JPS6257198B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6257198B2 JPS6257198B2 JP57132161A JP13216182A JPS6257198B2 JP S6257198 B2 JPS6257198 B2 JP S6257198B2 JP 57132161 A JP57132161 A JP 57132161A JP 13216182 A JP13216182 A JP 13216182A JP S6257198 B2 JPS6257198 B2 JP S6257198B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- diprotin
- culture
- water
- observed
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ
に対して酵素阻害活性を示す新規な生理活性物質
ジプロチン（Diprotin）Ａ，ＢおよびＣに関し、
またジプロチンＡ，Ｂの製造法に関するものであ
る。 本発明者らは、東京都杉並区久我山の土壌より
分離されたバクテリアであつてBMF673−RFI株
と名付けた菌を培養し、得られる培養物中にジペ
プチジルアミノペプチダーゼ阻害活性を有する
トリペプチド物質二つが存在することを見出し
た。その酵素阻害物質の採取方法について検討
し、それらの物質の単離に成功し、また本物質が
新規物質であることを確認してジプロチンＡ、ジ
プロチンＢと命名した。またその類縁化合物とし
てのジプロチンＣを合成し、本発明を完成した。 本発明者らは、さらに医薬としてのジプロチン
の有用性について検討して、本物質が細胞性免疫
に対して増強作用を有して免疫賦活剤として有用
であることを見出した。 グリシルプロリン−β−ナフチルアミドのジペ
プチジルアミノペプチダーゼによる分解を阻止
するジプロチンＡ，Ｂ，Ｃの効力について調べた
結果、後述の試験例に示されるごとく、抗ジペプ
チジルアミノペプチダーゼ活性を有することが
確認された。 従つて、第１の本発明の要旨とするところは、
次の一般式： （但しジプロチンＡでは、R′はエチル基、R2
は水素、R3はメチル基であり、ジプロチンＢで
は、R1はメチル基、R2はメチル基、R3は水素で
あり、ジプロチンＣでは、R1はメチル基、R2は
水素、R3はメチル基である）で表わされる抗ジ
ペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する新
生理活性物質ジプロチンＡ，ＢおよびＣ又はその
塩又はエステルにある。 本発明のジプロチンＡ，ＢならびにＣは夫々に
次の構造を有する。 ジプロチンＡ（即ちＬ−イソロイシル−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−イソロイシン）。 ジプロチンＢ（即ちＬ−バリル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−ロイシン）。 ジプロチンＣ（即ちＬ−バリル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−イソロイシン）。 ジプロチンＡ及びＢは後記の実施例に示すごと
く、ジプロチン生産菌の培養液をダウエツクス
50Wのクロマトグラフイー等で分画することによ
りいづれも無色の粉末として取得できる。 本発明化合物の物性は次の通りである。 即ち、ジプロチンＡは、融点178〜180℃質量分
析法で得られる分子量は341である。元素分析値
は、C59.42％，H8.90％，N12.05％，であり、
C17H3N31N3O4の分子式を得る。ジプロチンＡの
赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠）は、添
付図面第１図に示す通りであり、3400，2960，
2875，1650，1590，1460，1390，1240，1200，
1145，1100，990，905，880，680（cm-1）に特異
吸収帯を示す。ジプロチンＡのプロトン核磁気共
鳴スペクトル（重水溶液、90MHz）は、1.13〜
2.06（CH3×４，CH2×２），2.06〜3.00（CH2×
２，CH×２），3.86〜4.43（CH2），4.43〜4.83
（CH×２）および4.83〜5.33（CH）ppmに吸収
を示す。 ジプロチンＢは融点158〜160℃、質量分析法で
得られる分子量は327である。元素分析値は
C58.20％，H8.88％，N12.52％，であり、
C16H29N3O4の分子式を得る。 ジプロチンＢの赤外部吸収スペクトル（臭化カ
リウム錠）は第２図に示す通りであり、3390，
2960，2875，1650，1585，1520，1475，1455，
1400，1370，1240，1200，1165，1110，1050，
1000，940，880，760，710（cm-1）に特異吸収帯
を有する。ジプロチンＢのプロトン核磁気共鳴ス
ペクトル（重水溶液、90MHz）は、1.16〜1.73
（CH3×４），1.86〜2.20（CH2，CH），2.20〜3.03
（CH2×２，CH），3.86〜4.36（CH2），4.46〜4.80
（CH×２），および4.80〜5.33（CH）ppmに吸収
を示す。 ジプロチンＣは後記の実施例に示すごとくＬ−
イソロイシンから通常のペプチド合成法により製
造できる。 ジプロチンＣの物性値は次の通りである。質量
分析法で得られる分子量は327である。元素分析
値はC58.37％，H8.82％，N12.73％であり、
C16H29N3O4の分子式を得る。赤外部吸収スペク
トル（臭化カリウム錠）は第３図に示す通りであ
り、3430，2975，2890，1650，1530，1410，
1245，1210，1150，1060，1000，865，690（cm
-1）に特異吸収帯を有する。ジプロチンＣのプロ
トン核磁気共鳴スペクトル（重水溶液、90MHz）
は1.16〜2.06（CH3×４，CH2），2.06〜3.06
（CH2×２，CH×２），3.86〜4.43（CH2），4.43
〜4.86（CH×２）および4.86〜5.33（CH）ppm
に吸収を示す。 また、第２の本発明の要旨はバチルス属に属す
るジプロチン生産菌を培養してジプロチンＡ又
は／及びジプロチンＢを培養物中に生産、蓄積さ
せ、さらにこれらを単独に又は混合物として採取
することを特徴とする新規生理活性物質ジプロチ
ンＡ又は／及びＢの製造法にある。 本発明の方法において、ジプロチン生産菌と
は、ジプロチンＡ又はＢ、又はこれらの両者を生
産する菌を意味する。本発明のジプロチンの生産
に使用される生産菌の一例には、本発明者らによ
つて東京都杉並区久我山で採取された土壌より分
離されたバクテリアであつて、BMF673−RFI株
と命名した菌がある。本菌株は、工業技術院微生
物工業技術研究所に、昭和57年７月15日保管委託
し、微工研菌寄第6623号（FERM−P6623）の受
託番号が付されて保管されている。 以下にこの菌株の菌学的性状について記述す
る。 BMF673−RFI株の菌学的性状 １ 形態 (1) 細胞は桿菌、大きさは0.6〜1.0×1.5〜2.5
ミクロンである。 (2) 細胞の多形性は、特に認められない。 (3) 活発な運動性を示し、周鞭毛を有する。 (4) 胞子を有する。その形は卵円形、大きさは
0.6〜0.7×1.4〜1.6ミクロン位置は中立
（central）、菌体の膨隆は認められない。 また耐熱性である。 (5) グラム染色は陽性である。 (6) 非抗酸性である。 ２ 各種培地における生育状態 肉汁ゼラチン穿刺培養以外は、すべて30℃で試
験した。 (1) 肉汁寒天平板培養 コロニーは光沢のない、不透明な円形で、
辺縁は不規則、色はうす黄（Pale Yellow）
からうす黄茶（Pale Yellowish Brown）を
示す。培養後、40〜48時間を経過すると、コ
ロニーは辺縁部からしわの入つた発育を呈す
る。拡散性色素は認められない。 (2) 肉汁寒天斜面培地 接種線に沿つて一様に生育し、不透明で光
沢がなく、うす黄（Pale Yellow）からうす
黄茶（Pale Yellowish Brown）を示す。拡
散性色素は認められない。 (3) 肉汁液体培養 培養後24時間で培地表面に菌膜をつくり、
３日目には培地表面を菌膜がおおい、試験管
底部に菌体が沈澱して、培地が濁つてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃培養では、表面と穿刺線に沿つて菌の
生育が認められ、培養後５日目頃に液化が認
められた。その型は層状である。 30℃培養では、24時間で表面に菌膜を形成
し、３日目頃から菌膜上にしわが認められ
る。ゼラチンの液化は、培養後２日目頃から
始まり、14日目でほぼ完了した。 (5) ミルク BCPミルク培地で培養すると、培養後２日
目に完全な凝固が観察され、直ちにペプトン
化が始まり、培養後１週間でほぼ完了した。
反応は、アルカリ性である。 ３ 生理的性質（特に記さない限り、培養温度は
全て30℃） (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応（駒形らの方法：長谷川武治編
著；微生物の分類と同定、223頁、東京大学
出版会、1975年）：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) Ｖ−Ｐテスト：陽性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陽性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地、
Christensenの培地ともに生育する。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸ナトリウム、硫酸
アンモニウムのいずれも利用する。 (10) 色素の生成（キングＡおよびキングＢ培
地、栄研）：キングＡ培地では、ほんのわず
かに黄色味を帯び、キングＢ培地では、黄色
の溶解性色素を認めた。 (11) ウレアーゼ（尿素培地、栄研）：陰性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲：PH4.4〜PH8.8の範囲で生育
を認め、最適PHは、7.0〜8.0である。また、
10℃〜45℃の範囲で生育を認め、最適温度は
24℃〜30℃である。 (15) 酸素に対する態度：通性嫌気性 (16) Ｏ−Ｆテスト（Hugh−Leifson法によ
る）：発酵型である。 (17) 糖類からの酸およびガスの生成（Hugh
−Leifsonの培地を使用）
に対して酵素阻害活性を示す新規な生理活性物質
ジプロチン（Diprotin）Ａ，ＢおよびＣに関し、
またジプロチンＡ，Ｂの製造法に関するものであ
る。 本発明者らは、東京都杉並区久我山の土壌より
分離されたバクテリアであつてBMF673−RFI株
と名付けた菌を培養し、得られる培養物中にジペ
プチジルアミノペプチダーゼ阻害活性を有する
トリペプチド物質二つが存在することを見出し
た。その酵素阻害物質の採取方法について検討
し、それらの物質の単離に成功し、また本物質が
新規物質であることを確認してジプロチンＡ、ジ
プロチンＢと命名した。またその類縁化合物とし
てのジプロチンＣを合成し、本発明を完成した。 本発明者らは、さらに医薬としてのジプロチン
の有用性について検討して、本物質が細胞性免疫
に対して増強作用を有して免疫賦活剤として有用
であることを見出した。 グリシルプロリン−β−ナフチルアミドのジペ
プチジルアミノペプチダーゼによる分解を阻止
するジプロチンＡ，Ｂ，Ｃの効力について調べた
結果、後述の試験例に示されるごとく、抗ジペプ
チジルアミノペプチダーゼ活性を有することが
確認された。 従つて、第１の本発明の要旨とするところは、
次の一般式： （但しジプロチンＡでは、R′はエチル基、R2
は水素、R3はメチル基であり、ジプロチンＢで
は、R1はメチル基、R2はメチル基、R3は水素で
あり、ジプロチンＣでは、R1はメチル基、R2は
水素、R3はメチル基である）で表わされる抗ジ
ペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する新
生理活性物質ジプロチンＡ，ＢおよびＣ又はその
塩又はエステルにある。 本発明のジプロチンＡ，ＢならびにＣは夫々に
次の構造を有する。 ジプロチンＡ（即ちＬ−イソロイシル−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−イソロイシン）。 ジプロチンＢ（即ちＬ−バリル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−ロイシン）。 ジプロチンＣ（即ちＬ−バリル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−イソロイシン）。 ジプロチンＡ及びＢは後記の実施例に示すごと
く、ジプロチン生産菌の培養液をダウエツクス
50Wのクロマトグラフイー等で分画することによ
りいづれも無色の粉末として取得できる。 本発明化合物の物性は次の通りである。 即ち、ジプロチンＡは、融点178〜180℃質量分
析法で得られる分子量は341である。元素分析値
は、C59.42％，H8.90％，N12.05％，であり、
C17H3N31N3O4の分子式を得る。ジプロチンＡの
赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠）は、添
付図面第１図に示す通りであり、3400，2960，
2875，1650，1590，1460，1390，1240，1200，
1145，1100，990，905，880，680（cm-1）に特異
吸収帯を示す。ジプロチンＡのプロトン核磁気共
鳴スペクトル（重水溶液、90MHz）は、1.13〜
2.06（CH3×４，CH2×２），2.06〜3.00（CH2×
２，CH×２），3.86〜4.43（CH2），4.43〜4.83
（CH×２）および4.83〜5.33（CH）ppmに吸収
を示す。 ジプロチンＢは融点158〜160℃、質量分析法で
得られる分子量は327である。元素分析値は
C58.20％，H8.88％，N12.52％，であり、
C16H29N3O4の分子式を得る。 ジプロチンＢの赤外部吸収スペクトル（臭化カ
リウム錠）は第２図に示す通りであり、3390，
2960，2875，1650，1585，1520，1475，1455，
1400，1370，1240，1200，1165，1110，1050，
1000，940，880，760，710（cm-1）に特異吸収帯
を有する。ジプロチンＢのプロトン核磁気共鳴ス
ペクトル（重水溶液、90MHz）は、1.16〜1.73
（CH3×４），1.86〜2.20（CH2，CH），2.20〜3.03
（CH2×２，CH），3.86〜4.36（CH2），4.46〜4.80
（CH×２），および4.80〜5.33（CH）ppmに吸収
を示す。 ジプロチンＣは後記の実施例に示すごとくＬ−
イソロイシンから通常のペプチド合成法により製
造できる。 ジプロチンＣの物性値は次の通りである。質量
分析法で得られる分子量は327である。元素分析
値はC58.37％，H8.82％，N12.73％であり、
C16H29N3O4の分子式を得る。赤外部吸収スペク
トル（臭化カリウム錠）は第３図に示す通りであ
り、3430，2975，2890，1650，1530，1410，
1245，1210，1150，1060，1000，865，690（cm
-1）に特異吸収帯を有する。ジプロチンＣのプロ
トン核磁気共鳴スペクトル（重水溶液、90MHz）
は1.16〜2.06（CH3×４，CH2），2.06〜3.06
（CH2×２，CH×２），3.86〜4.43（CH2），4.43
〜4.86（CH×２）および4.86〜5.33（CH）ppm
に吸収を示す。 また、第２の本発明の要旨はバチルス属に属す
るジプロチン生産菌を培養してジプロチンＡ又
は／及びジプロチンＢを培養物中に生産、蓄積さ
せ、さらにこれらを単独に又は混合物として採取
することを特徴とする新規生理活性物質ジプロチ
ンＡ又は／及びＢの製造法にある。 本発明の方法において、ジプロチン生産菌と
は、ジプロチンＡ又はＢ、又はこれらの両者を生
産する菌を意味する。本発明のジプロチンの生産
に使用される生産菌の一例には、本発明者らによ
つて東京都杉並区久我山で採取された土壌より分
離されたバクテリアであつて、BMF673−RFI株
と命名した菌がある。本菌株は、工業技術院微生
物工業技術研究所に、昭和57年７月15日保管委託
し、微工研菌寄第6623号（FERM−P6623）の受
託番号が付されて保管されている。 以下にこの菌株の菌学的性状について記述す
る。 BMF673−RFI株の菌学的性状 １ 形態 (1) 細胞は桿菌、大きさは0.6〜1.0×1.5〜2.5
ミクロンである。 (2) 細胞の多形性は、特に認められない。 (3) 活発な運動性を示し、周鞭毛を有する。 (4) 胞子を有する。その形は卵円形、大きさは
0.6〜0.7×1.4〜1.6ミクロン位置は中立
（central）、菌体の膨隆は認められない。 また耐熱性である。 (5) グラム染色は陽性である。 (6) 非抗酸性である。 ２ 各種培地における生育状態 肉汁ゼラチン穿刺培養以外は、すべて30℃で試
験した。 (1) 肉汁寒天平板培養 コロニーは光沢のない、不透明な円形で、
辺縁は不規則、色はうす黄（Pale Yellow）
からうす黄茶（Pale Yellowish Brown）を
示す。培養後、40〜48時間を経過すると、コ
ロニーは辺縁部からしわの入つた発育を呈す
る。拡散性色素は認められない。 (2) 肉汁寒天斜面培地 接種線に沿つて一様に生育し、不透明で光
沢がなく、うす黄（Pale Yellow）からうす
黄茶（Pale Yellowish Brown）を示す。拡
散性色素は認められない。 (3) 肉汁液体培養 培養後24時間で培地表面に菌膜をつくり、
３日目には培地表面を菌膜がおおい、試験管
底部に菌体が沈澱して、培地が濁つてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃培養では、表面と穿刺線に沿つて菌の
生育が認められ、培養後５日目頃に液化が認
められた。その型は層状である。 30℃培養では、24時間で表面に菌膜を形成
し、３日目頃から菌膜上にしわが認められ
る。ゼラチンの液化は、培養後２日目頃から
始まり、14日目でほぼ完了した。 (5) ミルク BCPミルク培地で培養すると、培養後２日
目に完全な凝固が観察され、直ちにペプトン
化が始まり、培養後１週間でほぼ完了した。
反応は、アルカリ性である。 ３ 生理的性質（特に記さない限り、培養温度は
全て30℃） (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応（駒形らの方法：長谷川武治編
著；微生物の分類と同定、223頁、東京大学
出版会、1975年）：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) Ｖ−Ｐテスト：陽性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陽性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地、
Christensenの培地ともに生育する。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸ナトリウム、硫酸
アンモニウムのいずれも利用する。 (10) 色素の生成（キングＡおよびキングＢ培
地、栄研）：キングＡ培地では、ほんのわず
かに黄色味を帯び、キングＢ培地では、黄色
の溶解性色素を認めた。 (11) ウレアーゼ（尿素培地、栄研）：陰性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲：PH4.4〜PH8.8の範囲で生育
を認め、最適PHは、7.0〜8.0である。また、
10℃〜45℃の範囲で生育を認め、最適温度は
24℃〜30℃である。 (15) 酸素に対する態度：通性嫌気性 (16) Ｏ−Ｆテスト（Hugh−Leifson法によ
る）：発酵型である。 (17) 糖類からの酸およびガスの生成（Hugh
−Leifsonの培地を使用）
【表】
【表】
ガスの生成はすべて陰性であつた。
(18) リゾチーム感受性 基礎培地（ペプトン10ｇ、牛肉エキス10
ｇ、NaCl5ｇ，PH7.4）に、別に滅菌したリ
ゾチームを0.001％になるように加え、
BMF673−RFI株を接種し、ロータリー・シ
エーカ−（180r・ｐ・m.）で30℃、24時間振
とう培養を行い、菌の増殖を認めた。 (19) レシトビテリン（LV）反応（卵黄反
応）： レシト・ビテリン寒天培地（Billing and
Luckhurst：J.appl.Bact.20巻、90頁）に菌
を接種し、２日目になると生育した菌の周辺
は透明になり、真珠様層が認められた。LV
反応は、陽性である。 以上の性状を要約すると、BMF673−RFI株は
通性嫌気性のグラム陽性の有芽胞桿菌で、周鞭毛
を有し、運動性を示す。芽胞は卵円形で中立
（Central）、耐熱性である。菌体の膨隆は認めら
れず、非抗酸性である。寒天培地での生育は不透
明で、辺縁は不規則、接種線に沿つて一様に生育
し、のちに、培地表面にわずかにひろがつて増殖
する。ゼラチンを液化し、ミルクを凝固、ペプト
ン化する。硝酸塩を還元し、脱窒反応陰性、MR
テスト陰性、Ｖ−Ｐテスト陽性である。インドー
ルは検出されず、硫化水素を生成しない。デンプ
ンを分解し、クエン酸を利用する。 ウレアーゼ反応陰性、オキシダーゼ反応陰性、
カタラーゼ反応陽性である。PH4.4〜8.8の範囲で
生育し、最適PHは、7.0〜8.0である。また、10℃
〜45℃の範囲で生育し、最適温度は24℃〜30℃で
ある。ブドウ糖を発酵的に分解し、酸を生成す
る。糖類からの酸の生成は、Ｌ−アラビノス、Ｄ
−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトー
ス、麦芽糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビツ
ト、イノシツト、Ｄ−マンニツト、グリセリン、
デンプンからすべてみとめられない。ガスの生成
は、いずれの糖からも認められない。リゾチーム
には抵抗性で、レシトビテリン（卵黄）反応は陽
性である。 以上の性状をもとにBMF673−RFI株を
Bergcy′s Manual of Determinative
Bacteriology 8thedition（R.E.Buchanan＆N.E.
Gibbons，The Williams＆Wilkins Company，
Baltimore，1974）で検索すると、531頁のバチル
ス（Bacillus）属に属すると考えられる。更に、
種を検索すると、グルコースからアセトインを生
成し、芽胞形成時の菌体の膨隆が認められずＬ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニツト
から酸を生成しない種、すなわちBacillus
Cereus，B.Thuringiensis，B.megaterium等が近
縁のものと思われる。このうち、B.
Thuringiensisは昆虫の病源菌である（前記の
Bergcy′s Manualの536ページ参照）ことから、
BMF673−RFI株と明確に区別される。BMF673
−RFI株の性状と、B.Cereus及びB.megaterium
の文献上の記載を比較すると次表のようになる。
(18) リゾチーム感受性 基礎培地（ペプトン10ｇ、牛肉エキス10
ｇ、NaCl5ｇ，PH7.4）に、別に滅菌したリ
ゾチームを0.001％になるように加え、
BMF673−RFI株を接種し、ロータリー・シ
エーカ−（180r・ｐ・m.）で30℃、24時間振
とう培養を行い、菌の増殖を認めた。 (19) レシトビテリン（LV）反応（卵黄反
応）： レシト・ビテリン寒天培地（Billing and
Luckhurst：J.appl.Bact.20巻、90頁）に菌
を接種し、２日目になると生育した菌の周辺
は透明になり、真珠様層が認められた。LV
反応は、陽性である。 以上の性状を要約すると、BMF673−RFI株は
通性嫌気性のグラム陽性の有芽胞桿菌で、周鞭毛
を有し、運動性を示す。芽胞は卵円形で中立
（Central）、耐熱性である。菌体の膨隆は認めら
れず、非抗酸性である。寒天培地での生育は不透
明で、辺縁は不規則、接種線に沿つて一様に生育
し、のちに、培地表面にわずかにひろがつて増殖
する。ゼラチンを液化し、ミルクを凝固、ペプト
ン化する。硝酸塩を還元し、脱窒反応陰性、MR
テスト陰性、Ｖ−Ｐテスト陽性である。インドー
ルは検出されず、硫化水素を生成しない。デンプ
ンを分解し、クエン酸を利用する。 ウレアーゼ反応陰性、オキシダーゼ反応陰性、
カタラーゼ反応陽性である。PH4.4〜8.8の範囲で
生育し、最適PHは、7.0〜8.0である。また、10℃
〜45℃の範囲で生育し、最適温度は24℃〜30℃で
ある。ブドウ糖を発酵的に分解し、酸を生成す
る。糖類からの酸の生成は、Ｌ−アラビノス、Ｄ
−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトー
ス、麦芽糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビツ
ト、イノシツト、Ｄ−マンニツト、グリセリン、
デンプンからすべてみとめられない。ガスの生成
は、いずれの糖からも認められない。リゾチーム
には抵抗性で、レシトビテリン（卵黄）反応は陽
性である。 以上の性状をもとにBMF673−RFI株を
Bergcy′s Manual of Determinative
Bacteriology 8thedition（R.E.Buchanan＆N.E.
Gibbons，The Williams＆Wilkins Company，
Baltimore，1974）で検索すると、531頁のバチル
ス（Bacillus）属に属すると考えられる。更に、
種を検索すると、グルコースからアセトインを生
成し、芽胞形成時の菌体の膨隆が認められずＬ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニツト
から酸を生成しない種、すなわちBacillus
Cereus，B.Thuringiensis，B.megaterium等が近
縁のものと思われる。このうち、B.
Thuringiensisは昆虫の病源菌である（前記の
Bergcy′s Manualの536ページ参照）ことから、
BMF673−RFI株と明確に区別される。BMF673
−RFI株の性状と、B.Cereus及びB.megaterium
の文献上の記載を比較すると次表のようになる。
【表】
【表】
表から明らかなように、BMF673−RFI株は嫌
気培養でも生育し、レシトビテリン反応が陽性、
リゾチームに抵抗性であるという点でB.
megateriumとは異なり、一方、B.Cereusとは極
めて類似した性状を示している。 従つて、BMF673−RFI株をバチルス・セレウ
ス（Bacillus Cereus）BMF673−RFIと同定し
た。 次に、本発明の方法を具体的に説明する。 本発明の方法を実施するに当つて、ジプロチン
生産菌を培養するのに用いる栄養源としては、細
菌の栄養源として公知のものを適宜使用できる。
例えば、市販されているグリセリン、グルコー
ス、ラクトース、シユクロース、デンプン、マル
トース、糖蜜などの炭水化物、脂肪などを炭素源
として、市販されているペプトン、肉エキス、コ
ーン・ステイープ・リカー、綿実粉、落花生粉、
大豆粉、コーン・グルテンミール、魚粉、酵母エ
キス、Ｎ−Ｚアミン、カゼイン、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを
窒素源として、食塩、リン酸塩、炭酸カルシウ
ム、硫酸マグネシウムなどを無機の栄養源とし
て、それぞれ使用できる。特に好ましい培地成分
としては、炭素源としてグリセリン、ポテト・ス
ターチ、グルコースなど、窒素源として、ポリペ
プトン、肉エキスなどがある。ポリペプトン0.5
％、グルコース1.0％、ポテトスターチ1.0％、グ
リセリン1.0％、肉エキス0.5％、食塩0.5％、炭酸
カルシウム0.32％、消泡剤KM70（信越化学社
製）0.01％を含む培地などを用いるのが好まし
い。 ジプロチンの大量生産には液体培養が好まし
い。培養温度としては、ジプロチン生産菌が発育
し、ジプロチンを生産する範囲の温度が適用し得
るが、特に好ましい温度は25〜35℃である。培養
は、普通は、本物質が培養物中に生産され充分に
蓄積するまで継続される。 例えば、ポリペプトン0.5％、グルコース1.0
％、ポテトスターチ1.0％、グリセリン1.0％、肉
エキス0.5％、食塩0.5％、炭酸カルシウム0.32
％、消泡剤KM70（登録商標）0.01％を含む培地
を滅菌したのち、これにジプロチン生産菌の斜面
培養物の一白耳を接種し、27℃で好気的に振盪培
養を行なつたところ、培養24時間後から150時間
後にジプロチンの蓄積が認められた。ジプロチン
は、タルク培養法でも振盪培養法と同様によく生
産される。例えば、200の醗酵槽に100の培地
を入れて滅菌し、あらかじめ培養した種培養液を
３接種し、毎分80の無菌空気を通気し、毎分
250回転で撹拌した。この条件で本物質の生産は
65時間で最高に達した。 ジプロチンの培養工程ならびに精製工程中での
追跡は、次の方法による抗ジペプチジルアミノペ
プチダーゼ活性の測定に基づいて行なつた。抗
ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性の測定
は、YA（H.YA，I.NAGATSU，T.
NAGATSU，Biochimica et Biophysica Acta
258，591，1972）記載の方法の改良法で行つた。
即ち、0.002Mグリシルプロリン−β−ナフチル
アミド0.2mlに0.1Mトリス−マレイン酸緩衝液
（PH7.2）0.5ml、検体を含む溶液0.25mlを加えた混
合溶液を37℃３分間加温した後、YAらの方法
による酵素の精製法で、ラツト腎より、硫安分画
法（55〜80％飽和）で精製したジペプチジルアミ
ノペプチダーゼの溶液を50μｌ加え37℃30分間
反応したのち、１mg／mlの濃度にフアーストガー
ネツトGBCを含み、10％の濃度に界面活性剤ツ
イーン20（Tween20）を含む1.0M酢酸緩衝液
（PH4.2）１mlを加え、室温に15分放置後525nmに
おける吸光度ａを測定した。同時にジプロチンを
含まない緩衝液のみを用いた対照の吸光度ｂを測
定し、ジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害率
を、式〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×100により計算した。
この定量方法で1.1μｇ／mlのジプロチンＡ，ま
た55μｇ／mlのジプロチンＢはジペプチジルアミ
ノペプチダーゼを50％阻害（IC50）した。 ジプロチンＡ，Ｂは、ジプロチン生産菌の培養
液中及び菌体中に存在する。ジプロチンを培養物
から採取するに当つては、培養液から吸着剤に
吸着および脱離させる方法で好収率で採取でき
る。吸着剤としては、活性炭、イオン交換樹脂な
どが使用できる。例えばジプロチンは、活性炭に
吸着され、90％メタノール水（塩酸酸性PH２）で
溶出される。培養液の２％の活性炭を培養液に
入れ撹拌することによりジプロチンを吸着し、
過後活性炭を水洗し、用いた培養液の1/4量の
90％メタノール水（塩酸酸性PH２）で溶出され
る。培養液中のジプロチンは約50％溶出され
る。この90％メタノール水を、減圧濃縮すること
により粗物質を得ることができる。またイオン交
換体のクロマトグラフイーも精製に用いられる。
特にダウエツクス50Wのクロマトグラフイーが有
効であり、ピリジン−酢酸緩衝液で溶出すること
によりジプロチンＡおよびＢを相互に分離でき
る。 一方、ジプロチンＣの製造はＬ−イソロイシン
から出発して通常のペプチド合成法によつて行わ
れる。 すなわち、カルボキシル基をベンジル基で保護
したＬ−イソロイシン（Ile−OBzl）を、アミノ
基をｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）で保護し
たＬ−プロリン（Boc−Pro）とラセミ化防止剤
例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（HOBT）の存在下で活性エステル化剤例えばジ
シクロヘキシルカルボシイミド（DCC）を用い
て縮合させる。反応生成物として得たジペプチド
（Boc−Pro−Ile−OBzl）のアミノ末端の保護基
（Bec）をトリフルオル酢酸ではづした後、これ
に、アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保
護したＬ−バリン（Ｚ−Val）を同様のペプチド
合成法で縮合する。得られたトリペプチド反応生
成物（Ｚ−Val−Pro−Ile−OBzl）を、接触還元
することにより保護基（Ｚ及びBzl）を脱離する
と、ジプロチンＣが得られる（実施例３参照）。 本発明のジプロチンの生物活性について、その
薬理作用を検討した。その結果、ジプロチンＡ，
Ｂ，Ｃは細胞性免疫に対する増強作用を有してい
ることが見出された。 本発明のジプロチンの細胞性免疫賦活活性につ
いて試験例を挙げて説明する。 試験例 １ 本例は、正常マウスにおける細胞性免疫に及ぼ
す効果を示す。細胞性免疫に及ぼすジプロチンＡ
の作用を、羊赤色球（SRBCと略す）を抗原とし
てマウス足蹠に接種して得られる遅延型過敏症
（Ｄ・Ｔ・Ｈと略す）を指標（参考文献J.Exp.
Med139，1529〜1539，1974）として検討した。 即ち、SRBC 108個を0.05mlの生理食塩水に浮
遊させた懸濁液をJCL：ICR（雄性、６週令）マ
ウスの足蹠皮下に接種し、これと同時にジプロチ
ンＡを0.8mg／Kg，0.2mg／Kg，0.05mg／Kg，
0.0125mg／Kg，0.00313mg／Kgの投与量でジプロ
チンＡ生理食塩水溶液の形で１回、腹腔内投与し
た。投与４日後、他の一方の足蹠にSRBC 108個
を0.05mlの生理食塩水に浮遊させた懸濁液を皮下
投与して二次感作させた。その24時間後、その足
蹠にみられる腫脹度（足蹠の厚さの増加）をキヤ
リパスで測定した。供試化合物を投与しないで
SRBC及び生理食塩水の皮下注射を受けた対照動
物の足蹠肥厚度を100％と評価し、これと処理し
た供試動物の足蹠肥厚度を比較することにより供
試化合物の細胞性免疫増強効果を判定した。ジプ
ロチンＢ及びＣについても同様に試験した。試験
結果を第１表に示す。
気培養でも生育し、レシトビテリン反応が陽性、
リゾチームに抵抗性であるという点でB.
megateriumとは異なり、一方、B.Cereusとは極
めて類似した性状を示している。 従つて、BMF673−RFI株をバチルス・セレウ
ス（Bacillus Cereus）BMF673−RFIと同定し
た。 次に、本発明の方法を具体的に説明する。 本発明の方法を実施するに当つて、ジプロチン
生産菌を培養するのに用いる栄養源としては、細
菌の栄養源として公知のものを適宜使用できる。
例えば、市販されているグリセリン、グルコー
ス、ラクトース、シユクロース、デンプン、マル
トース、糖蜜などの炭水化物、脂肪などを炭素源
として、市販されているペプトン、肉エキス、コ
ーン・ステイープ・リカー、綿実粉、落花生粉、
大豆粉、コーン・グルテンミール、魚粉、酵母エ
キス、Ｎ−Ｚアミン、カゼイン、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを
窒素源として、食塩、リン酸塩、炭酸カルシウ
ム、硫酸マグネシウムなどを無機の栄養源とし
て、それぞれ使用できる。特に好ましい培地成分
としては、炭素源としてグリセリン、ポテト・ス
ターチ、グルコースなど、窒素源として、ポリペ
プトン、肉エキスなどがある。ポリペプトン0.5
％、グルコース1.0％、ポテトスターチ1.0％、グ
リセリン1.0％、肉エキス0.5％、食塩0.5％、炭酸
カルシウム0.32％、消泡剤KM70（信越化学社
製）0.01％を含む培地などを用いるのが好まし
い。 ジプロチンの大量生産には液体培養が好まし
い。培養温度としては、ジプロチン生産菌が発育
し、ジプロチンを生産する範囲の温度が適用し得
るが、特に好ましい温度は25〜35℃である。培養
は、普通は、本物質が培養物中に生産され充分に
蓄積するまで継続される。 例えば、ポリペプトン0.5％、グルコース1.0
％、ポテトスターチ1.0％、グリセリン1.0％、肉
エキス0.5％、食塩0.5％、炭酸カルシウム0.32
％、消泡剤KM70（登録商標）0.01％を含む培地
を滅菌したのち、これにジプロチン生産菌の斜面
培養物の一白耳を接種し、27℃で好気的に振盪培
養を行なつたところ、培養24時間後から150時間
後にジプロチンの蓄積が認められた。ジプロチン
は、タルク培養法でも振盪培養法と同様によく生
産される。例えば、200の醗酵槽に100の培地
を入れて滅菌し、あらかじめ培養した種培養液を
３接種し、毎分80の無菌空気を通気し、毎分
250回転で撹拌した。この条件で本物質の生産は
65時間で最高に達した。 ジプロチンの培養工程ならびに精製工程中での
追跡は、次の方法による抗ジペプチジルアミノペ
プチダーゼ活性の測定に基づいて行なつた。抗
ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性の測定
は、YA（H.YA，I.NAGATSU，T.
NAGATSU，Biochimica et Biophysica Acta
258，591，1972）記載の方法の改良法で行つた。
即ち、0.002Mグリシルプロリン−β−ナフチル
アミド0.2mlに0.1Mトリス−マレイン酸緩衝液
（PH7.2）0.5ml、検体を含む溶液0.25mlを加えた混
合溶液を37℃３分間加温した後、YAらの方法
による酵素の精製法で、ラツト腎より、硫安分画
法（55〜80％飽和）で精製したジペプチジルアミ
ノペプチダーゼの溶液を50μｌ加え37℃30分間
反応したのち、１mg／mlの濃度にフアーストガー
ネツトGBCを含み、10％の濃度に界面活性剤ツ
イーン20（Tween20）を含む1.0M酢酸緩衝液
（PH4.2）１mlを加え、室温に15分放置後525nmに
おける吸光度ａを測定した。同時にジプロチンを
含まない緩衝液のみを用いた対照の吸光度ｂを測
定し、ジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害率
を、式〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×100により計算した。
この定量方法で1.1μｇ／mlのジプロチンＡ，ま
た55μｇ／mlのジプロチンＢはジペプチジルアミ
ノペプチダーゼを50％阻害（IC50）した。 ジプロチンＡ，Ｂは、ジプロチン生産菌の培養
液中及び菌体中に存在する。ジプロチンを培養物
から採取するに当つては、培養液から吸着剤に
吸着および脱離させる方法で好収率で採取でき
る。吸着剤としては、活性炭、イオン交換樹脂な
どが使用できる。例えばジプロチンは、活性炭に
吸着され、90％メタノール水（塩酸酸性PH２）で
溶出される。培養液の２％の活性炭を培養液に
入れ撹拌することによりジプロチンを吸着し、
過後活性炭を水洗し、用いた培養液の1/4量の
90％メタノール水（塩酸酸性PH２）で溶出され
る。培養液中のジプロチンは約50％溶出され
る。この90％メタノール水を、減圧濃縮すること
により粗物質を得ることができる。またイオン交
換体のクロマトグラフイーも精製に用いられる。
特にダウエツクス50Wのクロマトグラフイーが有
効であり、ピリジン−酢酸緩衝液で溶出すること
によりジプロチンＡおよびＢを相互に分離でき
る。 一方、ジプロチンＣの製造はＬ−イソロイシン
から出発して通常のペプチド合成法によつて行わ
れる。 すなわち、カルボキシル基をベンジル基で保護
したＬ−イソロイシン（Ile−OBzl）を、アミノ
基をｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）で保護し
たＬ−プロリン（Boc−Pro）とラセミ化防止剤
例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（HOBT）の存在下で活性エステル化剤例えばジ
シクロヘキシルカルボシイミド（DCC）を用い
て縮合させる。反応生成物として得たジペプチド
（Boc−Pro−Ile−OBzl）のアミノ末端の保護基
（Bec）をトリフルオル酢酸ではづした後、これ
に、アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保
護したＬ−バリン（Ｚ−Val）を同様のペプチド
合成法で縮合する。得られたトリペプチド反応生
成物（Ｚ−Val−Pro−Ile−OBzl）を、接触還元
することにより保護基（Ｚ及びBzl）を脱離する
と、ジプロチンＣが得られる（実施例３参照）。 本発明のジプロチンの生物活性について、その
薬理作用を検討した。その結果、ジプロチンＡ，
Ｂ，Ｃは細胞性免疫に対する増強作用を有してい
ることが見出された。 本発明のジプロチンの細胞性免疫賦活活性につ
いて試験例を挙げて説明する。 試験例 １ 本例は、正常マウスにおける細胞性免疫に及ぼ
す効果を示す。細胞性免疫に及ぼすジプロチンＡ
の作用を、羊赤色球（SRBCと略す）を抗原とし
てマウス足蹠に接種して得られる遅延型過敏症
（Ｄ・Ｔ・Ｈと略す）を指標（参考文献J.Exp.
Med139，1529〜1539，1974）として検討した。 即ち、SRBC 108個を0.05mlの生理食塩水に浮
遊させた懸濁液をJCL：ICR（雄性、６週令）マ
ウスの足蹠皮下に接種し、これと同時にジプロチ
ンＡを0.8mg／Kg，0.2mg／Kg，0.05mg／Kg，
0.0125mg／Kg，0.00313mg／Kgの投与量でジプロ
チンＡ生理食塩水溶液の形で１回、腹腔内投与し
た。投与４日後、他の一方の足蹠にSRBC 108個
を0.05mlの生理食塩水に浮遊させた懸濁液を皮下
投与して二次感作させた。その24時間後、その足
蹠にみられる腫脹度（足蹠の厚さの増加）をキヤ
リパスで測定した。供試化合物を投与しないで
SRBC及び生理食塩水の皮下注射を受けた対照動
物の足蹠肥厚度を100％と評価し、これと処理し
た供試動物の足蹠肥厚度を比較することにより供
試化合物の細胞性免疫増強効果を判定した。ジプ
ロチンＢ及びＣについても同様に試験した。試験
結果を第１表に示す。
【表】
以上の結果より、ジプロチンＡ，Ｂ，Ｃは正常
動物の細胞性免疫能を増強する物質であると認め
られた。従つて本発明により得られた化合物は、
免疫増強剤として有用である。また抗腫瘍免疫賦
活剤として、各種癌化学療法剤の補助薬として有
用性をもつ。 マウスに対する急性毒性試験では、ジプロチン
Ａの500mg／Kgをマウスに静脈内投与しても、ま
たジプロチンＢおよびＣの500mg／Kgをマウスに
静脈内投与しても死亡例は認められない。従つて
ジプロチンは毒性の低い物質であると認められ
る。 ジプロチンを有効成分とする上記薬剤として
は、ジプロチンあるいはその薬学的に許容される
塩又はエステルのいづれかを常用の担体と配合し
て製剤でき、更には各種の化学療法剤と混合した
ものでもよい。ジプロチンの塩の例としては、ジ
プロチンのカルボキシル基における薬学的に許容
できる陽イオン、例えばナトリウム、カリウムの
ごときアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム
の如きアルカリ土類金属の陽イオンがある。ジプ
ロチンのアミノ基における薬学的に許容できる無
機塩例えば塩酸塩など又は有機酸、例えば酢酸な
どとの酸付加塩も包含される。エステルとして
は、アルキルエステルあるいは生体内で代謝、分
解し易いアセトキシメチル・エステル、ピバロイ
ルオキシメチルエステル等がある。 本発明の化合物ないし薬剤の投与形態は、経
口、注射、直腸坐剤のいずれでもよい。注射剤を
調製する場合は、上記有効成分化合物にPH調整
剤、緩衝剤、安定化剤、賦形剤を添加し常法によ
り、凍結乾燥を行ない、凍結乾燥注射剤を作るこ
とができ、また有効成分化合物に、PH調整剤、緩
衝剤、安定化剤、等張剤、局麻剤等を添加し、常
法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤を作ること
もできる。経口用固形製剤を調整する場合は、有
効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応じて結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤を
加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、
散剤、カプセル剤等を作ることができる。経口液
状製剤を調製する場合には、有効成分化合物に、
矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、
常法によりシロツプ剤およびドライシロツプ剤を
作ることができる。直腸坐薬製剤を調製する場合
には、有効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応
じて、界面活性剤を加えた後、常法により坐剤と
することができる。 ジプロチンの投与量は症状により異なるが、成
人では１回ジプロチンとして0.02〜200mgを１日
１回投与するのがよい。又、癌化学療法剤または
免疫増強剤と併用するときは、癌化学療法剤また
は免疫増強剤の通常の使用量に、上記の範囲内の
量のジプロチンを併用すればよい。 次に、本発明のジプロチンの製造に関して、実
施例を示すが、本物質の理化学的性状ならびに生
産方法、その精製法が本発明者らによつて明らか
にされたので、本明細書に示された方法を修飾す
ることは容易であり、本発明は以下に記載する実
施例のみに限定されるものではない。例えば、本
明細書では、ジプロチンＡおよびＢの醗酵的製造
法を示したが、これらの化学的合成も可能であ
り、例えばＬ−イソロイシンから出発して公知の
ペプチド合成法を適宜使用することにより、きわ
めて容易に合成できる。 実施例 １ ジプロチン生産菌としてバチルス・セレウス
BMF673−RFI株（微工研菌寄第6623号）の斜面
培養から一白金耳を、あらかじめ120℃，20分間
滅菌した培地（500mlのロータリーフラスコに110
mlづつ分注したポリペプトン0.5％、グルコース
１％、ポテトスターチ１％、グリセリン１％、肉
エキス0.5％、食塩0.5％、炭酸カルシウム0.32
％、消泡剤（KM−70）0.01％からなる）に接種
した。27℃、毎分180回転の培養条件で経時的に
ジプロチン産生量を検討した。その結果、培養48
時間後、ジプロチン産生量は、プラトーに達し、
以後培養６日目まで、ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼの阻害活性により定量したジプロチン濃
度は減少しなかつた。 実施例 ２ 実施例１と同様の培地と培養条件でBMF673−
RFI株を培養して得られた培養液46を連続遠心
分離機にかけ45の上澄液を得た。この上澄液の
ジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害活性
（IC50）は39μｌ／mlであつた。 得られた培養上澄液45に、活性炭900ｇを入
れ撹拌し、吸着させ、活性炭を紙で過し水洗
後PH２の塩酸酸性下で90％メタノール水10で溶
出した。この溶出液を減圧下で濃縮した。この濃
縮液を水でうすめ２とし、ダウエツクス50W
（H+型）1.4のカラムに吸着させ、水洗後1Nア
ンモニア水で溶出した。溶出後を減圧下で濃縮乾
固することにより56ｇの粗粉末を得た。この粗粉
末のジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害活性
（IC50）は143μｇ／mlであつた。 得られた粗粉末を、２のPH3.2の0.2Mピリジ
ン−酢酸緩衝液に溶かし、酢酸を加えPH3.2とし
た。あらかじめ同緩衝液で平衡化したダウエツク
ス50W（ピリジニウム型、×４，100〜200メツシ
ユ）1.4のカラムに吸着させ、同緩衝液で溶出
した。活性分画を減圧下に濃縮乾固し9.8ｇの粗
粉末を得た。この粗粉末のジペプチジルアミノペ
プチダーゼ阻害活性（IC50）は、67μｇ／mlで
あつた。次にこの粗粉末を50mlの水に溶かし、
1.6のセフアデツクスG25のカラムにかけ、水
で展開した。活性分画を減圧下に濃縮乾固し、粗
粉末2.67ｇ（ジペプチジルアミノペプチダーゼ
阻害活性IC50＝20μｇ／ml）を得た。 この粗粉末2.67ｇを10mlの28％アンモニア水に
溶かし、アンモニア水の50倍量のエタノールを加
えて、300mlのシリカゲルに吸着させ、エタノー
ル：28％アンモニア水（50：１）の混液で展開し
活性分画を減圧下に濃縮乾固することにより、粗
粉末620mg（ジペプチジルアミノペプチダーゼ
阻害活性IC50＝5.75μｇ／ml）を得た。次にこの
粗粉末を30mlの0.2Mピリジン−酢酸緩衝液（PH
3.2）に溶かし、酢酸を加え、PH3.2とし、あらか
じめ同緩衝液で平衡化したダウエツクス50W（ピ
リジニウム型、×４，100〜200メツシユ）500mlの
カラムにかけ同緩衝液で展開することにより、２
つの活性分画を得た。先に溶出される活性分画を
濃縮乾固することにより、220mg（ジペプチジル
アミノペプチダーゼ阻害活性IC50＝7.5μｇ／
ml）のジプロチンＢの粗粉末を、後に溶出される
活性分画を濃縮乾固することにより、110mg（ジ
ペプチジルアミノペプチダーゼ阻害活性IC50＝
６μｇ／ml）のジプロチンＡの粗粉末を得た。 得られたジプロチンＡとＢの粗粉末をそれぞれ
10mlの水を加え、溶かしシリカゲル５ｇを加えて
減圧下に乾固し、それぞれ50mlのシリカゲルカラ
ムにかけて、クロロホルム：メタノール：酢酸：
水（60：８：２：１）の混液で展開し、それぞれ
の活性分画を減圧下に濃縮乾固することにより、
ジプロチンＡの粗粉末43.6mg（IC50＝1.4μｇ／
ml）とジプロチンＢの粗粉末145.5mg（IC50＝5.5
μｇ／ml）を得た。 得られたジプロチンＡとＢの粗粉末をそれぞれ
４mlのPH3.2の0.2Mピリジン−酢酸緩衝液に溶か
し、酢酸でPH3.2とし、それぞれ50mlのあらかじ
め同緩衝液で平衡化したダウエツクス50W（ピリ
ジニウム型、×４，100〜200メツシユ）のカラム
にかけ同緩衝液で展開し、活性分画をそれぞれ減
圧下に濃縮乾固することにより、純粋のプロチン
Ａの白色粉末22.5mg（ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ阻害活性IC50＝1.1μｇ／mlと、純粋の
ジプロチンＢの白色粉末64.8mg（ジペプチジルア
ミノペプチダーゼ阻害活性IC50＝5.5μｇ／
ml）を得た。 実施例 ３ (イ) 1.967ｇのＬ−イソロイシンベンジルエステ
ルトシル酸塩（蛋白質研究奨励会製）をジクロ
ルメタン50mlに溶かし、氷冷下にトリエチルア
ミン0.7mlを加え、次いで1.076ｇのｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｌ−プロリン（蛋白質研究奨励
会製）と1.02ｇの１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（蛋白質研究奨励会製）、そして1.24ｇ
のジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、氷
冷下で２時間反応した後、室温で14時間さらに
反応させた。反応液を濃縮した後、再び酢酸エ
チル200mlを加え溶解し、それぞれ200mlづつの
10％クエン酸、水、４％の炭酸水素ナトリウム
水、水で順次洗滌した。洗滌後、酢酸エチル層
に無水硫酸ナトリウムを加え、脱水した後、硫
酸ナトリウムを除去し、減圧下に濃縮して２ｇ
のｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−イソロイシンベンジルエステルを得た。 (ロ) 前項で得られた上記の物質２ｇにトリフルオ
ル酢酸10mlを加え室温で30分放置後減圧下に濃
縮後ジクロルメタンを加え減圧下に濃縮するこ
とにより残存のトリフルオル酢酸を溜去し2.8
ｇの飴状物質を得た。これを水150mlとエタノ
ール150mlの混液に溶かし、ダウエツクス
（（Cl-型、×４，100〜200メツシユ）100mlの
カラムを通過させた後水洗した。通過液と水洗
液をあわせて凍結乾燥し1.67ｇのＬ−プロリル
−Ｌ−イソロイシルベンジルエステル・塩酸塩
を得た。 (ハ) 前項で得られた反応生成物683mgをとり、ジ
クロルメタン20mlに溶解し、氷冷下にトリエチ
ルアミン0.27mlと483mgのカルボベンゾキシ−
Ｌ−バリン（蛋白質研究会製）を加え392mgの
１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと480mgの
ジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、氷冷
下に２時間反応した後室温でさらに14時間反応
した。反応液を減圧下に濃縮し、再び酢酸エチ
ル200mlに溶解し、それぞれ200mlの0.1N塩
酸、水、４％炭酸水素ナトリウム水、水で、順
次洗滌した。洗滌後酢酸エチル層に、無水硫酸
ナトリウムを加えて脱水し、減圧下に濃縮乾固
して、1.0ｇのカルボベンゾキシ−Ｌ−バリル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−イソロイシンベンジルエ
ステルを得た。 (ニ) 前項で得られた反応生成物700mgを酢酸3.5
ml、水10mlおよびメタノール５mlの混液に溶解
し、500mgの10％パラジウム炭素（川研フアイ
ンケミカル社製）を加え、常圧で３時間水素ガ
ス気流中で接解還元した後、過し液を減圧
下に濃縮乾固した。これを100mlの水に溶解
し、ダウエツクス50W（H+型、×４，100−200
メツシユ）40mlに吸着させ1Nのアンモニア水
で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固し271
mgの純粋のＬ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−イ
ソロイシン（Val−Pro−I1e）即ちジプロチン
Ｃの結晶性白色粉末を得た。 このジプロチンＣのジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ阻害活性（IC50）は1.9μｇ／mlであつた。
動物の細胞性免疫能を増強する物質であると認め
られた。従つて本発明により得られた化合物は、
免疫増強剤として有用である。また抗腫瘍免疫賦
活剤として、各種癌化学療法剤の補助薬として有
用性をもつ。 マウスに対する急性毒性試験では、ジプロチン
Ａの500mg／Kgをマウスに静脈内投与しても、ま
たジプロチンＢおよびＣの500mg／Kgをマウスに
静脈内投与しても死亡例は認められない。従つて
ジプロチンは毒性の低い物質であると認められ
る。 ジプロチンを有効成分とする上記薬剤として
は、ジプロチンあるいはその薬学的に許容される
塩又はエステルのいづれかを常用の担体と配合し
て製剤でき、更には各種の化学療法剤と混合した
ものでもよい。ジプロチンの塩の例としては、ジ
プロチンのカルボキシル基における薬学的に許容
できる陽イオン、例えばナトリウム、カリウムの
ごときアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム
の如きアルカリ土類金属の陽イオンがある。ジプ
ロチンのアミノ基における薬学的に許容できる無
機塩例えば塩酸塩など又は有機酸、例えば酢酸な
どとの酸付加塩も包含される。エステルとして
は、アルキルエステルあるいは生体内で代謝、分
解し易いアセトキシメチル・エステル、ピバロイ
ルオキシメチルエステル等がある。 本発明の化合物ないし薬剤の投与形態は、経
口、注射、直腸坐剤のいずれでもよい。注射剤を
調製する場合は、上記有効成分化合物にPH調整
剤、緩衝剤、安定化剤、賦形剤を添加し常法によ
り、凍結乾燥を行ない、凍結乾燥注射剤を作るこ
とができ、また有効成分化合物に、PH調整剤、緩
衝剤、安定化剤、等張剤、局麻剤等を添加し、常
法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤を作ること
もできる。経口用固形製剤を調整する場合は、有
効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応じて結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤を
加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、
散剤、カプセル剤等を作ることができる。経口液
状製剤を調製する場合には、有効成分化合物に、
矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、
常法によりシロツプ剤およびドライシロツプ剤を
作ることができる。直腸坐薬製剤を調製する場合
には、有効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応
じて、界面活性剤を加えた後、常法により坐剤と
することができる。 ジプロチンの投与量は症状により異なるが、成
人では１回ジプロチンとして0.02〜200mgを１日
１回投与するのがよい。又、癌化学療法剤または
免疫増強剤と併用するときは、癌化学療法剤また
は免疫増強剤の通常の使用量に、上記の範囲内の
量のジプロチンを併用すればよい。 次に、本発明のジプロチンの製造に関して、実
施例を示すが、本物質の理化学的性状ならびに生
産方法、その精製法が本発明者らによつて明らか
にされたので、本明細書に示された方法を修飾す
ることは容易であり、本発明は以下に記載する実
施例のみに限定されるものではない。例えば、本
明細書では、ジプロチンＡおよびＢの醗酵的製造
法を示したが、これらの化学的合成も可能であ
り、例えばＬ−イソロイシンから出発して公知の
ペプチド合成法を適宜使用することにより、きわ
めて容易に合成できる。 実施例 １ ジプロチン生産菌としてバチルス・セレウス
BMF673−RFI株（微工研菌寄第6623号）の斜面
培養から一白金耳を、あらかじめ120℃，20分間
滅菌した培地（500mlのロータリーフラスコに110
mlづつ分注したポリペプトン0.5％、グルコース
１％、ポテトスターチ１％、グリセリン１％、肉
エキス0.5％、食塩0.5％、炭酸カルシウム0.32
％、消泡剤（KM−70）0.01％からなる）に接種
した。27℃、毎分180回転の培養条件で経時的に
ジプロチン産生量を検討した。その結果、培養48
時間後、ジプロチン産生量は、プラトーに達し、
以後培養６日目まで、ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼの阻害活性により定量したジプロチン濃
度は減少しなかつた。 実施例 ２ 実施例１と同様の培地と培養条件でBMF673−
RFI株を培養して得られた培養液46を連続遠心
分離機にかけ45の上澄液を得た。この上澄液の
ジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害活性
（IC50）は39μｌ／mlであつた。 得られた培養上澄液45に、活性炭900ｇを入
れ撹拌し、吸着させ、活性炭を紙で過し水洗
後PH２の塩酸酸性下で90％メタノール水10で溶
出した。この溶出液を減圧下で濃縮した。この濃
縮液を水でうすめ２とし、ダウエツクス50W
（H+型）1.4のカラムに吸着させ、水洗後1Nア
ンモニア水で溶出した。溶出後を減圧下で濃縮乾
固することにより56ｇの粗粉末を得た。この粗粉
末のジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害活性
（IC50）は143μｇ／mlであつた。 得られた粗粉末を、２のPH3.2の0.2Mピリジ
ン−酢酸緩衝液に溶かし、酢酸を加えPH3.2とし
た。あらかじめ同緩衝液で平衡化したダウエツク
ス50W（ピリジニウム型、×４，100〜200メツシ
ユ）1.4のカラムに吸着させ、同緩衝液で溶出
した。活性分画を減圧下に濃縮乾固し9.8ｇの粗
粉末を得た。この粗粉末のジペプチジルアミノペ
プチダーゼ阻害活性（IC50）は、67μｇ／mlで
あつた。次にこの粗粉末を50mlの水に溶かし、
1.6のセフアデツクスG25のカラムにかけ、水
で展開した。活性分画を減圧下に濃縮乾固し、粗
粉末2.67ｇ（ジペプチジルアミノペプチダーゼ
阻害活性IC50＝20μｇ／ml）を得た。 この粗粉末2.67ｇを10mlの28％アンモニア水に
溶かし、アンモニア水の50倍量のエタノールを加
えて、300mlのシリカゲルに吸着させ、エタノー
ル：28％アンモニア水（50：１）の混液で展開し
活性分画を減圧下に濃縮乾固することにより、粗
粉末620mg（ジペプチジルアミノペプチダーゼ
阻害活性IC50＝5.75μｇ／ml）を得た。次にこの
粗粉末を30mlの0.2Mピリジン−酢酸緩衝液（PH
3.2）に溶かし、酢酸を加え、PH3.2とし、あらか
じめ同緩衝液で平衡化したダウエツクス50W（ピ
リジニウム型、×４，100〜200メツシユ）500mlの
カラムにかけ同緩衝液で展開することにより、２
つの活性分画を得た。先に溶出される活性分画を
濃縮乾固することにより、220mg（ジペプチジル
アミノペプチダーゼ阻害活性IC50＝7.5μｇ／
ml）のジプロチンＢの粗粉末を、後に溶出される
活性分画を濃縮乾固することにより、110mg（ジ
ペプチジルアミノペプチダーゼ阻害活性IC50＝
６μｇ／ml）のジプロチンＡの粗粉末を得た。 得られたジプロチンＡとＢの粗粉末をそれぞれ
10mlの水を加え、溶かしシリカゲル５ｇを加えて
減圧下に乾固し、それぞれ50mlのシリカゲルカラ
ムにかけて、クロロホルム：メタノール：酢酸：
水（60：８：２：１）の混液で展開し、それぞれ
の活性分画を減圧下に濃縮乾固することにより、
ジプロチンＡの粗粉末43.6mg（IC50＝1.4μｇ／
ml）とジプロチンＢの粗粉末145.5mg（IC50＝5.5
μｇ／ml）を得た。 得られたジプロチンＡとＢの粗粉末をそれぞれ
４mlのPH3.2の0.2Mピリジン−酢酸緩衝液に溶か
し、酢酸でPH3.2とし、それぞれ50mlのあらかじ
め同緩衝液で平衡化したダウエツクス50W（ピリ
ジニウム型、×４，100〜200メツシユ）のカラム
にかけ同緩衝液で展開し、活性分画をそれぞれ減
圧下に濃縮乾固することにより、純粋のプロチン
Ａの白色粉末22.5mg（ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ阻害活性IC50＝1.1μｇ／mlと、純粋の
ジプロチンＢの白色粉末64.8mg（ジペプチジルア
ミノペプチダーゼ阻害活性IC50＝5.5μｇ／
ml）を得た。 実施例 ３ (イ) 1.967ｇのＬ−イソロイシンベンジルエステ
ルトシル酸塩（蛋白質研究奨励会製）をジクロ
ルメタン50mlに溶かし、氷冷下にトリエチルア
ミン0.7mlを加え、次いで1.076ｇのｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｌ−プロリン（蛋白質研究奨励
会製）と1.02ｇの１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（蛋白質研究奨励会製）、そして1.24ｇ
のジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、氷
冷下で２時間反応した後、室温で14時間さらに
反応させた。反応液を濃縮した後、再び酢酸エ
チル200mlを加え溶解し、それぞれ200mlづつの
10％クエン酸、水、４％の炭酸水素ナトリウム
水、水で順次洗滌した。洗滌後、酢酸エチル層
に無水硫酸ナトリウムを加え、脱水した後、硫
酸ナトリウムを除去し、減圧下に濃縮して２ｇ
のｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−イソロイシンベンジルエステルを得た。 (ロ) 前項で得られた上記の物質２ｇにトリフルオ
ル酢酸10mlを加え室温で30分放置後減圧下に濃
縮後ジクロルメタンを加え減圧下に濃縮するこ
とにより残存のトリフルオル酢酸を溜去し2.8
ｇの飴状物質を得た。これを水150mlとエタノ
ール150mlの混液に溶かし、ダウエツクス
（（Cl-型、×４，100〜200メツシユ）100mlの
カラムを通過させた後水洗した。通過液と水洗
液をあわせて凍結乾燥し1.67ｇのＬ−プロリル
−Ｌ−イソロイシルベンジルエステル・塩酸塩
を得た。 (ハ) 前項で得られた反応生成物683mgをとり、ジ
クロルメタン20mlに溶解し、氷冷下にトリエチ
ルアミン0.27mlと483mgのカルボベンゾキシ−
Ｌ−バリン（蛋白質研究会製）を加え392mgの
１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと480mgの
ジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、氷冷
下に２時間反応した後室温でさらに14時間反応
した。反応液を減圧下に濃縮し、再び酢酸エチ
ル200mlに溶解し、それぞれ200mlの0.1N塩
酸、水、４％炭酸水素ナトリウム水、水で、順
次洗滌した。洗滌後酢酸エチル層に、無水硫酸
ナトリウムを加えて脱水し、減圧下に濃縮乾固
して、1.0ｇのカルボベンゾキシ−Ｌ−バリル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−イソロイシンベンジルエ
ステルを得た。 (ニ) 前項で得られた反応生成物700mgを酢酸3.5
ml、水10mlおよびメタノール５mlの混液に溶解
し、500mgの10％パラジウム炭素（川研フアイ
ンケミカル社製）を加え、常圧で３時間水素ガ
ス気流中で接解還元した後、過し液を減圧
下に濃縮乾固した。これを100mlの水に溶解
し、ダウエツクス50W（H+型、×４，100−200
メツシユ）40mlに吸着させ1Nのアンモニア水
で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固し271
mgの純粋のＬ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−イ
ソロイシン（Val−Pro−I1e）即ちジプロチン
Ｃの結晶性白色粉末を得た。 このジプロチンＣのジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ阻害活性（IC50）は1.9μｇ／mlであつた。
第１図はジプロチンＡの赤外部吸収スペクト
ル、第２図はジプロチンＢの赤外部吸収スペクト
ル、第３図はジプロチンＣの赤外部吸収スペクト
ルを示す。
ル、第２図はジプロチンＢの赤外部吸収スペクト
ル、第３図はジプロチンＣの赤外部吸収スペクト
ルを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中R1，R2およびR3は夫々に水素、メチル
基又はエチル基を示す）で表わされる抗ジペプチ
ジルアミノペプチダーゼ活性を有する新生理活
性物質ジプロチンまたはその塩又はエステル。 ２ 式 で表わされるジプロチンＡである特許請求の範囲
第１項記載の化合物。 ３ 式 で表わされるジプロチンＢである特許請求の範囲
第１項記載の化合物。 ４ 式 で表わされるジプロチンＣである特許請求の範囲
第１項記載の化合物。 ５ バチルス属に属するジプロチン生産菌を培養
して、ジプロチンＡ又はＢ、又はその両者を培養
液中に生産、蓄積させ、ジプロチンＡ又はＢ、又
はその両者を採取することを特徴とする新生理活
性物質ジプロチンＡ又は／及びＢの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57132161A JPS5925366A (ja) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | 新生理活性物質ジプロチン及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57132161A JPS5925366A (ja) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | 新生理活性物質ジプロチン及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5925366A JPS5925366A (ja) | 1984-02-09 |
| JPS6257198B2 true JPS6257198B2 (ja) | 1987-11-30 |
Family
ID=15074787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57132161A Granted JPS5925366A (ja) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | 新生理活性物質ジプロチン及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5925366A (ja) |
-
1982
- 1982-07-30 JP JP57132161A patent/JPS5925366A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5925366A (ja) | 1984-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2310400C (en) | Novel physiologically active substance sulphostin, process for producing the same, and use thereof | |
| JPH0347163A (ja) | アントラキノン誘導体およびその製造 | |
| HINO et al. | FK409, a novel vasodilator isolated from the acid-treated fermentation broth of Streptomyces griseosporeus I. Taxonomy, fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics | |
| SK68594A3 (en) | Lipopeptides made by actinoplanes bacteries, method of their preparing and using | |
| RU1826970C (ru) | Способ получени производных пептидов WS-9326 А | |
| JPH075638B2 (ja) | Ａ―２１９７８ｃ環状ペプチド誘導体 | |
| US4732910A (en) | Enzyme Inhibiting substance | |
| US4859593A (en) | New physiologically active substance, arphamenine and production thereof | |
| EP0084826A2 (en) | Antibiotic compound | |
| EP0192828B1 (en) | Novel, immunosuppressive compounds, a microbiological method for their preparation and their use as medicaments | |
| JPS6257198B2 (ja) | ||
| JP3111240B2 (ja) | Ｆａ−７０ｄ物質、その製造法及びその用途 | |
| US5436140A (en) | Process for producing WS-9326A and WS-9326B | |
| JPWO1997031122A1 (ja) | Ｆａ−７０ｄ物質、その製造法及びその用途 | |
| WO1996027594A1 (en) | Antitumour isocoumarins | |
| JPH0358342B2 (ja) | ||
| US5217952A (en) | Peptides WS-9326a and WS-9326b, derivatives thereof and uses thereof | |
| JPS6317834B2 (ja) | ||
| US4916063A (en) | BU-2867T peptide antibiotics | |
| US4463092A (en) | Process for production antibiotic A53868 | |
| JP4235298B2 (ja) | 抗生物質パレイン酸ａとその製造法 | |
| JPH0258280B2 (ja) | ||
| JPH03148227A (ja) | 鎮痛剤 | |
| JPS5825658B2 (ja) | デスアシル−ペプシジン | |
| JPS6257196B2 (ja) |