JPS6256137B2

JPS6256137B2 -

Info

Publication number: JPS6256137B2
Application number: JP54142153A
Authority: JP
Inventors: Chikao Yoshikumi; Takami Fujii; Masahiko Fujii; Kenichi Matsunaga; Yoshiharu Oguchi; Koichi Niimura
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1979-11-02
Filing date: 1979-11-02
Publication date: 1987-11-24
Also published as: JPS5665829A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規抗腫瘍剤に関し、更に詳しくは、
腫瘍抗原に対する抗体に、抗腫瘍性代謝拮抗剤を
アミド結合させてなる物質を有効成分として含有
する抗腫瘍剤に関する。本発明者は、さきにマイトマイシンＣ、塩酸ド
キソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシ
ン、アクチノマイシンＤおよびザルコマイシンの
ごとき抗生物質系の抗腫瘍剤を腫瘍抗体に結合し
てなる物質を有効成分とする抗腫瘍剤を発明した
（特願昭53−161388参照）。しかし、上記抗生物質系の抗腫瘍剤は主として
微生物により生産される物質であつて構造が複雑
であるため、これを腫瘍抗体と結合させて抗腫瘍
性物質を製造するうえで最適のものとは言えな
い。本発明者は更に研究した結果、シタラビン、メ
ソトキセート、アミノプテリンナトリウム、８−
アザグアニン、５−フルオロウラシルのごとき代
謝拮抗剤系の物質が腫瘍抗体と結合させて抗腫瘍
性物質を製造するに適している事を見いだし本発
明をなすに至つた。本発明は、細胞毒性の高い上掲抗腫瘍性代謝拮
抗物質を極めて穏和な条件下で腫瘍抗原に対する
抗体とアミド結合（−NHCO−）によつて結合さ
せた新規な物質を有効成分とする抗腫瘍剤に係る
ものであつて、抗腫瘍効果にすぐれながら細胞毒
性は、出発物質の１つである上記抗腫瘍性代謝拮
抗剤にくらべて格段に低い抗腫瘍剤を提供するこ
とを目的とする。さらに、本発明は腫瘍抗原に対する抗体自身の
精製手段およびかかる精製抗体をアミノ基又はカ
ルボキシル基を有する上記の抗腫瘍性代謝拮抗物
質及びアミノ基又は、カルボキシル基を導入した
上記の抗腫瘍性代謝拮抗物質にアミド結合（−
NHCO−）によつて結合させることからなる上記
の物質を有効成分とする抗腫瘍剤を製造する方法
を提供することを目的とする。近年、種々の抗腫瘍剤が広く使用されており、
或る程度の効果をあげている。これらの抗腫瘍剤
としてシタラビン、メソトレキセート、アミノブ
テリンナトリウム、８−アザグアニン、５−フル
オロウラシルのごとき代謝拮抗剤も使用されてい
るが、これらの物質はそれ自体何れも高い細胞毒
性を有していて、投与した時に白血球減少、脱
毛、胃腸障害等の副作用を呈することが知られて
おり、その為にこれら薬剤の使用に限度のあるの
が実情である。また、従来からある種の腫瘍抗原に対する抗体
を製造または単離してこれをその腫瘍の治療に用
いる試みがなされているが、望ましい抗腫瘍効果
は得られていない。さらに、最近腫瘍抗体に抗腫
瘍剤を化学的に結合させて得られる新規な物質に
よる抗腫瘍効果を期待することが提案されている
が、上記物質を得るための化学反応の条件が過酷
すぎるために十分な成長は得られていない。ま
た、これらの実験で用いられる抗体は免疫グロブ
リン画分までの精製しか行なわれていないので、
一般の免疫グロブリンを含有していて、真の意味
では腫瘍抗体とは認め難い。そして抗体が一般の
免疫グロブリンである故に上記化合物を投与され
た生体に正常組織の障害や全身痙攣または硬直な
どのアナフイラキシーシヨツクの生ずる事が多
い。本発明は、動物に接種した腫瘍の抗原に対する
抗体を含む抗血清を採取し、この中の免疫グロブ
リン画分を分取し、これを更に特異な手段で精製
することによつて、より純粋な腫瘍抗体を先づ、
単離し、これを抗腫瘍性代謝拮抗剤と結合させる
ことにより、穏和な反応条件下で製造でき、かつ
上記のごときアナフイラキシーシヨツクを生じな
い抗腫瘍剤を提供し得るものである。以下本発明を詳しく説明する。本発明の有効成分である物質は、抗体および抗
腫瘍性代謝拮抗剤の両者に元来存在しているアミ
ノ基又はカルボキシル基を穏和な反応条件下に反
応せしめることにより、この両者をアミド結合さ
せて得られる。この際、必要により上記代謝拮抗
剤にさらにアミノ基又はカルボキシル基を導入し
たものを抗体と反応させることにより両者をアミ
ド結合させる。本物質の製造に用いる抗腫瘍性代謝拮抗剤とし
てはシタラビン、メソトレキセート、アミノプテ
リンナトリウム、８−アザグアニンならびに５−
フルオロウラシルが好ましい。上掲の抗腫瘍性代謝拮抗剤の名称は一般名であ
つて、それの構造は次のとおりである。シタラビン：メソトレキセート：アミノプテリンナトリウム：８−アザグアニン：５−フルオロラウシル：また、本物質の出発物質の１つである抗体とし
ては治療を目的とする腫瘍の抗体が用いられる。腫瘍としてはザルコーマー180、佐藤肺癌、吉
田肉腫、エーリツヒ癌、Ｌ−1210白血病、Ｐ−
388白血病、急性白血病、悪性リンパ腫、癌腫、
肉腫、悪性繊毛上皮腫、急性骨髄性白血病、メラ
ノーマ、急性リンパ性白血病、骨髄癌、などの各
種の腫瘍があげられる。本発明で用いる抗体の製造は日本免疫学会総会
記録第６巻198頁（1976年）記録の方法により又
はDauphin、M.J.らの方法〔J.Immunal.113948
（1974参照）〕に準じて行なう。前者はフロイント
のコンプリートアジユバンド（Complete
Ajuvant）を用い、先ず腫瘍細胞を動物に皮下注
射することによつて、これを免疫し更に続けて腫
瘍細胞を静脈内注射することにより追加免疫して
これから抗体を得る方法であり、後者は腫瘍抗原
を動物の腹腔内に３〜４回反復投与して動物を免
疫して、これから抗体を得る方法である。本発明で用いる抗体は同種抗体、異種抗体のい
ずれでもよいが、同種抗体が好ましい。このようにして得た抗体は、アフイニテイクロ
マトグラフイーにおけるカラムの充填剤に治療の
目的の腫瘍抗原を先づブロムシアンを用いて結合
せしめて置いて、これをカラムに充填し、カラム
に免疫グロブリン画分まで精製した抗体の溶液を
流入させる。かくてカラム中で抗原と抗体とを結
合させた後に、特殊な溶剤をカラムに流入して抗
原・抗体結合を解かして抗体のみを溶出させ、更
にこれを透析して精製抗体水溶液を得る。即ち、
かくて得られた抗体は従来の免疫グロブリン画分
よりも更に純度の高い抗腫瘍免疫グロブリンであ
る。一般に抗体の精製には、硫安塩析とDEAEセル
ロースカラムによるイオン交換クロマトグラフイ
ーを使つて、抗血清から分画を得る方法がしばし
ば用いられる。本発明では、これに加えて、アフ
イニテイクロマトグラフイーを用いて腫瘍細胞に
対する特異的抗体のみを選択的に得る為の特異的
精製操作を行なつた。アフイニテイクロマトグラフイーは、酵素と基
質、抗体と抗原などのような生体物質相互間に働
く特異的親和力を利用し、一方の生体物質を使つ
て他方を選択的に分離するという原理にもとづく
ものである。本発明で用いられるアフイニテイクロマトグラ
フイーには、(1)腫瘍細胞から抽出した抗原をセフ
アロース（Sepharose^R）のごとき担体に（プロ
ムシアンを用いて）共有結合させ、これをカラム
に充填し、抗体溶液を通して、抗体を抗原に結合
させ、更に十分量の溶媒を流して結合しなかつた
抗体を洗い去つた後、PHのより低い緩衡溶液を流
し入れて、抗体・抗原の結合を解いて、分離した
抗体を溶出させる方法、(2)カラムを用いず、抗原
を結合させた担体と抗体溶液を混合して抗体を抗
原に結合させ、担体粒子を洗浄して結合しなかつ
た抗体を除いた後、抗体を溶離させる方法、およ
び(3)上記で抗原を結合させた担体の代りに、腫瘍
細胞自身を用いる方法を含むが本発明の実施例で
は上記(1)と(3)の方法を採用した。従つて、アフイニテイクロマトグラフイによつ
て精製された抗体は従来の免疫グロブリン画分よ
りも遥に純度の高い抗腫瘍免疫グロブリン即ち抗
腫瘍抗体である。このようにして得られた抗体を抗腫瘍性代謝拮
抗剤に結合させるには、アミノ基又はカルボキシ
ル基を有する上記代謝拮抗剤もしくはアミノ基又
はアミノ基を導入した上記代謝拮抗剤とを水溶性
溶媒中に溶解せしめ、これにカルボジイミドを触
媒として加えて０〜50℃、好ましくは10〜40℃で
10分〜８時間、好ましくは30分〜５時間反応させ
て酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液などの添加で反応
を停止させる。次にこの反応液中の過剰な代謝拮抗剤、触媒お
よび上記反応停止液の成分ならびに塩類を除く為
に透析、ゲル過ならびに限外過の何れかの操
作を行なうか、又はこれらの操作を組み合せた操
作を行なう。上記反応で触媒として用いるカルボジイミド
は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−カルボジイミド、１−シクロヘキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド又
はジシクロヘキシルカルボジイミドを含む。抗腫瘍性代謝拮抗剤に必要によりアミノ基又は
カルボキシル基を導入するには、該拮抗剤そのま
まにか又はNa、Ｋ、Agのごとき塩の形体にした
ものに、一般式Ｘ（CH₂）_oCOOH（式中ＸはCl又
はBrを示し、ｎは１乃至３の整数を示す）の化
合物か或いは一般式HCl・NH₂（CH₂）_oCOX（式
中ＸはCl又はBrを示し、ｎは１乃至３の整数を
示す）の化合物を水性溶媒、例えばメタノール、
水、エタノール、ジメチルスルフオキシド、ジオ
キサン中で０〜50℃、好ましくは10〜40℃で10分
乃至72時間反応させるとよい。反応生成物は水、
アルコール、クロロホルム、ジオキサンのごとき
溶媒を用いて再結晶することにより抗腫瘍性代謝
拮抗剤誘導体が得られる。本物質は抗体１分子に対して抗腫瘍性代謝拮抗
剤の１〜10分子が結合したものである。本物質の哺乳動物に対する急性毒性はマウスを
用い300mg／Kgの静脈投与で調べたが１週間の観
察で死亡が認められなかつた。したがつて、本物質は毒性も低い各種の人癌に
対して有効である。例えば、急性白血病、悪性リ
ンパ腫、癌腫、肉腫、悪性繊毛上皮腫、急性骨髄
性白血病、メラノーマ、急性リンパ性白血病、骨
髄癌等に有効である。本物質を抗腫瘍剤として用いる場合の製剤化方
法、および投与の方法としては抗腫瘍剤に関する
公知の方法を適用し得る。投与方法としては経
口、注射または直腸投与があげられ投与形態とし
ては粉末、顆粒、錠剤または注射剤、座薬等のい
ずれであつてもよい。特に注射による投与が好ましい。注射薬の製剤には生理的食塩水、滅菌水、リン
ゲル液等の水溶性溶剤、非水溶性溶剤、等張化
剤、無痛化剤、安定剤、防腐剤、懸濁化剤、緩衡
剤、乳化剤等を任意に用い得る。その一例を示すと、本物質10mgとマンニトール
50mgを蒸溜水に溶解して10mlとして常法で除菌し
た後２ml宛を注射用小瓶に分注し、又はそのまま
凍結乾燥して注射剤とする。そして本剤は使用に
際し、生理的食塩水で稀釈して注射液とする。本物質は製剤化中一般に0.01〜90％好ましくは
0.1〜60％含有することができる。本物質の投与量は主として症状に左右されるが
成人１人１日当り0.1〜９ｇ、好ましくは１〜６
ｇである。なお、本発明によると、抗体の向腫瘍性と抗腫
瘍剤ならびに抗腫瘍剤の抗腫瘍性は失われること
なく上記化合物にそのまま保たれているので、本
物質は投与されると効率よく目的とする腫瘍部位
に到達し、抗腫瘍効果を発揮する。従つて本物質
がその成分として含有する抗腫瘍剤の重量を基準
として考えるならば、同一の抗腫瘍剤そのものの
投与量の1/10〜1/20に相当する重量の抗腫瘍剤を
成分として含有する本物質の投与によつて同程度
の腫瘍増殖抑制が得られ、かつ成分として含有す
る抗腫瘍剤による副作用は、同一の抗腫瘍剤その
ものの投与の場合の1/10〜2/10にすぎないと期待
される。これは本物質の成分それぞれの好ましい
性質の複合効果と云うことができる。以下本発明を実施例によつて更に詳細に説明す
る。実施例１１−１：アフイニテイクロマトグラフイ(3)を利用
した抗体の調製と精製 DBA／２マウスを用いて継代培養した腹
水型Ｐ−388腫瘍細胞を生理的食塩水に懸濁
させ、マイトマイシンＣ（50μｇ／ml）を加
えて30分間37℃で処理したのち遠心分離によ
つて上清を除き、細胞を0.85％の生理食塩水
で３回洗滌した。かくして増殖能を失つたＰ
−388腫瘍細胞にフロイント（Freund）のコ
ンプリートアジユバント（Complete
Ajuvant）（FCAと略す）を混合し、体重2.9
Kgのウサギ足蹠の皮下に１匹当り細胞10⁸個
の割合で注射し、２週間後に同様な方法で注
射してウサギを免疫し、更に２週間後同上の
細胞10⁸個をこのウサギの静脈に注射した。
１週間経過後に頚動脈にカニユーレを挿入し
て全血を採取し、これより抗血清を分離して
下記の精製を行つた。即ち、100mlの抗血清
に硫酸アンモニウムを飽和量の20〜30％添加
して生ずる塩析画分を採取して、これを20ml
の水に再溶解し、この溶液をPH7.0の10ｍＭ
燐酸塩緩衝食塩水溶液（PBSと略す）に対し
て４℃、72時間透析して脱塩した（この間、
24時間毎に透析外液の交換を行つた）。これ
に、食塩水で３回洗浄した正常なDBA／２
マウスの血球を等量混合し、４℃で30分放置
して吸収を行わしめた後、遠心分離して上清
を得た。この吸収操作を更に４回行つて、全
部で５回の吸収操作を加えた。かくて得られ
た抗体を精製前抗体と云う（通常ＩｇＧ）。
次いで下記の方法で更に精製を行つた。即ち
上記吸収の済んだ上清に、Ｐ−388細胞を等
量混合し、４℃に30分放置してＰ−388細胞
に対する抗体をＰ−388腫瘍細胞に結合させ
た後、遠心分離して上清を除き、沈澱にPH
3.0のグリシン−塩酸緩衝液を加えて、抗体
を遊離せしめ、この混合物を遠心分離して、
抗体を含む上清を採取した。上清のPHを
0.1M苛性ソーダ水溶液で中性近くに調整し
た後、PBSに対して４℃で24時間透析を行つ
た（８時間毎に透析外液を交換した）。かく
て行われたものがウサギの抗Ｐ−388白血病
腫瘍免疫抗体の水溶液である。１−２：腫瘍細胞および正常細胞に対する障害性
試験（その１）上記で得たウサギの抗Ｐ−388腫瘍免疫抗
体について補体（モルモツトの血清）存在下
の細胞障害試験を行つた。即ち、上記抗体水
溶液又はこれを10、100および1000倍に稀釈
したものと、Ｐ−388腫瘍細胞浮遊液或いは
正常DBA／２マウス脾細胞浮遊液（何れも
イーグル（Eagle）のMinimum Essential
Medium（以下MEMと略す）を溶媒として
用い、細胞濃度は５×10⁶個／とした）とを
100μ宛混合し、室温で15分放置して抗体
をそれぞれの細胞に結合せしめた。その後モ
ルモツトの血清をイーグルのMEMで２倍に
稀釈し（これを補体と云う）この100μ
を、上記の混合液に加え、37℃で30分培養
し、遠心分離して、沈澱をイーグルのMEM
で１回洗滌し、これにトリバンブルー液を加
えて、顕微鏡下で上記それぞれの細胞の死滅
の程度を観察した。その結果は下記の第１表に示すごとく、細
胞の死滅程度（細胞障害活性）を＋、＋＋、＋
＋＋の３段階に分けて表示する（死滅なしは
−で示す）と抗血清を上記の方法で精製した
後に抗体を取り出したものは、抗血清を精製
することなく抗体を取り出したものにくらべ
てＰ−388白血病細胞に対する毒性はあまり
大きく異らないが、正常のDBA／２マウス
脾細胞に対する毒性は極めて低く、これを殺
すことはなかつた。即ち抗血清の精製は目的
にかなつていることがよく示される。

【表】なお、ここで正常細胞の代表として用いた
DBA／２マウスの脾細胞は、脾を摘出した
後、ピンセツトを用いてイーグルのMEM中
でこれを細く砕き、200meshのステンレス網
を通過させ、１回MEMで洗滌し、トリス−
（ヒドロキシルメチル）アミノメタン緩衝
0.75％塩化アンモニウム水溶液（PH7.4）３
mlを加えて試料中の赤血球を破壊し更にイー
グルのMEMで３回洗つて得たものである。１−３：アフイニテイクロマトグラフイーによる
抗体の精製腫瘍抗原を結合させたカラムを使用するア
フイニテイクロマトグラフイーを用いて下記
に示すごとき精製を行つた。先ず抗原自身を
下記により精製した。即ちDBA／２マウス
を用いて継代培養したＰ−388腫瘍細胞を凍
結乾燥し、このもの30ｇに５ｍＭ燐酸カリウ
ム緩衝液で緩衝した3MKCl溶液（PH7.4）を
加えて、抗原の抽出を20時間行い、抽出液を
65000Gで10分間遠心分離して上清を採取
し、更にこの上清を180000Gで30分間遠心分
離して上清を採取し、蒸溜水に対して４℃で
70時間透析した（この間24時間毎に外液を交
換）。透析後更に65000Gで透析液を遠心分離
して沈澱を除き、上清に硫酸アンモニウムを
加えて2Mの濃度にしてから、65000Gで10分
間遠心分離して沈澱を採取した。この沈澱を
蒸溜水に溶解し、この溶液を蒸溜水に対して
72時間透析した（この間、24時間毎に外液を
交換した）。かくして得たＰ−388腫瘍抗原を用いて、
アフイニテイクロマトグラフイー用カラムを
下記のごとく作製した。先ず、アガロースゲル（Sepharose 4B；
Pharmacia Japan Co Ltdの製品）を水で膨
潤させて20mlとし、これに、１ｇ／mlのブロ
ムシアン水溶液20mlを加えて、PHを11.0に保
ちつつ両者を８分間反応させてから反応物を
ガラス斗で過し、沈澱を斗上で氷冷し
た蒸留水、次に氷冷した0.5M炭酸水素ナト
リウム水溶液で洗滌した後、直ちに0.1M炭
酸水素ナトリウム水溶液に懸濁させ、これに
上述した精製抗原水溶液を添加し、室温で１
夜撹拌しながら反応せしめた。生成物をガラ
ス斗で過し、先づ0.1M炭酸水素ナトリ
ウム水溶液、次いで蒸溜水、最後に燐酸塩緩
衝食塩水溶液（0.85％、PH7.0）で洗滌し
た。この洗滌した反応生成物を内径13mm高さ
15cmのガラス管に充填してアフイニテイクロ
マトグラフイー用カラムとした。このカラム
に前記１−１の操作（ただしＰ−388腫瘍細
胞との結合による操作は省略）で作成した抗
体溶液（ＩｇＧ）３mlを流入し、次いで５ｍ
Ｍ燐酸塩緩衝食塩水溶液（0.85％、Hz7.0）
を、カラムの溶出液に蛋白が検出されなくな
るまで流し、次いで、50ｍＭグリシン一塩酸
緩衝水溶液（PH4.0）を添加した0.5M食塩水
溶液をカラムに流して、溶出する画分を採取
し、これを直ちに炭酸水素ナトリウムで中性
にし、燐酸塩緩衝食塩水溶液（0.85％、PH
7.0）に対して72時間透析した（24時間毎に
透析外液を交換した）。かくしてカラムによ
るアフイニテイクロマトグラフイーを用いて
精製したＰ−388腫瘍に対する精製抗体水溶
液を得た。１−４：腫瘍細胞および正常細胞に対する障害性
試験（その２）上記１−３で得たウサギの抗Ｐ−388腫瘍
免疫抗体について１−２と同様な方法で細胞
障害性試験を行つた。結果は下記第２表に示
す。

【表】この結果は、アフイニテイクロマトグラフ
イーによる抗体の精製によつて抗体のＰ−
388細胞への活性が格段に高まり、脾細胞に
対する毒性が低下したことを示すもので、ア
フイニテイクロマトグラフイーによる精製の
優秀さを示している。１−５：抗Ｐ−388抗体と抗腫瘍性代謝拮抗剤と
の結合前記１−１および１−３で調製し、各々の
方法で精製したウサギ抗Ｐ−388抗体とシタ
ラビン、メソトレキセートならびに５−フル
オロウラシルの各々とを反応せしめてアミド
結合によるそれぞれの化合物を合成した。以
下その合成例を述べる。合成例（その１）抗体とシタラビンとの結合反応１−１で得た精製ウサギ抗Ｐ−388抗体を１ml
の水中に10.0mg含有する水溶液に20.0mgのシタラ
ビンを加えたのち、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を30
mg加え下記の時間反応させたものに酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液（PH4.70）２mlの添加で反応を停
止させた。次いで反応液を４℃で72時間、５の
蒸溜水に対して透析（この回、外液を３回交換し
た）した。透析内液を濃縮した後に、デキストリ
ン誘導体（Sephadex Ｇ−25フアルマシア・ジヤ
パン社製）を充填した直径1.5cm高さ55cmのカラ
ムを通して反応液中の低分子量物質を完全にカラ
ムに吸着し去り溶出液を−20℃で凍結乾燥して目
的物質を得た。抗体に対する各反応時間における
シタラビンの結合量をBio Assayより推定した結
果を第３表に示す。

【表】合成例（その２）抗体とメソトレキセートとの結合反応１−１で調製し各々の方法で精製したウサギ抗
Ｐ−388抗体を１mlの水溶液中に10mg含有する溶
液中に6.0mgのメソトレキセートを加えて、撹拌
下に塩酸で液のPHを4.75に調節しつつ2.5mgの１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド塩酸塩を加えて下記の時間反応さ
せたものに酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（PH
4.7）２mlの添加で反応を停止させた次いで反応
液を４℃で72時間５の蒸溜水に対して透析（こ
の間、外液を３回交換した）した。透析内液を濃
縮した後にデキストリン誘導体（Sephadex Ｇ−
25 フアルマシア・ジヤパン社製）を充填した直
径1.5cm高さ55cmのカラムを通して反応液中の低
分子量物質を完全にカラムに吸着し去り溶出液を
−20℃で凍結乾燥して目的物質を得た。抗体に対
する各反応時間におけるメソトレキセートの結合
量を下記第４表に示す。

【表】合成例（その３）５−フルオロウラシルと抗体との結合反応１−１により調製し、各々の方法で精製したウ
サギ抗Ｐ−388抗体を１mlの水溶液中に10mgを含
有する溶液10ml中に34.7mgの５−フルオロウラシ
ル誘導体を加えて撹拌下に塩酸で液のPHを4.75に
調節しつつ１−エチル−３−３−ジメチルアミノ
プロピル−カルボジイミド塩酸塩25.2mgを加えて
40分反応を行なつた。次に酢酸−酢酸ナトリウム
緩衝液（PH4.75）20mlの添加で反応を停止させ
た。次いで、反応液を４℃で72時間５のPBSに
対して透析（この間、外液を３回交換した）し
た。透析内液を濃縮した後に、デキストリン誘導
体（Sephadex Ｇ−200フアルマシア・ジヤパン
社製）を充填した直径３cm高さ65cmのカラムを通
して反応液中の高分子量物質及び低分子量物質を
完全に分離した。溶出液を超遠心分離機にて
40000ｇ×60分遠心分離した上清を−20℃で凍結
乾燥した。このようにして得られた物質では抗体１mgに対
して５−フルオロウラシルはほとんど結合してい
なかつた。そこで５−フルオロウラシルはモノクロル酢酸
を反応させてカルボキシル基を導入してその結合
性を高めた。以下その例をのべる。 10mlのメタノールに500mgの５−フルオロウラ
ジルと86mgの水酸化カリウムを加え、これにさら
に３mlの蒸溜水を加えた。得られる透明液にただ
ちに、145mgのモノクロル酢酸を加えて60分室温
で撹拌した。反応終了後、減圧濃縮を行ない残渣
をエチルアコールとクロロホルルムから再結晶す
ると495mg（収率49％）の白色結晶を得た。この
ものは、赤外吸収スペクトル及び元素分析より下
記構造を有する結合体であることを確認した。

【式】融点160〜165℃で分解元素分析結果Ｃ％Ｈ％Ｎ％計算値 27.43％ 1.91％ 10.66％実験値 27.40％ 2.00％ 10.30％次に、上述のごとくして得られた５−フルオロ
ウラシル誘導体を本合成例でさきに述べた方法と
まつたく同じ手順で１−１で得た精製ウサギ抗Ｐ
−388細胞腫瘍抗体と反応させて目的物質を得
た。この物質は抗体１mgに対して５−フルオロウラ
シル誘導体を10μｇ含有していた。合成例（その４）１−３で得た精製ウサギ抗Ｐ−388抗体を用
い、前述したと同様な手順で該抗体をシタラビ
ン、８−アザグアニン、メソトレキセート、アミ
ノプテリンナトリウムならびに５−フルオロウラ
シル誘導体（合成例その３参照）とそれぞれ反応
させた。得られる各化合物は上記合成例（その
１）−（その３）により得られたものと殆んど同様
な結合体であつた。実施例２２−１：腫瘍細胞に対する抗体の調製と精製 DBA／２マウスを用いて継代培養し、マ
イトマイシンＣにて増殖能をなくした腹水型
Ｐ−388細胞10⁷個を１週間毎に４回一匹の
DBA／２腹腔内に接種し、４回目の接種後
７日目にこのマウスを麻酔して開腹し腹部大
静脈から採血し、この血液から抗体を含む抗
血清を調製した。かくて100匹のマウスから
53mlの抗血清を得た。抗血清から抗体の採取
および抗体の精製は１−１に準じて行なつ
た。２−２：アフイニテイクロマトグラフイーによる
抗体の精製 DBA／２を用いて継代培養した腹水型Ｐ
−388腫瘍細胞を凍結乾燥し、このもの30ｇ
に５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液で緩衝した
3MKCl溶液（PH7.4）を加えて抗原の抽出を
20時間行なつた。この抽出液を65000Gで10
分間遠心分離して上清を採取し、更にこの上
清を180000Gで30分遠心分離して上清を採取
してこれを蒸溜水に対し４℃で72時間透析し
た。（この間、24時間毎に透析外液を交換し
た。）かくして得られたＰ−388腫瘍抗原によ
るアフイニテイークロマトグラフイーは次の
ごとく行なつた。先ず、アガロースゲル（Sepharose 4B；
Pharmacia Japan Co Ltdの製品）を水で膨
潤させて20mlとし、これに１ｇ／mlのブロム
シアン水溶液20mlを加えて、PHを11.0に保ち
つつ両者を８分間反応させてから、反応物を
ガラス斗で過し沈澱を斗上で氷冷した
蒸溜水次に氷冷した0.5M炭酸水素ナトリウ
ム水溶液で洗滌した後直ちに0.1M炭酸水素
ナトリウムに懸濁させ、これに上述した精製
抗原水溶液を添加し、室温で１夜撹拌しなが
ら反応せしめた。生成物をガラス斗で過
し、先ず0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液、
次いで蒸溜水、最後に燐酸塩緩衝食塩水
（0.85％PH7.0）で洗滌した。この洗滌した反
応生成物を内径13mm高さ15cmのガラス管に充
填してアフイニテイクロマトグラフイー用カ
ラムとした。前記２−１の操作で作つた抗血
清（抗体を含む）溶液３mlを上記のアフイニ
テイクロマトグラフイー用カラムに流入し、
次いで５ｍＭ燐酸塩緩衝食塩水溶液（0.85％
PH7.0）を、カラムの溶出液に蛋白が検出さ
れなくなるまで流した。次に50ｍＭグリシン
−塩酸緩衝水溶液（PH4.0）を添加した0.5M
食塩水溶液をカラムに流して溶出する画分を
採取した。これを直ちに炭酸水素ナトリウム
で中性にして燐酸塩緩衝食塩水溶液（0.85％
PH7.0）に対して72時間透析した。（24時間毎
に透析外液を交換した。）かくしてアフイニ
テイクロマトグラフイーを用いて精製した抗
Ｐ−388腫瘍細胞に対する抗体水溶液を得
た。２−３：腫瘍細胞および正常細胞に対する障害性
試験上記２−２で得たマウスの抗Ｐ−388腫瘍
免疫抗体について実施例１と同様な方法で細
胞障害性試験を行なつた。結果は下記第５表
に示す。

【表】第５表から分るごとく前述と同様アフイニ
テイクロマトグラフイーによつてＰ−388細
胞に対する活性は格段に増大している。２−４：マウス抗Ｐ−388抗体と抗腫瘍性代謝拮
抗剤との結合２−１および２−２で得たマウス抗Ｐ−
388抗体とシタラビン、メソトレキセート、
アミノプテリンナトリウム、８−アザグアニ
ンならびに５−フルオロウラシルの各々を前
記１−５で述べた方法とまつたく同様の方法
で結合せしめて、両者をアミド基で結合した
物質を得た。これらの物質は何れも前記１−５で得た対
応物質と殆ど同一の物理的、化学的性質を示
した。実施例３マウス白血病Ｐ−388に対する抗腫瘍効果
DBA／２マウスを用いて継代培養した腹水型Ｐ
−388細胞を10匹からなる群の各DBA／２マウス
の腹腔内に１×10⁶個／匹移植し、移植の24時間
後から各種抗体、各種市販抗腫瘍剤それぞれ単独
およびウサギ抗Ｐ−388抗体と各種市販抗腫瘍剤
との化合物およびマウス抗Ｐ−388抗体と各種市
販抗腫瘍剤との化合物のそれぞれの水溶液を１日
１回５日間連続、合計で５回各マウスの腹腔内に
注射し、試料投与群の平均生存日数（Ｔ）および
対照群の平均生存日数(C)を求め、延命率（Ｔ／Ｃ
×100）を算出した。結果を第６表乃至第10表に示す。

【表】

【表】を表わす。

【表】た抗体を表わす。
上記第６〜10表で判るごとく、本物質のＰ−
388細胞に対するマウスの延命率は、有姿では、
市販の抗腫瘍剤の５〜10倍の投与量で、ほぼ市販
抗腫瘍剤の抑制率と等しい。このことは第10表か
らも判るごとく、この程度の投与量では抗体自身
の腫瘍抑制力がほとんど現れないことを示すもの
であつて、当然のことである。本物質の特徴は、
本物質の成分である市販抗腫瘍剤の投与量と、本
物質投与による市販抗腫瘍剤成分の投与量を比較
すると判然とするのであつて、後者は前者の1/10
〜1/20に過ぎないのに、殆んど前者と同程度の腫
瘍増殖抑制率を示している。この事は本物質の成
分の１つである抗体が、他の成分である小量市販
抗腫瘍剤を如何に良く腫瘍部位に到達せしめてい
るかを示すものに外ならず、本発明の着想をみご
とに具体化している。本物質はこの作用によつて、元来副作用の極度
に高い市販抗腫瘍剤の使用を従来の1/10〜1/20に
低下しながら、かつ従来と同程度の腫瘍増殖抑制
力を発揮するのである。尚特記すべきは、腫瘍増殖抑制率の点では抗体
の由来は関係ないが、ウサギを用いて調製、精製
した抗体と市販抗腫瘍剤との結合した物質をマウ
スに投与した場合に、10匹のマウスの内３匹程度
に全身痙攣および硬直などのアナフラキシ−シヨ
ツクを呈した。これに対し、ウサギを用いて調製
し、本発明によりアフイニテイクロマトグラフイ
ーで精製した抗体を用いて合成した本物質を投与
した場合には、このようなアナフラキシ−シヨツ
クの発生は大いに軽減された。マウスを用いて作成・精製した抗体を用いて合
成した物質の場合には、アナフラキシ−シヨツク
の発生は極めて稀であつたが、更にこの抗体の精
製をアフイニテイクロマトグラフイーによつて行
つた場合の本物質ではアナフラキシ−シヨツクの
発生は全く見られなかつた。実施例４４−１：腫瘍細胞に対する抗体の調製と精製直腸癌患者（50才男性）から血液50mlを採
血し、この血液から抗体を含む抗血清22mlを
得た。４−２：アフイニテイクロマトグラフイーによる
抗体の精製手術時に摘出した患者腫瘍細胞を凍結乾燥
し、これに50mlの５ｍＭリン酸カリウム緩衝
液で緩衝した3MKCl溶液（PH7.4）を加え
て、抗原の抽出を20時間行なつた。この抽出
液を、65000Gで10分間遠心分離して、上清
を採取してこれを蒸留水に対し４℃で72時間
透析した。（この間24時間毎に透析外液を交
換した。）かくして得られた患者腫瘍抗原に
よるアフイニテイークロマトグラフイーは次
のごとく行なつた。先ずアガロースゲル（Sepharose 4B；
Pharmacia Japan Co Ltdの製品）を水で膨
潤させて20mlとし、これに１ｇ／mlのブロム
シアン水溶液20mlを加えてPHを11.0に保ちつ
つ両者を８分間反応させてから、反応生成物
をガラス斗で過し、沈澱を斗上で氷冷
した蒸留水で洗滌し、次に水冷した0.5炭酸
水素ナトリウム水溶液で洗滌した後、直ちに
0.1M炭酸水素ナトリウムに懸濁させ、これ
に上述した精製抗原水溶液を添加し、室温で
１夜撹拌しながら反応せしめた。得られた反応生成物をガラス斗で過
し、これに先ず0.1M炭酸水素ナトリウム水
溶液を、次いで蒸留水を最後に燐酸塩緩衝食
塩水（0.85％PH7.0）でそれぞれ洗滌した。
この洗滌した反応生成物を内径13mm高さ15cm
のガラス管に充填してアフイニテイクロマト
グラフイー用カラムとした。前記２−１の操
作で調製した抗血清（抗体を含む）溶液３ml
を上記のアフイニテイクロマトグラフイ用カ
ラムに流入し、次いで５ｍＭ燐酸塩緩衝食塩
水溶液（0.85％PH7.0）を、カラムの溶出液
に蛋白が検出されなくなるまで流した。次に
50ｍＭグリシン−塩酸緩衝水溶液（PH4.0）
を添加した0.5M食塩水溶液をカラムに流し
て溶出する画分を採取した。これを直ちに炭
酸水素ナトリウムで中性にして燐酸塩緩衝食
塩水溶液（0.85％PH7.0）対して72時間透析
した。（24時間毎に透析外液を交換した。）か
くしてアフイニテイクロマトグラフイーを用
いて精製した患者腫瘍に対する抗体水溶液を
得た。このようにして得た抗体は、水に可溶であ
るが、しかし、メタノール、エタノール、ア
セトン、ベンゼン等の有機溶媒には不溶であ
つた。さらにこの抗体は添附図面の第１図に
示すような赤外線吸収と第２図に示す紫外線
吸収を示し、分子量は、約15万で、disc電気
泳動ではRf0〜0.1の間に存在する物質であつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４に記載の手順で調製、精製し
た抗体についての赤外線吸収スペクトルを示し、
第２図は同じく紫外線吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１腫瘍抗原を結合させたアフイニテイクロマト
グラフイーにより精製して得られる、腫瘍抗原に
対する同種抗体と、少なくとも１個のアミノ基又
はカルボキシル基を有する抗腫瘍性代謝拮抗剤が
アミド結合してなる物質を有効成分とする抗腫瘍
剤。２抗体は、ザルコーマ180、佐藤肺癌、Ｌ−
1210白血病、Ｐ−388白血病、エーリツヒ癌、吉
田肉腫、急性リンパ性白血病、骨髄癌又はその他
の人癌から選択される腫瘍の抗原から誘起された
免疫グロブリン画分を腫瘍抗原を結合させたアフ
イニテイクロマトグラフイーにより精製したもの
である特許請求の範囲第１項記載の抗腫瘍剤。３抗腫瘍性代謝拮抗剤はシタラビン、８−アザ
グアニン、５−フルオロウラシル、メソトレキセ
ートおよびアミノプテリンナトリウムからなる群
から選択される特許請求の範囲第１項記載の抗腫
瘍剤。４抗腫瘍性代謝拮抗剤のアミノ基又はカルボキ
シル基は導入されたものである特許請求の範囲第
１項又は第３項記載の抗腫瘍剤。５前記アミノ基又はカルボキシル基の導入は、
一般式Ｘ（CH₂）_oCOOH（式中ＸはCl又はBrを示
し、ｎは１、２又は３の整数を示す）を有する化
合物を介して行われる特許請求の範囲第４項記載
の抗腫瘍剤。６前記物質は、同種抗体１分子当り抗腫瘍性代
謝拮抗剤が１乃至10分子結合したものである特許
請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の
抗腫瘍剤。７注射剤形態にある特許請求の範囲第１項乃至
第６項記載のいずれかに記載の抗腫瘍剤。