JPS6251993A - 単純ヘルペスウイルス遺伝子が組込まれた組換えプラスミド - Google Patents
単純ヘルペスウイルス遺伝子が組込まれた組換えプラスミドInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、組換えプラスミドに関し、特に、単純ヘルペ
スウィルス感染症の予防用ワクチンの製造に有用な単純
ヘルペスウィルス蛋白質の生産に利用することのできる
組換えプラスミドに関する。
スウィルス感染症の予防用ワクチンの製造に有用な単純
ヘルペスウィルス蛋白質の生産に利用することのできる
組換えプラスミドに関する。
さらに詳しくは、本発明は、大腸菌および酵母の両方で
増殖し得る、いわゆるシャトルベクターを用い、そのベ
クターに担われた適当なプロモーター領域の下流に、特
定の配列の単純ヘルペスウィルス（息下、Ｉ（Ｓνと略
す）のｇＢ遺伝子が組込まれた組換えプラスミドを得、
これを酵母に与えて形質転換を起こさせて形質転換酵母
とし、この形質転換酵母を培養してＨＳＶ蛋白質、待に
Ｈ５Ｖ膜蛋臼質ｇＢを高純度に大量生産させるための技
術に関する。
増殖し得る、いわゆるシャトルベクターを用い、そのベ
クターに担われた適当なプロモーター領域の下流に、特
定の配列の単純ヘルペスウィルス（息下、Ｉ（Ｓνと略
す）のｇＢ遺伝子が組込まれた組換えプラスミドを得、
これを酵母に与えて形質転換を起こさせて形質転換酵母
とし、この形質転換酵母を培養してＨＳＶ蛋白質、待に
Ｈ５Ｖ膜蛋臼質ｇＢを高純度に大量生産させるための技
術に関する。
技術的背景と従来技術
最近、先進国においてはＦＩＳＶに対する抗体保有人口
が減少してきており、そのような国では、性薔ヘルペス
、 ＩＦｉ生児ヘルペス、ヘルペス脳炎などのＨ５Ｖ感
染症が大きな問題となりつつある。このようなＨ５Ｖ感
染症の防御にはワクチンが有効であり、すでに弱毒化Ｈ
５Ｖからなる弱毒化ワクチンや１（ＳＶＤＮ＾を含む不
活化ワクチンが提案されている。
が減少してきており、そのような国では、性薔ヘルペス
、 ＩＦｉ生児ヘルペス、ヘルペス脳炎などのＨ５Ｖ感
染症が大きな問題となりつつある。このようなＨ５Ｖ感
染症の防御にはワクチンが有効であり、すでに弱毒化Ｈ
５Ｖからなる弱毒化ワクチンや１（ＳＶＤＮ＾を含む不
活化ワクチンが提案されている。
しかしながら、Ｈ５Ｖには潜伏感染や発癌性の危険があ
ることが知られており、従来の弱毒化ワクチンや不活化
ワクチンではかかる副作用の危険が残り実用上問題があ
る。
ることが知られており、従来の弱毒化ワクチンや不活化
ワクチンではかかる副作用の危険が残り実用上問題があ
る。
一方、Ｈ５Ｖが細胞に感染すると数覆の糖蛋白質ｆｇＢ
、 ｇｃ、 ｇＤ、 ｇＥなど。なお、従来の５人、ｇ
Ｂの称呼は１９８３年Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ ！ｆｏｒｋｇｈｏｐ（オッ
クスフォード、英国）にてｇＢと統一された】が生産さ
れ、これらの糖蛋白質がＨ５Ｖの感染防御抗原として重
要なことが明らかにされるとともに、これら糖蛋白質を
成分と、するいわゆるコンポーネントワクチンについて
の研究が行われている。例えば、キャイルらはＨ５ＶＴ
ｓ染細胞またはウィルス粒子より抽出して得られろ糖蛋
白質からなるコンポーネントワクチンでは、宿主細胞の
多くの蛋白質を含んでいるため、それら不要な蛋白質に
起因する副作用が問題である。したがって、副作用のな
いコンポーネントワクチンを得ろためには、高度に精製
された糖蛋白質を用いる必要がある。このような観点か
ら、本発明者らは［［ＳＶの糖蛋白質の１種であるｇＢ
に着目し、それを高度に精製し、マウスでの実験でその
有効性を確認しているｆ城野、細胞工学、 ３．１２０
（１９８４） ｌ。
、 ｇｃ、 ｇＤ、 ｇＥなど。なお、従来の５人、ｇ
Ｂの称呼は１９８３年Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ ！ｆｏｒｋｇｈｏｐ（オッ
クスフォード、英国）にてｇＢと統一された】が生産さ
れ、これらの糖蛋白質がＨ５Ｖの感染防御抗原として重
要なことが明らかにされるとともに、これら糖蛋白質を
成分と、するいわゆるコンポーネントワクチンについて
の研究が行われている。例えば、キャイルらはＨ５ＶＴ
ｓ染細胞またはウィルス粒子より抽出して得られろ糖蛋
白質からなるコンポーネントワクチンでは、宿主細胞の
多くの蛋白質を含んでいるため、それら不要な蛋白質に
起因する副作用が問題である。したがって、副作用のな
いコンポーネントワクチンを得ろためには、高度に精製
された糖蛋白質を用いる必要がある。このような観点か
ら、本発明者らは［［ＳＶの糖蛋白質の１種であるｇＢ
に着目し、それを高度に精製し、マウスでの実験でその
有効性を確認しているｆ城野、細胞工学、 ３．１２０
（１９８４） ｌ。
ところでこのような糖蛋白質ｇＢを得るには培養細胞に
ウィルスを接置し、それを培養することによって産生さ
せる方法が採られるが、かかる方法では、感染性の因子
を扱うためその作用が困難である工程もきわめて煩雑と
なるうえ、発癌遺伝子を担うＤＮＡを完全に除去したこ
とを証明することは不可能に近（、結局、かかる天然の
糖蛋白質ｇＢを用いて実用性のある安全なコンポーネン
トワクチンを製造することはきわめて困難である。
ウィルスを接置し、それを培養することによって産生さ
せる方法が採られるが、かかる方法では、感染性の因子
を扱うためその作用が困難である工程もきわめて煩雑と
なるうえ、発癌遺伝子を担うＤＮＡを完全に除去したこ
とを証明することは不可能に近（、結局、かかる天然の
糖蛋白質ｇＢを用いて実用性のある安全なコンポーネン
トワクチンを製造することはきわめて困難である。
本発明者らは、単純ヘルペスウィルス感染症に対する安
全なワクチンを得るために研究を行った結果、遺伝子工
学的手法、すなわち、所望のＨ５ＶｇＢ遺伝子を単離す
るとともに、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且
つ酵母の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子を担ったベク
ターを利用し、該ホスファターゼプロモーターの制譚下
に前記Ｆ［ＳＶのｇＢ遺伝子を組込んで新しい組換えＤ
ＮＡを！ＭＳｌｌ、それによって酵母を形質転換させ、
そのような形質転換酵母を培養することにより所望のＨ
ＳＶ蛋白質（すなわちＨＳＶｇＢ）を産生させ得ること
を先に見出している（特願昭５９−１５１７６６号、特
願昭５９−２６２４６５号）。
全なワクチンを得るために研究を行った結果、遺伝子工
学的手法、すなわち、所望のＨ５ＶｇＢ遺伝子を単離す
るとともに、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且
つ酵母の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子を担ったベク
ターを利用し、該ホスファターゼプロモーターの制譚下
に前記Ｆ［ＳＶのｇＢ遺伝子を組込んで新しい組換えＤ
ＮＡを！ＭＳｌｌ、それによって酵母を形質転換させ、
そのような形質転換酵母を培養することにより所望のＨ
ＳＶ蛋白質（すなわちＨＳＶｇＢ）を産生させ得ること
を先に見出している（特願昭５９−１５１７６６号、特
願昭５９−２６２４６５号）。
これらの特許出願に開示されている方法は、遺伝子工学
的手法により、ワクチンの製造に適するような高純度の
ＨＳＶｇＢの産生を可能にしているが、ＨＳＶｇＢをさ
らに高収率で産生じ得る技術が依然として望まれている
。
的手法により、ワクチンの製造に適するような高純度の
ＨＳＶｇＢの産生を可能にしているが、ＨＳＶｇＢをさ
らに高収率で産生じ得る技術が依然として望まれている
。
発明の概要
本発明者らは、さらに研究を重ねたところ、上述したシ
ャトルベクターに、特定のＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメン
ト、すなわち、所謂シグナル配列をコードする遺伝子を
含む下流の一部分が欠失した単純ヘルペスウィルスを組
込んで得られる組換えプラスミドを用いて形質転換させ
た酵素を培養することにより、所望の１１ＳＶｇＢが大
量に産生きれ得ることを見出した。かくして、本発明に
従えば、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つプ
ロモーター領域を担ったプラスミドベクターに、該プロ
モーター領域の下流に、シグナル配列をコードする遺伝
子を含む下流の一部が欠失した単純ヘルペスウィルスｇ
Ｂ遺伝子が組込まれていることを特徴とする組換えプラ
スミドが提供される。
ャトルベクターに、特定のＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメン
ト、すなわち、所謂シグナル配列をコードする遺伝子を
含む下流の一部分が欠失した単純ヘルペスウィルスを組
込んで得られる組換えプラスミドを用いて形質転換させ
た酵素を培養することにより、所望の１１ＳＶｇＢが大
量に産生きれ得ることを見出した。かくして、本発明に
従えば、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つプ
ロモーター領域を担ったプラスミドベクターに、該プロ
モーター領域の下流に、シグナル配列をコードする遺伝
子を含む下流の一部が欠失した単純ヘルペスウィルスｇ
Ｂ遺伝子が組込まれていることを特徴とする組換えプラ
スミドが提供される。
ＨＳＶｇＢの遺伝子の塩基配列については、本発明者等
の前記特許出願にも記載しているが、第１図のようにな
る。このうち、Ｎ末端は３０個のアミノ酸から成る所謂
シグナル配列をコードする遺伝子（図中、下線を引いた
部分）であると考えられる。
の前記特許出願にも記載しているが、第１図のようにな
る。このうち、Ｎ末端は３０個のアミノ酸から成る所謂
シグナル配列をコードする遺伝子（図中、下線を引いた
部分）であると考えられる。
本発明は、とのＮ末端の３０４１１のアミノ酸をコード
する遺伝子を欠失しているＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメン
ト、さらには、この部分とその下流の遺伝子が欠失して
いるＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメント（例えば、ＮａｅＪ
で切断され得るようなＮ末端の８３個のアミノ酸をコー
ドする遺伝子を欠失しているＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメ
ント、または、Ｓ息ＩＩで切断され得るＮ末端の３２０
個のアミノ酸をコードする遺伝子を欠失しているＨＳＶ
ｇＢ遺伝子フラグメント）を酵母のプロモーター下にシ
ャトルベクターに組込んで構築したプラスミドにより形
質転換された酵母は、ＨＳＶｇＢとして抗原性および免
疫原性を有するタンパクを高収率に産生ずるという事実
に基づくものである。
する遺伝子を欠失しているＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメン
ト、さらには、この部分とその下流の遺伝子が欠失して
いるＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメント（例えば、ＮａｅＪ
で切断され得るようなＮ末端の８３個のアミノ酸をコー
ドする遺伝子を欠失しているＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメ
ント、または、Ｓ息ＩＩで切断され得るＮ末端の３２０
個のアミノ酸をコードする遺伝子を欠失しているＨＳＶ
ｇＢ遺伝子フラグメント）を酵母のプロモーター下にシ
ャトルベクターに組込んで構築したプラスミドにより形
質転換された酵母は、ＨＳＶｇＢとして抗原性および免
疫原性を有するタンパクを高収率に産生ずるという事実
に基づくものである。
本発明に従い、シグナル配列をコードする遺伝子が欠失
した単純ヘルペスを組込むのに好適なプラスミドベクタ
ーの例は、本発明者らによる前記特許出願に開示されて
いるような酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つ
酵母の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域をプ
ロモーターとして担ったベクターであるが、同様の機能
を果す他のプロモーターを担ったプラスミドベクターを
使用することもできる。
した単純ヘルペスを組込むのに好適なプラスミドベクタ
ーの例は、本発明者らによる前記特許出願に開示されて
いるような酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つ
酵母の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域をプ
ロモーターとして担ったベクターであるが、同様の機能
を果す他のプロモーターを担ったプラスミドベクターを
使用することもできる。
以下、本発明の組換えプラスミド、および、このプラス
ミドを用いろ酵母の形質転換とＨＳＶｇＢの産生につい
て具体的に説明する。
ミドを用いろ酵母の形質転換とＨＳＶｇＢの産生につい
て具体的に説明する。
（１）シャトルベクタ一
本発明においては、大ｌ１ｌｉＩおよび酵母の両方で増
殖することができ、ＨＳＶｇＢの発現′を洞部するプロ
モーターを担ったシャトルベクターに対し、該プロモー
ターの下流に前述したようにシグナル配列をコードする
遺伝子が欠失した単純ヘルペスウィルスｇＢ遺伝子が組
込まれる。
殖することができ、ＨＳＶｇＢの発現′を洞部するプロ
モーターを担ったシャトルベクターに対し、該プロモー
ターの下流に前述したようにシグナル配列をコードする
遺伝子が欠失した単純ヘルペスウィルスｇＢ遺伝子が組
込まれる。
そのようなシャトルベクターの好ましい例は、酵母の遺
伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つ酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼ遺伝子を担ったプラスミドベクターであり
、このベクターは以下のように構築される。
伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つ酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼ遺伝子を担ったプラスミドベクターであり
、このベクターは以下のように構築される。
酵母の遺伝子としては、一般に、プラスミドが酵母中で
染色体と独立して増殖するのに必要なりＮＡ配列、例え
ば、酵母の自律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ）と
２μ厘ＤＮＡの複製に必要なり）１人配列（２μｏｒ
ｉｌがあり、所望により、さらに形質転換酵母の選択マ
ーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生
遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝
子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、これらのＩｍま
たは２種以上が用いられろ。
染色体と独立して増殖するのに必要なりＮＡ配列、例え
ば、酵母の自律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ）と
２μ厘ＤＮＡの複製に必要なり）１人配列（２μｏｒ
ｉｌがあり、所望により、さらに形質転換酵母の選択マ
ーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生
遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝
子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、これらのＩｍま
たは２種以上が用いられろ。
大揚菌鍔の遺伝子としては大Ｉｉｍ体内においてプラス
ミドが増殖するために必要なりＮＡ配列、例えばＣｏ１
ＥＩ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好
ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺
伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピ
シリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサ
イクリン耐性遺伝子。
ミドが増殖するために必要なりＮＡ配列、例えばＣｏ１
ＥＩ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好
ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺
伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピ
シリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサ
イクリン耐性遺伝子。
クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられ、これ
らの遺伝子の１種または２種以上が用いられる。このよ
うな大＠ ＠ ＤＮＡとしてアンピシリン耐性遺伝子と
テトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐＢ１３２２が一
般に汎用されている◎酸性ホスファターゼプロモーター
は、通常ホスファターゼを構成するｓｏ、 ｏｏｏダル
トンのポリペプチド（ｐ８０）のプロモーターである。
らの遺伝子の１種または２種以上が用いられる。このよ
うな大＠ ＠ ＤＮＡとしてアンピシリン耐性遺伝子と
テトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐＢ１３２２が一
般に汎用されている◎酸性ホスファターゼプロモーター
は、通常ホスファターゼを構成するｓｏ、 ｏｏｏダル
トンのポリペプチド（ｐ８０）のプロモーターである。
このようなシャトルベクターの代表的な例は、特開昭５
！１−３１７９９号開示されている酵母側の遺伝子とし
て、ａｒｓｌｐ２μｏｒｉおよび ロイシン耐性遺伝子
（Ｌｅｕ２）を有する酵母ＤＮＡと大ＩＩＩ菌プラスミ
ドｐＢＲ３２２とを組合わせたシャトルベクター（ｐ人
Ｔ７７と称している）から、その酸性ホスファターゼ構
造遺伝子の一部または全部と、さらに上流の一１００ｂ
ｐの前までの適当な部位まで（通常＋１〜−ｔｏｏｂｐ
、好ましくは＋１〜−５ｂｐまで）除去したプラスミド
、例えば−３３ｂｐまで除去したシャトルベクター（ｐ
ＡＭ８２と称している）である。
！１−３１７９９号開示されている酵母側の遺伝子とし
て、ａｒｓｌｐ２μｏｒｉおよび ロイシン耐性遺伝子
（Ｌｅｕ２）を有する酵母ＤＮＡと大ＩＩＩ菌プラスミ
ドｐＢＲ３２２とを組合わせたシャトルベクター（ｐ人
Ｔ７７と称している）から、その酸性ホスファターゼ構
造遺伝子の一部または全部と、さらに上流の一１００ｂ
ｐの前までの適当な部位まで（通常＋１〜−ｔｏｏｂｐ
、好ましくは＋１〜−５ｂｐまで）除去したプラスミド
、例えば−３３ｂｐまで除去したシャトルベクター（ｐ
ＡＭ８２と称している）である。
この、ＡＭ８２は酸性ホスファターゼプロモーター下流
にＸｈｏ １部位、さらにその下流にＰｖｕ ｆ１部位
が存在しており、本発明のＨＳＶｇＢ遺伝子を挿入する
ために、この１人Ｍ８２を制限酵素Ｐｖｕ ｌ［で切断
して平滑末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄ）に変換し、その部
位にＨａ鵬旧リンカ−を結合し、再環状化して、プラス
ミド（このプラスミドをｐＯＮＹ １と呼ぶ）とする。
にＸｈｏ １部位、さらにその下流にＰｖｕ ｆ１部位
が存在しており、本発明のＨＳＶｇＢ遺伝子を挿入する
ために、この１人Ｍ８２を制限酵素Ｐｖｕ ｌ［で切断
して平滑末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄ）に変換し、その部
位にＨａ鵬旧リンカ−を結合し、再環状化して、プラス
ミド（このプラスミドをｐＯＮＹ １と呼ぶ）とする。
このプラスミドｐＯＮＹ １は酸性ホスファターゼプロ
モーターの制御下に外来遺伝子を純粋な形で発現させ得
るシャトルベクターで、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈ
ｏ ｆで処理することにより容易にその組込み部位を開
裂させることができ、所望の遺伝子を組込むのに適して
いる。
モーターの制御下に外来遺伝子を純粋な形で発現させ得
るシャトルベクターで、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈ
ｏ ｆで処理することにより容易にその組込み部位を開
裂させることができ、所望の遺伝子を組込むのに適して
いる。
（２］ＦＩＳＶＫＩｌｉｌ伝子フラグメントの調製ＨＳ
Ｖ （ＫＯＳ株）のにＢ遺伝子は、ブチクらにより、ウ
ィルスＤＮＡ上の位Ｍ （０，３４８〜０３６６マツプ
ユニツト）とその塩基配列が決定されているＩＢｊｉｋ
ｅｔ ａｔ、。
Ｖ （ＫＯＳ株）のにＢ遺伝子は、ブチクらにより、ウ
ィルスＤＮＡ上の位Ｍ （０，３４８〜０３６６マツプ
ユニツト）とその塩基配列が決定されているＩＢｊｉｋ
ｅｔ ａｔ、。
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、月咀、 ３０１−３１４（１９ｇ４
１を参照１゜本発明で用いられるシャトルベクターに組
込むためのｌ（ＳＶｇＢ遺伝子は、ＨＳＶＤＮＡを制限
酵素Ｒａｍ）＋１で処理して切出される約８ Ｋｂ （
０，３４５〜０．３９９７ｙブユニソト）のフラグメン
ト（ＢａｍＨＩ−Ｇフラグメントという）中に存在する
。
１を参照１゜本発明で用いられるシャトルベクターに組
込むためのｌ（ＳＶｇＢ遺伝子は、ＨＳＶＤＮＡを制限
酵素Ｒａｍ）＋１で処理して切出される約８ Ｋｂ （
０，３４５〜０．３９９７ｙブユニソト）のフラグメン
ト（ＢａｍＨＩ−Ｇフラグメントという）中に存在する
。
Ｆ［ＳＶｇＢ遺伝子含有フラグメントのｔｌｉ製は、下
記のように、）ＨＳＶＤＮＡを制限酵素Ｂａ−ＨＴで切
断して得られるＢａ型旧−Ｇフラグメントをクローン化
して行われろ。
記のように、）ＨＳＶＤＮＡを制限酵素Ｂａ−ＨＴで切
断して得られるＢａ型旧−Ｇフラグメントをクローン化
して行われろ。
Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）で増殖させ
たＨ５ＶからウィルスＤＮＡを分離し、このウィルスＤ
ＮＡを制限酵素Ｂａｉ＋Ｅ［Ｉ−Ｇフラグメントを分離
、抽出する。このＢ亀−旧−Ｇフラグメントを、あらか
じめＢａ■Ｈ１処理した大腸菌プラスミド、ＢＲ３２２
とＴ４リガーゼにより結合反応させろ。この反応液にて
大腸菌χ１７７６を形質転換し、その形質転換体のうち
、アンビレリン耐性（Ａｐｒ）で且つテトラサイクリン
感受性（Ｔｅ”）の菌を選択、培養することにより、こ
の菌体からＢａｍＨＩ−Ｇフラグメントを含むプラスミ
ドｐｃを得る。このプラスミドｐｃは第２図に示す構造
を有する。
たＨ５ＶからウィルスＤＮＡを分離し、このウィルスＤ
ＮＡを制限酵素Ｂａｉ＋Ｅ［Ｉ−Ｇフラグメントを分離
、抽出する。このＢ亀−旧−Ｇフラグメントを、あらか
じめＢａ■Ｈ１処理した大腸菌プラスミド、ＢＲ３２２
とＴ４リガーゼにより結合反応させろ。この反応液にて
大腸菌χ１７７６を形質転換し、その形質転換体のうち
、アンビレリン耐性（Ａｐｒ）で且つテトラサイクリン
感受性（Ｔｅ”）の菌を選択、培養することにより、こ
の菌体からＢａｍＨＩ−Ｇフラグメントを含むプラスミ
ドｐｃを得る。このプラスミドｐｃは第２図に示す構造
を有する。
上記プラスミドｐｃをＢａｍＨＩとＸｈｏ （の両制限
酵素で切断するとＨ５ＶｇＢ遺伝子を含む３．５Ｋｂの
フラグメントが得られる。このフラグメントを分離、抽
出後、あらかじめＢｕｓｔ（１とＸｈｏ ■で処理した
大腸菌プラスミド、ＡＣＹＣ１７７の２．６Ｋｂフラグ
メントＴ４リガーゼにより結合反応を行わせる。この反
応液にて大腸菌を形質転換し、得られるアンピシリン耐
性の形質転換体を培養することにより、その菌体から［
（ＳＶｇＢ遺伝子を含有するプラスミドｐＧＢＸｆ＃得
ろ。
酵素で切断するとＨ５ＶｇＢ遺伝子を含む３．５Ｋｂの
フラグメントが得られる。このフラグメントを分離、抽
出後、あらかじめＢｕｓｔ（１とＸｈｏ ■で処理した
大腸菌プラスミド、ＡＣＹＣ１７７の２．６Ｋｂフラグ
メントＴ４リガーゼにより結合反応を行わせる。この反
応液にて大腸菌を形質転換し、得られるアンピシリン耐
性の形質転換体を培養することにより、その菌体から［
（ＳＶｇＢ遺伝子を含有するプラスミドｐＧＢＸｆ＃得
ろ。
このプラスミドｐＧＢＸは第３図に示す構造を有する。
＋３１Ｈ５ＶｇＢ遺伝子発現プラスミドの構築前述した
ように、本発明は、［ｔＳＶｇＢ遺伝子のシグナル配列
コード部分を欠失したＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメント、
あるいは、該シグナル配列コード部分とその下流部分が
欠失したＨ５ＶｇＢ遺伝子フラグメントをシャトルベク
ターに組込んだプラスミドを用いることによって、単純
ヘルペスウィルス感染症の予防用ワクチンの製造に有用
な単純ヘルペスウィルスの産生を可能にするものである
。そのようなＨ５ＶｇＢ遺伝子発現プラスミドは、上記
のプラスミドｐＧＢＸから、ＨＳＶｇＢ遺伝子の制限酵
素部位に応じてシグナル配列をコードする遺伝子を含む
領域を欠失でせることにより次のように構築することが
できる。
ように、本発明は、［ｔＳＶｇＢ遺伝子のシグナル配列
コード部分を欠失したＨＳＶｇＢ遺伝子フラグメント、
あるいは、該シグナル配列コード部分とその下流部分が
欠失したＨ５ＶｇＢ遺伝子フラグメントをシャトルベク
ターに組込んだプラスミドを用いることによって、単純
ヘルペスウィルス感染症の予防用ワクチンの製造に有用
な単純ヘルペスウィルスの産生を可能にするものである
。そのようなＨ５ＶｇＢ遺伝子発現プラスミドは、上記
のプラスミドｐＧＢＸから、ＨＳＶｇＢ遺伝子の制限酵
素部位に応じてシグナル配列をコードする遺伝子を含む
領域を欠失でせることにより次のように構築することが
できる。
（ａ）Ｎ末端の８３個のアミノ酸をコードする遺伝子を
欠失させる場合（第４図参照）： まず、ｐＧＢＸをＮａｅ Ｊで部分的に切断する。その
後、Ｃ１ａ ニリンカー（ＣＡＴＣＧ人ＴＧ）をＴ４リ
ガーゼ（こより結合させｐＧＢＸを閉環する。得られる
プラスミドの中から、ｇＢのＮ末端のメチオニンから８
３番目のアミノ酸の部位に相当するＮａｅ １部位のみ
がＣｌａ １部位に変換されたプラスミド（ｐＨ：Ｂ）
０１１と呼ぶ）を得ろ。この操作によりｇＢのＮ末端の
メチオニンから８４番目のアミノ酸の１つ上流にメチオ
ニンをコードするＡＴ（ｉが付加されることになる。
欠失させる場合（第４図参照）： まず、ｐＧＢＸをＮａｅ Ｊで部分的に切断する。その
後、Ｃ１ａ ニリンカー（ＣＡＴＣＧ人ＴＧ）をＴ４リ
ガーゼ（こより結合させｐＧＢＸを閉環する。得られる
プラスミドの中から、ｇＢのＮ末端のメチオニンから８
３番目のアミノ酸の部位に相当するＮａｅ １部位のみ
がＣｌａ １部位に変換されたプラスミド（ｐＨ：Ｂ）
０１１と呼ぶ）を得ろ。この操作によりｇＢのＮ末端の
メチオニンから８４番目のアミノ酸の１つ上流にメチオ
ニンをコードするＡＴ（ｉが付加されることになる。
ｐＧＢＸＮ １をＣ１ａ （にて切断後、ＤＮＡポリメ
ラーゼにより、末端を（ｌｕｓｈ ｅｎｄに変換する。
ラーゼにより、末端を（ｌｕｓｈ ｅｎｄに変換する。
その後、Ｘｈｏ ニリンカーをＴ４１Ｊガーゼにより結
合させ閉環スル。得うレルフ５ ｘ Ｅ ）’ （ｐＧ
ＢＸＮ２ ）Ｉｔ、ｐＧＢＸＮｌのＣ１ａ （部位がＸ
ｈｏ １部位に変換したものである。
合させ閉環スル。得うレルフ５ ｘ Ｅ ）’ （ｐＧ
ＢＸＮ２ ）Ｉｔ、ｐＧＢＸＮｌのＣ１ａ （部位がＸ
ｈｏ １部位に変換したものである。
ｐＧＢＸＮ２をＸｈｏ （をＢａｗＨＩで切断し、切り
出される断片のうちｇＢのシグナル配列コード領域を含
まない断片２．９Ｋｂと、あらかじめＸｈｏ （とＢａ
ｇ旧で処理したシャトルベクターｐｏ）ＩＹ １とをＴ
４リガーゼにより結合させ、酸性ホスファターゼプロモ
ーター下流にシグナル配列コード領域を欠失したｇＢｉ
Ｒ伝子が挿入されたプラスミド（ｐＯＮＹＧＢ ２と呼
ぶ）を得る。
出される断片のうちｇＢのシグナル配列コード領域を含
まない断片２．９Ｋｂと、あらかじめＸｈｏ （とＢａ
ｇ旧で処理したシャトルベクターｐｏ）ＩＹ １とをＴ
４リガーゼにより結合させ、酸性ホスファターゼプロモ
ーター下流にシグナル配列コード領域を欠失したｇＢｉ
Ｒ伝子が挿入されたプラスミド（ｐＯＮＹＧＢ ２と呼
ぶ）を得る。
（ｂ）Ｎ末端の３０個のアミノ酸をコードする遺伝子（
シグナル配列コード遺伝子）を欠失させる場合（第５図
参照）ニ ブ’ｙ Ｘ Ｅ Ｆ ｐＧＢＸｅ ＸｈｏＩ ”Ｑ 切
１ｉ シ、ｇＢｉｌ 伝子（Ｄシグナル配列を除くため
に、エキソヌクレアーゼＢａｔ−３１を作用させる。Ｂ
龜１−３１処理したＤＮＡをＴし）が−ゼにより、Ｃ１
ａｉリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と結合させプラスミ
ドを閉環させる。得られるプラスミドの中から、ｌＢ遺
伝子のシグナル配列をコードする領域が除かれ、さらに
挿入されたＣｌａ ■リンカーの人ＴＧが、その下流の
ｇＢ遺伝子のアミノ酸をコードするコドンと同じフレー
ムになったプラスミドｐＧＢＸＢ ｌを得る。
シグナル配列コード遺伝子）を欠失させる場合（第５図
参照）ニ ブ’ｙ Ｘ Ｅ Ｆ ｐＧＢＸｅ ＸｈｏＩ ”Ｑ 切
１ｉ シ、ｇＢｉｌ 伝子（Ｄシグナル配列を除くため
に、エキソヌクレアーゼＢａｔ−３１を作用させる。Ｂ
龜１−３１処理したＤＮＡをＴし）が−ゼにより、Ｃ１
ａｉリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と結合させプラスミ
ドを閉環させる。得られるプラスミドの中から、ｌＢ遺
伝子のシグナル配列をコードする領域が除かれ、さらに
挿入されたＣｌａ ■リンカーの人ＴＧが、その下流の
ｇＢ遺伝子のアミノ酸をコードするコドンと同じフレー
ムになったプラスミドｐＧＢＸＢ ｌを得る。
ｐＧＢＸＢ １をＣ１亀■で切断し、ＤＮＡポリメラー
ゼにより、末端をｆｌｕＳｈ ｅｎｄに変換させ、Ｔ４
リガーゼによりＸｈｏ ■リンカー（ＣＣＴＣＧＡＧＧ
）を結合させプラスミドを閉環させる。得られるプラス
ミドｐＧＢＸＢ ２をＸｈｏ ■とＢ１旧で切断し、ｇ
Ｂ通遺伝子含む３ＫｂのＤＮＡ断片を分離し、あらかじ
めＸｈｏ ＩとＢａｍＨｌで処理したｐＯＮＹ １とＴ
４１Ｊガーゼによる結合反応を個のなわせる。乙の反応
により、ホスファターゼプロモーター下流にｇＢ遺伝子
が挿入されたプラスミドｐＯＮＹＧＢ ３を得ろ。
ゼにより、末端をｆｌｕＳｈ ｅｎｄに変換させ、Ｔ４
リガーゼによりＸｈｏ ■リンカー（ＣＣＴＣＧＡＧＧ
）を結合させプラスミドを閉環させる。得られるプラス
ミドｐＧＢＸＢ ２をＸｈｏ ■とＢ１旧で切断し、ｇ
Ｂ通遺伝子含む３ＫｂのＤＮＡ断片を分離し、あらかじ
めＸｈｏ ＩとＢａｍＨｌで処理したｐＯＮＹ １とＴ
４１Ｊガーゼによる結合反応を個のなわせる。乙の反応
により、ホスファターゼプロモーター下流にｇＢ遺伝子
が挿入されたプラスミドｐＯＮＹＧＢ ３を得ろ。
（ｃｌ Ｎ末端の３２０個のアミノ酸をコードする遺伝
子を欠失させる場合ニ プラスミドｐＧＢＸｌｔＳａｔ Ｉで切断し、ＤＮＡポ
リメラーゼにより、末端をｆｌｕｓｈ ｅｎｄに変換し
、その後、Ｈｉｎｄｕリンカ−（＾ＣＡＡＧＣＴＴＧＴ
）をＴ４リガーゼにより結合させ、プラスミドを閉環す
る。得られるプ’） Ｘ Ｅ Ｆ ｐＧＢＸｓ １ ヲ
［（ｉｎｄｌ［テ切断１． 、ＤＮＡ、ｔ’ Ｕメラー
ゼにより末端をｆｌｕｓｈ ｅｎｄに変換後、Ｃｌａ
ｌリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）をＴ４リガーゼにより
結合させ、プラスミドを閉環する。得られるプラスミド
ｐＧＢＸＳ ２では、Ｃ１ａ ｌリンカ−の＾ＴＧが、
それにより下流のにＢ遺伝子のアミノ酸をコードするコ
ドンと同じフレームになる。
子を欠失させる場合ニ プラスミドｐＧＢＸｌｔＳａｔ Ｉで切断し、ＤＮＡポ
リメラーゼにより、末端をｆｌｕｓｈ ｅｎｄに変換し
、その後、Ｈｉｎｄｕリンカ−（＾ＣＡＡＧＣＴＴＧＴ
）をＴ４リガーゼにより結合させ、プラスミドを閉環す
る。得られるプ’） Ｘ Ｅ Ｆ ｐＧＢＸｓ １ ヲ
［（ｉｎｄｌ［テ切断１． 、ＤＮＡ、ｔ’ Ｕメラー
ゼにより末端をｆｌｕｓｈ ｅｎｄに変換後、Ｃｌａ
ｌリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）をＴ４リガーゼにより
結合させ、プラスミドを閉環する。得られるプラスミド
ｐＧＢＸＳ ２では、Ｃ１ａ ｌリンカ−の＾ＴＧが、
それにより下流のにＢ遺伝子のアミノ酸をコードするコ
ドンと同じフレームになる。
ＰＧＢＸＳ ２をＣ１ａ ｌで切断し、Ｉ）ＮＡポリメ
ラーゼにより、末端をｆｌｕｓｈ ｅｎｄに変換し、Ｘ
ｈｏ ｌリンカ−（ＯＣＴＣＧＡＧＧ）をＴ４リガーゼ
により結合させプラスＥド’ｅ閉環し、ｐＧＢＸｓ３ヲ
得る。ｐＧＢＸＳ ３ ヲＸｈｏ ■とＢａｍＨＩで切
断し、ｇＢ遺伝子を含む２．２ＫｂのＤＮＡ断片を分離
し、あらかじめＸｈｏ （とＢａｇ）ＩＩで処理したｐ
ＯＮＹ １とＴ４リガーゼによる結合反応を行わせる。
ラーゼにより、末端をｆｌｕｓｈ ｅｎｄに変換し、Ｘ
ｈｏ ｌリンカ−（ＯＣＴＣＧＡＧＧ）をＴ４リガーゼ
により結合させプラスＥド’ｅ閉環し、ｐＧＢＸｓ３ヲ
得る。ｐＧＢＸＳ ３ ヲＸｈｏ ■とＢａｍＨＩで切
断し、ｇＢ遺伝子を含む２．２ＫｂのＤＮＡ断片を分離
し、あらかじめＸｈｏ （とＢａｇ）ＩＩで処理したｐ
ＯＮＹ １とＴ４リガーゼによる結合反応を行わせる。
この反応によりホスファターゼプロモーター下流にｈＢ
遺伝子が挿入されたプラスミドｐＯＮＹＧＢ ５を得る
。
遺伝子が挿入されたプラスミドｐＯＮＹＧＢ ５を得る
。
（４）酵母の形質転換
形質転換されるべき酵母としては、プラスミドに担われ
た形質転換酵母の選択マーカー遺伝子よって相補させる
変異を持った変異株、例えば、ロイシンｉ求ａ変ｘ株で
あるサツカロミセス°セレビシェ（Ｓａｃｅｈｍｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１人Ｆ［２２または
＾Ｈ２２ｐｈｏ８０（ａ ｌａｕ ２ ｈｉ口Ｃｓｎ１
． Ｃｉ”）を月いる。上記組換えプラスミドを大Ｗ、
菌にて増殖させたのち、該酵母変異株に常法による作用
させ、例えばスフェロプラスト化したのちカルシウム処
理した菌体とプラスミドＤＮＡを混合して形質転換を起
こさせる。
た形質転換酵母の選択マーカー遺伝子よって相補させる
変異を持った変異株、例えば、ロイシンｉ求ａ変ｘ株で
あるサツカロミセス°セレビシェ（Ｓａｃｅｈｍｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１人Ｆ［２２または
＾Ｈ２２ｐｈｏ８０（ａ ｌａｕ ２ ｈｉ口Ｃｓｎ１
． Ｃｉ”）を月いる。上記組換えプラスミドを大Ｗ、
菌にて増殖させたのち、該酵母変異株に常法による作用
させ、例えばスフェロプラスト化したのちカルシウム処
理した菌体とプラスミドＤＮＡを混合して形質転換を起
こさせる。
このように処理された酵母をベクター上に担われている
宿主酵母の変異を相補する遺伝子、例えばロイシン産生
遺伝子の発現を指標として形質転換酵母を選択し、分離
する。
宿主酵母の変異を相補する遺伝子、例えばロイシン産生
遺伝子の発現を指標として形質転換酵母を選択し、分離
する。
なお、酵母としてはロイシン要求性変異株のほかに、ヒ
スチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異株、
ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変異株などが挙
げられる。
スチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異株、
ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変異株などが挙
げられる。
（５）形質転換酵母の培養およびＨＳＶｇＢの生産上記
の方法で得られた形質転換酵母をリン酸を含む培地にて
通常の培養条件下に前培養し、対数増殖期にある国体を
リン酸を含まない培地に移しかえて酸性ホスファターゼ
プロモーターが抑制されない条件下に培養する。培Ｉｌ
後、常法により集菌し、溶菌処理し、所望のＨＳＶｇＢ
を多量に含む溶菌液を得る。
の方法で得られた形質転換酵母をリン酸を含む培地にて
通常の培養条件下に前培養し、対数増殖期にある国体を
リン酸を含まない培地に移しかえて酸性ホスファターゼ
プロモーターが抑制されない条件下に培養する。培Ｉｌ
後、常法により集菌し、溶菌処理し、所望のＨＳＶｇＢ
を多量に含む溶菌液を得る。
なお、用いろ酵母の種類により１例えばｐｈｏｌｌｏ変
異株を用いた場合には、酸性ホスファターゼプロモータ
ーを抑制しない条件を特に採用する必要はなく、該形質
転換酵母を直接培養して所望のＨＳ １．１ ｇ Ｂを
多量に産生させることができる。
異株を用いた場合には、酸性ホスファターゼプロモータ
ーを抑制しない条件を特に採用する必要はなく、該形質
転換酵母を直接培養して所望のＨＳ １．１ ｇ Ｂを
多量に産生させることができる。
上記培養によって得られるｌ（ＳＶｇＢを通常の蛋白質
精製法により精製する。例えば、抗ｇＢ抗体を結合した
ゲルを充填したカラムに該ｈＢ含有抽出液を通し、３
ＭＫＳＣＮで溶出してｇＢを単離する。
精製法により精製する。例えば、抗ｇＢ抗体を結合した
ゲルを充填したカラムに該ｈＢ含有抽出液を通し、３
ＭＫＳＣＮで溶出してｇＢを単離する。
上記の方法で得られるｇＢはＨ３Ｖ感染細胞から得られ
る天然ｇＢと免疫学的に全く同一であり、Ｈ５Ｖワクチ
ンまたは診断用試薬として利用し得ろ。
る天然ｇＢと免疫学的に全く同一であり、Ｈ５Ｖワクチ
ンまたは診断用試薬として利用し得ろ。
次に、本発明を実施例に沿って、さらに説明する。
ｆｌｌＨ５ＶｇＢ遺伝子含有ＤＮＡ）調製■Ｈ３Ｖ−Ｉ
ＤＩＩＡ（＋）調製 Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）（約５ｘｌ
Ｏ８ＢｌｌＳｌに単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶ−
１１（Ｋ２Ｓ株）を０．５〜Ｉ ＰＦＵ／ｃｅｌｌの量
で感染させ、３７℃で２０〜２４時間培養して、細胞変
性が充分に起きた時点で２３．０ＯＯｒｐ−にて１時間
遠心して感染細胞と上清を分離して、感染細胞のベレッ
ト（２〜３Ｉ！１＃）を得る。
ＤＩＩＡ（＋）調製 Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）（約５ｘｌ
Ｏ８ＢｌｌＳｌに単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶ−
１１（Ｋ２Ｓ株）を０．５〜Ｉ ＰＦＵ／ｃｅｌｌの量
で感染させ、３７℃で２０〜２４時間培養して、細胞変
性が充分に起きた時点で２３．０ＯＯｒｐ−にて１時間
遠心して感染細胞と上清を分離して、感染細胞のベレッ
ト（２〜３Ｉ！１＃）を得る。
これをリンｆｉ１１緩衝液−生理食ｔ！！ ＷＲ（ｐ）
１７．２） （以下、ＰＢＳと略する）６．Ｏ＋！１＃
に懸濁し、この懸濁液を超音波処理（９Ｋｔｌｚ、 ２
００！！、 ５分間処理）また；よ凍結融解〔−５０℃
（アセトン−ドライアイス）と３７℃にて３回凍結融解
を繰９返す）を行って細胞を破壊し、細胞残渣を低速遠
心分ｇｌ （３，０００ｒｐ■、２０分間）により除去
する。得られる溶液をグリセロールクッシｌン（５１４
０π）に重層し、３５．０ＯＯｒｐｍにて１時間遠心分
離する。得られたベツレト０５〜１１１１＃をＰＢＳ
１〜２−に懸濁し、これにＤＮｍｓｅｌＯμｇ／−およ
びＲＮ＊ｓｅＯ，３（／１１１＃３７℃で１時間作用さ
せ、ついで１１５量の５ｘｓＴＥＰ （０，５ＸＳＤＳ
、 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，０，４Ｍ
ＥＤＴＡ。
１７．２） （以下、ＰＢＳと略する）６．Ｏ＋！１＃
に懸濁し、この懸濁液を超音波処理（９Ｋｔｌｚ、 ２
００！！、 ５分間処理）また；よ凍結融解〔−５０℃
（アセトン−ドライアイス）と３７℃にて３回凍結融解
を繰９返す）を行って細胞を破壊し、細胞残渣を低速遠
心分ｇｌ （３，０００ｒｐ■、２０分間）により除去
する。得られる溶液をグリセロールクッシｌン（５１４
０π）に重層し、３５．０ＯＯｒｐｍにて１時間遠心分
離する。得られたベツレト０５〜１１１１＃をＰＢＳ
１〜２−に懸濁し、これにＤＮｍｓｅｌＯμｇ／−およ
びＲＮ＊ｓｅＯ，３（／１１１＃３７℃で１時間作用さ
せ、ついで１１５量の５ｘｓＴＥＰ （０，５ＸＳＤＳ
、 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，０，４Ｍ
ＥＤＴＡ。
０、１％プロティナーゼＫ）を加え、５０℃で３０分間
作用させる。乙の処理液を等量のフェノール、フェノー
ル−クロロホルム（１１）およびクロロホルムで順に抽
出し、ＤＮＡを含む水層を得る。
作用させる。乙の処理液を等量のフェノール、フェノー
ル−クロロホルム（１１）およびクロロホルムで順に抽
出し、ＤＮＡを含む水層を得る。
この水層をＴＥ［ｌ［ｉ液（２０ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、 １ｍ１ｉ ＥＤＴＡ。
ｌ、 １ｍ１ｉ ＥＤＴＡ。
ｐＨ７，５）に透析したのち、冷エタノールを加えてＤ
ＮＡを沈殿させろ。このＤＮＡをろ取し、真空下で乾燥
後、塩化セシウム水ｉｌ ｗＲ（Ｒｆｌ、 ３８８５．
エチジウムブロマイド０．０４％、ラウロイルサルコシ
ネート０．４％を添加）５−に溶解し、４． ＯＯＯｒ
ｐｍで７２時間遠心分離し、ＨＳＶ−Ｉ ＤＮＡのバン
ドを形成させる。このバンドを回収し、イソプロピルア
ルコールで洗浄してエチジウムブロマイドを除去後、Ｔ
ＥＩＩＩ衝液に透耐液る。これに冷エタノールを加えて
沈殿させて１（ＳＶ−Ｉ ＤＮＡ！ ４ ル。
ＮＡを沈殿させろ。このＤＮＡをろ取し、真空下で乾燥
後、塩化セシウム水ｉｌ ｗＲ（Ｒｆｌ、 ３８８５．
エチジウムブロマイド０．０４％、ラウロイルサルコシ
ネート０．４％を添加）５−に溶解し、４． ＯＯＯｒ
ｐｍで７２時間遠心分離し、ＨＳＶ−Ｉ ＤＮＡのバン
ドを形成させる。このバンドを回収し、イソプロピルア
ルコールで洗浄してエチジウムブロマイドを除去後、Ｔ
ＥＩＩＩ衝液に透耐液る。これに冷エタノールを加えて
沈殿させて１（ＳＶ−Ｉ ＤＮＡ！ ４ ル。
■Ｈ３Ｖ−Ｉ ＤＮＡｆＪＢａ−旧切断Ｇフラグメント
のクローン化 上記の方法で調製したＨＳＶ−Ｉ Ｄ）ＩＡ約１００μ
ｇを、７３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，ｏ）、
７ ｍＭ ＭｇＣｌ２． １００ｍＭ ＮａＣｌ。
のクローン化 上記の方法で調製したＨＳＶ−Ｉ Ｄ）ＩＡ約１００μ
ｇを、７３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，ｏ）、
７ ｍＭ ＭｇＣｌ２． １００ｍＭ ＮａＣｌ。
２■Ｍ２−メルカプトエタノールの混液０．７Ｓｄ 中
で、制限酵素８口Ｈｒにより３７℃、６時間処理したの
ち、０．７％アガロース電気泳動によって各断片を分離
し、Ｇフラグメント（０，３４５〜０３９９マツプユニ
。
で、制限酵素８口Ｈｒにより３７℃、６時間処理したの
ち、０．７％アガロース電気泳動によって各断片を分離
し、Ｇフラグメント（０，３４５〜０３９９マツプユニ
。
ト）に相当する部分のゲルを切り取り、電気泳動的にＧ
フラグフン８回収する。
フラグフン８回収する。
前記と同様にして制限酵素８口［（Ｉにより開裂された
ｐＢＲ３２２プラスミド１７１０モル量と上記Ｇフラグ
メント約２７７ｇとを、５０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐＨ７，９，１０−Ｍ ＭｇＣｌ２．２０ａＭジチオ
スレイトール、 ｌ ｍｕ ＡＴＰｆｆ液中にて、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で約１６時間反応させ
る。
ｐＢＲ３２２プラスミド１７１０モル量と上記Ｇフラグ
メント約２７７ｇとを、５０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐＨ７，９，１０−Ｍ ＭｇＣｌ２．２０ａＭジチオ
スレイトール、 ｌ ｍｕ ＡＴＰｆｆ液中にて、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で約１６時間反応させ
る。
高木康敬縮著「遺伝子操作実験法」第１６１項に記載の
方法で大腸菌χ１７７６の培養液を調製し、その菌液０
． Ｉｄに上記反応液を加えてよく混合させ、０℃で４
５分間放置したのち、アンピシリン１００ｕ ｇ／−を
含（寒天プレート上に塗沫し、３７℃で一夜培養する。
方法で大腸菌χ１７７６の培養液を調製し、その菌液０
． Ｉｄに上記反応液を加えてよく混合させ、０℃で４
５分間放置したのち、アンピシリン１００ｕ ｇ／−を
含（寒天プレート上に塗沫し、３７℃で一夜培養する。
出現したコロニーについて、アンピシリン１００μｓ／
ｍｆを含む寒天プレートとテトラサイクリン１００μｇ
７ｍｌを含む寒天プレートにそれぞれ塗沫し、同様に培
養してアンピシリンを含む寒天プレートでのみ増殖した
コロニーを選択する。
ｍｆを含む寒天プレートとテトラサイクリン１００μｇ
７ｍｌを含む寒天プレートにそれぞれ塗沫し、同様に培
養してアンピシリンを含む寒天プレートでのみ増殖した
コロニーを選択する。
ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイク
リン耐性遺伝子を有するがテトラサイクリン耐性遺伝子
中にあるＢ１旧部位Ｈ５Ｖ−ＩＤＮ＾断片が押入される
ことによ−テトラサイクリン耐性が消失されルタメ、上
記選択すセタ） Ｏ＝ −１！ ｐＢＲ３２２−ＨＳＶ
ＤＮＡのＨａ纒旧Ｇフラグメントの組換えＤＮＡを保持
してぃることになる。
リン耐性遺伝子を有するがテトラサイクリン耐性遺伝子
中にあるＢ１旧部位Ｈ５Ｖ−ＩＤＮ＾断片が押入される
ことによ−テトラサイクリン耐性が消失されルタメ、上
記選択すセタ） Ｏ＝ −１！ ｐＢＲ３２２−ＨＳＶ
ＤＮＡのＨａ纒旧Ｇフラグメントの組換えＤＮＡを保持
してぃることになる。
上記の方法で得られたコロニーにつし）て、「代謝」第
１７巻、第４号、第８１〜８９頁（１９８０） ｒプラ
スミドＤＮ人の調製」に記載される方法にしたがってプ
ラスミドを調製する。得られたプラスミドを種々の制限
酵素（ＢａｍＨＩ、ｌ／１ｓｔＥｌ［、Ｋｐｎｌ、Ｓｍ
ｌ ｌ 、５ｓｔｉ 、ＸｈｏＪ ）にてその切断パタ
ーンを分析すること（こより、ＨＳＶ−ＩＤＮ人のＢａ
＋ｍＨＩ Ｇ ７ラグメントがｐＢＲ３２２に組込まれ
たＰＢＲ３２２−Ｂ口Ｈｒ−Ｇフラグメントの組換えＤ
ＮＡ（プラスミドｐＧ）を得る。
１７巻、第４号、第８１〜８９頁（１９８０） ｒプラ
スミドＤＮ人の調製」に記載される方法にしたがってプ
ラスミドを調製する。得られたプラスミドを種々の制限
酵素（ＢａｍＨＩ、ｌ／１ｓｔＥｌ［、Ｋｐｎｌ、Ｓｍ
ｌ ｌ 、５ｓｔｉ 、ＸｈｏＪ ）にてその切断パタ
ーンを分析すること（こより、ＨＳＶ−ＩＤＮ人のＢａ
＋ｍＨＩ Ｇ ７ラグメントがｐＢＲ３２２に組込まれ
たＰＢＲ３２２−Ｂ口Ｈｒ−Ｇフラグメントの組換えＤ
ＮＡ（プラスミドｐＧ）を得る。
■プラスミドル ＧＢＸの調製
上記の方法で得られたプラスミドｐＧ１０μｇを、６
＋ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ６
ｍＭ ＭｇＣｌ２． ６ ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール 加工，コれに制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位およびＸｈ
ｏｉｌＯ単位を加えて、３７℃で２時間反応させる。こ
の反応液を、高木康敬繻著「遺伝子操作マニュアル」３
３〜３４頁に記載の方法により、１％アガロースゲルに
て電気泳動により３． ＳＸｂフラグメントＤＮＡＩＯ
口にと大腸菌プラスミド２人ＣＹＣ１７７ （Ｂｉｌｌ
旧およびＸｈｏ ■で処理して開裂したもの） Ｉｏｎ
（とを、Ｔ４リガーゼ０１単位．８６ｍＭ Ｔｒｉｊ
−ＨＣＩ （ｐＨ７．６１ 、８．６ｍＭ ＭｇＣＩ
２、１０＋＋Ｍジチオスレイトールとの混液１０μｌを
用いて１６℃で８時間反応させる。この反応液を用い、
高木康敬編著「遺伝子操作実験法」１６１〜１６２頁に
記載の方法により、大腸菌χ１７７６を形質転換させ、
その形質転換体からアンピシリン耐性菌を選択し、この
菌から、上記「代謝」第１７巻，第４号，第８１〜８９
頁（１９８０）に記載の方法にしたがってｇＢ遺伝子を
含むプラスミドＰＧＢＸを得る。
＋ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ６
ｍＭ ＭｇＣｌ２． ６ ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール 加工，コれに制限酵素ＢａｍＨＩ １０単位およびＸｈ
ｏｉｌＯ単位を加えて、３７℃で２時間反応させる。こ
の反応液を、高木康敬繻著「遺伝子操作マニュアル」３
３〜３４頁に記載の方法により、１％アガロースゲルに
て電気泳動により３． ＳＸｂフラグメントＤＮＡＩＯ
口にと大腸菌プラスミド２人ＣＹＣ１７７ （Ｂｉｌｌ
旧およびＸｈｏ ■で処理して開裂したもの） Ｉｏｎ
（とを、Ｔ４リガーゼ０１単位．８６ｍＭ Ｔｒｉｊ
−ＨＣＩ （ｐＨ７．６１ 、８．６ｍＭ ＭｇＣＩ
２、１０＋＋Ｍジチオスレイトールとの混液１０μｌを
用いて１６℃で８時間反応させる。この反応液を用い、
高木康敬編著「遺伝子操作実験法」１６１〜１６２頁に
記載の方法により、大腸菌χ１７７６を形質転換させ、
その形質転換体からアンピシリン耐性菌を選択し、この
菌から、上記「代謝」第１７巻，第４号，第８１〜８９
頁（１９８０）に記載の方法にしたがってｇＢ遺伝子を
含むプラスミドＰＧＢＸを得る。
■プラスミド、ＧＢＸＮ２の調製
上記プラスミドｐｃｓｘを下記のように処理してｇＢ遺
伝子翻訳開始コドン＾ＴＯの約２５０ｂｐ下流のＨｕｅ
１部位のみをＣｌｍ １部位に変換する。
伝子翻訳開始コドン＾ＴＯの約２５０ｂｐ下流のＨｕｅ
１部位のみをＣｌｍ １部位に変換する。
プラスミドｐＧＢＸ ２ ｐｇ， Ｎａｅｉ Ｏ．１
単位，６ーＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．５’）、
５０ｍＭ ＮａＣＩ， ６ ｍＭ ＭｇＣ
Ｉ２． ６ ｍＭ２−メルカプトエタノールの処
理，エタノール沈殿を行う。そのＤＮＡｌｊ！Ｔ ＡＤ
Ｎ人ポリメラーゼＯＩ単位。
単位，６ーＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７．５’）、
５０ｍＭ ＮａＣＩ， ６ ｍＭ ＭｇＣ
Ｉ２． ６ ｍＭ２−メルカプトエタノールの処
理，エタノール沈殿を行う。そのＤＮＡｌｊ！Ｔ ＡＤ
Ｎ人ポリメラーゼＯＩ単位。
２００μ Ｍ ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴ
Ｐ， ｄＴＴＰ， ６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８． ６１ 、６． ７ｍＭ ＭｇＣＩ２，１０
薦Ｍ２ーメイルカプトエタノール、 １６． ７ｍＭ（
ＮＨ，） ２ＳＯ４の混液５０μｍ中で３７℃。
Ｐ， ｄＴＴＰ， ６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ８． ６１ 、６． ７ｍＭ ＭｇＣＩ２，１０
薦Ｍ２ーメイルカプトエタノール、 １６． ７ｍＭ（
ＮＨ，） ２ＳＯ４の混液５０μｍ中で３７℃。
３０分間反応後、フェノール処理，エタノール沈殿を行
う。このＤＮＡ１ ｐｍｏｌｅを、Ｔ４リガーゼ０１単
位。
う。このＤＮＡ１ ｐｍｏｌｅを、Ｔ４リガーゼ０１単
位。
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）、 ６．
６＋ｍＭ ＭｇＣ１２． １０＋ｍＭジチオスレイト
ール、 ６６μＭ 人ＴＰおよび１０ｐｓｏｌｅ Ｃｌ
ａ ■リンカー（ＣＡＴＣＧ人ＴＧ）の混液１０μ暑中
で１６℃、８時間反応させる。
６＋ｍＭ ＭｇＣ１２． １０＋ｍＭジチオスレイト
ール、 ６６μＭ 人ＴＰおよび１０ｐｓｏｌｅ Ｃｌ
ａ ■リンカー（ＣＡＴＣＧ人ＴＧ）の混液１０μ暑中
で１６℃、８時間反応させる。
この反応液にて、前記高木康敬編著「遺伝子操作実験法
」１６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌χ１７
７６を形質転換させる。アンピシリン含有プレートに成
育してくるクローンを複数選択し、これらの菌体から前
記と同様の方法によりプラスミドを調製する。これらの
プラスミドを各々制限酵素Ｃｌａ ｆとＢ１旧で処理し
、その電気泳動パターンによ’ＩｇＢ遺伝子翻訳開始コ
ドンＡＴＧの約２５０ｂｐＴ流のにａｅ■部位のみがＣ
ｌａ ｉ部位に変換されたプラスミドｐＧＢＸＮ １を
選択する。
」１６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌χ１７
７６を形質転換させる。アンピシリン含有プレートに成
育してくるクローンを複数選択し、これらの菌体から前
記と同様の方法によりプラスミドを調製する。これらの
プラスミドを各々制限酵素Ｃｌａ ｆとＢ１旧で処理し
、その電気泳動パターンによ’ＩｇＢ遺伝子翻訳開始コ
ドンＡＴＧの約２５０ｂｐＴ流のにａｅ■部位のみがＣ
ｌａ ｉ部位に変換されたプラスミドｐＧＢＸＮ １を
選択する。
次にｐＧＢＸＮｌ ２ ｐ ｇ， ＣｌａＩ２単位，
６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＦＩ７．９）、
５０諷Ｍ ＮｍＣＩ， ６ ｍＭ ＭｇＣＩ
２， ６ ｍＭ ２−メルカプトエタノールの混液
５０μｍを３７℃，１時間反応後、フェノール処理，エ
タノール沈殿を行うそのＤＮＡを上記と同様に７ ４１
１ＮＡポリメラ一ゼ反応を行すせｙｓ。サラニ、Ｘｂｏ
Ｉ リ：／ カー （ＣＣＴＣＧＡＧＧ）を上記と同
様に反応させる。得られるプラスミドの中からＣ１畠■
部位がＸｈｏ （部位に変換されたプラスミドｐＧＢＸ
Ｎ ２を得る。
６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＦＩ７．９）、
５０諷Ｍ ＮｍＣＩ， ６ ｍＭ ＭｇＣＩ
２， ６ ｍＭ ２−メルカプトエタノールの混液
５０μｍを３７℃，１時間反応後、フェノール処理，エ
タノール沈殿を行うそのＤＮＡを上記と同様に７ ４１
１ＮＡポリメラ一ゼ反応を行すせｙｓ。サラニ、Ｘｂｏ
Ｉ リ：／ カー （ＣＣＴＣＧＡＧＧ）を上記と同
様に反応させる。得られるプラスミドの中からＣ１畠■
部位がＸｈｏ （部位に変換されたプラスミドｐＧＢＸ
Ｎ ２を得る。
（２）シャトルベクターｐＯＮＹ Ｉの調製特開昭５９
−３１７９９号に記載の方法と同様にして調製してプラ
スミドｐＡＭ８２を用い、これを下記のように処理して
そのＰｕｖ ｆ１部位をＢａｍ８１部位に変換する。
−３１７９９号に記載の方法と同様にして調製してプラ
スミドｐＡＭ８２を用い、これを下記のように処理して
そのＰｕｖ ｆ１部位をＢａｍ８１部位に変換する。
プラスミドｐＡＭ８２をＸｈｏ ■で処理して切断した
フラグメント２μｇを、２００μＭのｄＡＴＰ， ｄＣ
ＴＰ， ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む６７ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，６１，８，７ｗｒＭｖｇｃ１
２．１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６７μＭＥ
ＤＴ＾および１６．７ｍＭ ＯＪＨ，） ２Ｓｏ４の混
液５０μｍ中で、Ｔ ４ＤＮＡポリメラ一ゼ０１単位と
３７℃にて３０分間反応させる。この反応液をフェノー
ル抽出、エタノール沈殿に付したのち、得られろＤＮ人
とＢａｍＨＩリンカ−を１１０モル比にてＴ４リガーゼ
により１６℃、８時間結合反応を行う。
フラグメント２μｇを、２００μＭのｄＡＴＰ， ｄＣ
ＴＰ， ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む６７ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，６１，８，７ｗｒＭｖｇｃ１
２．１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６７μＭＥ
ＤＴ＾および１６．７ｍＭ ＯＪＨ，） ２Ｓｏ４の混
液５０μｍ中で、Ｔ ４ＤＮＡポリメラ一ゼ０１単位と
３７℃にて３０分間反応させる。この反応液をフェノー
ル抽出、エタノール沈殿に付したのち、得られろＤＮ人
とＢａｍＨＩリンカ−を１１０モル比にてＴ４リガーゼ
により１６℃、８時間結合反応を行う。
この反応液を用い、前記プラスミド、 ＧＢＸの調製の
場合と同様に、高木康敬編著「遺伝子操作実験法」１６
１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌プラスミドχ
１７７６を形質転換し、アンピシリン耐性菌を培養し、
その菌体から前記と同様の方法にてｐＡＭ８２のＰｖｕ
ｆ１部位がＢａ■１１部位に変換されたプラスミドｐ
ＯＮＹ １を単離する。
場合と同様に、高木康敬編著「遺伝子操作実験法」１６
１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌プラスミドχ
１７７６を形質転換し、アンピシリン耐性菌を培養し、
その菌体から前記と同様の方法にてｐＡＭ８２のＰｖｕ
ｆ１部位がＢａ■１１部位に変換されたプラスミドｐ
ＯＮＹ １を単離する。
［３１ＨＳＶｇＢ遺伝子発現プラスミドの調製前記のよ
うにして得られたＨ５ＶｇＢ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＧＢＸＮ２ １０７７ ｇを、６ ｍＷ Ｔｒｉｇ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ６ ｍＭＭｇＣ１２，６
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、 １５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１，ＢａｍＨＩ １０単位、 Ｘｈｏｌ １０単
位の混液１００μｉ中で３７℃、２時間反応後、１％ア
ガロース電気泳動により前記と同様の方法にてシグナル
配列コード領域が欠失した［ＳＶｇＢ遺伝子を含む２．
９ＫｂのＤＮ人フラグメントを分離抽出する。
うにして得られたＨ５ＶｇＢ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＧＢＸＮ２ １０７７ ｇを、６ ｍＷ Ｔｒｉｇ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ６ ｍＭＭｇＣ１２，６
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、 １５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１，ＢａｍＨＩ １０単位、 Ｘｈｏｌ １０単
位の混液１００μｉ中で３７℃、２時間反応後、１％ア
ガロース電気泳動により前記と同様の方法にてシグナル
配列コード領域が欠失した［ＳＶｇＢ遺伝子を含む２．
９ＫｂのＤＮ人フラグメントを分離抽出する。
一方、上記（２）で得られたシャトルベクターｌＯμに
を上記と同様にして制限酵素Ｂａｇ旧およびＸｈｏ ■
で処理し、１％アガロース電気泳動より酸性ホスファタ
ーゼプロモータを含む１０Ｋｂの０８人フラグメントを
分離抽出する。
を上記と同様にして制限酵素Ｂａｇ旧およびＸｈｏ ■
で処理し、１％アガロース電気泳動より酸性ホスファタ
ーゼプロモータを含む１０Ｋｂの０８人フラグメントを
分離抽出する。
上記で得られた２、 ９Ｋｂフラグメント１１００ｎと
１０Ｋｂフラグメント１０ｎｇとを、６６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ （ｐＥ！７．６１ 。
１０Ｋｂフラグメント１０ｎｇとを、６６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ （ｐＥ！７．６１ 。
８ 、８ ｗＩＭ Ｍ ｇ ＣＩ ２．１０鳳Ｍジチオ
スレイトールおよび６６μＭ 人ＴＰの混液１０μｍ中
、Ｔ４１Ｊガーゼ０１単位にて１６℃、８時間結合反応
させる。
スレイトールおよび６６μＭ 人ＴＰの混液１０μｍ中
、Ｔ４１Ｊガーゼ０１単位にて１６℃、８時間結合反応
させる。
この反応液を用い、前記プラスミド、ＧＢＸの調製の場
合と同様に、高木康敬編薯「遺伝子操作実験法」１６１
〜１６２頁に記載の方法により、大ＩＩ！菌プラスミド
χ］７７６を形質転換し、アンピシリン耐性菌を選択培
養し、上記と同様の方法にて、その菌体から１酸性ホス
フアターゼプロモータ下流（こ、ＨＳＶｇＢ遺伝子（シ
グナル配列コード領域を含むＮ末端の８３個のアミノ酸
をコードする遺伝子が欠失している）が結合された組換
えプラスミドｐ（ＩＮＹＧＢ ２を単離する。
合と同様に、高木康敬編薯「遺伝子操作実験法」１６１
〜１６２頁に記載の方法により、大ＩＩ！菌プラスミド
χ］７７６を形質転換し、アンピシリン耐性菌を選択培
養し、上記と同様の方法にて、その菌体から１酸性ホス
フアターゼプロモータ下流（こ、ＨＳＶｇＢ遺伝子（シ
グナル配列コード領域を含むＮ末端の８３個のアミノ酸
をコードする遺伝子が欠失している）が結合された組換
えプラスミドｐ（ＩＮＹＧＢ ２を単離する。
（４）形質転換酵母の調製
酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｉｔ
Ｉｅｕ２ ｈｉｓ４ Ｃａｎ１ （Ｃｉｒ＋）Ｉ（黴工
研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポ
リペプトン、１％イーストエキス、２％グルコース）１
００ｍ＃に接種し、３０℃で一晩培養したのち、遠心し
て集菌する。減菌水２０−にて国体を洗浄し、ついで１
．２Ｍソルビトールおよび１００μｇ／ｍＺチモリアー
ゼ６０．０００ （生化学工業製）の溶液５−に懸濁さ
せ、３０℃で約３０分間保ち、スフェロプラスト化する
。ついで、スフェロプラストを１２トノルビトール溶液
で３回洗浄したのち、２Ｍソルビトール、 １０ｍＭ
ＣａＣｌ２および１０＋ｍＭ暫目−Ｆ［ＣＩ （ｐＨ７
，５）の溶液０．６艷に懸濁させ、その６０μｍずっを
小試験管に分注する。これに前記（３）で調製した組換
えプラスミドｐＯＮＹＧＢ２ （１０μｇ）を加え、充
分混合し、さらにＯ，ＩＭ ＣａＣｌ２（３μｍ）加え
て最終濃度１０１０鳳Ｍ ＣａＣｌ２とし、室温に５〜
ｌＯ分間放置する。ついでこれに、２０％ポリエチレン
グリコール４０Ｇ０．１０ｍＭ ＣｍＣＩ２および１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５１溶液ｌｄずつを
加えて混合し、室温に約２０分間放置する。この混合液
０２−ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソル
ビトール、２駕グルコース、０７ｚイーストニトロゲン
ベースアミノ酸、２χＹＰ０．２０μｇ／ｄｇスチジン
、３９ｇ寒天）１０艷に加え、軽く混合させ、予め準備
された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０，７Ｘイ
ーストニトロゲンベースアミノｆｉ、２Ｘグルコース、
２０μｇ／ａｓｌヒスチジン、２％寒天）プレートに重
層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン非要
求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μｇ／
Ｉ！１！ｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニ７４
）ヂウＡ ＋Ｔｏｈｅ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ ；Ｊ、
Ｂｉｅｈｔｅｒｏｌ、 、 １１３゜７２７〜７３８
（１９７３）を参照］にて培養して形質転換酵母サツカ
ロミセス・セレビシェ（ＹＧＢＳ）を得る。
Ｉｅｕ２ ｈｉｓ４ Ｃａｎ１ （Ｃｉｒ＋）Ｉ（黴工
研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポ
リペプトン、１％イーストエキス、２％グルコース）１
００ｍ＃に接種し、３０℃で一晩培養したのち、遠心し
て集菌する。減菌水２０−にて国体を洗浄し、ついで１
．２Ｍソルビトールおよび１００μｇ／ｍＺチモリアー
ゼ６０．０００ （生化学工業製）の溶液５−に懸濁さ
せ、３０℃で約３０分間保ち、スフェロプラスト化する
。ついで、スフェロプラストを１２トノルビトール溶液
で３回洗浄したのち、２Ｍソルビトール、 １０ｍＭ
ＣａＣｌ２および１０＋ｍＭ暫目−Ｆ［ＣＩ （ｐＨ７
，５）の溶液０．６艷に懸濁させ、その６０μｍずっを
小試験管に分注する。これに前記（３）で調製した組換
えプラスミドｐＯＮＹＧＢ２ （１０μｇ）を加え、充
分混合し、さらにＯ，ＩＭ ＣａＣｌ２（３μｍ）加え
て最終濃度１０１０鳳Ｍ ＣａＣｌ２とし、室温に５〜
ｌＯ分間放置する。ついでこれに、２０％ポリエチレン
グリコール４０Ｇ０．１０ｍＭ ＣｍＣＩ２および１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５１溶液ｌｄずつを
加えて混合し、室温に約２０分間放置する。この混合液
０２−ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソル
ビトール、２駕グルコース、０７ｚイーストニトロゲン
ベースアミノ酸、２χＹＰ０．２０μｇ／ｄｇスチジン
、３９ｇ寒天）１０艷に加え、軽く混合させ、予め準備
された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０，７Ｘイ
ーストニトロゲンベースアミノｆｉ、２Ｘグルコース、
２０μｇ／ａｓｌヒスチジン、２％寒天）プレートに重
層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン非要
求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μｇ／
Ｉ！１！ｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニ７４
）ヂウＡ ＋Ｔｏｈｅ、 Ａ、 ｅｔ ａｌ ；Ｊ、
Ｂｉｅｈｔｅｒｏｌ、 、 １１３゜７２７〜７３８
（１９７３）を参照］にて培養して形質転換酵母サツカ
ロミセス・セレビシェ（ＹＧＢＳ）を得る。
ｆ５］形質転換酵母によるＨ５ｖにＢの製法前記（４）
で得られた形質転換酵母のコロニーをさらに２０μｇ／
−ヒスチジンを含むバルクホルダー２ニマルメデイウム
の寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養してコロニ
ーを形成させる（ロイシン非要求性となった形質転換体
の再確認のため）。
で得られた形質転換酵母のコロニーをさらに２０μｇ／
−ヒスチジンを含むバルクホルダー２ニマルメデイウム
の寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養してコロニ
ーを形成させる（ロイシン非要求性となった形質転換体
の再確認のため）。
ついでこのコロニーから菌体を分離し、２０μｇ／ｍｌ
ヒスチジンを含むバルクホルダー２ニマルメデイウム１
０−に接種し、３０℃にて培養を行う。約２４時間後、
対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これをリン酸
を含まない最小培地（バルクホルダー２ニマルメデイウ
ムに含まれるＫＨ２ＰＯ４をＫＣＩで置換し、さらに２
０μｇ／−ヒスチジンを加えたもの）１０ｍｊ菌数約４
ｘｌＯ６ｅｅｌｌｓ／−になるように懸濁し、３０℃に
て約２４時間培養を続けたのち、４． ｏｏｏ回転。
ヒスチジンを含むバルクホルダー２ニマルメデイウム１
０−に接種し、３０℃にて培養を行う。約２４時間後、
対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これをリン酸
を含まない最小培地（バルクホルダー２ニマルメデイウ
ムに含まれるＫＨ２ＰＯ４をＫＣＩで置換し、さらに２
０μｇ／−ヒスチジンを加えたもの）１０ｍｊ菌数約４
ｘｌＯ６ｅｅｌｌｓ／−になるように懸濁し、３０℃に
て約２４時間培養を続けたのち、４． ｏｏｏ回転。
１０分間の遠心により菌体を集める。この菌体を１．２
ＭＶ ルｔ’ ） ／し、 ５０ｍＭ！Ｊ ン酸ｖ１
間’ｇｌ （ｐＨ７，２）。
ＭＶ ルｔ’ ） ／し、 ５０ｍＭ！Ｊ ン酸ｖ１
間’ｇｌ （ｐＨ７，２）。
１４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、 １００μｇ／
−ザイモリエース６０．０００の溶液３−に懸濁させ、
３０℃にて３０分間ゆるやか（ζ振盪してスフェロプラ
スト化し、遠心分離によりこれを集めろ。このスフェロ
プラストを１％トリトンＸ−１００を添加したＳＯ＋ｍ
Ｍリン酸ｌ！衝液（ｐ耐液、 ２） １ ｒｎｌに＠濁
し、グラスビーズを加えて撹拌して菌体を破砕（する。
−ザイモリエース６０．０００の溶液３−に懸濁させ、
３０℃にて３０分間ゆるやか（ζ振盪してスフェロプラ
スト化し、遠心分離によりこれを集めろ。このスフェロ
プラストを１％トリトンＸ−１００を添加したＳＯ＋ｍ
Ｍリン酸ｌ！衝液（ｐ耐液、 ２） １ ｒｎｌに＠濁
し、グラスビーズを加えて撹拌して菌体を破砕（する。
この破砕液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上
清のｇＢ抗原活性を酵素抗体法により測定した。その結
果を第１表１ζ示す。第１表１ζは、ネガティブコント
ロールとしてシャトルベクターｐＯＮＹ １をもつ酵母
についての値、およびポジティブコントロールとしてＨ
５Ｖから精製したｇＢの値を併せて示している。同表か
ら理解されるように、本発明の組換えプラスミドにより
形質転換された酵母は、効率よ（ＨＳＶｇＢを産生じて
いる。
清のｇＢ抗原活性を酵素抗体法により測定した。その結
果を第１表１ζ示す。第１表１ζは、ネガティブコント
ロールとしてシャトルベクターｐＯＮＹ １をもつ酵母
についての値、およびポジティブコントロールとしてＨ
５Ｖから精製したｇＢの値を併せて示している。同表か
ら理解されるように、本発明の組換えプラスミドにより
形質転換された酵母は、効率よ（ＨＳＶｇＢを産生じて
いる。
また、上記破砕液を５匹のモルモットに１−ずつ１週問
おきに４回皮下接種すると、すべてのモルモットに中和
抗体が出現しており、該破砕液がｇＢ免疫原住を有する
ことが確かめられた。
おきに４回皮下接種すると、すべてのモルモットに中和
抗体が出現しており、該破砕液がｇＢ免疫原住を有する
ことが確かめられた。
前述した他の組換えプラスミド（ｐＯＮＹＧＢ３ 。
ＰＯＮＹＧＢ５１を用いた場合においてもほぼ同様の結
果が得られた。
果が得られた。
第１図１，１１本発明で用いられろＨＳ Ｖ Ｋ ＲＪ
伝子の塩基配列を示し、 第２図は、本発明で用いらｉｌ、 １ ［（ＳＶＩＩＮ
Ａ〕ＢＡａＨＩ−Ｇフラグメント４ｃ含むプラスミドｐ
Ｇの構造を示し、第３図は、本発明で用いらｉｌろジグ
ｉ’ ）ｈ配列コード領域を有ずろＩ（ＳｖｌＫＢ道伝
子を含むプラスミドｐＧＢＸの構造を示し、 第４図、第５図および１６図は、いずわも、プラスミド
ｐＧＢ＞Ｉから本発明）こしｔ：がう各種の組換えプラ
スミド４ｃ構築する工程を示すものである。 特許出願人 財団法人化学及血清療法研究所代 理
人 弁理士 筒 井 知図面のｔ↑書（内
容に変更なＬ） 第２図 第３図 琴 叩 Ｑ リ リ リ 専 青 ！”；ｉＥ’ ＩＵ薄 〆１悼 〆１緊 りど １］
４ 冗ａｇ ｕ、［Ｆ Ｌ’ｌ Ｅ＆
１４Ｊ ！ＪＦ リ ｒ ！
ＪＸと １］ｙ イ匹 １１薄 ’ｄ３ Ｍ月 ぺ
白 １？ｉｉ 睨舅 Ｌ腸 トｉ Ｖｉ Ｒ１１３１片
リど月 −と りと べ！Ｊ−ｔＪｇ 尾９ イユ
讐ど漫 ■ｙ ９μ 目？ｉ べ！！−目ｙ 見と
１〕、Ａ薄 リ、！４ 目ｎ 膣と ［ａ リど Ｗ
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目コ ｆ−！ 、！ＡＢ畠１ＩＨ１ 図面の！；Ｃ（内容に変更なし） 第６図 手続補正書（方式） ％式％ 単純ヘルペスウィルス遺伝子が組込 まれた組換えプラスミド ３、補正をする者 財団法人化学及血清療法研究所内 〒８６０ 電話０９６（３４４）１２１１昭和６０年
１１月２６日（発送日） ＋１、 ６ 補正の対象 明細書の発明の名称及び図面 ７、補正の内容 １）明４１）１書第１頁の発明の名称を１−弔純ヘルペ
スウィルス１）：を包子が組込吐れ／７組換えプラスミ
ド−１に訂正ゴる３、 ２）第２図、第３図、第４図、第５図及び第６図を別紙
のとおり訂正する。
伝子の塩基配列を示し、 第２図は、本発明で用いらｉｌ、 １ ［（ＳＶＩＩＮ
Ａ〕ＢＡａＨＩ−Ｇフラグメント４ｃ含むプラスミドｐ
Ｇの構造を示し、第３図は、本発明で用いらｉｌろジグ
ｉ’ ）ｈ配列コード領域を有ずろＩ（ＳｖｌＫＢ道伝
子を含むプラスミドｐＧＢＸの構造を示し、 第４図、第５図および１６図は、いずわも、プラスミド
ｐＧＢ＞Ｉから本発明）こしｔ：がう各種の組換えプラ
スミド４ｃ構築する工程を示すものである。 特許出願人 財団法人化学及血清療法研究所代 理
人 弁理士 筒 井 知図面のｔ↑書（内
容に変更なＬ） 第２図 第３図 琴 叩 Ｑ リ リ リ 専 青 ！”；ｉＥ’ ＩＵ薄 〆１悼 〆１緊 りど １］
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３．す” 属ａａ ド孕 １番 目ρ Ｆ１外 目ｇ
目コ ｆ−！ 、！ＡＢ畠１ＩＨ１ 図面の！；Ｃ（内容に変更なし） 第６図 手続補正書（方式） ％式％ 単純ヘルペスウィルス遺伝子が組込 まれた組換えプラスミド ３、補正をする者 財団法人化学及血清療法研究所内 〒８６０ 電話０９６（３４４）１２１１昭和６０年
１１月２６日（発送日） ＋１、 ６ 補正の対象 明細書の発明の名称及び図面 ７、補正の内容 １）明４１）１書第１頁の発明の名称を１−弔純ヘルペ
スウィルス１）：を包子が組込吐れ／７組換えプラスミ
ド−１に訂正ゴる３、 ２）第２図、第３図、第４図、第５図及び第６図を別紙
のとおり訂正する。
Claims (4)
- （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み且つプロ
モーター領域を担ったプラスミドベクターに、該プロモ
ーター領域の下流に、シグナル配列をコードする遺伝子
を含む下流の一部が欠失した単純ヘルペスウィルスｇＢ
遺伝子が組込まれていることを特徴とする組換えプラス
ミド。 - （２）組込まれた単純ヘルペスウィルスｇＢ遺伝子が、
Ｎ末端の３０個のアミノ酸をコードする遺伝子を欠失し
ている特許請求の範囲第（１）項に記載の組換えプラス
ミド。 - （３）組込まれた単純ヘルペスウィルスｇＢ遺伝子が、
Ｎ末端の８３個のアミノ酸をコードする遺伝子を欠失し
ている特許請求の範囲第（１）項に記載の組換えプラス
ミド。 - （４）プロモーター領域が抑制性酸性ホスファターゼ形
質発現調節領域である特許請求の範囲第（１）項〜第（
３）項のいずれかに記載の組換えプラスミド。
Priority Applications (7)
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|---|---|---|---|
| JP60192916A JPH0668B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 単純ヘルペスウイルス遺伝子が組込まれた組換えプラスミド |
| US06/896,923 US5059538A (en) | 1985-08-30 | 1986-08-15 | Recombinant plasmid inserted with herpes simplex virus gene |
| CA000516821A CA1295564C (en) | 1985-08-30 | 1986-08-26 | Recombinant plasmid inserted with herpes simplex virus gene |
| KR1019860007220A KR940005582B1 (ko) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | 단순포진비루스 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드의 제조방법 |
| EP86112005A EP0216195B1 (en) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Recombinant plasmid inserted with herpes simplex virus gene |
| DE8686112005T DE3671916D1 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Mit einem herpes-simplex-virus-gen inseriertes rekombinantes plasmid. |
| AT86112005T ATE53606T1 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Mit einem herpes-simplex-virus-gen inseriertes rekombinantes plasmid. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60192916A JPH0668B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 単純ヘルペスウイルス遺伝子が組込まれた組換えプラスミド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH0668B2 JPH0668B2 (ja) | 1994-01-05 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP3005292B2 (ja) * | 1990-08-02 | 2000-01-31 | カイロン コーポレイション | 単純ヘルペスウィルスのｖｐ１６のワクチン |
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| JPS60197629A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
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| EP0170169B1 (en) * | 1984-07-20 | 1991-03-20 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant dna containing a herpes simplex virus gene or a fragment thereof, yeast transformed with said recombinant dna, and method for the production of herpes simplex virus proteins |
-
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- 1986-08-29 KR KR1019860007220A patent/KR940005582B1/ko not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3005292B2 (ja) * | 1990-08-02 | 2000-01-31 | カイロン コーポレイション | 単純ヘルペスウィルスのｖｐ１６のワクチン |
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