JPS6257197B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、蛋白分解酵素、特に酵素部類E.
C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、トロンビン及びプラズミンを定量分析するた
めの基質として有用な新規のトリペプチド誘導体
に関する。 所謂器官カリクレイン又は腺カリクレインは、
種々の器官及び腺、例えば分泌腺、唾液腺、腎
臓、消化管粘膜等によつて得られ、前酵素の形又
は活性形で分泌される。これらの器官又は腺カリ
クレインは、化学的及び生理学的に血漿カリクレ
インとは異なるものである。一定の病理学的条件
下で器官カリクレイン分泌物濃度は、正常値より
も低下するか又は正常値よりも上昇する。すなわ
ち、例えば尿のカリクレイン分泌は、腎臓疾病の
患者の正常値よりも実質的に減少する。腎臓硬化
症の患者においてカリクレイン分泌は、殆んど完
全に抑圧されている。特発性高血圧症の患者にお
いて、24時間−尿のカリクレイン分泌は、正常値
の50％平均として有効に減少されている（例え
ば、H.S.Margolius著、“Chemistry and Biology
of the Kallikrein−Kinin Sytem in Health and
Disease”、1974年、第399〜409頁、参照）。それ
故、簡単な処理方法で器官カリクレインを迅速に
定量分析することは重要である。例えば、一定の
アルギニンエステル、例えばトジル−アルギニン
メチルエステル（TAME）をエステル分解する
ことによつて尿カリクレインを分析することは、
公知である。改善されたエステル分解法では、三
重水素で標識されたトジル−アルギニンメチルエ
ステルを使用し、エステル分解によつて放出され
るメタノールの放射能を測定する。しかし、これ
らのエステル分解法は、該方法がカリクレインが
エステル分解によらずアミド分解により天然のペ
プチド鎖を分解する蛋白分解酵素である程度に非
生理学的であるという欠点を有する。更に、エス
テル基質は、該基質が多数の他の酵素によつて分
解されている、すなわちカリクレインによつて不
明確に分解されているという欠点を有する。三重
水素で標識されたTAMEを用いる方法は、三重
水素で標識されたメタノールの放射能測定よりも
前に、エステル分解混合物中になお存在する三重
水素で標識された残留TAMEが測定を邪魔する
のでメタノールをエステル分解混合物から水と不
混和性の液体で抽出しなければならない程度に複
雑である。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2527932号明細書には、式：R¹−Pro−Ｘ−
Arg−NH−R²（但し、R¹は保護基を表わし、−
NH−R²は発色団を表わし、Ｘはフエニルアラニ
ル基、β−シクロヘキシルアラニル基、フエニル
グリシル基又はチロシル基を表わす）で示される
基質が記載されている。該基質は、血漿カリクレ
インによつて極めて簡単に分解され、有色の分解
生成物R²−NH₂を生じ、この場合この分解生成物
の量は、測光法、分光測光法又は蛍光測光法によ
つて測定することができる。また、器官又は腺カ
リクレインを分析するために該基質を使用するこ
とも試みられた。しかし、意外なことに、該基質
は、器官又は腺カリクレインに対して敏感でな
い、すなわち器官又は腺カリクレインによつて分
解されないか又は少量が分解されるにすぎないこ
とが判明した。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2629067号明細書には、特定の蛋白分解酵
素、例えば腺又は器官カリクレイン及びプラズミ
ンを分析するための基質として有用なトリペプチ
ド誘導体が記載されている。すなわち、Ｈ−Ｄ−
バリル−ロイシル−アルギニル−ｐ−ニトロアニ
リドジヒドロクロリド及びＨ−Ｄ−バリル−ロイ
シル−リジル−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロ
リドが２つの例として挙げられている。第１のト
リペプチド誘導体は、腺カリクレインのための基
質であり、第２のトリペプチド誘導体は、プラズ
ミンのための基質である。これら２つの化合物
は、該酵素によつて分解され、ｐ−ニトロアニリ
ンを生じ、この場合このｐ−ニトロアニリンの量
は、測光法又は分光測光法により測定することが
できる。しかしながら、Ｈ−Ｄ−バリル−ロイシ
ル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリドジヒドロク
ロリドの感受率は、濃縮されてない尿中の尿カリ
クレインを正確に分析するのに必要な限界値に到
達する。しかし、該アミド基質を濃縮された尿中
で使用する場合には、ｐ−ニトロアニリンの測光
法による測定は、尿の独自の色によつて強固に阻
止される。 前記の西ドイツ国特許明細書に記載された２つ
のトリペプチド誘導体のトリペプチド鎖中の第１
の２つのアミノ酸は、α−又はβ位に阻水性イソ
プロピル基を有する。この阻水性を増大させ、そ
の後に腺カリクレインに対する感受性を増大させ
るために、ジペプチド鎖の基本構造を維持しなが
ら、イソプロピル基を芳香族基、例えばフエニル
基に代えることが試みられた。しかし、この試み
は失敗した。芳香族基を装入することによつて得
られるトリペプチド基質は、腺カリクレインによ
つて全く分解されないか又は多くの場合極めて少
量が分解されるにすぎない。しかし、芳香族基を
有するこれらのトリペプチド基質は、プラズミン
に対して驚異的に高い感受性を有する。更に、意
外なことに、該トリペプチドプラズミン基質にお
ける芳香族基の水素添加は、器官又は腺カリクレ
インに対して驚異的に高い感受性を有する新規部
類のトリペプチド基質を生じることが見い出され
た。トリペプチド鎖を増加させるには、蛋白分解
酵素によつて分解される基質を得るために天然に
生じるアミノ酸だけを使用することができること
が判明していた。それ故、シクロヘキシル基を含
有しかつ天然に生じないアミノ酸を使用すること
により、器官又は腺カリクレイン及びその他の蛋
白分解酵素、例えば血漿カリクレインによつて簡
単に分解される発色団基質を得ることができるこ
とが見い出されたことは意外なことであつた。 本発明は、特定の蛋白分解酵素、特に酵素部類
E.C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレ
イン、プラズミン及びトロンビンに対して高い感
受性を有し、したがつて該酵素を定量分析するた
めの基質として有用な新規の発色団基質に関す
る。該基質は、一般式： Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−Arg−Ｒ 〔式中、 Ｘはアラニル基、α−ブチリルアミノ基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わし、 Ｙはシクロヘキシルアラニル基を表わし、 Ｒはｐ−ニトロフエニルアミノ基、２−ナフチ
ルアミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ
基、４−メチル−クマリル−７−アミノ又は１，
３−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−５−
アミノ基を表わす〕で示されるトリペプチド透導
体である。 式のトリペプチド誘導体は、水性媒体に対し
て難溶性であり、したがつてその酸との塩の形
で、殊に鉱酸、例えばHCl，HBr，H₂SO₄，
H₃PO₄等、又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロ
ピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、トリ
クロル−又はトリフルオル酢酸のようなハロゲン
化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、ク
エン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族酸、
例えばトルイル酸、クロル−又はブロム安息香
酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、フタ
ル酸等との塩の形で有利に使用される。該酸の性
質は、該酸が基質と酵素との間の反応に関与しな
いので重要ではない。 式の基質及びその酸との塩は、特定の蛋白分
解酵素、特に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素
（“Enzyme Nomenclature”，Elsevier
Scientific Publishing Company（Amsterdam）
社刊、1973年、第238頁以降、参照）、例えば器官
カリクレイン及び腺カリクレイン、プラズミン及
びトロンビンの作用によつて加水分解により分解
され、その結果式：Ｒ−NH₂の有色性又は蛍光性
分解生成物が形成され、この場合この分解生成物
の量は、測光法、分光測光法、蛍光分光測光法又
は電気化学的方法によつて測定することができ
る。従つて、この新規の基質は、蛋白分解酵素、
殊にアルギニンないしはリジンのカルボキシル側
鎖上の天然のペプチド鎖を分解する酵素部類E.
C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、プラズミン、血漿カリクレイン、トロンビン
ないしはそれらの抑制因子及び前酵素、ならびに
該酵素の形成又は抑御に関与するその他の因子を
定量分析するのに有用である。 トリペプチド誘導体の優れた群は、 Ｙがシクロヘキシルアラニル基を表わし、 Ｘがアラニル基、α−アミノブチリル基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わす式の化合物から
なる。 次の実施例３，５，７，９，12，13，36，37，
38，40及び41に記載のトリペプチド誘導体は、殊
に尿カリクレインを分析するための基質として有
用である。 ヒトの喀痰中のカリクレインを分析するには、
次の実施例３，５，７，９，12，13，36，37，
38，40及び41に記載のトリペプチド誘導体を使用
することができる。 次の実施例36，37、及び41に記載のトリペプチ
ド誘導体は、プラズミンを分析するのに使用する
ことができる１群の基質を構成する。 本発明は、蛋白分解酵素、殊にアルギニンない
しはリジンのカルボキシル側鎖上の天然のペプチ
ド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例
えば器官又は腺カリクレイン、プラズミン及びト
ロンビンを定量分析する方法にも関する。本発明
による方法は、前記酵素を含有するか又は該酵素
を形成又は消費する物質を、式のトリペプチド
誘導体と反応させ、このトリペプチド誘導体にお
ける酵素の加水分解作用によつて形成される有色
又は蛍光分解生成物Ｒ−NH₂の量を、測光法、分
光測光法、蛍光分光測光法又は電気化学的方法に
よつて測定することよりなる。本発明方法は、例
えば酵素標本の酵素含量又はヒトの体液及び哺乳
動物の体液、例えば尿、膵液、腸粘液、乳腺分泌
物、汗腺分泌物、喀痰及び血液中の酵素濃度を分
析することができる。本発明方法は、殊に前記体
液中の器官又は腺カリクレイン及び血漿カリクレ
インを定量分析するのに有用である。この方法に
よれば、遊離器官カリクレイン及び粘膜カリクレ
インないしはプレカリクレインから形成されたカ
リクレイン、さらにカリクレインの生理学的又は
非生理学的抑制因子及びプレカリクレインの生理
学的又は非生理学的賦活体を分析することができ
る。 式のトリペプチド誘導体は、以下に記載した
方法により製造することができる： (1) 発色団Ｒを、Ｃ−末端アルギニンのカルボキ
シル基に結合させ、その際にα−アミノ基を保
護基、例えばカルボベンゾキシ基又はｔ−ブト
キシカルボニル基によつて保護し、δ−グアニ
ジル基を、例えばHClを用いるプロトン化、ニ
トロ化又はトジル化によつて保護する。また、
Ｃ−末端Ｒ−NH基は、ペプチド鎖を段階的に
合成する間保護基として役立つ。その他の保護
基は、必要な場合には所望のペプチド鎖が完全
に合成されるまで他のアミノ酸誘導体を結合さ
せるために選択的に除去することができる。最
後に、残留する保護基を、Ｒ−NH−基を作用
させることなしに完全に分解する（例えば、
Miklos Bodansky他“Peptide Synthesis”、
Interscience Publishers社刊、1966年、第163
〜165頁）。 (2) 第１にペプチド鎖を（Bodansky他による方
法、上記引用文中、により）合成するが、その
際にアルギニンのＣ−末端カルボキシル基を常
用のエステル基、例えばメトキシ基、エトキシ
基又はベンジルオキシ基（アルギニンの場
合）、又はｔ−ブトキシ基（リジンの場合）に
よつて保護する。該エステル基は、トリフルオ
ル酢酸により選択的に分解しなければならない
ｔ−ブトキシ基を除いて、アルカリ加水分解に
よつて除去することができる。アルギニンのδ
−グアニジル基をプロトン化する場合には、該
エステル基をトリプシンを用いて酵素により除
去し、この場合ラセミ化は起こらない。次に、
発色団Ｒ−NH−を結合させる。アルギニンの
δ−グアニジノ基をニトロ基又はトシル基によ
つて保護し、トリペプチド誘導体のＮ−末端α
−アミノ基をカルボベンゾキシ基又はｐ−メチ
ル−、ｐ−メトキシ−又はｐ−クロルベンジル
オキシカルボニル基又はｔ−ブトキシ基によつ
て保護する場合には、全ての保護基を同時に除
去する。この除去は、保護されているトリペプ
チド誘導体を無水HFで室温で処理することに
よつて実施することができ、したがつてこの場
合にはアミノ基及びδ−グアニジノ基の全ての
前記保護基が除去される。また、この除去は、
保護されているトリペプチド誘導体が保護ニト
ロ基又はトシル基を含有しない場合、氷酢酸中
の2N HBrで室温で処理することによつて実施
することもできる。 本発明によるトリペプチド誘導体の製造は、次
の実施例に詳記されている。 実施例によつて得られた溶出液及び生成物の分
析は、シリカゲルで被覆されたガラス板（Merck
社、F254）を用いて薄層クロマトグラフイーに
よつて行なわれた。薄層クロマトグラムは、次の
溶剤系によつて展開した： ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：１：１） 次の略語を使用する： AcOH＝酢酸 AIa＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル But＝α−アミノ酪酸 Cbo＝カルボベンゾキシ CHA＝シクロヘキシルアラニン DMF＝ジメチルホルムアミド DPA＝１，３−ジ（メトキシカルボニル）−フ
エニル−(5)−アミド TLC＝薄層クロマトグラフイー Et₃N＝トリエチルアミン HMPTA＝燐酸Ｎ，Ｎ，N′，N′，N″，N″−ヘ
キサメチルトリアミド IIe＝イソロイシン Leu＝ロイシン SS＝溶剤系 Lys＝リジン MCA＝４−メチル−クマリル−(7)−アミド MeOH＝メタノール ４−MeO−２−NA＝４−メトキシ−２−ナフ
チルアミド Nleu＝ノルロイシン Nval＝ノルバリン OpNP＝ｐ−ニトロフエノキシ pNA＝ｐ−ニトロアニリド THF＝テトラヒドロフラン Val＝バリン 特に記載しない限り、ペプチド鎖中のアミノ酸
はＬ−形を有する。 例 １ Ｈ−Ｄ−VaI−CHA−Arg−pNA.2HBr 1a Cbo−Arg−pNA.HCl 250mlの三首フラスコ中で（真空中でP₂O₅上
で乾燥した）Cbo−Arg−OH.HCl16.0ｇ（47.0
ミリモル）を20℃で無水HMPTA90mlに溶解
し、この場合フラスコ中の雰囲気は湿分を含ま
ないように保持した。得られた溶液に室温でま
ずHMPTA10ml中のEt₃N4.74ｇ（47.0ミリモ
ル）の溶液を添加し、次に（100％過剰の）ｐ
−ニトロフエニルイソシアネート16.4ｇ（100
ミリモル）を滴加した。20℃での24時間の反応
時間後、HMPTAの大部分を真空中で蒸留する
ことによつて除去した。この残滓を30％AcOH
で数回抽出した。この残滓を廃棄した。合した
酢酸抽出液を30％AcOHで平衡させかつ30％
AcOHで溶離せしめる“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−15”（登録商標）のカラムを
通すことによつてさらに精製した。ｐ−ニトロ
アニリンの遊離下にトリプシンで処理すること
によつて分解されたAcOH溶出液の画分を凍結
乾燥した。こうして、TLCによつて示される
ようにSS中で均一な無定形粉末12.6ｇが得ら
れた。元素分析及び実験式C₂₀H₂₅N₆O₅Clから
の計算により次の値が得られた（実験式からの
値は括弧内のものである）：Ｃ＝51.29％
（51.67％）、Ｈ＝5.48％（5.42％）、Ｎ＝17.92％
（18.08％）、Cl＝7.50％（7.63％）。 1b 2HBr.H−Arg−pNA 化合物1a4.65ｇ（10ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr40mlで20℃で湿分の不在下に
45分間処理した。アミノ酸誘導体はCO₂の発生
下に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無
水エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H−Arg−pNAの沈殿物を生じた。エ−
テル相を吸引過し、その上固体相を副生成物
として形成された臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテル
100mlの量で４回洗浄した。この残滓をメタノ
ール50mlに溶解し、そのPHをEt₃Nを添加する
ことによつて4.5に調節し、この溶液を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。得られた生成物を
MeOH75mlに溶解し、MeOHで平衡させた“セ
フアデツクス（Sephadex）LH−20”（架橋デ
キストランゲル）のカラムを通した。この溶出
液の画分から、TLCによつて示されるように
SS中で均一な無定形化合物1b4.18ｇ（理論値
の91.6％）が得られた。元素分析及び実験式
C₁₂H₂₀N₆O₃Br₂からの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝4.35％
（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及びBr＝
34.81％（35.03％）。 1c Cbo−CHA−Arg−pNA.HBr 化合物1b4.56ｇ（10ミリモル）を新しく蒸留
したDMF30mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液に撹拌下でEt₃N1.40ml（10
ミリモル）を添加した。形成したEt₃N.HBrを
過することによつて除去し、冷たいDMFの
少量で洗浄した。この液に−10℃でCbo−
CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を添加し、
反応を湿分の不在下に２〜３時間継続させ、こ
の場合反応溶液の温度は次第に約20℃に到達し
た。この溶液を再び−10℃に冷却し、Et₃N0.70
ml（５ミリモル）で緩衝し、−10℃で約２時間
反応させ、室温で約３時間反応させた。この方
法をEt₃N0.70mlを用いて繰り返し、16時間この
反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥した。この
残滓を50％AcOH75mlに溶解し、50％AcOHで
平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
−15”のカラムでゲル過することによつて精
製した。ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解されたAcOH
溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。この残滓をMeOH150mlに溶解し、再び濃
縮して乾燥した。得られた残滓を真空デシケー
ター中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSS中で均一な無定形化合物
1c5.85ｇ（理論値の88.3％）を得た。元素分析
及び実験式C₂₉H₄₀N₇O₆Brからの計算により次
の値が得られた：Ｃ＝52.28％（52.57％）、Ｈ
＝6.16％（6.09％）、Ｎ＝15.09％（14.80％）及
びBr＝11.85％（12.06％）。 1d 2HBr.H−CHA−Arg−pNA 化合物1c5.30ｇ（８ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr32mlで20℃で40分間処理し
た。ジペプチド誘導体は、CO₂の発生下に次第
に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無水
エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H−CHA−Arg−pNAの沈殿物を生じ
た。エ−テル相を吸引過し、その上固体相を
副生成物として形成した臭化ベンジルならびに
過剰のHBr及びAcOHを除去するために無水エ
ーテル100mlの量で４回洗浄した。この残滓を
MeOH50mlに溶解した。PHをEt₃Nを用いて4.5
に調節し、この溶液を真空中で30℃で濃縮乾燥
した。得られた残滓をMeOH50mlに溶解し、
MeOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液の
画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られた
残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSS中で
均一な無定形化合物1d4.48ｇ（理論値の91.9
％）を得た。元素分析及び実験式
C₂₁H₃₅N₇O₄Brからの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝41.80％（41.39％）、Ｈ＝5.86％
（5.79％）、Ｎ＝16.31％（16.09％）及びBr＝
25.85％（26.23％）。 1e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA.HBr 化合物1d3.05ｇ（５ミリモル）を新しく蒸留
したDMF20mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液にEt₃N0.70ml（５ミリモ
ル）を撹拌下で添加した。形成したEt₃N.HBr
を過することによつて除去し、冷たいDMF
の少量で洗浄した。この液に−10℃でCbo−
Ｄ−VaI.OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）を撹拌下
で添加した。この反応混合物を湿分の不在下で
２〜３時間反応させ、この場合この反応溶液の
温度は次第に約20℃に到達した。この溶液を再
び−10℃に冷却し、Et₃N0.35ml（2.5ミリモ
ル）で緩衝し、−10℃で約２時間反応させ、室
温でさらに３時間反応させた。この方法を
Et₃N0.35mlを用いて繰り返し、16時間後この反
応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥した。この残
滓を50％AcOH50mlに溶解し、50％AcOHで平
衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−
15”のカラムでゲル過することによつて精製
した。ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプシ
ンで処理することによつて分解されたAcOH溶
出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。
この残滓をMeOH100mlに溶解し、この溶液を
再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を真空デ
シケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、TLC
によつて示されるようにSS中で均一な無定形
化合物1e3.15ｇ（理論値の82.7％）を得た。元
素分析及び実験式C₃₄H₄₉N₈O₇Brからの計算に
より次の値が得られた：Ｃ＝52.88％（53.61
％）、Ｈ＝6.54％（6.48％）、Ｎ＝15.08％
（14.71％）及びBr＝10.25％（10.49％）。 1f 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−pNA 化合物1e2.29ｇ（３ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr12mlで20℃で湿分の不在下に
40分間処理した。トリペプチド誘導体は、脱カ
ルボキシル化下及びCO₂の発生下で次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル120mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H−Ｄ
−VaI−CHA−Arg−pNAの沈殿物を生じた。
エ−テル相を過棒を通して吸引過し、次に
固体相を無水エーテル50mlの量で４回洗浄し
た。得られた残滓をMeOH40mlに溶解した。PH
をEt₃Nを用いて4.5に調節し、この溶液を真空
中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓をMeOH30
mlに溶解し、MeOHで平衡させた“セフアデツ
クス（Sephadex）LH−20”のカラムで精製し
た。ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプシン
で処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。後精
製するために、予備精製された残滓を33％
AcOH30mlに溶解し、33％AcOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ｐ−
ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の主画
分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。得られた残
滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で乾
燥し、TLCによつて示されるようにSS中で均
一な無定形化合物1f1.84ｇ（理論値の86.4％）
を得た。元素分析及び実験式C₂₆H₄₄N₈O₅Br₂か
らの計算により次の値が得られた：Ｃ＝43.60
％（44.08％）、Ｈ＝6.41％（6.26％）、Ｎ＝
16.15％（15.82％）及びBr＝22.21％（22.56
％）。 アミノ酸分析により次の正確な比率で所望のア
ミノ酸の存在が確認された。： Arg：1.00−CHA：0.96−Ｄ−CHG：0.98。Rf
値0.46。 例 ２ 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−MCA 2b 2HBr.H−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA.HCl13.0ｇ（25.9ミ
リモル）を氷酢酸中の2NHBrの溶液104ml
（208ミリモル）を用いて例1bにより解封鎖し
た。この乾燥残滓をMeOH400mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH−
20”のカラムで精製した。４−メチル−７−ア
ミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたMeOH溶出液の画分
を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られた残滓
を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で乾燥
し、TLCによつて示されるようにSS中で均一
な無定形化合物2b11.2ｇ（理論値の87.7％）を
得た。元素分析及び実験式C₁₆H₂₃N₅O₃Br₂から
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝39.40
％（38.96％）、Ｈ＝4.61％（4.70％）、Ｎ＝
14.48％（14.20％）及びBr＝31.90％（32.40
％）。 2c Cbo−CHA−Arg−MCA.HBr 化合物2b4.93ｇ（10ミリモル）及びCbo−
CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を新しく蒸
留したDMF75mlに添加した。−10℃への冷却
後、撹拌下でEt₃Nをまず1.40ml（10ミリモ
ル）、次に0.70ml（５ミリモル）添加した。こ
の混合物を、湿分の不在下で、まず−10℃で３
時間反応させ、次に室温で４時間反応させた。
この反応溶液を再び−10℃に冷却し、Et₃N0.70
mlで緩衝し、かつ20℃で１晩撹拌した。この反
応混合物を真空中で50℃で濃縮乾燥し、この残
滓を50％AcOH200mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。４−メチル−７−アミノ−クマ
リンの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。こうして得られた残滓を
真空デシケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥
し、TLCによつて示されるようにSS中で均一
な結晶性化合物2c5.95ｇ（理論値の85.0％）を
得た。元素分析及び実験式C₃₃H₄₃N₆O₆Brから
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝56.33
％（56.65％）、Ｈ＝6.28％（6.19％）、Ｎ＝
12.25％（12.01％）及びBr＝11.30％（11.42
％）。 2d 2HBr.H−CHA−Arg−MCA 化合物2c5.60ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH100mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH
−20”のカラムで精製した。４−メチル−７−
アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理
することによつて分解されたMeOH溶出液の画
分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られた残
滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で乾
燥し、TLCによつて示されるようにSS中で均
一な無定形化合物2d4.76ｇ（理論値の92.1％）
を得た。元素分析及び実験式C₂₅H₃₈N₆O₄Br₂か
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
47.02％（46.45％）、Ｈ＝6.02％（5.93％）、Ｎ
＝13.21％（13.00％）及びBr＝24.48％（24.72
％）。 2e Cbo−Ｄ−VaI−CHA−Arg−MCA.HBr 化合物2d3.23ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−VaI−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。得られた粗製生成物を50％
AcOH75mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムで精製し
た。４−メチル−７−アミノ−クマリンの遊離
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で60
℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示される
ようにSS中で均一な無定形化合物2e3.21ｇ
（理論値の80.4％）を得た。元素分析及び実験
式C₃₈H₅₂N₇O₇Brからの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝57.05％（57.14％）、Ｈ＝6.61％
（6.56％）、Ｎ＝12.49％（12.28％）及びBr＝
9.82％（10.00％）。 2f 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−MCA 化合物2d2.40ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。得
られた粗製生成物をMeOH50mlに溶解し、この
溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH−
20”のカラムで精製した。４−メチル−７−ア
ミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたMeOH溶出液の画分
を真空中で30℃で濃縮乾燥した。更に、精製す
るために、予備精製された生成物を50％
AcOH40mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲル
過することによつて精製した。４−メチル−７
−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたAcOH溶出液の
主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残
滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で乾
燥し、TLCによつて示されるようにSS中で均
一な無定形化合物2f1.73ｇ（理論値の77.3％）
を得た。元素分析及び実験式C₃₀H₄₇N₇O₅Br₂か
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
48.12％（48.33％）、Ｈ＝6.43％（6.35％）、Ｎ
＝13.38％（13.15％）及びBr＝21.18％（21.44
％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： VaI：1.00−Arg：1.02−Ｄ−CHA：0.97。Rf
値：0.42。 例 ３ 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−DPA 3a Cbo−Arg−DPA.HCl 無水Cbo−Arg−OH.HCl34.48ｇ（0.1モル）
を1000mlの三首フラスコ中で新しく蒸留した無
水DMF150mlと無水THF300mlとの混合物に20
℃で溶解した。−10℃に冷却した該溶液に撹拌
下でEt₃N10.2ｇ（0.1モル）を湿分の不在下で
添加した。更に、THF50ml中のクロル蟻酸イ
ソブチル13.65ｇ（0.1モル）の溶液を20分間で
滴加し、その後に反応温度は−５℃を決して越
えないようにした。−10℃〜−５℃の温度で10
分間の付加的な反応時間後、DMF75ml中のジ
メチル５−アミノ−イソフタレート20.92ｇ
（0.1モル）の溶液を30分間で滴加し、その後に
反応温度はいつも−５℃以下に保持した。この
反応混合物を−５℃でさらに１時間反応させ
た。この反応混合物を、Et₃N.HClを晶出させ
るために、20℃で１晩撹拌し、次に−15℃に冷
却した。形成したEt₃N.HClを別し、冷たい
DMFの少量で洗浄した。この液と洗浄液を
一緒に真空中で50℃で濃縮乾燥した。この残滓
を50％AcOH1000mlに溶解し、この溶液を50％
AcOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲル過する
ことによつて精製した。ジメチル５−アミノ−
イソフタレートの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の主画
分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を
真空デシケーター中で50℃でP₂O₅上で乾燥
し、TLCによつて示されるようにSS中で均一
な無定形化合物3a24.6ｇ（理論値の45.9％）を
得た。元素分析及び実験式C₂₄H₃₀N₅O₇Clから
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝53.21
％（53.78％）、Ｈ＝5.71％（5.64％）、Ｎ＝
13.20％（13.07％）及びCl＝6.52％（6.62％）。 3b 2HBr.H−Arg−DPA 化合物3a21.44ｇ（40ミリモル）を例1bによ
り解封鎖した。普通の処理後、得られた粗製生
成物をMeOH250mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）LH−20”のカラム
でゲル過することによつて精製した。ジメチ
ル５−アミノ−イソフタレートの遊離下でトリ
プシンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の画分を真空中で濃縮乾燥した。
この残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅
上で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS
中で均一な無定形化合物3b19.63％（理論値の
93.1％）を得た。元素分析及び実験式
C₁₆H₂₅N₅O₅Br₂からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝36.82％（36.45％）、Ｈ＝4.67％
（4.78％）、Ｎ＝13.45％（13.28％）及びBr＝
29.85％（30.31％）。 3c Cbo−CHA−Arg−DPA.HBr 化合物3b5.27ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH200mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSS中で均一な無定形化合物
3c6.06ｇ（理論値の82.6％）を得た。元素分析
及び実験式C₃₃H₄₅N₆O₈Brからの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝53.74％（54.02％）、
Ｈ＝6.28％（6.18％）、Ｎ＝11.90％（11.46％）
及びBr＝10.68％（10.89％）。 3d 2HBr.H−CHA−Arg−DPA 化合物3c5.87ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中で
2NHBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精製
した。ジメチル５−アミノ−イソフタレートの
遊離下でトリプシンで処理することによつて分
解されたMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で
濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中
で40℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示さ
れるようにSS中で均一な無定形化合物3d4.79
ｇ（理論値の88.0％）を得た。元素分析及び実
験式C₂₅H₄₀N₆O₆Brからの計算により、次の値
が得られた：Ｃ＝43.75％（44.13％）、Ｈ＝5.88
％（5.93％）、Ｎ＝12.69％（12.35％）及びBr
＝23.22％（23.49％）。 3e Cbo−Ｄ−VaI−CHA−Arg−DPA.HBr 化合物3d3.40ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−VaI−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタ
レートの遊離下でトリプシンで処理することに
よつて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中
で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケ
ーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによ
つて示されるようにSS中で均一な無定形化合
物3e3.25ｇ（理論値の78.1％）を得た。元素分
析及び実験式C₃₈H₅₄N₇O₉Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝53.95％（54.80
％）、Ｈ＝6.65％（6.54％）、Ｎ＝12.07％
（11.77％）及びBr＝9.38％（9.59％）。 3f 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−DPA 化合物3e2.50ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH50ml
に溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで予備精製し
た。ジメチル５−アミノ−イソフタレートの遊
離下でトリプシンで処理することによつて分解
されたMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃
縮乾燥した。この予備精製された生成物を50％
AcOH50mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲル
過することによつて精製した。ジメチル５−ア
ミノ−イソフタレートの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたAcOH溶出液
の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この
残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSS中で
均一な無定形化合物3f1.93ｇ（理論値の82.6
％）を得た。元素分析及び実験式
C₃₀H₄₉N₇O₇Br₂からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝46.84％（46.22％）、Ｈ＝6.42％
（6.34％）、Ｎ＝12.16％（12.58％）及びBr＝
20.22％（20.50％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−VaI：1.00−Arg：0.98−CHA：1.02。Rf
値：0.44。 例 ４ 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−２−NA 4b 2HBr.H−Arg−２−NA 市販のCbo−Arg−２−NA.HCl9.40ｇ（20ミ
リモル）を例1bにより氷酢酸中の2NHBr80ml
の溶液と反応させた。普通の処理後に得られた
生成物をMeOH150mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”のカ
ラムで精製した。２−ナフチルアミンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS中で均一な無定形化合物4b8.60ｇ（理
論値の93.2％）を得た。元素分析及び実験式
C₁₆H₂₃N₅OBr₂からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝42.08％（41.67％）、Ｈ＝5.12％
（5.03％）、Ｎ＝14.68％（15.19％）及びBr＝
33.96％（34.65％）。 4c Cbo−CHA−Arg−２−NA.HBr 化合物4b4.6ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。２−ナフチルアミンの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮乾燥
した。この残滓を真空デシケーター中で60℃で
P₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSS中で均一な無定形化合物4c5.31ｇ（理論
値の79.5％）を得た。元素分析及び実験式
C₃₃H₄₃N₆O₄Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝59.18％（59.37％）、Ｈ＝6.58％
（6.49％）、Ｎ＝12.87％（12.59％）及びBr＝
11.55％（11.97％）。 4d 2HBr.H−CHA−Arg−２−NA 化合物4c4.67ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液をセフアデツ
クス（Sephadex）LH−20”のカラムで精製し
た。２−ナフチルアミンの遊離下でトリプシン
で処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この
残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSS中で
均一な無定形化合物4d3.95ｇ（理論値の91.8
％）を得た。元素分析及び実験式
C₂₅H₃₈N₆O₂Br₂からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝49.22％（48.87％）、Ｈ＝6.30％
（6.23％）、Ｎ＝13.61％（13.68％）及びBr＝
25.84％（26.01％）。 4e Cbo−Ｄ−VaI−CHA−Arg−２−NA.HBr 化合物4d3.07ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−VaI−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。２−ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の第１の主画分を真空中で40℃で
濃縮乾燥し、真空デシケーター中で60℃で
P₂O₅上で乾燥した。こうして、TLCによつて
示されるようにSS中で均一な無定形化合物
4e3.14ｇ（理論値の81.9％）が得られた。元素
分析及び実験式C₃₈H₅₂N₇O₅Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝58.92％（59.52
％）、Ｈ＝6.93％（6.84％）、Ｎ＝13.02％
（12.79％）及びBr＝10.18％（10.42％）。 4f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA.Arg−２−NA 化合物4e1.53ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH40ml
に溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
２−ナフチルアミンの形成下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液の
主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この生
成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。２−ナフチルアミンの形成下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS中で均一な無定形化合物4f1.05ｇ（理論
値の73.6％）を得た。元素分析及び実験式
C₃₀H₄₇N₇O₃Br₂からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝50.16％（50.50％）、Ｈ＝6.71％
（6.64％）、Ｎ＝14.00％（13.74％）及びBr＝
22.05％（22.40％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−VaI：1.00−Arg：0.98−CHA：0.97。Rf
値：0.42。 例 ５ 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−４−MeO−
２−NA 5b 2HBr.H−Arg−４−MeO−２−NA 市販のCbo−Arg−４−MeO−２−NA.
HCl10.0ｇ（20ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr80mlを用いて例1bにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH150mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精製
した。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの遊
離下でトリプシンで処理することによつて分解
されたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で
濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中
で40℃でP₂O₅上で乾燥した後、TLCによつて
示されるようにSS中で均一な無定形化合物
5b8.98ｇ（理論値の91.4％）が得られた。元素
分析及び実験式C₁₇H₂₅N₅O₂Br₂からの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝41.22％（41.57
％）、Ｈ＝5.19％（5.13％）、Ｎ＝14.40％
（14.26％）及びBr＝32.01％（32.53％）。 5c Cbo−CHA−Arg−４−MeO−２−Na.HBr 化合物5b4.91ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。４−メトキシ−２−ナフチルアミ
ンの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を真
空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デ
シケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥した後、
TLCによつて示されるようにSS中で均一な無
定形化合物5c5.36ｇ（理論値の76.8％）が得ら
れた。元素分析及び実験式C₃₄H₄₅N₆O₅Brから
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝58.85
％（58.53％）、Ｈ＝6.59％（6.50％）、Ｎ＝
11.91％（12.05％）及びBr＝11.32％（11.45
％）。 5d 2HBr.H−CHA−Arg−４−MeO−２−NA 化合物5c4.88ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精製
した。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形
成下でトリプシンで処理することによつて分解
されたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で
濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中
で40℃でP₂O₅上で乾燥した後、TLCによつて
示されるようにSS中で均一な無定形化合物
5d4.12ｇ（理論値の91.3％）が得られた。元素
分析及び実験式C₂₆H₄₀N₆O₃Br₂からの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝48.92％（48.46
％）、Ｈ＝6.36％（6.26％）、Ｎ＝12.84％
（13.04％）及びBr＝24.33％（24.80％）。 5e Cbo−Ｄ−VaI−CHA−Arg−４−MeO−２
−NA.HBr 化合物5d3.22ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−VaI−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させる。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH125mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。４−メトキシ−２−ナフチルア
ミンの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を
真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空
デシケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥した
後、TLCによつて示されるようにSS中で均一
な無定形化合物5e3.15ｇ（理論値の79.1％）が
得られた。元素分析及び実験式C₃₉H₅₄N₇O₆Br
からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
58.35％（58.79％）、Ｈ＝6.78％（6.83％）、Ｎ
＝12.68％（12.31％）及びBr＝9.82％（10.03
％）。 5f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO
−２−NA 化合物5e1.59ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH40ml
に溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで予備精製し
た。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃
縮した。この予備精製された生成物を50％
AcOH60mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムで精製し
た。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃
縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で
40℃でP₂O₅上で乾燥した後、TLCによつて示
されるようにSS中で均一な無定形化合物5f1.09
ｇ（理論値の73.3％）が得られた。元素分析及
び実験式C₃₁H₄₉N₇O₄Br₂からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝49.63％（50.07％）、Ｈ
＝6.70％（6.64％）、Ｎ＝13.42％（13.19％）及
びBr＝21.22％（21.49％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−VaI：1.00−Arg：1.01−Ｄ−CHA：
0.98。Rf値0.47。 一連の他のトリペプチド誘導体を前記実施例の
記載の方法により製造した。これらのトリペプチ
ド誘導体は、次の第１表に纒められている。 第１表に示したトリペプチド誘導体の製造に使
用されたトリペプチド中間体は、第２表に記載さ
れている。

【表】

【表】

【表】 例 12 2AcOH.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−pNA 2HBr.H−Ｄ−VaI−CHA−Arg−pNA（例38
により製造）7.09ｇ（10ミリモル）を60％MeOH
水溶液75mlに溶解した。この溶液を酢酸塩の形で
“アンバーライト（AmberIite）”（登録商標）
JRA−401のカラムに充填した。このカラムを60
％MeOH水溶液で溶離し、その後にHBrをイオン
交換することによつてAcOHに代えた。この溶出
液を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真
空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で乾燥した
後、臭化物不含の2AcOH.H−Ｄ−VaI−CHA−
Arg−pNA6.33ｇ（理論値の98.5％）が得られ
た。 上記方法によれば、有機酸、例えば蟻酸、プロ
ピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息
香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又はフタル酸
との他の塩は、前記のトリペプチド誘導体から製
造することができる。イオン交換体、例えば塩酸
塩の形の“アンバーライト（Amberlite）”JRA
−401を使用することができ、これは苛性ソーダ
液で処理することによつて該イオン交換体を塩基
性OH形に変換し、次に該塩基性イオン交換体を
60％MeOH水溶液中の所望の有機酸とそのナトリ
ウム塩との１：１混合物の溶液で処理することに
よつて所望の酸塩の形に変換することができる。 本発明によるトリペプチド基質を用いての酵素
の定量分析は、次のようにして実施することがで
きる： １ 尿カリクレイン分析 尿１mlならびにPH7.9及びイオン強度1.0を有す
るTRIS−イミダゾール緩衝液１mlを37℃で５分
間恒温保持し、次に沈殿物を除去するために遠心
分離する。 37℃に加熱した蒸留水1.4mlと遠心分離物0.4ml
をプラスチツク製キユベツト中で充分に混合す
る。この混合物に２×10^-3モルの基質水溶液0.2
mlを添加し、成分を迅速に混合する。この混合物
を37℃で正確に15分間恒温保持する。次に、この
反応混合物を酵素反応を停止させるために氷酢酸
0.2mlと混合する。色を計測するためには、同じ
成分からなるが、酵素反応を阻止するための基質
添加前に添加された氷酢酸を有する空試料を使用
する。次に、形成された有色化合物Ｒ−NH₂の量
を空試料と試験試料との差から405nmで測光法又
は分光測光法により測定する。得られる値から尿
における尿カリクレイン活量を次式により測定す
る： △OD＝15分間の405nmでの光学濃度の増加分 Ｖ＝試験混合物の全容量＝2.2ml 1000＝ＵをmUに変換するための変換係数 Ｆ＝尿（２）の稀釈係数 Ｖ＝試料の容量＝0.4ml ε＝1000で割つた吸光係数＝10.4 尿における尿カリクレイン含量の計算は、形成
される生成物Ｒ−NH₂（例えば、ｐ−ニトロアニ
リン）を連続的に測定することによつて実施する
こともできる。この方法を喀痰中の腺カリクレイ
ンの分析に適用するように後記する。 尿カリクレイン以外に、尿も本発明による基質
を少量ではあるが分解することもできる蛋白分解
酵素としてのウロキナーゼを含有する。前記分析
方法においては、尿カリクレインとウロキナーゼ
との活量の合計が測定される。尿カリクレイン活
量の正確な値を得るためには、ウロキナーゼ活量
は差し引かなければならない。このウロキナーゼ
活量は、比較試験において尿カリクレイン活量を
完全に抑制するために緩衝液１ml当りトリプシン
抑制因子（牛の肺からのトリプシン抑制因子）
0.075単位を添加し、かつ単独にウロキナーゼ活
量を測定することによつて測定することができ
る。 ２ 喀痰における腺カリクレイン分析： 喀痰0.5mlをTRIS−イミダゾール緩衝液（イオ
ン強度1.0）２mlと混合し、この混合物を37℃で
５分間予め恒温保持する。この恒温保持物を遠心
分離する。試験キユベツトに37℃の蒸留水1.5ml
を充填し、これに遠心分離物0.25mlを添加する。
これらの成分を充分に混合する。更に、２×10^-3
モルの基質水溶液0.2mlを添加する。次に、
405nmでの吸光変化を記録装置を用いて５〜10分
間連続的に追跡する。毎分の△ODの測定値から
喀痰１ml当りのカリクレイン活量は、mUで次式
により計算される： Ｆ＝５ Ｖ＝1.95 ｖ＝0.25 IU（単位）＝PH、イオン強度、温度及び基質濃
度の最適条件下又は他に規定される条件下
に１分間で基質１マイクロモルを分解する
ことのできる酵素量。 膵液において膵蔵カリクレインは、主にプレカ
リクレインの形で存在し、活性化後でのみ、例え
ばトリプシンを用いて分析することができる。プ
レカリクレインの活性後、トリプシンは、大豆ト
リプシン抑制因子（SBTI）により抑制されてい
る。この活性化混合物中のカリクレイン含量は、
前記方法の１つによつて測定することができる。 ３ プラズミン分析： TRIS−イミダゾール緩衝液（PH7.5、イオン強
度0.2）1.7mlを25％グリセロール中のプラズミン
溶液0.1mlと37℃で混合し、この混合物を37℃で
１分間恒温保持する。この混合物に37℃の２×
10^-3モルの基質水溶液0.2mlを添加し、成分を迅
速に混合する。次に、単位時間当りの基質から分
離される分解生成物Ｒ−NH₂の量を連続的に測定
する。試料１ml当りのプラズミン活量は、毎分測
定される値からmUで次式により計算される： △Ｅ／ｍｉｎ．×Ｖ×１０００／ｖ×ε＝試料のmU／
ml数 △Ｅ＝毎分分離される分解生成物の量 Ｖ＝試験混合物の全容量 ｖ＝試料の容量 ε＝1000で割つた吸光係数 ４ ヒトの血漿における抗プラズミン分析： １：20の比率でTRIS−イミダゾール緩衝液で
稀釈された血漿0.1mlを、25％グリセロール１ml
当りのヒトプラズミン（AB Kabi（Stockholm、
Sweden）社製）1.25cU及びヒルジン
（Pentapharm A.G.（Basle、Switzerland）社
製）50ATUの溶液0.02mlと混合する。この混合
物を37℃で90秒間恒温保持する。この恒温保持物
に37℃のTRIS−イミダゾール緩衝液（PH7.5、イ
オン強度0.2）1.7mlを混合し、さらに２×10^-3モ
ルの基質水溶液0.2mlを混合する。次に、単位時
間当りの基質から分離される分解生成物Ｒ−NH₂
の量を連続的に測定する。残留プラズミン活量
は、測定値から前記方法により計算される。 空試験では、血漿は緩衝液の相当量に代える
が、それ以外はこの試験は前記方法により実施さ
れる。測定されるプラズミン活量は、開始プラズ
ミン量に相当する。抗プラズミン活量は、空試験
で測定されるプラズミン活量と、血漿を用いる試
験で測定される残留プラズミン活量との差から次
式により計算される： Ｆ＝血漿（20）の稀釈係数。 本発明による基質は、血漿中に存在するプラズ
ミノジエンを緩衝系中のウロキナーゼ又はストレ
プトキナーゼを用いて変換しかつ形成されるプラ
ズミンの量を前記プラズミン分析法により本発明
による基質の１つを用いて測定することによつて
ヒトの血漿中のプラズミノジエンを分析するのに
使用することもできる。血漿中に元来存在するプ
ラズミノジエンの量は、活性下でプラズミン１分
子がプラズミノジエン１分子から形成されるので
プラズミンに対する測定値から誘導される。 次の第４表には、器官又は腺カリクレイン、プ
ラズミン及びトロンビンに対する本発明による若
干の基質の感受性が示されている。

【表】 基質の酵素加水分解によつて形成される分解生
成物Ｒ−NH₂の測定は、この分解生成物が基質の
紫外スペクトルとは異なる紫外スペクトルを有し
かつより高い波長に向つて移動するという前堤条
件に基づく。405nmにおける基質の吸収は、実際
に皆無である。分解生成物としてのｐ−ニトロア
ニリンは、380nmでの吸収最高及びモル吸光係数
13200を示す。しかし、該吸光係数は405nmで僅
かに低下する、すなわち9650になる。分離される
ｐ−ニトロアニリン量に比例する基質の酵素加水
分解による量は、405nmで分光測光法により測定
することによつて測定することができる。過剰の
基質の存在下であつても405nmにおける測定には
支障がない。 分解生成物Ｒ−NH₂の量は、２−ナフチルアミ
ノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ基、４
−メチル−クマリル−（７）−アミノ基又は１，３
−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−（５）−
アミノ基を含有する基質を用いて蛍光分光測光法
により測定される。酵素、緩衝液及び基質からな
る試験系において、低エネルギー量の輻射線は、
形成された蛍光性分解生成物が高エネルギー量の
光線によつて励起された後、400〜470nmで連続
的に測定される。単位時間当りに形成される分解
生成物の量は、存在する酵素活量に対して測定さ
れる。前記のように、毎分の分解生成物１ミクロ
ンモルは、所定の基質に基づく１酵素単位に相当
する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−Arg−Ｒ ［式中、 Ｘはアラニル基、α−ブチリルアミノ基、バリ
   ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
   基又はイソロイシル基を表わし、 Ｙはシクロヘキシルアラニル基を表わし、 Ｒはｐ−ニトロフエニルアミノ基、２−ナフチ
   ルアミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ
   基、４−メチル−クマリル−７−アミノ又は１，
   ３−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−５−
   アミノ基を表わす］で示されるトリペプチド誘導
   体及びその酸との塩。 ２ 鉱酸、例えばHCl，HBr，H₂SO₄又はH₃PO₄
   又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、
   トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、トリクロル−又
   はトリフルオル酢酸のようなハロゲン化酢酸、ア
   ミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、クエン酸、安
   息香酸、核中で置換された芳香族酸、例えばトル
   イル酸、クロル−又はブロム安息香酸、メトキシ
   安息香酸及びアミノ安息香酸、又はフタル酸でプ
   ロトン化されている、特許請求の範囲第１項記載
   のトリペプチド誘導体。