Ｑｅｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、］　（ツマティックセル　ジエネット。３：２３１〜２３６　（１９７７年）　［３０’ｎａｔｉＣＣｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、３：２３１−２３６　（１９７７）］　）は、ジジメチルスルフキキシのＰＥＧとの組合せはさらに綱胞隔合を高めることを報告している。例外的に高い度合の効率で細胞を融合し１ｑる電気的用具がまた利用できる。融合が起こると、ハイブリドーマ細胞は融合されなかった親細胞株より選択されなければならない。この選択プロセスは、バイブ１ノドーマ細胞増殖を支持するが親季ｍ胞層殖は支持しない培地中における細胞培養によって容易に達成され得る。融合に用いられた体Ｂ細胞は培養における限定された寿命を有し、そしてこれゆえこれらが老衰および死滅を受ける時に失なわれるが、定限のない培養寿命を有する親骨髄腫細胞は、特別の選択技術によって消去されなければならない。本発明の実施例においては、ヒポキザンチンホスフォリボシルトランスフエラーゼを欠いた（ＨＰＲＴ−）骨髄腫細胞が用いられた。これらの細胞は、ヒポキサンチン遊離塩基の再利用に関するスカベンジャー経路を欠き、そしてアミノプテリンなどのような阻止因子がプリン新生経路を阻害するために用いられる場合には、生存できないものである。骨髄腫親細胞はこれゆえ、ヒボキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）媒地中に融合混合物を培養することに抗して選択され、一方ハイブリドーマ細胞は、抗体産生性融合親細胞によるＨＰＲＨの寄与により生存する。選択培養の期間の後、生存するハイブリドーマ細胞はクローン化され、株は標準細胞培薔法によって増殖され、そしてクローンが産生する所望の特異的免疫グロブリンは、抗体が指向する抗原の使用によって、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、おるいはその他の試験によって検知される。本発明の使用によって得られうる抗ＬＴ−ＢＮＴ抗体はさらにエンテロトキシン診断試験の調製のために用いられ得る。このような診断系は、遊離溶液あるいは同相におけるラジオイムノアッセイ（放射線免疫検定法）の形態を取り１与る。あるいはまた、酵素結合免疫吸着剤検定法が・イムノプロット［ｉｍｍｎｏｂｌｏｔ］分析に基づく検定法であるゆえに作成され得る。これらの検定法は、直接のものであってもあるいは抗ＬＴ−ＢＮＴ抗体に指向する第２の抗体の適用を用いる間接のものであってもよい。可能性のほんのわずかであるペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼなどと共に、数多くの酵素活性が抗体に結合され得る。当業者はまた、例えばいくつかの凝集試験の１つにおけるような、診断学的立場において抗ＬＴ−ＢＮＴ抗体が利用され得るその他の多くの用途があることを認識できよう。このような凝集検定においては、抗体と任意のコレラ様エンテロトキシン産生性細菌性エンテロトキシン（あるいはそれからの結合サブユニット）との相互作用は、粒子が抗ＬＴ−ＢＮＴ抗体で被覆されている系を用いて検知される。このような粒子は、ラテックスビーズ、リポソーム、赤血球、ポリアクリルアミドビーズあるいはいくつかの適当なポリマーの任意のものでありうる。本発明においては、ＬＴ−ＢＮＴ遺伝子の源は、ヒトエンテロトキシン産生性単離体、Ｈ１０４０７のＬＴ−８丁プラスミドを含むに一１２トランスコンシュガントである、エシェリキア・コリア１１（１０４０７）であった。この株は、ｌ”ｔＳ　ｌａｃ　：　：丁ｎ５プラスミドからの転位によりエシェリキア・コリＨ１０４０７のエンテロトキシンプラスミドを表現型標識し、そしてＴｎ　５標識化プラスミドをエシェリキア・コリに一１２株７１１に接合移植することによって誘導された。このプラスミドは、Ｌ丁遺信子を含む微小なりＮＡフラグメントを得るために制限酵素によって切断された。このＤＮＡフラグメントは、次にＤＢＲ３２２プラスミド中へ連結反応され、ｐＤ　Ｆ　８２と呼称されるプラスミドを産生じた。このプラスミドを抱くエシェリキア・コリに一１２トランスフォーマントは次に、抗生物質耐性標識を基礎として選択された。このトランスフォーマントによるＬ丁産生は、酵素結合免疫吸着剤検定および副腎細胞検定系を用いて確証された。クローン化しＴ−Ｂ　ＤＮＡ領域は、固定され、その後最初にプラスミドｐＤＦ８７を与えるためにｐＢＲ３２２プラスミド中へそして次にＭ１３由来クローニングベクターｐＵｃａ中へと２度再クローニングされた。得られた組換え型プラスミドｐＪＣ２１７は、エシェリキア・コリに一１２中への形質転換ならびに抗生物質耐性および酵素活性標識損失による選択ののちクローニングされた。ｐＤＦ８７および生ＬＴ−８より免疫学的に識別されないが完全に非毒性である、ｐＪＣ２１７より回収されるＬＴ−ＢＮ丁は、次に免疫原としての使用のために宿主細胞溶解物から単離された。構成におけるそれぞれの段階の詳細な説明は次に続く。６．１．１．制限酵素消化の条件用いられた制限酵素は、メリーランド州ガイゼルスブルグのベスエスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、インコーホレーテッド［３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｋａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、。Ｇａ１ｔｈｅｒＳｔ）Ｌｌｒｑ、Ｍａｒｙｌａｎｄコの製品であった。酵素活性の単位は、適当な温度においておよび５０μρの反応混合物全量において、１時間で１．０μ９のλＤＮＡを完全に消化するために必要とされる酵素の量として定義された。消化は、緩衝液２０μｇ中で３０分間３７℃でＤＮＡ２μ３を酵素１０単位とインキュベートすることによって行なわれた。反応は、７０’Ｃに５分間加熱することで停止され、そしてこの全体にわたる条件がベクター　プラスミドＤＮＡ分子当り１つの切断をもたらした。１）ｓｔＩおよびＨ庫ｄｌｌに関しては、緩衝液は、５０ｍＭトリス−１−ＩＣｆｌ（１））−１８，０＞　、１０　ｍＭ　Ｍ（］Ｃｕ　２およ’ＣＦ５０ｍＭＮａＣＪから成るものであった。伯の反応は、本質的に製た業者によって述べられるようにして行なわれた。６．１．２．ＤＮＡ消化産物の精製ＤＤＦ８７の制限酵素処理に続き、消化混合物は、４０ｍＭトリス、０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび２ｍＭＥＤＴΔ（ｐＨ７，８＞中に１．２％低融点アガロースを含む垂直ゲル平板において電気泳動分離にかけられた。電気泳動は、１０ｖ／ｃｍで行なわれ、そして平板は、次にポリバーとベックマン［ｆ３　ｏｆ　１ｖａｒ　ａｎｄ　Ｂ　ｅｃｋｍａｎ］　（メソツヅ述べられるように、臭化エチジウムで染色され、紫外光下で視認化された。分１ｉＳｌｔされたＤＮＡフラグメントは次に、ゲルから切り取られ、ゲルが溶融され、そしてしＴ−Ｂ　ＤＮＡフラグメントがフェノールで抽出された。６．１．３．Ｔ４　ＤＮＡ　連結反応連結反応が、メリーランド州ガイゼルスブルグのベスエスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、インコーホレーテッド［１３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｇａ１ｔｈｅｒｓｂｕｔｃ＋、Ｍａｒｙｌａｎｄ　］から得られたＴ４　ＤＮＡ　リガーゼを用いて行なわれた。Ｔ４　ＤＮＮツリガーゼ活性単位は、３７℃にて２０分間での’ｌｎｍｏｌの３２ＰＰｉ　（７）［ａ／β３２Ｐ１−ＡＴＰ中への転化を触媒するのに要求される量として定義される。ＤＮＡ連結反応は、４°Ｃにて１℃時間でＤＮＡ１μ３当り１０中位の酵素を用いて行なわれた。緩衝液は、ｐｔ−４７゜６で６６ｍＭ１〜リス−ＨＣＪＩ　、６　、６ｍＭ　ＭｑＣ，Ｑ　２．１０ｍＭ　ジチオ１１レイ１、−ルおよび６６ μＭＡ丁Ｐを含むものであった。再循還化を減じるために、いくつかの場合において、プラスミドｐＢＲ３２２は、連結反１芯の前に、セファ　１］−ス１．５ｅｐｈａｒｏｓｅＪに接合したアルカリ性小スフン・ターセで処理された。用いられた酵素は、メリーランド州がイゼルスブルグのへスエスグ　リサーチ　ラボラド１ノーズ、インコーホ（ノーテッドから得られたＭＡＴＥ　−ＢＡＰであった。ＭＡＴＥ−８ＡＰの１単位は、３０分間、３７℃でＡ　Ｔ　Ｐｌｎｍｏｌを加水分解する酵素の聞で定義された。酵素は、１０ｍＭ　トリスート１ＣｆＪ、叶４Ｂ、０中で、ＤＮＡ］μ７当り５００１ｉ位の温度で、６５°Ｃで１時間用いられた。反応に続い一゛（、酵素は遠心ぺｌフッ１〜化によっで除人された。６、′１．４．．形質転換および粗換え体の単向（ニジ２「リキア・コリに一１２株の形質転換は、ポリバーとベックマン［Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｎｄ　ｌ−３ｅ１−３ｅｃｋ　（メソツズ　イン　エンザイモロジイ　並：２４５（１９７９年）ＣＭｅｔｈｏｄｓ　白）　（：ｎｚｙｍｏｌｏｑｙ　６８　：２４５　（１９７９）　」　）　によって述べられたようにしで行なわれた。細１１＋ｇは、３０ｍＭ　ＣａＣ１１２中においでＯ′Ｃで２０分間インキュベートすることで受容能力めるものとされた。次に１０倍濃縮細胞の０．２ｍ１部分標本は、３０ｍＭ　ＣａＣｆ１２で補足された低温連結反応緩衝液０．１ｍｌ中のＤＮＡへ添加され、そして０℃で１時間インキュバー１・された。細胞は次に３７℃へ２分間加熱され、そしてルリアＵＬｕｒｉａＪ　７ｏス（「ブ１コス）４Ｉｎｌ中へ希釈された。１リッ１ヘル当り、１−ブロスは、すべて１ＭＮａＯＨを用いて吐１７．５に調整された、ペクト１ＢａｃｔｏＪｈリプ（〜ン１０５Ｊ、バク１〜酵母抽出物５ｇおよびＮａＣ，Ｉ）１０びを含むものである。３７℃での３時間のインキュベーションの後、１〜ランスフオーマントは、トリブチカーゼ　ソイ　アガール［Ｔ　ｒＶｐｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ａｑａｒ］　ｌ：ビービーエル　ミクロパイΔロシイシステムス、クツキースピル　メリーランド州［ＢＢＬＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　］　）あるいはＹ丁プレートにおいて、下記に述ぺるような適当な抗生物質または酵素活性標識を用いて選択された。昼−２，ｉ−Ｔ！坂チ凧リす近且刃」」症クローニング手順のそれぞれの段階で、ニジ■リキア・コリＫ１２トランスフオーマン１へは、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）によって１−丁またはＬＴ−Ｂ産物の質および量に関して分析された。これらの遺伝子産物の毒性を測定するため、トランスフォーマントはまた、エンテロトキシン産生性エシエ１ノキア・コｌノにあるいはそれらの毒素に曝された細胞が容易に検知可能な形態学的変化を示すマウス副腎細胞検定系によって分析された。６．２．１．酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）クレメンツら「ＣｌｅｍｅｎｔＳ　ｅｔ　ａｌ、ｌ　（インフエクト、イ分析されるべきクローンは、１〜リプチカーゼ　ソイ　ブロス［Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ　］　）　（ビービーエル　ミクロバイオロジイ　システム、クツキースピル、メ１ノーランド州［ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ３ｙｓｔｅｍ、Ｑｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、Ｍａｒ１／１ａｎｄコ〕２０ｍ１中に３７°Ｃで一晩培養され、遠心分離され、０．０５Ｍトワトリス、００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．００３Ｍ　アジ化ナトリウムおよび０．２Ｍ　ＮａＣ，Ｑを含むＭ附液（ＤＩ−１７，５＞２．ｄ中に懸濁され、そしてプランソン　ソニケータ−［３ｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃａｔｏｒ］を用い１００〜１５０ワツトにセットする動力で１２秒間音波処理することにより破壊された。得られた溶解物は、遠心分離によって清澄化されそして０．０５％ツクツーン２０［丁Ｗｅｅｎ　２０コを含むＩ）ｌ−１７，４リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ−丁ｗｅｅｎ）中に分析のために連続的に希釈された。ＥＬＩＳＡは２つの基本的方法を用いて行なわれた。１つの方法においては、ポリスチレン微小力価プレート（コンスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州［Ｃ０ｎＳｔｅｒ、　Ｑａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓ、］　）の窪みは、Ｌ　Ｔ　−８サブユニツトの結合を改善するために、そしてこれにより感度を増加させるために、５０μび／属の■型ガングリオシドＵシグマ　ケミカル　カンパニー、セントルイス、ミズーリー州［ＳｉＯｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、、　３ｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ］で予め被覆された。微小力価窪みは、次に希釈された溶解物試料を含む０．２ｍ１部分標本で満たされ、そして空温で１時間インキュベートされた。インキュベーションに続き、微小力価窪みは、空とされ、そしてＰＢＳ−丁ｗｅｅｎを用いて３回洗浄された。窪みは次に、それぞれ空温にて、ＬＴに対する単特異性ヤギ高度免疫抗血清〔クレメンツら、インフエクト、　イム／、２９：９１　（１９８０年）　［Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　ｅｔｓｌ、、Ｊｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　２９　：９１　（１９８０）　］　）で、またアルカリ性ホスフ？ターゼに接合したウサギ抗−ヤギ抗血清〔マイルス　リサーチ　ラホラ１〜リーズ［ＭｉｌｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１−ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　］　）で、１１時の間連続的に処理された。なお、それぞれの添加に続いて、３回のＰＢＳ−Ｗｅｅｎ洗浄が行なわれた。アルカリ性ホスファターゼ分析は次に、１０％ジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８＞中の１ｍ９／ｍｆ！ｌ）−二トロＭ　ＮａＯＨの２５μｐ部分標本の添加により反応を停止させ、そして結果を４００ｎｍで分光側光的に測定することによってなされた。いくつかの場合において、ホルムグレンとスベネルホルムＣＨｏ１ｍｃ＋ｒｅｎ　ａｎｄ　５ｖｅｎｎｅｒｈｏｌｔｎ’ｌ　（スカンド、ジエイ。（１９７８）］）のＥＬＩＳＡ法の変更体が代わりに用いられた。微小力価プレートは■型ガングリオシドで予め被覆され、そして０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｇ）中の試験されるべき試料の１００μρ部分標本が微小力価窪みの中ヘビヘットにより入れられた。プレートは次に３７°Ｃで４５分間インキ１ベートされ、窪みはＰＢＳ−Ｇで満たされ、インキュベーションがざらに３７ °Ｃで３０分間続けられ、そして、プレートはＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄された。窪みは次に、最初にしＴに対する抗血清を含む、そして次に西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された抗しＴ免疫グロブリンに対して指向した抗血清を含むＰＢＳ−Ｇの１００μρ部分標本を用いて３７℃で４５分間の間連続的に処理された。それぞれのインキュベーション期間に続き、窪みはＰ’Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ分析は、次に、基質としてのＯ−フェニレンジアミンの使用によって行なわれた。この基質は、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ＤＨ５。０１威当り　Ｏ−フェニレンジアミン（シグマ　ケミカル　カンパニー、セントルイス、ミズーリー州［３ｉｐｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏ、、　Ｓｔ、１−ｏｕｉｓ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　コ）１りを溶解することによって使用の直前に調製された。次に、このクエン酸塩緩衝液５０μρ当り０．３％町０２を１ｄ含む溶液の等容量が添加され、０．００６％Ｈ２ｏ２の最籟濃度を得た。基質２００μ ｍがそれぞれの窪みに添加され、プレートは、暗所において室温下３０分間インキュベートされ、そしてペルオキシダーゼ反応は、それぞれの窪みへの４Ｍ　Ｈ２Ｓ○４７５μｆの添加によって停止された。結果は、４９２ｎｍでの吸光度を計測することにより分光測光学的に測定された。西洋ワサビペルオキシダーゼを用いるＥＬＩＳＡは、アルカリ性ホスファターゼを用いるものよりもがなりより感度のよいものでおった。しかしながら、その他の点においては、この２つの系は匹敵するものでおった。６．２．２．Ｙ１副腎細胞エンテロトキシン検定法れた、清澄化細胞溶解物は、サックとサック［５ａｃｋ　ａｎｄ３ａｃｋ］のマウスＹ１副腎細胞系〔インフェクト、イムノ。ニー１　：３３４　（１９７５年）　［Ｉ’ｎｆｅｃｔ、Ｉ　ｍｍｕｎ、ユニ１：　３３４　（１９７５）１　）において毒性に関して分析された。１２．５％ウマ血清、２．５％胎児ウシ血清および４０μ９／μβゲンタマイシンを含むハムのＦ１０培地［Ｈａｍ’ＳＦ　１０　ｍｅｄｉｕｍ　］に維持されたＹ１副腎細胞は、同じ培地を含む７５ｃｔｔｒ培養皿中に植継ぎされ、細胞が集、密［ｃｏｎｆ１ｕｅｎｃｙ］に達するまで３７°Ｃでインキュベートされた。細胞が集密的となると、培地は、エシェリキア・コリＬＴ−８クローン溶解物の一連に希釈された部分標本を含む新鮮な培地によって置換えられ、そして培養株はさらにインキュベートされた。インキュベーションの１８〜２４時間後に、培養株は細胞形態に関して位相差変換顕微鏡を用いて調べられた。ＬＴ毒素の影響下においては、正常な平たい副腎細胞は丸くなる。この検定法の感度は、培地２００μｊ当り粗エシェリキア・コリ毒素０．２μｇめるいは精製ＬＴ１０１）ｇの程度が検知され得るようなものである。６．２．３．エンテロトキシン活性のラット回腸ループ検定法クリプスティンとエンガード［Ｋ１１ｐｓｔｅｎ　ａｎｄ　Ｅｎｐｅｒｔ　］〔インフエクト、イム人λ旦：５９２〜５９９（１９７９年＞　［Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　２３　：５９２−５９９　（１９７９）］〕の方法を用いて、離乳スプラーグードゥーリ−［５１）ｒａｉ７Ｕｅ　−Ｄａｗｌ　ｅｙｌラット（チャーＡｔスリハーフ’）　−７’インク　ラボラトリーズ、ウィルミントン、マサチューセッツ州［Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｏｔｏｎ、Ｍａｓｓ、　］　）は、回腸を露出シソシテ遠位テ１０ｍループを結紮することによって外科手技的に準備された。それぞれの動物は次に、滅菌食塩溶液０．５ｍｌ中のＬＴ。ＬＴ−ＢまたはＬＴ−ＢＮＴをループ中に直接接種によって抗原投与された。１８時間後に、動物は屠殺され、そしてルーブガ流体蓄積に関して調べられた。それぞれのエンテロトキシン濃度で５〜８匹のラットからの値から導き出されたデータは、回腸１　ｃｍ当りの流体蓄積として表わされた。回腸１　ｃｍ当り５０μ９より多い流体蓄積によって示される正の応答は、ＬＴの１μ７程度の少なさで観察された。６．３．特異的ＬＴ−Ｂ産生性クローンの調製および単離第一代クローンにより産生きれたしＴ−８における毒性ゆえに、ＬＴ−ＢＪ伝信子、プラスミドｐＢＲ３２２中にそして次にＭ１３１１１Ｄ７由来ｆ）ｔＪｃ８プラスミド〔ビエイラとメッシング、ジーン三：２５９　（１９８２年）　［Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｑ、Ｇｅｎｅ　１９　：　２５９　（１９８２）　コ　〕中に連続的に移植された。６．３．１　ｐＤＦ８２の単離ヒト単離体Ｈ１０４０７のＬＴ＋ＳＴ＋エンテロトキシン　プラスミドは、制限Ｍ素支足Ｉで切断され、５．２Ｋｂ’ＤＮＡフラグメントが生じた（第１図参照）。しＴｍｍ壬子含んだこのフラグメントは、次にＰｓｔＩで切断され、そしてアルカリ性ホスファターゼで処理されたプラスミドｐＢＲ３２２中へ挿入された。連結反応は丁４　ＤＮ△リガーゼを用いて行われ、ｐＤｔ−８２と呼称される１０゜４Ｋｂプラスミドを産生じた。連結反応混合物は次にエシェリキア＃］すＭＭ２９４ｆ旦、延　ＭＭ２９４１を形質転換するために用いられた。プラスミドρＢＲ３２２はアンピシリンおよびテ１〜ラサイク１尺ノ耐性をコード化りる。このプラスミドが制限酵素１つＳｔ　Ｉて”切断されそジノて［〕ＩＮ八フラへメン）へか挿入された場合、アンピリジン耐性は失なわれるが、テ１〜ラザイクリン耐性は失なわれない。これらの形質転換はそれゆえ、これらの抗生物質を含むＪＲｊ川にお１プる増殖あるいは増殖無能により判断されるアンピリジン感性（ＡＩ）　）およびテトラ（ノイクリン耐性（王ＣＩ′）に関するふるいわけ法によ−）′（甲雌された。２５μ７／威テ１−ラサイクリンを含有する１へリブナ力−ぜ　ソイ　ア万−ル上への５ｔｊ板培ｉＳ化の後に、培養株は３７℃で１８時間インキ１６ベー１へされ１．：。増殖集落は、次にしブ「１ス中にでクローニングされ、部分標本が１００μ９　／　ｔｒｔｌアンピシリンを含有する（−リ１チカーゼ　ソ、イ　アカ−・ル　ブレー１〜」ニヘスポツＩ・されそし゛（３７°Ｃで１８時間インキュベー１〜された。ＡｐＳ丁ｃ　−−ラシヌフＡ　”７ントは次に、Ｙ１副腎細胞系およびＥ　Ｌ　Ｉ　ＳΔ【Ｊよつ−Ｃ１−７丁産生に関して検定された。プラスミドｆ）　Ｎ　Ａ　！。上、ポリバーとバンクマン［Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｎｄ　Ｂａｃｋｍａｎ］の方法〔メソツズ　イン　エンザイモロジイ　６８　：　２４５　（１９７９年＞　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８　：　２４５　（１９７９）　］　）によっていくつかのＬ丁　トランスフォーマン１−から単離され、そして０゜７％アガロース中で電気泳動にかけられた。電気泳動およびＤＮＡ視認化の条件は上記第６．１．２節において述べたようなものである。ｐＤ　Ｆ　８２と呼称される１つの単離体１、土、両方の検定系に陽性であり、また電気泳動において単一プラスミドを示すのみであった。。２旦　■での再切断の際、プラスミド１）ＤＦ８２は、４゜３Ｋｂ　Ｉ）ＢＲ３２２クローニングベクター及び５．２ＫｂＬ下コード化ＤＮＡフラグメン１〜に一致する４つずかに２つのフラグメントを生じた。旦ｓｔｙ、几鵠ＲＩ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、　Ｈｉｎｅ　ＩＩ、　Ｈ功ｆ　■およびΔ刊　Ｈによる絹換え型プラスミドのこれに続く分析は、ＤＮＡフラグメントのサイズ１）ＤＦ８２からのクローン化［−丁　ＤＮＡ領ｊ或が、プラスミド１）ｆ３Ｒ３２２のテ１−ラザイクリン耐情遺伝子にあけるシングルＨｉｎｄ１１１部位中に再クローニングされた（第２図参照）５．プラスミドＩ）Ｄｒ”８２Δ３よび［）ＢＲ３２２が旦ｉｎｄ　ｆｆＪで切断され、混合されそｌノて丁４　ＤＮＡ　リガーゼで連結された。この連結反応混合物は、再びエシェリキア・コリＭＭ２９４中に形質転換され、ぞしＴ１ヘランスフォーマントは、抗生物質耐性および感性に基づいて選択ざイクリン耐性を破壊し、一方アンピリシン耐性には影響をもたらさないので、Ａｐ’　ＴＣ”細胞が選択される。これは、増殖するエシェリキア・］り細胞を殺すシクロセリンの使用によってざらに９められる選択アブ（］−チによって達成された。５０μＵ／μβアンピリジンを含むしブロスにおける１８時間のインキ１ベーシヨンの後、培養株は４μ９／威テトラサイク１ノンを含む新鮮培地中へ１：１００に希釈された。４５分間のインキュベーションの後、Ｄ−シクロセリンが１００μ９／ｍｌの濃度へと添１損され、ざらに２時間インキュベーションが続りられた。培養株は次に遠心分離され、そしてペレットがしブロス２０威中に再懸濁された。ざらにに３時間のインキ１べ一ションの後、０．１ｍ１部分標本が５０ｔｉｚ／ｍアンピリジンを含むトリブチカーゼ　ソイ　アガール上に平板培養され、得られた集落が単離された。トランスフォーマン１へは次に、ＬＴ−Ｂ産生量してＥＬＩＳＡにより、またしＴ−への不在に関してＹ１副腎細胞検定における毒性の欠如により検定された。これらの要望にほぼ合致するが、重量換算でＤＤＦ８２よりのしＴの毒性の１／１０００か残存する１つのクローンをｐＤＦ８７と呼称した。！￥４　雌状態下におりるポリアクリドアミドゲル電気泳動法、ＥＬＩＳＡあるいはゲル濾過によっては、ｐＤＦ８７中にＬ　Ｔ　−Ａを全く検知できなかったゆえに、この毒性の理由は明らかとはならなかった。ｐＤ　Ｆ　８７のＨｉｎｄ［ｌでのｆｆ１Ｅｌｕは、ＤＮＡを２つのフラグメントすなわちｐＢＲ３２２としＴ−Ｂに関しコードされたより小さな（０，８Ｋｂ　）フラグメントに分（プる。重要なことは、しＴ−への産生に関（リコードする１、５Ｋｂ１−（ｉｎｄＩｕｍ伝子フラグ信子トが存在しなかったことで必る。６．３．３．　ｐＪＣ２１７の単離１）ＤＦ８７からのクローン化しＴ−Ｂ　ＤＮＡは、クローニングベクターｐＵｃ８のシングルＨｉｎｄ［［部位中へ再クローニングされたく第３図参照）。ビエイラとメッシング〔ジーン　、工９　：２５９　（１９８２年）　［Ｇｅｎｅ　１９　：２５９　（１９８２）］　）によって作られた、このベクターは、Ｍ１３１１１Ｄ７由来のものである。プラスミドＤＤＦ８７は、）（ｉｎｄｌＩｉで切断され、そして０．８Ｋｂ　ＬＴ−Ｂ　ＤＮＡフラグメントが、低融点アガロース中で電気泳動（上記、第６．１．２節参照のこと。）することによって分離され、さらににフェノールで抽出された。ｐＵｃ８が次に１２中に形質転換された。辻ｉｎｄ　Ｉ［［部位にお【づるＤＮへフラグメントの挿入は、変化しないアンピリジン耐性と共にトランスフォーマント選択の基礎を与えるβ−ガラクトシダーゼ活性に関する溝造遺伝子を破壊するものである。トランスフォーマントは、１００μ９／ｍｌアンピリジンを含むＹＴ　プレート（水１１当り　バタト　トリプトン［３ａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　］　８９、ＮａＣＪｌ１５９、酵母抽出物・５３および寒天１．５！９）上にて平板培養されそして、２００μｇ／ｄ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β− Ｄガラクトシダーゼ（Ｘ−ｐａｌ）で補足された。リューツエール［Ｒｉ、１ｔｈｅｒｅコ　〔モル、ジエン、ジャネット。１７８：４７５　（１９８０年＞　［Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、ニア８　：　４７５　（１９８０）コ〕によって述べられるように、Ｘ−ｇａｌは、β −ガラクトシダーゼ基質の１つであって、該酵素の存在において無色から青色に変化する。Ｘ−ｇａｌ−ＹＴにおいて３７°Ｃでの１８時間培養に続いて、無色集落（プラスミド提携β−ガラクトシダーゼ活性が、挿入により不活性化されたもの）が単離された。Ａｐ　β−ガラクトシダーゼ−トランスフォーマントは、次にＬＴ−ＢＮＴ産生に関してＥＬＩＳＡによって検定された。１）ＪＣ２１７と呼称される１つの正のクローンからのＬＴ−ＢＮＴは次に、Ｙ１副腎＃Ｉｌ胞において試験され、完全に非毒性であることが見出された。このプラスミドを抱く細菌は、エシェリキア・コリ株ＪＭ８３　（ｐＪＣ２１７）と呼称された。６．４．ＬＴ−ＢＮＴの回収６．４．１．１）ＪＣ２１７プラ、スミドを含むエシェリキア・コリに−１２の増殖株ＪＭ８３　（ｐＪＣ２１７）の継代培養が、２つのタイプの集落を産出した。 ○型と呼称される一方のものは、形状において小さく、ふくれたそして不透明なものであった。丁型と呼称される他方のものは、より大きく、平らでそして半透明のものであった。ＬＴ−ＢＮＴの産生に関して、丁型集落がＱ型集落に比べて５０〜１００倍も多くのＬＴ−ＢＮＴを産出するゆえに、丁型集落のみを利用することが重要である。Ｏ型集落が丁型集落から自然発生し得るために、単一丁型集落が選択されるべきである。エシェリキア・コリ株ＪＭ８３　（ｐＪｃ２１７）の繁殖のための培地の選択は、臨界的なものではなく、トリブチカーゼ　ソイ　ブロス、ＭＬ培地及びエバンス［Ｅ　ｖａｎｓ］のＣＡＹＥ培地は満足できるものである。本発明の一実施態様においては、プラスミドＩ）ＪＣ２１７により形質転換された有機体は、該プラスミドを安定化するために、３００μヒ／７！アンピシリンを含むトリブチカーゼ　ソイ°ブロスを入れた１０Ｘ１．５ｒ、ａ培養皿において集密的に画線培養された。３７°Ｃでの１８時間のインキュベーションの後に、それぞれのプレートは、１Ｃ）ｆＪの増殖培地に対する接種物として与えるのに十分な量の細胞を含んでいた。インキューベーションの後、トリブチカーゼ　ソイ　アガール　プレートからの細菌は、減菌０．８５％ＮａＣ，ｌ１５ｄで収穫され、そして０．５％グルコースを含むＣＡＹＦ培地を約１０６ＣＦＵ／ｄのレベルで接種するために用いられた。ＣＡＹ圧培地は、蒸留水１１当りカザミノ酸ＣＣａｓａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓｌ　２０９、酵母抽出物６９．ＮａＣ，ｆ）２．５７、Ｋ２　ＨＰＯ４８，７１ｇおよび極微量の塩類（５％ＭＣ］ＳＯ４，０，５％ＭｎＣｆＪ２および０．５％ＦｅＣ，Ｑ３＞１ｍからなるものである。接種に続き、培養ａ　は、３７° Ｃで１８〜２４時間攪拌しながらインキュベートされた。６．４．２．細胞破壊インキュベーション培地からの細胞は、４°Ｃで２０分間、５．０ＯＯＸＣＩで遠心分離することによって集められた。上澄み流体は、クロロツクス［ＣＩｏｒｏｘ　］消毒へ！Ｉ中にＫｌされ、そして細胞ペレットは、０．０５Ｍ　トリス、０゜００１Ｍ　ジナリウムＥＤＴへ、０．００３Ｍ　アジ酸ナトリウムおよび０．２Ｍ　ＮａＣ，ｌｌを含む緩衝液、Ｉ）Ｈ７。５　（ＴＥＡＮ緩衝液）の最小容量中に懸濁された。これらの細胞懸濁液は次にプールされ、そして必要とされるまで一６０’Ｃで凍結保存された。細胞の凍結は、ＬＴ−ＢＮＴ回収のためのエシェリキア・コリに−１２の十分な破壊をもたらす。音波処理やフレンチプレス［Ｆ　ｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ］の使用のような機械的破壊技術は、試料におりる熱の上昇をなくすために細心な取扱いがなされる限り適用されることができる。リゾチームは、溶解剤としてリゾチームを用いての最終ＬＴ−ＢＮＴ回収率が６０％近くまで減少したために、避けられるべきである。３７°Ｃの水浴中に保存容器を最少時間旋動させることにより、凍結細胞懸濁液は急速に解凍された。懸濁液は次に等容量のＴＥＡＮＩ衝液と合わせられ、混合するためにゆっくりと旋動され、そして次に膜および非溶解細胞を沈降させるために５．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分離された。この凍結解凍法の単回適用からのＬＴ−ＢＮＨの代表的回収率は５０％でめった。より高い回収率が、より不応な非溶解細胞に対し、このサイクルを繰返すかあるいは他の破壊技術を適用することによって得られうる。遠心分離段階からの上澄み分画はすべて、次にさらに精製のために合わせられた。６．４．３．ＬＴ−ＢＮＴのアフィニティークロマトグラフィー的精製遠心分離された細胞溶解物からの透明な上澄み流体は、必らかしめ４℃でＴＥＡＮ緩衝液中で平衡化された２、５Ｘ　８０　ｃｍセファロース４Ｂ（）７ラマシア　ファインケミカルズ、ビス力夕ウエイ、ニューシャーシー州［ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、　Ｊ、］）の頂部に直接（緩衝液下に層状にされることはない。）適用された。カラムは次に、２８０ｎｍで監視される流出が、ベースラインレベルに達するまで、１時間当り２０ｍ１の流速でＴＥＡＮ緩衝液を用いて浄化された。この時点で、ＴＥＡＮ緩衝液中の０．２Ｎ４ガラク１−一−スが適用されそして１時間当り２０ｍの流速か維持され、一方、６ｍ！！の分画が果められた。１−丁−Ｂ　Ｎ丁の出現は、ガラク）−一−スにわずか前方に位置する２８０ｎｍでの吸光度の単一ピークととして検知された。すべでの操作は４°Ｃで行へわれ、そして完ｒした際、１−丁−ＢＮｆ分画〔ユブールされ、そ（〕で大量のＴ”　Ｅ　Ａ　Ｎ緩励液で透析され、保存のために凍結乾燥された。６．５．毒性に関する１−丁−ＢＮＴの分析クローンＩ）ＤＦ８７からのＬｌ− 、ＬＴ−８，およびクローン１）ＪＣ２１”７’からのり１丁−ＢＮＴの試料が上記、第６９２．２節において述べ！、＝ようなＹ１副腎細胞検定系において分析された。試料のタンパク質含最Ｉに、ローリ〜ら［ＬＯＷ１゛ｙ、酊ａ１．Ｊのブ）法［ジ］イ、パイオル、ケム、ユ支足：２６５−２７５　（１９５１年）　〔Ｊ、　ｆ３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、土建旦：２６５−２７５　（１９５１）コ）１．：よ−〕で３１１定された。結果は第１表に示されろ。（以下余白）第１表しＴ−Ｂ　（、ｐＤＦ８７　）　３９１−Ｔ−ＢＮＴ（ｐＪｃ：２１７’）　２５．０００中活性は、５０％の細１抱の丸い形状化をもたらすのに必要とされたそれぞれのＡＰＪ製物のノナグラム呈と（）て表されるー雫−−―−―――−一り情ガ警−婦一■−−鴨−ｈ　−一一一雫う御−−−一一輌一冒　０節１表のデル夕は、ｌ　’Ｔ−はＬＴ−ＢＮＴよりも６５ｏ。０００倍も活性が大きなものであることで、ＬＴ−ＢＮＴの毒性がＬＴのそれと比較して相当烈し７く低減されることを示すもので必る。ＬＴ−Ｂに関する結果は、これがＬＴよりも実質的に低い毒性ではあるが、かなりの毒性をとどめていることを示すものである。完全「Ｔエンテロ１〜キシンのそのザブユニツ１へへのクロマｌルブラフィー的分離により産生きれるＢサブユニツ１〜の毒性と匹敵するこの毒性は、ＬＴ−Ｂをワクチンとしての使用に不適当なものへと、通常してしまう。第６．２．３節において述べたようなラット回腸ループ検定におけるＬ　Ｔ　；ｊ：３よび［／丁−ＢＮＴの分析はまた、Ｌ］−ＢＮＴの注目すべき非毒性の特徴を表わすものであった。結果は、それぞれの値が５へ一８匹のラットからの平均値でおる第２表に示される。第２表流体蓄積比１＊５０よりも大きな流体蓄積比は、陽性の結果であると考えられる。第２表において示されるように、ＩＴ−ＢＮＴの１００μ７川は、ラット回腸ループ検定において完全に不活性でめった。これに対して、ＬＴの同量は、極小の有意レベルよりも１６倍も高い回腸ループ流体蓄積の刺激をもたらした。６．６．ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清の調製６．６．　］、マウスにおけるＬＴ −ＢＮＴに対する抗血清のｊ１４製第４〜６齢の１０匹のバルブ／′シージエイ［Ｂａ１ｂ　／ｃｊｌ雌性マウス（起源）のグループが、食塩水（蒸留水１ｆ１当りＮａＣΩ’ｌ）０．１威を、比較対照としてそれのみであるいは、ある吊のＬＴ−ＢＮＴを加えてかのいずれかで皮下注射された。いくつかの場合にａ３いては、１週間後に追加注射が投与された。ワクチン接種の直前およびその１変の種々の時間で、血液標本が尾部スワツピング［ＳＳｎ１ｐｐｉｎ］によって得られ、そして血清が希釈され、上記第６．２゜１節において述べたようなＥＬＩＳＡによって抗体活性について検定された。抗体活性は、吸光度曲線の直線領域に降下する吸光度をもたらすのに必要とされる仝試料希釈として表わされる。予備実験においては、ＬＴ−ＢＮＴの種々の量でのワクチン接種の効果が観察された。結果は第３表に示される。第３表ＬＴ−ＢＮＴでのマウスのワクチン接種に伴なう用量応答しＴ−ＢＮＴ　抗体活性＋ＮＤ−検知されない。承免疫後活性は、示されたしＴ−８ＮＴｉでのワクチン接種１週間後の尾部スワツピング血液試料において、アルカリ性ボスファターゼＥＬＩＳＡにより測定された。抗体活性は、吸光度曲線の直線領域に下降する４００１ｍでの吸光（第３表続き）度をもたらすのに必要とされる全試料希釈として表わされる。ワクチン接種は、アジュバントを用いることなく食塩）寥液において行われた。第３表に示したように、ＬＴ−ＢＮＴに対する抗体は、ワクチン接種前には、いずれの動物からも検知されなかった。ワクチン接種１週間後近くで、抗り丁−ＢＮＴ抗体が検知され得た。期待したように、抗体活性は、ＬＴ−ＢＮＴへの暴露を増すことで増加した。多重ワクチン接種に対する二次抗体応答があり得るか否かを決定するために、マウスのグループは、上述したと同様にＬＴ−ＢＮＴを注射され、そして再び１週間後に等用量を注射された。結果は第４表に示される。（以下余白）第４表マウス中の抗体産生におけるＬＴ−ＢＮＴでの２次ワクＬＴ−ＢＮＴ　２次ワクチン投与量（μｇ）　免疫前　免疫後−１＊　接種　免疫後−２１＋ −ＮＤ　ＮＤ　ＮＤｌｏ　ＮＤ　８　＋　７，１４４１０　ＮＤ　８　３８４＋ＮＤ＝検知されない。＊免疫後活性は、ＬＴ−ＢＮＴでのワクチン接種（１°）１週間後に尾部スリッピング血液試料において、アルカリ性ホスファターゼＥＬＩＳＡによって調べられた。この特開に、２次ワクチン接種（２°）あるいは食塩溶液が投与され、そして免疫後活性が再びその１週間後に調べられた。ワクチン接種は、アジュバントを用いることなく曾塩溶液において行われた。第４表におけるデータは、抗ＬＴ−８ＮＴ活性は、ＬＴ−ＢＮＴを注射された動物においてのみ検知され得ることを示すものである。この活性は、ＬＴ−ＢＮＴでの２次抗原投与によって顕著に増加した。これに対して、ＬＴ−ＢＮ丁追加が全く与えられなかった場合、抗体力価にあける増加は、実質的とはいえより低いものであった。ＬＴ−ＢＮＴによる抗原投与に対する応答において産出される抗体活性が持続性であったということは、アジュバントを用いずに食塩溶液中のＬＴ−ＢＮＴＩＯ μびを１０試料は、抗り丁−ＢＮ丁抗体活性に関して、西洋ワサビペルオキシダーゼＥＩＩＳＡによって分析さ、れた。第５表に示すように、抗体活性は、免疫処置の２週間後にピークに達するが、２Ｑ週間後においてすら実質的に持続された。この強烈でかつ持続された応答は、追加物が投与されずまたアジュバントが用いられなかった場合ですら見られた。第５表単回り丁−ＢＮＴ注射に伴なうマウスにあける抗体活性の持続性ワクチン接種後十ＮＤ＝検知されない（第５表続き）＊抗体活性は、４９２ｎｍでのＥＬＩＳＡ吸光度曲線の直線領域にあける応答をもたらすために必要とされる抗血酒肴６．６．２．ヤギにあけるＬＴ−ＢＮＴに対する高結成の調製抗血清が、標準方法を用いて精製ＬＴ−ＢＮ丁２／ｆｆＪを皮下注射することによって６月令異系交配ヤギに産生された。同一量の付加ワクチン接種が４週間後に与えられ、そして血液試料が最初のワクチン接種から１０週間後に、採収された。このように採収された血液は、凝血するまで放置され、凝塊は５，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって沈降させされ、そして得られた血清は、４°Ｃで一晩５０％硫酸アンモニウムで処理された。形成された沈澱物は、１０．ＯＯＯＸｇで５分間遠心分離することによってペレット化され、そしてこのペレットは、ＴＥＡＮ緩衝液（第６．４．２節＞１０ｄ中に溶解され、そして２００倍容量の同じ緩衝液に対して４°Ｃで総計２’　４１間の間３回透析された。得られた抗血清をＬＴ−、ＢＮＨに関してかなり特異的とするために、調製物は、アフィニティー　りロマトグラフィーによって２度精製された。この精製方法に関して、しＴ−ＢＮＴセロファースおよびＣＴ−Ｂセロファースは、製造業者の指示に従い、臭化シアン活性化セロフ７−ス４Ｂ（）？ラマシア　フ？イン　ケミカルス′、ビスカタウエイ、ニューシャーシー州［ｐ　１１ａｒｍａｃＩａ　Ｆ　！ｎｅ　Ｃ１１ｅｍｌＣ１１ｅ、　Ｐ　１ｓｃａｔａＷａＶ、　Ｎ　Ｊ　）に精製された１−丁−ＢＮ丁あるいは０丁−８（リスト　バイオロジカル　ラボラトリーズ、インニ］−ボレーテッド１ｌ−ｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｏｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉ’ｎｃ。Ｊ）を共有結合づろことにより調製され１こ。透析された抗血清は、ＬＴ−１３Ｎ　’Ｔセロフ７−スの１．５Ｘ１８ｃＩｆｌカラムを通（、・て最初に通過させ、これは、丁ＥＡＮ緩衝液で十分に洗浄された。固定化１−丁−［３Ｎ丁に結合した免疫グロブリンは次に、０．２Ｍグリシン−ＨＧＩ緩衝液を用いてカラムより溶出され、これは、採集された際に０９２５Ｍ１〜リスで中和された。溶出された免疫グロブリンは、上記に述べたようにして−［ヒＡＮ緩極工液に対しで透析され、そ（〕Ｃ次に、ｌＸ５ｃｍＣ−ｌ−８セフアロースカラムにか４ −Ｊられｔこ。該カラムを通過“４る免疫グ［Ｉプリンは採収され、モしてＥ　１．、、、　Ｉ　ＳＡによっでＬ　’Ｔ’　−Ｂ　Ｎ　’Ｈに関（〕て特異的であるがＣｌ−８に対して非反応的であることがホされた。６．６．３．ｎｉクローン性抵抗体製造Ｌ　Ｔ　−Ｂ　Ｎ−１−に対づる抗体を産生することをなさせ冑る貯蔵細胞を得るために、６へ・８週令　Ｂａ１ｂ／ｃマウス（ジャクソン　ラボラトリーズ［ＪａＣｋＳｏｎ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　］　）が層殺されそして牌臓が無菌的に除去された。単ＮＩ胞ｊ陽濁液が牌、臓をワイヤーメツシュ（コレクター、イーーシーアパラタス　コーポレーション、セント　ペータースバーグ、フロリダ州［Ｃｏ１１ｅｃｔｏｒ、　Ｅ− ＣＡｔ）ｌ）ａｒａｔＵｓ　ＣＯＩ”４１、、　Ｓｔ、ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｆｌａ］　＞を通して強制押出しされることによって得られた。このようにして調製された牌祠胞が、４，５００ｍ３／Ｎグル］−ス、２０％胎児ウシ血清、１０％ＮＣＴＣ１０９，１％非必須アミノ酸類、１００単イウ／ｍｌペニシリン、１００μび７ｍｌストレプトマイシン、０８３ｍＭ８−ブロモグアノシン、５Ｘ１０’Ｍ　２−メルカプトエタノールｄ′−３よび５０％胸腺細胞ならし培地（Ｔ’ＣＭ）を有する完全ダルベラ］変性イーグル培地しＤｕｌｂｅｃｏｏ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｌａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　］　（ＤＭＥＭ）中の滅菌しＴ−ＢＮＴ１μ９／ｄに曝された。牌細胞の首尾よい試験管内免疫化に必要とされ、また細胞クローニングにおけるフィーダ一層の必要性を排除する丁ＣＭは、４〜６週令ＢへしＢ／Ｃ？ウスから胸腺を無菌的に除去することによって調装され１．ＴＯ単離された胸腺は次に上述したようにして粉砕され、細胞は完全Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中で３７°Ｃで７Ｊｔｌ湿された１０％ＣＯ２インキ１−べ・− ターにおいて３日間培養され、そして培地は１，０００ｘｇで１０分間遠心分離することにより細胞をペレット化することによって採取され、そして必要とされるまで一２０’Ｃで凍結保存された。３７℃で１０％ＣＯ２において４日間１８養の後、ＬＴ−８Ｎ丁処理牌細胞は、１．ＯＯＯｘｇで１０分間遠心分離することによって回収された。ハイブリドーマを産生するために、これらは次にマウス骨髄腫細胞と４倍過剰において混合され、そして融合は、４０％ボ１ノエチレングリコール（ＰＥＧ１３００．エムシービー　ケミカルズｒ　ＭＣＢＣｈｅｍｉｃａｌｓ］　）および５％ジメチルスルフオキシドの添加によって促進された。２５°Ｃでの１分間のゆっくりした混合に続いて、懸濁液は、ゆっくりとＤＥＡＭで希釈され、そして細胞は遠心分離によって培地より除去された。細胞は次に、５Ｘ１０’Ｍ　２−メルカプト　エタノール、３０％Ｔ　ＣＭ　Ｊ５よびＨＡＴ　（１０−４Ｍヒボキサンチン。１０　Ｍ　アミノプロティン、３Ｘ１０’Ｍ　チミジン）で追加されている完全ＤＭＥＭ中に５ｘ１０５骨髄腫細胞／ｄの希釈度で懸濁された。細胞は次に、この懸濁液を９６ウエル（窪み）組織培倦旧中に分配することにより培肴化され、そして３７°Ｃで１０％ＣＯ２において、１週１回の培地交換を２度行なってインキニーベートされた。１週間後に可視的群落が３０〜６０％の窪みにおいて表われ、そして３週間後に、窪みにあける上澄み培地は、西洋ワサビペルオキシダーゼ　ＥＬＩＳＡによってＬＴ−ＢＮ丁特異性抗体の存在に関して、第６．２．１節において述べるようにして試験された。培地がＥＬＩＳＡによって陽性であった窪みにあける細胞は次に限界希釈によっであるいは７カロースに８いて平板培養することによってクローニングされた。限界希釈クローニングは、所望されたハイブリドーマ細胞を、４０％ＴＣＭ″ｃ付加された完全ＤＭＥＭ中に５００．５Ｑおよび５細胞／ｄの濃度に希釈し、この懸濁液の部分標本を複数ウェル組織培養匝中に平板培養することによって行なわれた。クローンをあおう培地は、２〜３週間のインキュベーションの後にＥ　Ｌ　Ｉ　ＳＡによって再試験され、そして陽性クローンは、同じ培地にｄ−３ける継代培るによって拡大された。アガロースにお【プるクローニングは］ラフイノとシャルフ［Ｃｏｆｆ１ｎｏ　ａｎｄ　５ｃｈａｒｆｆｌ　（ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスエイ　６８：２１９〜２２３　（１９７１年）［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　６８　：　２　１　９　−　２２３　（１９７１）］　）によって述べられるようにして本質的に行なわれた。ＤＭＥＭ中の４％ジ−プラークアガロース［Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　Ａｇａｒｏｓｅ１４　ｍｆｌで被覆された組織培ａｌｌＴ１（１５ｘ６０ｓ、Ｄ−ニング［Ｃ０ｒｎｉｎＣＩ］　）は、４０％ＴＣＭで追加された完全ＤＭＥＭ中の１０００細胞／ｄを含む０．３５％アガロース１ｄで型処された。このプレートはｈＯ堤された１０％ＣＯ２インキユベータにおいて３７°Ｃで、群落が８〜抗マウス１９Ｍ／１ｆｆＧの１：５０希釈度を有するＤＭＥＭ中の０．４％アガロースを含む重畳物”７がそれぞれの皿に添加された。２へ・３日のインキュベーションの後に、視認できる沈澱物は、免疫グロブリン分泌群落を区分し、そして最も活発な分泌群落が無菌パスツールピペットによって９６ウエルプレートへと移された。特に強力な抗り丁−ＢＮＴ抗体産生体はＥＬＩＳＡによって識別され、そして株は所望されるように継代培養によって発育された・し・かじながら誘導されクローン化された株は、９０％胎児ウシ血清を有する１０％ジメチルスルフオキシド中に一１７０°Ｃで凍結して貯蔵することによって保存された。診断試験における使用のために、あるいは他の目的のために大量の単クローン性抗体を産生するために、ハイブリトーマ細胞は、腹水腫として増殖させられた。８退会ＢＡＬＢ／Ｃマウスがプリスタン［ｐｒｉｓｔａｎｅ　］　（０−５ｍ／マウス、アルドリッチケミカル　カンパニー、ミルウオーキー、ウィスコンシン州［Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、ＭｉｌＳＶａｕｋｅｅ、　Ｗｉｇ、　］　）で初回抗原刺激され、そして次に１０日後に１０７個ハイブリドーマ細胞で注射された。７〜１０日間において発現した腹水流体は、麻酔された動物の腹部中に挿入された１８ゲージ注射針で捕集された。この流体は次に、１０分間２．ＯＯＯｘｇで遠心分離することにより清澄化され、０．１％アジ化ナトリウムの添加によって保存され、そして４°Ｃで貯蔵された。６．７．ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清によるエンテロトキシン活性の中和ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清がビブリオ・コレラおよびエシェリキア・コリのエンテロトキシンの活性を中和し得るか否かを測定するために、Ｙ１副ＷｊＨＩｌ胞系において細胞の丸くなることをもたらすのに必要とされる量の１００倍であるこれらの毒素の量が、種々の希釈度のヤギ抗血清（第６．２．２節）と、３７ °Ｃにて１時間インキュベートされた。このインキューベーションに続いて、試料は、第６．２．２節において述べるようにして、副腎細胞系にあける毒性に関して分析された。第６表において示されるように、ＬＴ−ＢＮＨに対する希釈された抗血清は双方のエンテロトキシンを完全に中和した。第６表ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清による副腎細胞検定におけるコレラおよびエシェリキア・コリエンテロトキシンの活コレラ毒素　４０エシエリキア・コリＬＴ　１，２８０＞十用いられたエンテロトキシンは、球状化する最小用量の約１００倍である。市力価は、生物学的活性の完全な中和を示す最も高い血清希釈度のｌ数として定義される。６．８．ＬＴ−ＢＮＨに基づく　析系６．８．１．ＥＬＩＳＡ検定上記第６．２．１節においては、手順が試料にあけるＬＴ−ＢＮＴのＥＩＩＳＡ検知に関して述べられる。ＥＬＩＳＡ系は、人類からのあるいは免疫された動物からの血清中のＬＴのあるいはＬＴ−Ｂに対する特異的抗体の検知に同様に適用できる。抗体検知にＥＬＩＳＡを使用するために、５０＋ｎＭ炭酸ナトリウムを含むコーティング緩衝液、ＤＨ９，６中の１μ９／ｄＬ丁−ＢＮＨの１００μ９部分標本が、９６ウエルポリビニルプレート（コスタ−［Ｃｏ５ｔａｒｌ）の窪み中にピペットにより添加された。このプレートは空温で２時間インキュベートされ、その時点で窪みはコーティング緩衝液中の０．５％ゼラチンで満たされ、そして−晩４°Ｃでインキコベートされた。非付着抗原は次に、０．０５％ツクツーン２０［丁ｗｅｅｎ　２０　］を含むリン酸Ｍ衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄することによって除去された。　ヤギ、ヒトあるいはマウス血清またはマウスハイブリドーマ上澄み液などのような、分析されるべき抗体を含有する試料は、次に０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ中に希釈され、そして１００μｊ部分標本において抗原被覆窪みへ添加された。プレートは３７°Ｃで４５分間インキュベートされ、上澄み流体が除去され、そして窪みはＰｕ５−Ｔで３回洗浄された。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した第２の抗体（適当な抗ヤギ、ヒトあるいはマウス免疫グロブリン抗血清）が１００μｊ部分標本において、窪みに添加され、そしてプレートは３７°Ｃで４５分間インキュベートされた。第２抗体インキュベーションの後に、プレートはＰＢＳ−Ｔで洗浄され、そして基質（０，００６％町０２を含む０．１Ｍ　クエン酸ナトリエム緩衝液、ｐＨ５，０１瀬中の０−フェニレンジアミン　１ｍｇ）の、２００μ１部分標本が窪みに加えられた。２５°Ｃでの３０分間のインキュベーションの後、酵素反応は、４Ｍ　Ｈ２ＳＱ４７５μｍの添加によって停止された。窪みの内容物の吸光度が、次に４９２０ｍで計測された。陽性の試料は、最初の抗体が添加されなかった比較対照のものより、吸光度が少な（とも２倍であるものに解釈された。この方法の実施においては、第７表において示されるように、血清試料は小児および成人から採取されそしてＬＴ−ＢＮＴに対する抗体の存在に関して分析された。（以下余白）第７表ヒ１゛血清虫の−Ｌ」−二歇き丁に対ずろ抗体の有病率被験者　Ｘ賠Ａ　陽性件数小児成人妊婦　１０　２一般母集団　１０５小すＶ健康専門家　９７第７表に於けるデータは、示された年令範囲における個体からあるいはザ　−Ｊニウアー　シデイ　オブ　ロチニスター　メディカル　センターのデイヴイジョン　オブ　ベアイアｌ−リック　インンＴクシアス　ディジー・ズ巳ｈｅｌ）：Ｖ！Ｏｎ　ｏｆ　ｆ）ｅｄｉａｔｒｉｃ　ｌ　ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　［）ＩＳｅａＳｅ　ａｔ　１−ｈｅＬＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｏｃｈｅｓｔｅｒ　Ｍｅｄｉｃａ！　Ｃｅｎｊｅｒｌに従。事ｙる０１康保護専門家から採取されＬこ面液試料の分析に基づくものである、１限された亘露遍歴を有する小児に関して明待されたＪ−う（こ、１ブＩ−Ｂ　Ｎ　ｌに対する抗体の発生は低かった。王を生は、一般的成人母集団に関して幾分かより高いものでおり、そして小月健康専門家グループに関してより一層高いものであった。後者のグループの９個体中の７個体の血清が陽性であり、エンテロトキシン誘発性下痢症の存在する患者に接触する彼ら′の高い可能性の見地からは予想されない発見であった。６．８．２．免疫プロット分析り丁または１−ＴｍＢを含むタンパク質の混合物は、電気泳動的に分離されることができ、そしてホロ毒素またはＢサブ］−ニットは免疫プロット法によって同定され得る。この方法の１つの例示として、１２丁−Ｂへ王１０μびが、５％スペーサーおよび１３％分解化ゲルを用いて、ラエムリ［１ａｅｍｍｌｉ　］　（ネイチｐ−２２７：６８０〜６８５（１９７０年）［Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）１〕の方法によってドデシル１１２ブトリウムーポリアクリドアミドゲル電気泳動へと運ばれた。電気泳動に続いて、ゲルは、１９２ｍＭグリシンｊ３よび２０％メタノールと共に、２５ｍＭトリス−ＨＣｏ、ｐＨ８，３を含む電気溶出緩衝液中に４°Ｃで４５分間浸された。タンパク質は最大電流量を用いて、ホエファー　Ｖイエンテイフ−ｒツク　トランスノｙ　−［１−１ｏｅｆｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ丁ｒａｒｉｓｐｈｏｒ　］電気移動装置にお【プる４℃で２時間の電気泳動によって二１−ロセルロース紙（ＢＡ８５．シコレイカーアンド　シュエル［３ｃｈｌｅｉｃｂｅｒ　ａｎｄ　３ｃｂｕｅｌ　ｌコ）に膨潤ゲルより移された。１、、、　Ｔ　−Ｂ　Ｎ　Ｔを検知するために、二１−ロセルロースシ一トは２つの方法を発展させた。シー１への一切片がずべての移動されたタンパクｐ１を暴露するために７ミドブラツク［八ｍ１ｄｏ　ＢＩａｃｋＪで染色された。シートの残りの切片は残存タンパク質結合部位を、ブロックするために０．１％アジ化プ川用リウムおよび１％オボアルブミンを含有するＰＢＳ緩雨液（ＰＢＳ−Ａｚ−０）中に４°Ｃで一晩浸された。ブロックされたニトロセルロースは次にＰＢＳ−丁で３度、それぞれ１０分間かけて洗浄された。ＬＴ−ＢＮＴを含有するレーンか、室温にて２時間、アフィニティークロマトグラフィー精製ヤギ抗ＬＴ −ＢＮ丁抗血清（第６．６．２節〉またはアフィニティークロマトグラフィーによりＬＴ−ＢＮ　Ｔ結合抗体の１周温した血清のいずれかに曝された。これらの血清調製物は、使用前にＰＢＳ−ＡＺ−０でそれぞれ１−５００８よび１−１０６に希釈された。血清への暴露が完了した後に、このシートはＰＢＳ−丁を用いて３度それぞれ１０分間かけて洗浄され、そして次に１％オボアルブミンを含有するＰＢＳで１００倍希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギ免疫グロブリンと室温で１時間インキュベートされた。このシートは再び、ＰＢＳ−丁で３度、１０分間かけて洗浄され、その後基質（０，００５％町０２を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、Ｉ）Ｈ７，６１ｄ当り３，３°　−ジアミノベンゼン塩酸塩０．３ｍ３＞と室温で３０分間インキュベートされた。反応はシー１へを水中に浸しこれを風屹することによって停止され、ＬＴ−ＢＮＨの位置が褐色の帯域で示された。６．８．３．ラテックスビーズ凝集抗原または抗体のいずれかで被覆されたラテックスビーズは対応する特異性抗体または抗原を検知するために用いられ得る。ＬＴ−ＢＮＴに対する抗体を検知するのにこの試験を実行するために、０．８μラテツクスビーズ（ディフコ　ラポラ１〜リーズ、デ１〜ロイド、ミシカン州［Ｄ　ｉ　ｆｃ。Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ　Ｍｉｃｈ、］　）が００．１５ＭＮａ、！Ｊを含む０．１Ｍグリシン緩衝液、１）Ｈ８，２中の１μ９／ｍ１精製ＬＴ−ＢＮ丁の等容量に添加されたａ懸濁液はゆっくりとした振　を行いながら３７°Ｃで２時間インキュベートされ、有効なビーズ被覆が結果的になされた。インキュベーションの後に、ビーズは１．ＯＯＯＸｇで１２分間ゆっくりと遠心分離することによって洗浄された。上澄み流体は０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで置き代えられ、ブロモフェノール　ブルー［１３ｒｏｍｏｐｈｅｎｏ１３１ｕｅ］およびアジ化ナトリウムが、それぞれ最終濃度０．０４％および０．１％へと添加された。抗ＬＴ− ＢＮ丁抗体に関する凝集検定を行うために、感作ビーズ懸濁液５μｐが、ＰＢＳ比較対照緩衝液あるいはＰＢＳで希釈された試験試料１５μりと混合された。混合直後に示された凝集は、乳状（比較対象）懸濁液から清澄された素性を有する粒子状の懸濁液への変化として定義された。凝集検定はまた、ビーズを０．２５ｍ３／彪のアフィニティー精製ヤギ抗血清あるいは０．１ｍ９／７！のＬＴ−ＢＮ丁に対するマウス単クローン性抗体を含有する等容量のグリシン緩衝液中のビーズを感作することによって・試料中のＬＴ −ＢＮＨの見地にも適用された。６．９．微生物の供託プラスミドＩ）ＪＣ２１７を保持するＬＴ−ＢＮＴ産生性エシェリキア・コリ株が、イリノイ州ペオリアのザ　アガリカルチュラル　リサーチ　カルチャー　コレクション（エヌアールアールエル＞　［ｔｈｅ　Ａｏｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ［（ＮＲＲＬ）　、　Ｐｅｏｒｉａ、　Ｉ　ｌ１ｉｎｏｉｓコに供託され、そして受入番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７５７を指定された。供託微生物の培養株は、本出願に基づく特許の認可によって公衆に入手可能なものとなされるであろう。ここに説明されそして請求の範囲に記載された発明は、供託された実施態様が本発明のひとつの例示として意図されたものであるから、供託された微生物の株によってＩｓを限定されるものではない。等価のエンテロトキシン　サブユニットを機能的に産生ずる任意の等価の微生物は、本発明の範驕に属するものである。（１）際調査報告ｌＩＩｍ飛＋ｔａｎａ自＾−ｌ−ツー”ＰＣＴ／ＬＪＳＩ３５１０１２５２

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）エントロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ− Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性のかつ抗原性の決定基を有するポリペプチドに関してコードされたＤＮＡ配列からなり、また単細胞性有機体中において複製され、転写されかつ翻訳され得る組換え型ベクターを含有する単細胞性有機体を培養し、そして（ｂ）培養株からこのポリペプチドを単離することからなる、エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性のかつ抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチドを製造する方法。
２．ポリペプチドが免疫原性である請求の範囲第１項に記載の方法。
３．組換え型ベクターが、形質転換により単細胞性有機体中に導入されるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
４．組換え型ベクターが形質導入により単細胞性有機体中に導入されるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
５．組換え型ベクターがトランスフェクションにより単細胞性有機体中に導入されるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
６．ＤＮＡ配列中に含まれる情報がエンテロトキシン産生性エシエリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
７．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ブタ起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
８．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ウシ起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
９．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ヒト起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
１０．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ヒト単離体Ｈ１０４０７のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
１１．ＤＮＡ配列がエンテロトキシンＢサブユニットＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクターから得られるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
１２．単細胞性有機体が真核性有機体である請求の範囲第１項に記載の方法。
１３．単細胞性有機体が原核性有機体である請求の範囲第１項に記載の方法。
１４．原核性有機体がエシェリキア・コリである請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．エシェリキア・コリが、ＮＲＲし受入番号Ｂ−１５７５７を有するものあるいはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体である請求の範囲第１４項に記載の方法。
１６．エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性のかつ抗原性の決定基を有するポリペプチドに関してコードされたＤＮＡ配列からなり、単細胞性有機体中において複製され、転写されかつ翻訳され得る組換え型ベクターを、単細胞性有機体中へ導入することでなる、エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性のかつ抗原性の決定基を有するポリペプチドに関してコードされたＤＮＡ配列を有する単細胞性有機体を調製する方法。
１７．エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性のかつ抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチド。
１８．エシェリキア・コリＮＲＲＬ受入番号Ｂ−１５７５７によりあるいはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体により産生されたものである請求の範囲第１７項に記載の非毒性ポリペプチド。
１９．請求の範囲第１７項のＬＴ−Ｂポリペプチドおよびこれのための適合性薬理学的担体よりなるワクチン処方物。
２０．請求の範囲第１９項のワクチン処方物をＬＴ−Ｂおよびコレラ毒素に対する抗体の産生を誘導するのに十分な量で哺乳類または鳥類動物に注射することでなる、細菌誘発性下痢症に対する防御免疫学的応答をもたらすために哺乳類または鳥類動物を刺激する方法。
２１．さらに産生された抗体を収穫しそして免疫グロブリン分画を単離することでなる請求の範囲第２０項に記載の方法。
２２．哺乳類動物がヤギである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２３．哺乳類動物がウマである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２４．哺乳類動物がヒツジである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２５．哺乳類動物が雌ウシである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２６．哺乳類動物が雄ウシである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２７．鳥類動物がニワトリである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２８．哺乳類動物がヒトである請求の範囲第２０項に記載の方法。
２９．請求の範囲第１７項に記載のＬＴ−Ｂポリペプチドに対する抗体。
３０．請求の範囲第１８項に記載のＬＴ−Ｂポリペプチドに対する抗体。
３１．請求の範囲第２９項のＬＴ−Ｂポリペプチドに対する抗体およびこれのための薬理学的担体よりなる薬理学的組成物。
３２．薬理学的担体が動物へのまたはヒトヘの口中投与に適したものである請求の範囲第３１項に記載の薬理学的組成物。
３３．薬理学的担体が家畜飼料である請求の範囲第３２項に記載の薬理学的組成物。
３４．薬理学的担体がヒト幼児用食品である請求の範囲第３２項に記載の薬理学的組成物。
３５．薬理学的担体が薬理学的に許容される電解質溶液である請求の範囲第３２項に記載の薬理学的組成物。
３６．組成物が錠剤投薬形態にある請求の範囲第３２項に記載の薬理学的組成物。
３７．組成物がカプセル形態にある請求の範囲第３２項に記載の薬理学的組成物。
３８．ヒトまたは動物に請求の範囲第３１項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトまたは動物におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
３９．ヒトまたは動物に請求の範囲第３２項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトまたは動物におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
４０．動物に請求の範囲第３３項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなる動物におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
４１．ヒトに請求の範囲第３４項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
４２．ヒトに請求の範囲第３５項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
４３．ヒトに請求の範囲第３６項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
４４．ヒトに請求の範囲第３７項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
４５．ヒトまたは動物に請求の範囲第３１項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトまたは動物を治療する方法。
４６．ヒトまたは動物に請求の範囲第３２項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトまたは動物を治療する方法。
４７．動物に請求の範囲第３３項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされる動物を治療する方法。
４８．ヒトに請求の範囲第３４項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
４９．ヒトに請求の範囲第３５項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
５０．ヒトに請求の範囲第３６項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
５１．ヒトに請求の範囲第３７項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
５２．動物が子ブタである請求の範囲第３８項、第３９項、第４０項、第４５項または第４６項のいずれかに記載の方法。
５３．動物が子ウシである請求の範囲第３８項、第３９項、第４０項、第４５項または第４６項のいずれかに記載の方法。
５４．動物が子ヒツジである請求の範囲第３８項、第３９項、第４０項、第４５項または第４６項のいずれかに記載の方法。
５５．エンテロトキシン産生性細菌がエシェリキア・コリである請求の範囲第３８項に記載の方法。
５６．エンテロトキシン産生性細菌がビブリオ・コレレである請求の範囲第３８項に記載の方法。
５７．請求の範囲第２９項の抗ＬＴ−ＢＮＴポリペプチド抗体を、コレラ様エンテロトキシン産生性細菌、それらのエンテロトキシンあるいはこれらからの結合サブユニットを含むと疑われる試料と混合し、そしてこの抗体と任意のコレラ様エンテロトキシン産生性細菌性エンテロトキシンあるいはこれらからの結合サブユニットとの相互作用を検知することでなるコレラ様エンテロトキシン陽性のエンテロトキシン産生性細菌、それらのエンテロトキシンあるいはこれらからの結合サブユニットに関する診断試験方法。
５８．エンテロトキシン産生性細菌がエシェリキア・コリである請求の範囲第５７項に記載の方法。
５９．エンテロトキシン産生性細菌がビブリオ・コレレである請求の範囲第５７項に記載の方法。
６０．相互作用が酵素結合免疫吸着剤検定法により検知されるものである請求の範囲第５７項に記載の方法。
６１．相互作用が放射標識免疫検定法により検知されるものである請求の範囲第５７項に記載の方法。
６２．相互作用がイムノブロット分析法により検知されるものである請求の範囲第５７項に記載の方法。
６３．相互作用が、この抗ＬＴ−ＢＮＴポリペプチド抗体で被覆された粒子のラテックスビーズ凝集により検知されるものである請求の範囲第５７項に記載の方法。
６４．粒子がラテックスビーズである請求の範囲第６３項に記載の方法。
６５．粒子がリポソームである請求の範囲第６３項に記載の方法。
６６．粒子が赤血球である請求の範囲第６３項に記載の方法。
６７．粒子がポリアクリルアミドからなるものである請求の範囲第６３項に記載の方法。