JPS6257200B2 - - Google Patents
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- JPS6257200B2 JPS6257200B2 JP56140717A JP14071781A JPS6257200B2 JP S6257200 B2 JPS6257200 B2 JP S6257200B2 JP 56140717 A JP56140717 A JP 56140717A JP 14071781 A JP14071781 A JP 14071781A JP S6257200 B2 JPS6257200 B2 JP S6257200B2
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、ヒトじゆう毛性性腺刺激ホルモン
（hCG）活性の測定用ペプチドに関する。 さらに詳しくは、本発明は、式 （式中、Ｘは単結合または
（hCG）活性の測定用ペプチドに関する。 さらに詳しくは、本発明は、式 （式中、Ｘは単結合または
【式】基を示す）で表わされる
ペプチドまたはその塩である。
hCGは糖蛋白であり、妊娠と共に胎盤より分泌
され、妊娠の維持に重要な役割を果している性ホ
ルモンである。このhCGを定性または定量するこ
とにより妊娠の有無、異所性妊娠、じゆう毛性性
癌などの早期発見並びに診断が可能となる。しか
しながら、性腺刺激ホルモンには黄体形体成ホル
モン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）及びCG
があり、その分子構造は類似しており、糖蛋白で
ある。しかもα鎖、β鎖の２種のサブユニツトか
らなり、特にα鎖は交換しても活性に変化がない
程分子構造的に類似している。３鎖は各々の性腺
刺激ホルモンにより特異的であるが、LHのβ鎖
とCGのβ鎖とは類似している。たゞし、CGβ鎖
のＣ末端近辺のアミノ酸組成がLHのβ鎖とは大
きく異なつており、従つてCGβ鎖のＣ末端近辺
を認識する測定系が出現すれば、他の性腺刺激ホ
ルモン、特にLHと全く交叉しない信頼性の高い
CG測定系が可能となる。 本発明は、上記に着目して完成されたものであ
り、式〔〕で表わされる本ペプチドはhCGの測
定系のためのラジオイムノアツセイ用の標識試薬
として有用である。 本発明のペプチド〔〕は、式〔〕で示され
るアミノ酸順序に個々のアミノ酸または低級ペプ
チドを縮合して構成せしめ、縮合反応の最終段階
で側鎖の官能基の保護基を脱離することにより得
られる。縮合反応自体はペプチド合成のための常
法手段に従つて、保護基の着脱、縮合反応を繰り
返すことにより行なわれる。即ち、本目的化合物
の原料ならびにすべての中間体の製造において使
用される各種保護基はペプチド合成で既知なも
の、従つて加水分解、酸分解、還元、アミノリシ
スまたはヒドラジノリシスのような既知手段によ
つて容易に脱離することのできる保護基が用いら
れる。 例えば、アミノ基に使用する保護基としては、
ホルミル基、トリフルオロアセチル基、フタロイ
ル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスル
ホニル基、ｏ−ニトロフエニルスルフエニル基、
２，４−ジニトロフエニルスルフエニル基、２，
４−ジニトロフエニルスルフエニル基などのアシ
ル基、ベンジル基、ジフエニルメチル基、トリフ
エニルメチル基（これらの基は場合によつてｏ−
メトキシ基、ｐ−メトキシ基などの低級アルコキ
シ基によつて置換されている）などのアラルキル
基、ベンジルオキシカルボニル基、ｏ−ブロモベ
ンジルオキシカルボニル基、ｐ−ブロモベンジル
オキシカルボニル基、ｏ−クロロベンジルオキシ
カルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボ
ニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル
基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、
ｐ−フエニルアゾーベンジルオキシカルボニル
基、ｐ−（p′−メトキシフエニルアゾ）−ベンジル
オキシカルボニル基などのベンジルオキシカルボ
ニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、ト
リクロロエチルオキシカルボニル基、ｔ−アミル
オキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル
基、ジイソプロピルメトキシカルボニル基などの
脂肪族オキシカルボニル基、２−フエニル−イソ
プロポキシカルボニル基、２−トリル−イソプロ
ポキシカルボニル基、２−ｐ−ジフエニル−イソ
プロポキシカルボニル基などのアラルキルオキシ
カルボニル基などがある。またこれらアミノ基を
ベンゾイルアセトン、アセチルアセトン、ジメド
ンなどの１，３−ジケトンと反応させることによ
つて得られるエナミンの形成により保護すること
ができる。 カルボキシル基は、アミド形成、ヒドラチド形
成またはエステル化によつて保護される。すなわ
ちアミド基は３，４−ジメトキシベンジル基、ビ
スー（ｐ−メトキシフエニル）メチル基などによ
つて置換される。ヒドラチド基はベンジルオキシ
カルボニル基、トリクロロエチルオキシカルボニ
ル基、トリフルオロアセチル基、ｔ−ブトキシカ
ルボニル基、トリチル基、２−ｐ−ジフエニル−
イソプロポキシカルボニル基などによつて置換さ
れる。エステル基はメタノール、エタノール、ｔ
−ブタノール、シアノメチルアルコールなどのア
ルカノール、ベンジルアルコール、ｐ−プロモベ
ンジルアルコール、ｐ−クロロベンジルアルコー
ル、２，６−ジクロロベンジルアルコール、ｐ−
メトキシベンジルアルコール、ｐ−ニトロベンジ
ルアルコール、２，４，６−トリメチルベンジル
アルコール、ベンズヒドリルアルコール、ベンゾ
イルメチルアルコール、ｐ−ブロモベンゾイルメ
チルアルコール、ｐ−クロロベンゾイルメチルア
ルコールなどのアラルカノール、２，４，６−ト
リクロロフエノール、２，４，５−トリクロロフ
エノール、ペンタクロロフエノール、ｐ−ニトロ
フエノール、２，４−ジニトロフエノール、ｐ−
シアノフエノール、ｐ−メタンスルホニルフエノ
ールなどのフエノール、チオフエノール、チオク
レゾール、ｐ−ニトロチオフエノールなどのチオ
フエノールなどによつて置換される。 前記チロシン、セリンおよびスレオニンの水酸
基は、例えばエステル化またはエーテル化によつ
て保護することができる。このエステル化に適す
る基としては例えばアセチル基などの低級アルカ
ノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベン
ジルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニ
ル基などの炭酸から誘導される基である。またエ
ーテル化に適する基としては、例えばベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基など
である。これら水酸基の保護には２，２，２−ト
リフルオロー１−ｔ−ブチルオキシカルボニルア
ミノエチル基、２，２，２−トリフルオロー１−
ベンジルオキシカルボニルアミノエチル基も適す
る。 しかしながら、これら水酸基を必ずしも保護す
る必要はない。 前記アルギニンのグアニジノ基中のアミノ基を
保護するのに使用する基としては、例えばニトロ
基、トシル基、ベンジルオキシカルボニル基など
であるが、このグアニジノ基を必ずしも保護する
必要はない。 本目的化合物〔〕の合成においては、個々の
アミノ酸もしくは低級ペプチドの縮合は、例え
ば、保護されたα−アミノ基および活性化末端カ
ルボキシル基をもつアミノ酸またはペプチドと遊
離α−アミノ基および保護された末端カルボキシ
ル基をもつアミノ酸またはペプチドとを反応させ
るか、あるいは活性化α−アミノ基および保護さ
れた末端カルボキシル基をもつアミノ酸またはペ
プチドと遊離の末端カルボキシル基および保護さ
れたα−アミノ基をもつアミノ酸またはペプチド
を反応させることにより実施することができる。 この場合のカルボキシル基は、ヒドラジドまた
はN′−保護ヒドラジド、例えばｔ−プチルオキ
シカルボニルヒドラジド、ベンジルオキシカルボ
ニルヒドラジドなどから亜硝酸で誘導したアジ
ド、酸無水物、酸イミダゾリドまたは活性エステ
ル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロチ
オフエニルエステル、ｐ−ニトロフエニルエステ
ル、２，４−ジニトロフエニルエステル、２，
４，５−トリクロロフエニルエステル、２，４，
６−トリクロロフエニルエステル、ペンタクロロ
フエニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステルなどに変換することによつて、あるい
はＮ，N′−ジシクロヘキシル−カルボジイミ
ド、Ｎ−エチル−N′−３−ジメチルアミノプロ
ピルーカルボジイミドなどのカルボジイミド、
Ｎ，N′−カルボニル−ジイミダゾールまたはウ
ツドワード反応剤などのイソオキサゾリウム塩、
ジフエニルホスホラジデートなどを使用して反応
させることによつて活性化することができる。 本発明において好ましい縮合方法は、アジド
法、活性エステル法およびカルボジイミド法であ
る。縮合の各段階ではラセミ化が起らない方法ま
たはラセミ化が最少になる方法を用いるのが望ま
しく、好ましくは、アジド法、活性エステル法、
ラセミ化防止試薬わ添加するカルボジイミド法、
例えばDCC−HOSuを用いるＷｕ¨nsch法〔Z.
Naturforsch.，21b，426（1966）〕、DCC−HOBt
を用いるGeiger法〔Chem.Ber.，103，788
（1970）〕、WSCI−HOSuを用いる泉屋法〔Arch
Biochem.Biophys.，144，237（1971）〕、WSCI−
HOBtを用いる方法などと用いるのが適する。 縮合順序は式〔〕で示されるアミノ酸順序で
あれば、如何なる順序からも合成し得るが、Ｃ−
末端側から順次アミノ酸またはペプチドを連結さ
せるのが好ましい。 保護された〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕は、
Ｃ−末端フラグメント116−145とチロシンフラグ
メント115をアジド法により縮合するのが好まし
い。Ｃ−末端フラグメント116−145は、Ｃ−末端
フラグメント130−145に順次フラグメント127−
129、フラグメント123−126、フラグメント120−
122およびフラグメント116−119をアジド法によ
り縮合するのが好ましい。Ｃ末端130−145は、Ｃ
−末端フラグメント140−145に順次139番目のア
ミノ酸、138番目のアミノ酸、フラグメント136−
137、フラグメント133−135およびフラグメント
130−132をアジド法により縮合するのが好まし
い。 保護された〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕は、
Ｃ末端フラグメント112−145とチロシンフラグメ
ント111をアジド法により縮合させるのが好まし
い。Ｃ−末端フラグメント112−145は、前記Ｃ−
末端フラグメント116−145に順次フラグメント
114−115およびフラグメント112−113をアジド法
により縮合するのが好ましい。 上記のペプチドの合成に際して、その末端カル
ボキシル基は、これを必らずしも保護しなければ
ならないわけではない。例えば、アジド法、活性
エステル法によつて縮合させる場合には、保護し
なくてもよい。 しかしながら、これらの基を前記で述べたよう
なエステル化によつて、例えばメチルエステル、
エチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ベンジル
エステルなどの保護することもできる。また、こ
れらのエステル基は、例えばメチルエステル基は
これを希薄な水酸化ナトリウム水溶液で分裂し、
あるいはヒドラチドまたはN′−保護ヒドラチド
に変え、ｔ−ブチルエステル基はこれをトリフル
オロ酢酸で分裂し、またベンジルエステルは無水
弗化水素または水素添加分解によつて分裂するこ
とができる。 これらペプチドのα−アミノ基は、ベンジルオ
キシカルボニル基で保護するのが適する。これら
は水素添加分解によつて脱離される。 チロシン、セリンおよびスレオニンの水酸基
は、必らずしも保護するわけではないが、保護す
る場合には、ｔ−ブチル基またはベンジル基で保
護するのが適する。アスパラギン酸の側鎖カルボ
キシル基は、必らずしも保護するわけではない
が、保護する場合にはベンジルエステル基で保護
するのが適する。リジンのε−アミノ基はｔ−ブ
チルオキシカルボニル基で、アルギニンのグアニ
ジノ基中のアミノ基はニトロ基で保護するのが適
する。 前記Ｃ−末端フラグメント116−145、即ち保護
されたhCG（116−145）およびＣ−末端フラグメ
ント130−145、即ち保護されたhCG（130−145）
並びにそれらの中間フラグメントについては、
Chem.，Pharm.Bull.，28（９），2707〜2713
（1980）、同28（９），2714〜2719（1980）に記載
されている。 こうして保護された〔Tyr115〕−hCG〔115−
145〕または保護された〔Tyr111〕−hCG〔111−
145〕が得られるが、これらの保護基は、好まし
くは酸分解、例えばトリフルオロ酢酸、無水弗化
水素などで一段階で脱離され、式〔〕のペプチ
ド、即ち〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕または
〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕が得られる。 上記のペプチドは、公知のペプチドを精製する
手段により分離、精製することができる。例えば
セフアデツクスＧ−25、セフアデツクスＧ−50、
ダウエツクスX1、セフアデツクスLH−20、カル
ボキシメチルセルロースなどの担体を用いるカラ
ムクロマトグラフイーにより行うことができる。 本目的化合物〔〕は、その方法の条件により
遊離塩基または塩の形で得られる。通常は塩酸の
如き無機酸との塩、酢酸の如き有機酸との塩の形
で保存され得る。 尚、本明細書中に記載の略記号は次の意味を有
する。 Tyr；Ｌ−チロシン Asp；Ｌアスパラギン酸 Pro；Ｌ−プロリン Arg；Ｌ−アルギニン Phe；Ｌ−フエニルアラニン Gln；Ｌ−グルタミン Ser；Ｌ−セリン Lys；Ｌ−リジン Ala；Ｌ−アラニン Leu；Ｌ−ロイシン Giy；グリシン Thy；Ｌ−スレオニン Ile；Ｌ−イソロイシン Boc；ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｚ；ベンジルオキシカルボニル OBut；ｔ−ブチルエステル OBzl；ベンジルエステル ONP；ｐ−ニトロフエニルエステル But；ｔ−ブチル MeOH；メタノール DMF；ジメチルホルムアミド CHCl3；クロロホルム エーテル；ジエチルエーテル TFA；トリフルオロ酢酸 Et3N；トリエチルアミン DCC；Ｎ，N′−ジシクロヘキシル−カルボジイ
ミド HOBt；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール 次に実施例を挙げて本発明の製造例を具体的に
説明する。尚、実施例中で使用した薄層クロマト
グラフイー（TLC）の担体および展開溶媒は、
特記しない限り次の通りである。 担体；メルク社製シリカゲル60GArt7731 展開溶媒； Ａ；CMCl3−MeOH−酢酸（90：８：２） Ｂ；CHCl3−MeOH−水（８：３：１）の下層 Ｃ；ブタノール−ピリジン−酢酸−水（４：１：
１：２） Ｄ；ブタノール−ピリジン−酢酸−水（30：20：
６：24） Ｅ；ブタノール−酢酸−水（４：15）の上層 Ｆ；ブタノール−酢酸エチル−酢酸−水（１：
１：１：１） 実施例 １ 〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕；Ｈ−Tyr−Gln
−Asp−Ser−Ser−Ser−Ser−Lys−Ala−Pro
−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser
−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−
Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OH (1) フラグメント115−145；Ｚ−Tyr−Gln−
Asp−（OBzl）−Ser−Ser−Ser−Ser−Lys−
（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro
−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OBut〔１〕 Ｚ−Gln−Asp（OBzl）−Ser−Ser−Ser−Ser
−Lys（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu
−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OBut 〔２〕50mgを酢酸0.1mlを含む40％含水エタノ
ール５mlに溶かし、パラジウム触媒の存在下水素
添加する。触媒を去し、母液を減圧濃縮する。
残渣を1N塩酸0.03mlを含む水に溶かし、凍結乾
燥する。 一方、Ｚ−Tyr−NHNH223mgを1N塩化水素／
ジオキサン溶液0.14mlを含むDMF1mlに溶かし、
これに−30℃に冷却下亜硝酸イソアミル0.01mlを
加え、５分間撹拌した後、Et3N0.02mlを加え；ア
ジド溶液を得る。 上記の凍結乾燥品をEt3N0.006mlを含むDMF1
mlに溶かし、これに氷冷下上記で得たアジド溶液
を加え、２日間撹拌する。反応液をDMFでセフ
アデツクスLH−20を充填したカラム（1.2×180
cm）に通し、DMFで溶出する。溶出液は３ｇづ
つ分画し、TLCにより追跡して43〜49番目のフ
ラクシヨンを集めて減圧濃縮する。残渣にエーテ
ルを加え、生じた白色粉末を遠心分離により集
め、エーテルで洗浄して〔１〕28mg（収率54.4
％）を得る。 融点、270℃（分解）、210℃で半融 TLC；RfE＝0.75 元素分析〔C169H259N37O52HCl・15H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 51.4 7.40 13.1 測定値 51.3 7.06 13.2 アミノ酸分析〔酸加水分解〕；Asp2.11(2)、
Thr0.97(1)、Ser7.30(8)、Glu2.28(2)、Pro8.70(9)、
Gly1.00(1)、Ala1.06(1)、Ile1.03(1)、Leu2.76(3)、
Tyr0.80(1)、Lys1.08(1)、Arg0.97(1) 前記のペプチドフラグメント〔２〕の物性およ
び製造法はChem.Pharm.Bull.，28(9)、2714〜
2719（1980）に記載されている。 (2)〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕 〔２〕20mgにTFA0.6ml、アニソール0.1mlを加
え、室温で３時間放置する。反応液にエーテルを
加え、析出した沈澱物を遠心分離により集める。
これをエーテルで洗浄し、KOH上で減圧乾燥し
た後、エタレール４mlおよび５％酢酸４mlを加
え、パラジウム触媒の存在下水素添加する。触媒
を去し、母液を減圧濃縮する。残渣を水に溶か
し、凍結乾燥してふわふわした粉末を得る。 この粉末を５％酢酸に溶かし、これを５％酢酸
でセフアデツクスＧ−25を充填したカラム（2.2
×130cm）に通し、５％酢酸で溶出する。溶出液
は４ｇづつ分画し、275nmの吸光度の測定により
追跡して58〜70番目のフラクシヨンを集め、減圧
下で溶媒を留去する。残渣を水に溶かし凍結乾燥
して〔Tyr115〕−〔115−145〕17mg（収率85.2％）
を得る。 〔α２７ Ｄ−164.7゜（Ｃ＝0.2，水） TLC；RfD＝0.13，RfF＝0.10 アミノ酸分析〔酸加水分解〕；Asp2.01(2)、
Thr0.99(1)、Ser7.00(8)、Glu2.11(2)、Pro9.82(9)、
Gly1.00(1)、Ala1.05(1)、Ile0.99(1)、Ile0.99(1)、
Leu3.10(3)、Tyr0.80(1)、Lys1.02(1)、Arg1.00(1) 実施例 ２ 〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕；Ｈ−Tyr−Asp
−Pro−Arg−Phe−Gln−Asp−Ser−Ser−
Ser−Ser−Lys−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−
Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro
−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu
−Pro−Gln−OH (1) フラグメント114−115；Ｚ−Arg（NO2）−
Phe−NHNHBoc〔３〕 Ｚ−Phe−NHNHBoc〔E.Wunsch and G.
Wendlberger，Chem.Ber.，97，2504（1964）〕
2.0ｇからPd触媒存在下で水素添加分解により得
られるＨ−Phe−NHNHBocとＺ−Arg（NO2）−
OH1.7ｇをDMF20mlに溶かし、これに氷冷下
DCC1.2ｇおよびHOBt0.9ｇを加え、一夜撹拌す
る。反応後、析出した尿素誘導体を去し、液
を減圧濃縮する。残渣を酢酸エチルで抽出し、５
％重曹水、10％クエン酸水、水の順に洗浄する。
無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮する。残渣にエーテ
ルを加え、生じた沈澱物を取する。これを少量
のクロロホルムに溶かし、シリカゲルのカラムに
チヤージして３％メタノール含有クロロホルムに
よりクロマトグラフイーを行う。TLCでRfA＝
0.41付近のフラクシヨンを集めて減圧乾固して
〔３〕1.6ｇ（収率4.45％）を得る。 融点；120−125℃ 〔α〕２７ Ｄ−28.92（ｃ＝1.0，MeOH） TLC；RfA＝0.41，RfB＝0.79 元素分析〔C28H38N8O8として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 54.7 6.23 18.8 測定値 54.5 6.23 18.5 (2) フラグメント114−145；Ｚ−Arg（NO2）−
Phe−Gln−Asp−Ser−Ser−Ser−Ser−Lys
−（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−
Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu
−Pro−Gln−OBut〔４〕 Ｚ−Gln−Asp（OBzl）−Ser−Ser−Ser−Ser
−Lys（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu
−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OBut〔５〕にエタノール10mlおよび
５％酢酸10mlを加えて溶解し、Pd触媒の存在下
で水素添加分解を行う。触媒を去し、液を減
圧濃縮する。残渣をDMF5mlに溶かし、Et3NでPH
８に調節する。 一方、〔３〕316mgにアニソール0.05mlおよび
TFA1mlを加え、室温で40分間放置した後、エー
テルを加える。生じた白色沈澱物を遠心分離によ
り集め、エーテルで洗浄した後、KOH上で減圧
乾燥する。このヒドラジドをDMF4mlに溶かし、
これに−20℃に冷却下6.4N塩化水素／ジオキサ
ン溶液0.16mlを加えた後、次いで亜硝酸イソペン
チル0.072mlを加える。５分後、反応液のPHを
Et3N0.15mlでPH８に調節する。このアジド溶液を
前記のPH調節したDMF溶液に加え、４℃で48時
間撹拌する。反応混合物をDMFで充填したセフ
アデツクスLH−20のカラム（1.5×180cm）に通
し、DMFで流出液は３ｇづつ分画し、TLCで追
跡して25日−30番目のフラクシヨンを集めて減圧
濃縮する。残渣にエーテルを加え、生じた白色沈
澱物を集める。この沈澱物を前記と同じ方法でゲ
ル過して白色固形物310mg（収率94.7％）を得
る。これをできるだけ少量のブタノール−酢酸−
水（４：１：５）の上層液に溶かし、上記と同一
溶媒で充填したシリカゲル（1.3×35cm）のカラ
ムに通し、上記と同一溶媒で溶出する。溶出液は
３ｇづつ分画し、TLCにより追跡して14−33番
目のフラクシヨンを集めて減圧濃縮する。残渣に
エーテルを加え、生じた白色沈澱物を遠心分離に
より集めて〔４〕287mg（収率87.7％）を得る。 融点；160℃で湿潤、187℃で分解 〔α〕２７ Ｄ−63.0（ｃ＝0.2，DMF） TLC；RfA＝0.20 元素分析〔C175H270N42O54 HCl 2H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 53.4 7.15 15.0 測定値 53.52 7.72 15.36 アミノ酸分析；Asp2.03(2)、Thr0.95(1)、
Ser7.77(8)、Glu2.17(2)、Pro8.96(9)、Gly1.00(1)、
Ala1.01(1)、Ile0.93(1)、Leu2.96(3)、Phe1.30(1)、
Lys1.05(1)、Arg1.84(2) 前記のペプチドフラグメント〔５〕の物性は、
Chem.Pharm.Bull.，28(9)，2714〜2719（1980）
に記載され、そのフラグメント自体およびその中
間フラグメントの製造法は同文献および同誌，28
(9)，2707〜2713（1980）に記載されている。 (3) フラグメント112−113；Ｚ−Asp（OBzl）−
Pro−NHNHBoc〔６〕 Ｚ−Asp（OBzl）−ONP4.8ｇとＨ−Pro−
NHNHBoc2.3ｇをEt3N1.4mlを含むジオキサン22
mlに溶かし、室温で一夜撹拌する。反応後、ジオ
キサンを減圧下留去し、残渣を酢酸エチルに溶か
した後、10％クエン酸水、５％重曹水、水の順に
洗浄する。無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮し、残渣
に石油エーテルを加える。生じた沈澱物を集め無
定形粉末〔６〕4.45ｇ（収率78.2％）を得る。 〔α〕２７ Ｄ−78.9゜（ｃ＝1.0，MeOH） TLC；RfA＝0.49、RfB＝0.79 元素分析〔C29H36N4O8として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 61.3 6.38 9.9 測定値 61.2 6.60 9.6 (4) フラグメント112−145；Ｚ−Asp（OBzl）−
Pro−Arg−Phe−Gln−Asp−Ser−Ser−Ser
−Ser−Lys（BOc）−Ala−Pro−Pro−Pro−
Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro
−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut〔７〕 〔４〕250mgにエタノール10mlおよび５％酢酸
水10mlを加えて溶解し、Pd触媒の存在下で水素
添加分解を行う。触媒を去し、液を減圧濃縮
する。残渣に0.1N塩酸0.19mlを含む水を加え、凍
結乾燥する。得られたペプチドをDMF3mlに溶か
し、Et3NでPH８に調節する。 一方、〔６〕183mgを6.4N塩化水素／ジオキサ
ン溶液0.21mlに溶かし、５分後、これにジオキサ
ン0.2mlを加えた後、室温で30分間放置する。次
いでDMF5mlを加え、−20℃に冷却下亜硝酸イソ
ペンチル0.045mlを加える。５分後、Et3Nで溶液
のPHを８に調節した後、このアジド溶液を前記の
PH調節したDMF溶液に加え、４℃で48時間撹拌
する。反応混合物をDMFで充填したセフアデツ
クスＧ−25のカラム（1.8×190cm）に通し、
DMFで流出する。流出液を３ｇづつ分画し、23
〜29番目のフラクシヨンを集めて減圧濃縮する。
残渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を遠心分離
により集めて〔７〕226mg（収率81.7％）を得
る。 融点；191℃（分解）、178℃で半融を併なう。 〔α〕２７ Ｄ−69.5゜（ｃ＝0.2，DMF） TLC；RfB＝0.19、Rfc＝0.51 元素分析〔C191H289N43O562HCl 11H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 52.7 7.25 13.8 測定値 52.4 7.20 13.8 アミノ酸分析；Asp3.20(3)、Thr1.02(1)、
Ser7.41(8)、Glu2.12(2)、Pro10.38(10)、Gly1.00
(1)、Ala1.03(1)、Ile0.93(1)、Leu2.89(3)、Phe1.16
(1)、Lys1.08(1)、Arg1.95(2)、NH32.94 (5) フラグメント（111−145）；Ｚ−Tyr−Asp
（OBzl）−Pro−Arg−Phe−Gln−Asp−Ser−
Ser−Ser−Ser−Lys（Boc）−Ala−Pro−Pro
−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg
−Leu−Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thy
（But）−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut
〔８〕 〔７〕51mgにエタノール２mlおよび５％酢酸２
mlを加えて溶解し、パラジウム触媒の存在下で水
素添加分解を11時間行う。触媒を去し、母液を
減圧濃縮し、残渣を1N塩酸0.012mlを含む水に溶
かして凍結乾燥してふわふわした粉末を得る。こ
の粉末をDMF5mlに溶かし、Et3N0.0033mlでPH８
に調節する。 一方、Ｚ−Tyr−NHNH277.1mgを1N塩化水
素／ジオキサン溶液0.067mlを含むDMF3mlに溶
かし、これに−30℃に冷却下亜硝酸イソアミル
0.033mlを加え、10分間撹拌した後、Et3N0.066ml
でPH８に調節した後、このアジド溶液を前記のPH
調節したDMF溶液に加え、氷冷下で２日間撹拌
する。反応混合物をDMFで充填したセフアデツ
クスLH−20のカラム（1.6×170cm）に通し、
DMFで溶出する。溶出液を３ｇづつ分画し、32
〜35番目のフラクシヨンを集めて減圧濃縮する。
残渣にエーテルを加え、生じた白色沈澱物を遠心
分離により集めて〔８〕36mg（収率68％）を得
る。 融点；198〜220℃（分解） 〔α〕２７ Ｄ−75.5゜（ｃ＝0.2，DMF） TLC；RfD＝0.76 アミノ酸分解〔酸加水分解〕；Asp3.25(3)、
Thr0.97(1)、Ser6.71(8)、Glu2.35(2)、Pro9.77(10)、
Gly0.96(1)、Ala1.00(1)、Ile0.98(1)、Leu2.93(3)、
Tyr1.03(1)、Phe0.93(1)、Lys0.91(1)、Arg2.06(2) (6) 〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕 〔８〕20mgにTFA0.6mlおよびアニソール0.1ml
を加え、室温で３日間放置する。反応液にエーテ
ルを加え、析出した白色沈澱物を遠心分離により
集め、エーテルで洗浄した後、KOH上で減圧乾
燥する。この粉末にエタノール２mlおよび５％酢
酸２mlを加えて溶解し、パラジウム触媒の存在下
で水素添加分解を６時間行う。触媒を去し、母
液を減圧濃縮し、残渣を水に溶かして凍結乾燥す
る。得られた粉末を５％酢酸１mlに溶かし、これ
を５％酢酸で充填したセフアデツクスＧ−25のカ
ラム（2.2×135cm）に通し、５％酢酸で溶出す
る。溶出液は６ｇづつ分画し、275nmの吸光度の
測定により追跡して30〜35番目のフラクシヨンを
集め、減圧濃縮する。残渣を水に溶かし凍結乾燥
してふわふわした粉末の〔Tyr115〕−hCG〔115−
145〕11mg（収率62％）を得る。 〔α〕２６ Ｄ−144.3゜（ｃ＝0.2，水） TLC；RfD＝0.25 アミノ酸分析〔酸加水分解〕；Asp3.31(3)、
Thr0.95(1)、Ser7.27(8)、Glu2.37(2)、Pro10.86
(10)、Gly0.98(1)、Ala1.00(1)、Ile1.01(1)、Leu3.01
(3)、Tyr0.98(1)、Phe0.95(1)、Lys1.05(1)、
Arg2.24(2)。
され、妊娠の維持に重要な役割を果している性ホ
ルモンである。このhCGを定性または定量するこ
とにより妊娠の有無、異所性妊娠、じゆう毛性性
癌などの早期発見並びに診断が可能となる。しか
しながら、性腺刺激ホルモンには黄体形体成ホル
モン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）及びCG
があり、その分子構造は類似しており、糖蛋白で
ある。しかもα鎖、β鎖の２種のサブユニツトか
らなり、特にα鎖は交換しても活性に変化がない
程分子構造的に類似している。３鎖は各々の性腺
刺激ホルモンにより特異的であるが、LHのβ鎖
とCGのβ鎖とは類似している。たゞし、CGβ鎖
のＣ末端近辺のアミノ酸組成がLHのβ鎖とは大
きく異なつており、従つてCGβ鎖のＣ末端近辺
を認識する測定系が出現すれば、他の性腺刺激ホ
ルモン、特にLHと全く交叉しない信頼性の高い
CG測定系が可能となる。 本発明は、上記に着目して完成されたものであ
り、式〔〕で表わされる本ペプチドはhCGの測
定系のためのラジオイムノアツセイ用の標識試薬
として有用である。 本発明のペプチド〔〕は、式〔〕で示され
るアミノ酸順序に個々のアミノ酸または低級ペプ
チドを縮合して構成せしめ、縮合反応の最終段階
で側鎖の官能基の保護基を脱離することにより得
られる。縮合反応自体はペプチド合成のための常
法手段に従つて、保護基の着脱、縮合反応を繰り
返すことにより行なわれる。即ち、本目的化合物
の原料ならびにすべての中間体の製造において使
用される各種保護基はペプチド合成で既知なも
の、従つて加水分解、酸分解、還元、アミノリシ
スまたはヒドラジノリシスのような既知手段によ
つて容易に脱離することのできる保護基が用いら
れる。 例えば、アミノ基に使用する保護基としては、
ホルミル基、トリフルオロアセチル基、フタロイ
ル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスル
ホニル基、ｏ−ニトロフエニルスルフエニル基、
２，４−ジニトロフエニルスルフエニル基、２，
４−ジニトロフエニルスルフエニル基などのアシ
ル基、ベンジル基、ジフエニルメチル基、トリフ
エニルメチル基（これらの基は場合によつてｏ−
メトキシ基、ｐ−メトキシ基などの低級アルコキ
シ基によつて置換されている）などのアラルキル
基、ベンジルオキシカルボニル基、ｏ−ブロモベ
ンジルオキシカルボニル基、ｐ−ブロモベンジル
オキシカルボニル基、ｏ−クロロベンジルオキシ
カルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボ
ニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル
基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、
ｐ−フエニルアゾーベンジルオキシカルボニル
基、ｐ−（p′−メトキシフエニルアゾ）−ベンジル
オキシカルボニル基などのベンジルオキシカルボ
ニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、ト
リクロロエチルオキシカルボニル基、ｔ−アミル
オキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル
基、ジイソプロピルメトキシカルボニル基などの
脂肪族オキシカルボニル基、２−フエニル−イソ
プロポキシカルボニル基、２−トリル−イソプロ
ポキシカルボニル基、２−ｐ−ジフエニル−イソ
プロポキシカルボニル基などのアラルキルオキシ
カルボニル基などがある。またこれらアミノ基を
ベンゾイルアセトン、アセチルアセトン、ジメド
ンなどの１，３−ジケトンと反応させることによ
つて得られるエナミンの形成により保護すること
ができる。 カルボキシル基は、アミド形成、ヒドラチド形
成またはエステル化によつて保護される。すなわ
ちアミド基は３，４−ジメトキシベンジル基、ビ
スー（ｐ−メトキシフエニル）メチル基などによ
つて置換される。ヒドラチド基はベンジルオキシ
カルボニル基、トリクロロエチルオキシカルボニ
ル基、トリフルオロアセチル基、ｔ−ブトキシカ
ルボニル基、トリチル基、２−ｐ−ジフエニル−
イソプロポキシカルボニル基などによつて置換さ
れる。エステル基はメタノール、エタノール、ｔ
−ブタノール、シアノメチルアルコールなどのア
ルカノール、ベンジルアルコール、ｐ−プロモベ
ンジルアルコール、ｐ−クロロベンジルアルコー
ル、２，６−ジクロロベンジルアルコール、ｐ−
メトキシベンジルアルコール、ｐ−ニトロベンジ
ルアルコール、２，４，６−トリメチルベンジル
アルコール、ベンズヒドリルアルコール、ベンゾ
イルメチルアルコール、ｐ−ブロモベンゾイルメ
チルアルコール、ｐ−クロロベンゾイルメチルア
ルコールなどのアラルカノール、２，４，６−ト
リクロロフエノール、２，４，５−トリクロロフ
エノール、ペンタクロロフエノール、ｐ−ニトロ
フエノール、２，４−ジニトロフエノール、ｐ−
シアノフエノール、ｐ−メタンスルホニルフエノ
ールなどのフエノール、チオフエノール、チオク
レゾール、ｐ−ニトロチオフエノールなどのチオ
フエノールなどによつて置換される。 前記チロシン、セリンおよびスレオニンの水酸
基は、例えばエステル化またはエーテル化によつ
て保護することができる。このエステル化に適す
る基としては例えばアセチル基などの低級アルカ
ノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベン
ジルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニ
ル基などの炭酸から誘導される基である。またエ
ーテル化に適する基としては、例えばベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基など
である。これら水酸基の保護には２，２，２−ト
リフルオロー１−ｔ−ブチルオキシカルボニルア
ミノエチル基、２，２，２−トリフルオロー１−
ベンジルオキシカルボニルアミノエチル基も適す
る。 しかしながら、これら水酸基を必ずしも保護す
る必要はない。 前記アルギニンのグアニジノ基中のアミノ基を
保護するのに使用する基としては、例えばニトロ
基、トシル基、ベンジルオキシカルボニル基など
であるが、このグアニジノ基を必ずしも保護する
必要はない。 本目的化合物〔〕の合成においては、個々の
アミノ酸もしくは低級ペプチドの縮合は、例え
ば、保護されたα−アミノ基および活性化末端カ
ルボキシル基をもつアミノ酸またはペプチドと遊
離α−アミノ基および保護された末端カルボキシ
ル基をもつアミノ酸またはペプチドとを反応させ
るか、あるいは活性化α−アミノ基および保護さ
れた末端カルボキシル基をもつアミノ酸またはペ
プチドと遊離の末端カルボキシル基および保護さ
れたα−アミノ基をもつアミノ酸またはペプチド
を反応させることにより実施することができる。 この場合のカルボキシル基は、ヒドラジドまた
はN′−保護ヒドラジド、例えばｔ−プチルオキ
シカルボニルヒドラジド、ベンジルオキシカルボ
ニルヒドラジドなどから亜硝酸で誘導したアジ
ド、酸無水物、酸イミダゾリドまたは活性エステ
ル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロチ
オフエニルエステル、ｐ−ニトロフエニルエステ
ル、２，４−ジニトロフエニルエステル、２，
４，５−トリクロロフエニルエステル、２，４，
６−トリクロロフエニルエステル、ペンタクロロ
フエニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステルなどに変換することによつて、あるい
はＮ，N′−ジシクロヘキシル−カルボジイミ
ド、Ｎ−エチル−N′−３−ジメチルアミノプロ
ピルーカルボジイミドなどのカルボジイミド、
Ｎ，N′−カルボニル−ジイミダゾールまたはウ
ツドワード反応剤などのイソオキサゾリウム塩、
ジフエニルホスホラジデートなどを使用して反応
させることによつて活性化することができる。 本発明において好ましい縮合方法は、アジド
法、活性エステル法およびカルボジイミド法であ
る。縮合の各段階ではラセミ化が起らない方法ま
たはラセミ化が最少になる方法を用いるのが望ま
しく、好ましくは、アジド法、活性エステル法、
ラセミ化防止試薬わ添加するカルボジイミド法、
例えばDCC−HOSuを用いるＷｕ¨nsch法〔Z.
Naturforsch.，21b，426（1966）〕、DCC−HOBt
を用いるGeiger法〔Chem.Ber.，103，788
（1970）〕、WSCI−HOSuを用いる泉屋法〔Arch
Biochem.Biophys.，144，237（1971）〕、WSCI−
HOBtを用いる方法などと用いるのが適する。 縮合順序は式〔〕で示されるアミノ酸順序で
あれば、如何なる順序からも合成し得るが、Ｃ−
末端側から順次アミノ酸またはペプチドを連結さ
せるのが好ましい。 保護された〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕は、
Ｃ−末端フラグメント116−145とチロシンフラグ
メント115をアジド法により縮合するのが好まし
い。Ｃ−末端フラグメント116−145は、Ｃ−末端
フラグメント130−145に順次フラグメント127−
129、フラグメント123−126、フラグメント120−
122およびフラグメント116−119をアジド法によ
り縮合するのが好ましい。Ｃ末端130−145は、Ｃ
−末端フラグメント140−145に順次139番目のア
ミノ酸、138番目のアミノ酸、フラグメント136−
137、フラグメント133−135およびフラグメント
130−132をアジド法により縮合するのが好まし
い。 保護された〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕は、
Ｃ末端フラグメント112−145とチロシンフラグメ
ント111をアジド法により縮合させるのが好まし
い。Ｃ−末端フラグメント112−145は、前記Ｃ−
末端フラグメント116−145に順次フラグメント
114−115およびフラグメント112−113をアジド法
により縮合するのが好ましい。 上記のペプチドの合成に際して、その末端カル
ボキシル基は、これを必らずしも保護しなければ
ならないわけではない。例えば、アジド法、活性
エステル法によつて縮合させる場合には、保護し
なくてもよい。 しかしながら、これらの基を前記で述べたよう
なエステル化によつて、例えばメチルエステル、
エチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ベンジル
エステルなどの保護することもできる。また、こ
れらのエステル基は、例えばメチルエステル基は
これを希薄な水酸化ナトリウム水溶液で分裂し、
あるいはヒドラチドまたはN′−保護ヒドラチド
に変え、ｔ−ブチルエステル基はこれをトリフル
オロ酢酸で分裂し、またベンジルエステルは無水
弗化水素または水素添加分解によつて分裂するこ
とができる。 これらペプチドのα−アミノ基は、ベンジルオ
キシカルボニル基で保護するのが適する。これら
は水素添加分解によつて脱離される。 チロシン、セリンおよびスレオニンの水酸基
は、必らずしも保護するわけではないが、保護す
る場合には、ｔ−ブチル基またはベンジル基で保
護するのが適する。アスパラギン酸の側鎖カルボ
キシル基は、必らずしも保護するわけではない
が、保護する場合にはベンジルエステル基で保護
するのが適する。リジンのε−アミノ基はｔ−ブ
チルオキシカルボニル基で、アルギニンのグアニ
ジノ基中のアミノ基はニトロ基で保護するのが適
する。 前記Ｃ−末端フラグメント116−145、即ち保護
されたhCG（116−145）およびＣ−末端フラグメ
ント130−145、即ち保護されたhCG（130−145）
並びにそれらの中間フラグメントについては、
Chem.，Pharm.Bull.，28（９），2707〜2713
（1980）、同28（９），2714〜2719（1980）に記載
されている。 こうして保護された〔Tyr115〕−hCG〔115−
145〕または保護された〔Tyr111〕−hCG〔111−
145〕が得られるが、これらの保護基は、好まし
くは酸分解、例えばトリフルオロ酢酸、無水弗化
水素などで一段階で脱離され、式〔〕のペプチ
ド、即ち〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕または
〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕が得られる。 上記のペプチドは、公知のペプチドを精製する
手段により分離、精製することができる。例えば
セフアデツクスＧ−25、セフアデツクスＧ−50、
ダウエツクスX1、セフアデツクスLH−20、カル
ボキシメチルセルロースなどの担体を用いるカラ
ムクロマトグラフイーにより行うことができる。 本目的化合物〔〕は、その方法の条件により
遊離塩基または塩の形で得られる。通常は塩酸の
如き無機酸との塩、酢酸の如き有機酸との塩の形
で保存され得る。 尚、本明細書中に記載の略記号は次の意味を有
する。 Tyr；Ｌ−チロシン Asp；Ｌアスパラギン酸 Pro；Ｌ−プロリン Arg；Ｌ−アルギニン Phe；Ｌ−フエニルアラニン Gln；Ｌ−グルタミン Ser；Ｌ−セリン Lys；Ｌ−リジン Ala；Ｌ−アラニン Leu；Ｌ−ロイシン Giy；グリシン Thy；Ｌ−スレオニン Ile；Ｌ−イソロイシン Boc；ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｚ；ベンジルオキシカルボニル OBut；ｔ−ブチルエステル OBzl；ベンジルエステル ONP；ｐ−ニトロフエニルエステル But；ｔ−ブチル MeOH；メタノール DMF；ジメチルホルムアミド CHCl3；クロロホルム エーテル；ジエチルエーテル TFA；トリフルオロ酢酸 Et3N；トリエチルアミン DCC；Ｎ，N′−ジシクロヘキシル−カルボジイ
ミド HOBt；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール 次に実施例を挙げて本発明の製造例を具体的に
説明する。尚、実施例中で使用した薄層クロマト
グラフイー（TLC）の担体および展開溶媒は、
特記しない限り次の通りである。 担体；メルク社製シリカゲル60GArt7731 展開溶媒； Ａ；CMCl3−MeOH−酢酸（90：８：２） Ｂ；CHCl3−MeOH−水（８：３：１）の下層 Ｃ；ブタノール−ピリジン−酢酸−水（４：１：
１：２） Ｄ；ブタノール−ピリジン−酢酸−水（30：20：
６：24） Ｅ；ブタノール−酢酸−水（４：15）の上層 Ｆ；ブタノール−酢酸エチル−酢酸−水（１：
１：１：１） 実施例 １ 〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕；Ｈ−Tyr−Gln
−Asp−Ser−Ser−Ser−Ser−Lys−Ala−Pro
−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser
−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−
Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OH (1) フラグメント115−145；Ｚ−Tyr−Gln−
Asp−（OBzl）−Ser−Ser−Ser−Ser−Lys−
（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro
−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OBut〔１〕 Ｚ−Gln−Asp（OBzl）−Ser−Ser−Ser−Ser
−Lys（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu
−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OBut 〔２〕50mgを酢酸0.1mlを含む40％含水エタノ
ール５mlに溶かし、パラジウム触媒の存在下水素
添加する。触媒を去し、母液を減圧濃縮する。
残渣を1N塩酸0.03mlを含む水に溶かし、凍結乾
燥する。 一方、Ｚ−Tyr−NHNH223mgを1N塩化水素／
ジオキサン溶液0.14mlを含むDMF1mlに溶かし、
これに−30℃に冷却下亜硝酸イソアミル0.01mlを
加え、５分間撹拌した後、Et3N0.02mlを加え；ア
ジド溶液を得る。 上記の凍結乾燥品をEt3N0.006mlを含むDMF1
mlに溶かし、これに氷冷下上記で得たアジド溶液
を加え、２日間撹拌する。反応液をDMFでセフ
アデツクスLH−20を充填したカラム（1.2×180
cm）に通し、DMFで溶出する。溶出液は３ｇづ
つ分画し、TLCにより追跡して43〜49番目のフ
ラクシヨンを集めて減圧濃縮する。残渣にエーテ
ルを加え、生じた白色粉末を遠心分離により集
め、エーテルで洗浄して〔１〕28mg（収率54.4
％）を得る。 融点、270℃（分解）、210℃で半融 TLC；RfE＝0.75 元素分析〔C169H259N37O52HCl・15H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 51.4 7.40 13.1 測定値 51.3 7.06 13.2 アミノ酸分析〔酸加水分解〕；Asp2.11(2)、
Thr0.97(1)、Ser7.30(8)、Glu2.28(2)、Pro8.70(9)、
Gly1.00(1)、Ala1.06(1)、Ile1.03(1)、Leu2.76(3)、
Tyr0.80(1)、Lys1.08(1)、Arg0.97(1) 前記のペプチドフラグメント〔２〕の物性およ
び製造法はChem.Pharm.Bull.，28(9)、2714〜
2719（1980）に記載されている。 (2)〔Tyr115〕−hCG〔115−145〕 〔２〕20mgにTFA0.6ml、アニソール0.1mlを加
え、室温で３時間放置する。反応液にエーテルを
加え、析出した沈澱物を遠心分離により集める。
これをエーテルで洗浄し、KOH上で減圧乾燥し
た後、エタレール４mlおよび５％酢酸４mlを加
え、パラジウム触媒の存在下水素添加する。触媒
を去し、母液を減圧濃縮する。残渣を水に溶か
し、凍結乾燥してふわふわした粉末を得る。 この粉末を５％酢酸に溶かし、これを５％酢酸
でセフアデツクスＧ−25を充填したカラム（2.2
×130cm）に通し、５％酢酸で溶出する。溶出液
は４ｇづつ分画し、275nmの吸光度の測定により
追跡して58〜70番目のフラクシヨンを集め、減圧
下で溶媒を留去する。残渣を水に溶かし凍結乾燥
して〔Tyr115〕−〔115−145〕17mg（収率85.2％）
を得る。 〔α２７ Ｄ−164.7゜（Ｃ＝0.2，水） TLC；RfD＝0.13，RfF＝0.10 アミノ酸分析〔酸加水分解〕；Asp2.01(2)、
Thr0.99(1)、Ser7.00(8)、Glu2.11(2)、Pro9.82(9)、
Gly1.00(1)、Ala1.05(1)、Ile0.99(1)、Ile0.99(1)、
Leu3.10(3)、Tyr0.80(1)、Lys1.02(1)、Arg1.00(1) 実施例 ２ 〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕；Ｈ−Tyr−Asp
−Pro−Arg−Phe−Gln−Asp−Ser−Ser−
Ser−Ser−Lys−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−
Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro
−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu
−Pro−Gln−OH (1) フラグメント114−115；Ｚ−Arg（NO2）−
Phe−NHNHBoc〔３〕 Ｚ−Phe−NHNHBoc〔E.Wunsch and G.
Wendlberger，Chem.Ber.，97，2504（1964）〕
2.0ｇからPd触媒存在下で水素添加分解により得
られるＨ−Phe−NHNHBocとＺ−Arg（NO2）−
OH1.7ｇをDMF20mlに溶かし、これに氷冷下
DCC1.2ｇおよびHOBt0.9ｇを加え、一夜撹拌す
る。反応後、析出した尿素誘導体を去し、液
を減圧濃縮する。残渣を酢酸エチルで抽出し、５
％重曹水、10％クエン酸水、水の順に洗浄する。
無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮する。残渣にエーテ
ルを加え、生じた沈澱物を取する。これを少量
のクロロホルムに溶かし、シリカゲルのカラムに
チヤージして３％メタノール含有クロロホルムに
よりクロマトグラフイーを行う。TLCでRfA＝
0.41付近のフラクシヨンを集めて減圧乾固して
〔３〕1.6ｇ（収率4.45％）を得る。 融点；120−125℃ 〔α〕２７ Ｄ−28.92（ｃ＝1.0，MeOH） TLC；RfA＝0.41，RfB＝0.79 元素分析〔C28H38N8O8として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 54.7 6.23 18.8 測定値 54.5 6.23 18.5 (2) フラグメント114−145；Ｚ−Arg（NO2）−
Phe−Gln−Asp−Ser−Ser−Ser−Ser−Lys
−（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−
Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu
−Pro−Gln−OBut〔４〕 Ｚ−Gln−Asp（OBzl）−Ser−Ser−Ser−Ser
−Lys（Boc）−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu
−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OBut〔５〕にエタノール10mlおよび
５％酢酸10mlを加えて溶解し、Pd触媒の存在下
で水素添加分解を行う。触媒を去し、液を減
圧濃縮する。残渣をDMF5mlに溶かし、Et3NでPH
８に調節する。 一方、〔３〕316mgにアニソール0.05mlおよび
TFA1mlを加え、室温で40分間放置した後、エー
テルを加える。生じた白色沈澱物を遠心分離によ
り集め、エーテルで洗浄した後、KOH上で減圧
乾燥する。このヒドラジドをDMF4mlに溶かし、
これに−20℃に冷却下6.4N塩化水素／ジオキサ
ン溶液0.16mlを加えた後、次いで亜硝酸イソペン
チル0.072mlを加える。５分後、反応液のPHを
Et3N0.15mlでPH８に調節する。このアジド溶液を
前記のPH調節したDMF溶液に加え、４℃で48時
間撹拌する。反応混合物をDMFで充填したセフ
アデツクスLH−20のカラム（1.5×180cm）に通
し、DMFで流出液は３ｇづつ分画し、TLCで追
跡して25日−30番目のフラクシヨンを集めて減圧
濃縮する。残渣にエーテルを加え、生じた白色沈
澱物を集める。この沈澱物を前記と同じ方法でゲ
ル過して白色固形物310mg（収率94.7％）を得
る。これをできるだけ少量のブタノール−酢酸−
水（４：１：５）の上層液に溶かし、上記と同一
溶媒で充填したシリカゲル（1.3×35cm）のカラ
ムに通し、上記と同一溶媒で溶出する。溶出液は
３ｇづつ分画し、TLCにより追跡して14−33番
目のフラクシヨンを集めて減圧濃縮する。残渣に
エーテルを加え、生じた白色沈澱物を遠心分離に
より集めて〔４〕287mg（収率87.7％）を得る。 融点；160℃で湿潤、187℃で分解 〔α〕２７ Ｄ−63.0（ｃ＝0.2，DMF） TLC；RfA＝0.20 元素分析〔C175H270N42O54 HCl 2H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 53.4 7.15 15.0 測定値 53.52 7.72 15.36 アミノ酸分析；Asp2.03(2)、Thr0.95(1)、
Ser7.77(8)、Glu2.17(2)、Pro8.96(9)、Gly1.00(1)、
Ala1.01(1)、Ile0.93(1)、Leu2.96(3)、Phe1.30(1)、
Lys1.05(1)、Arg1.84(2) 前記のペプチドフラグメント〔５〕の物性は、
Chem.Pharm.Bull.，28(9)，2714〜2719（1980）
に記載され、そのフラグメント自体およびその中
間フラグメントの製造法は同文献および同誌，28
(9)，2707〜2713（1980）に記載されている。 (3) フラグメント112−113；Ｚ−Asp（OBzl）−
Pro−NHNHBoc〔６〕 Ｚ−Asp（OBzl）−ONP4.8ｇとＨ−Pro−
NHNHBoc2.3ｇをEt3N1.4mlを含むジオキサン22
mlに溶かし、室温で一夜撹拌する。反応後、ジオ
キサンを減圧下留去し、残渣を酢酸エチルに溶か
した後、10％クエン酸水、５％重曹水、水の順に
洗浄する。無水芒硝で乾燥後、減圧濃縮し、残渣
に石油エーテルを加える。生じた沈澱物を集め無
定形粉末〔６〕4.45ｇ（収率78.2％）を得る。 〔α〕２７ Ｄ−78.9゜（ｃ＝1.0，MeOH） TLC；RfA＝0.49、RfB＝0.79 元素分析〔C29H36N4O8として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 61.3 6.38 9.9 測定値 61.2 6.60 9.6 (4) フラグメント112−145；Ｚ−Asp（OBzl）−
Pro−Arg−Phe−Gln−Asp−Ser−Ser−Ser
−Ser−Lys（BOc）−Ala−Pro−Pro−Pro−
Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr（But）−Pro
−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut〔７〕 〔４〕250mgにエタノール10mlおよび５％酢酸
水10mlを加えて溶解し、Pd触媒の存在下で水素
添加分解を行う。触媒を去し、液を減圧濃縮
する。残渣に0.1N塩酸0.19mlを含む水を加え、凍
結乾燥する。得られたペプチドをDMF3mlに溶か
し、Et3NでPH８に調節する。 一方、〔６〕183mgを6.4N塩化水素／ジオキサ
ン溶液0.21mlに溶かし、５分後、これにジオキサ
ン0.2mlを加えた後、室温で30分間放置する。次
いでDMF5mlを加え、−20℃に冷却下亜硝酸イソ
ペンチル0.045mlを加える。５分後、Et3Nで溶液
のPHを８に調節した後、このアジド溶液を前記の
PH調節したDMF溶液に加え、４℃で48時間撹拌
する。反応混合物をDMFで充填したセフアデツ
クスＧ−25のカラム（1.8×190cm）に通し、
DMFで流出する。流出液を３ｇづつ分画し、23
〜29番目のフラクシヨンを集めて減圧濃縮する。
残渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を遠心分離
により集めて〔７〕226mg（収率81.7％）を得
る。 融点；191℃（分解）、178℃で半融を併なう。 〔α〕２７ Ｄ−69.5゜（ｃ＝0.2，DMF） TLC；RfB＝0.19、Rfc＝0.51 元素分析〔C191H289N43O562HCl 11H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 52.7 7.25 13.8 測定値 52.4 7.20 13.8 アミノ酸分析；Asp3.20(3)、Thr1.02(1)、
Ser7.41(8)、Glu2.12(2)、Pro10.38(10)、Gly1.00
(1)、Ala1.03(1)、Ile0.93(1)、Leu2.89(3)、Phe1.16
(1)、Lys1.08(1)、Arg1.95(2)、NH32.94 (5) フラグメント（111−145）；Ｚ−Tyr−Asp
（OBzl）−Pro−Arg−Phe−Gln−Asp−Ser−
Ser−Ser−Ser−Lys（Boc）−Ala−Pro−Pro
−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg
−Leu−Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thy
（But）−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut
〔８〕 〔７〕51mgにエタノール２mlおよび５％酢酸２
mlを加えて溶解し、パラジウム触媒の存在下で水
素添加分解を11時間行う。触媒を去し、母液を
減圧濃縮し、残渣を1N塩酸0.012mlを含む水に溶
かして凍結乾燥してふわふわした粉末を得る。こ
の粉末をDMF5mlに溶かし、Et3N0.0033mlでPH８
に調節する。 一方、Ｚ−Tyr−NHNH277.1mgを1N塩化水
素／ジオキサン溶液0.067mlを含むDMF3mlに溶
かし、これに−30℃に冷却下亜硝酸イソアミル
0.033mlを加え、10分間撹拌した後、Et3N0.066ml
でPH８に調節した後、このアジド溶液を前記のPH
調節したDMF溶液に加え、氷冷下で２日間撹拌
する。反応混合物をDMFで充填したセフアデツ
クスLH−20のカラム（1.6×170cm）に通し、
DMFで溶出する。溶出液を３ｇづつ分画し、32
〜35番目のフラクシヨンを集めて減圧濃縮する。
残渣にエーテルを加え、生じた白色沈澱物を遠心
分離により集めて〔８〕36mg（収率68％）を得
る。 融点；198〜220℃（分解） 〔α〕２７ Ｄ−75.5゜（ｃ＝0.2，DMF） TLC；RfD＝0.76 アミノ酸分解〔酸加水分解〕；Asp3.25(3)、
Thr0.97(1)、Ser6.71(8)、Glu2.35(2)、Pro9.77(10)、
Gly0.96(1)、Ala1.00(1)、Ile0.98(1)、Leu2.93(3)、
Tyr1.03(1)、Phe0.93(1)、Lys0.91(1)、Arg2.06(2) (6) 〔Tyr111〕−hCG〔111−145〕 〔８〕20mgにTFA0.6mlおよびアニソール0.1ml
を加え、室温で３日間放置する。反応液にエーテ
ルを加え、析出した白色沈澱物を遠心分離により
集め、エーテルで洗浄した後、KOH上で減圧乾
燥する。この粉末にエタノール２mlおよび５％酢
酸２mlを加えて溶解し、パラジウム触媒の存在下
で水素添加分解を６時間行う。触媒を去し、母
液を減圧濃縮し、残渣を水に溶かして凍結乾燥す
る。得られた粉末を５％酢酸１mlに溶かし、これ
を５％酢酸で充填したセフアデツクスＧ−25のカ
ラム（2.2×135cm）に通し、５％酢酸で溶出す
る。溶出液は６ｇづつ分画し、275nmの吸光度の
測定により追跡して30〜35番目のフラクシヨンを
集め、減圧濃縮する。残渣を水に溶かし凍結乾燥
してふわふわした粉末の〔Tyr115〕−hCG〔115−
145〕11mg（収率62％）を得る。 〔α〕２６ Ｄ−144.3゜（ｃ＝0.2，水） TLC；RfD＝0.25 アミノ酸分析〔酸加水分解〕；Asp3.31(3)、
Thr0.95(1)、Ser7.27(8)、Glu2.37(2)、Pro10.86
(10)、Gly0.98(1)、Ala1.00(1)、Ile1.01(1)、Leu3.01
(3)、Tyr0.98(1)、Phe0.95(1)、Lys1.05(1)、
Arg2.24(2)。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 Ｈ−Tyr−Ｘ−Gln−Asp−Ser−Ser−Ser−
Ser−Lys−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−
Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−
Gln−OH （式中、Ｘは単結合または−Asp−Pro−Arg
−Phe−基を示す）で表わされるペプチドまたは
その塩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56140717A JPS5841850A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | ヒトじゆう毛性性線刺激ホルモン測定用ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56140717A JPS5841850A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | ヒトじゆう毛性性線刺激ホルモン測定用ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5841850A JPS5841850A (ja) | 1983-03-11 |
| JPS6257200B2 true JPS6257200B2 (ja) | 1987-11-30 |
Family
ID=15275066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56140717A Granted JPS5841850A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | ヒトじゆう毛性性線刺激ホルモン測定用ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5841850A (ja) |
-
1981
- 1981-09-07 JP JP56140717A patent/JPS5841850A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5841850A (ja) | 1983-03-11 |
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