JPS6259975B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血漿脂質の増加に起因する各種疾患
と密接な関係をもつと考えられている低比重リポ
蛋白質を選択的に吸着除去する低比重リポ蛋白質
吸着材に関する。

周知の如く、血液中の脂質、特に低比重リポ蛋
白質の増加は、動脈硬化の原因あるいは進行と密
接な関係を持つていると考えられている。動脈硬
化が進むと心筋梗塞、脳梗塞等循環器系の重篤な
症状に陥る可能性が非常に高くなり、死亡率も高
い。

そこで、血液、血漿等の体液成分から低比重リ
ポ蛋白質を選択的に吸着除去することによつて、
上記の如き疾患の進行を防止し、症状を軽減せし
め、さらには治ゆを早めることが期待されてい
た。

上記目的に使用可能な既存の技術には、アガロ
ースゲルにヘパリンを固定化した吸着材による吸
着（Lupien Ｐ−Ｊ、et.al.：Ａ new approach
to the management of familial
hypercholesterolemia.Removal of plasma−
cholesterol based on the principle of affinity
chromatography.Lancet、２：1261〜1264、
1976.）および、ガラスパウダーまたはガラスビ
ーズを用いたクロマトグラフイー（Carlson、L.
A.；Chromatographic separation of serum
lipoproteins on glass powder colums.
Description of the method and some
applications.Clin.Chim.Acta、５：528〜538、
1960.）がある。

しかしながら、ヘパリンをアガロースに固定し
た吸着材は、低比重リポ蛋白質に選択的吸着能を
示すものの吸着能力が充分でなく、また、担体に
アガロースを用いているため、機械的強度が不充
分で取り扱い性、操作性が悪く、体液を流した場
合の目づまりが起こり易く、また、減菌操作によ
るポアーの破壊があり、非常に使い難いものであ
つた。

また、ガラスパウダーやガラスビーズを用いる
方法は、吸着能力が低く、その上、吸着選択性が
低いという欠点があり、実用的でなかつた。

本発明の目的は、上記の如き従来技術に基づく
吸着材の問題点に鑑み、一般的に普及可能であ
り、低比重リポ蛋白質を高い効率で選択的に吸着
し、非選択的な吸着が少なく、安全性があり、滅
菌操作も簡単に行なうことができ、体液浄化ある
いは再生用に適した吸着材を提供しようとするも
のである。

本発明者らは、上記目的に沿つて鋭意研究した
結果、分子中に負電荷を有する置換基を多数個持
ち、分子量の大きい高分子ポリアニオン部を不溶
性担体表面にリガンドとして有する吸着材が、驚
くべきほど高い効率で低比重リポ蛋白質を吸着
し、免疫グロブリン、アルブミン、補体、フイブ
リノーゲン等の非選択的吸着が少ないことを見出
し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、不溶性担体表面にリガン
ドとして分子量が25000以上である高分子ポリア
ニオン部を有することを特徴とする低比重リポ蛋
白質吸着材であり、分子量が25000以上である高
分子ポリアニオン部が、鎖状構造の高分子ポリア
ニオン部であることが好ましく、また分子量が
25000以上である高分子ポリアニオン部が、負電
荷を示す置換基を分子量1000当りに少なくとも１
個持つた高分子ポリアニオン部であることが好ま
しい。

本発明で対象とする吸着物質は、低比重リポ蛋
白であるが、より詳細に説明すると、分子量が
2.2×10⁶から3.5×10⁶、水和密度が1.003から
1.034（ｇ／ml）、浮上係数（1.063）が０から20
×10^-13cm・sec^-1・dyn^-1・ｇ^-1、直径が20.0から
30.0nｍのリボ蛋白（SCANU、A.M.：plasma
lipoproteins：an introduction.“The
Biochemistry of Atherosclerosis”ed.by
SCANU A.M.、1979、P.3〜８、による）を言
う。これより比重の小さいリポ蛋白、すなわち、
浮上係数（1.063）が20×10^-13・sec^-1・dyn^-1・
ｇ^-1より大きいリポ蛋白質は吸着されてもよい
が、比重の高い高比重リポ蛋白は吸着されないこ
とが好ましい。

本発明で言う高分子ポリアニオン部とは、１分
子の分子量が25000以上であり、１分子中にカル
ボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのよう
に、血液、体液等の中性電解液中で負電荷を示す
置換基を多数個持つものを言う。例示すると、ポ
リガラツクロン酸、リン酸化マンナン、コンドロ
イチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン
Ｃ、ヒアルロン酸、アルギン酸等の酸性多糖類、
ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、スチレン−
マレイン酸共重合体、ポリスチレンスルホン酸、
ポリエチレンスルホン酸、ポリ−α−メチルスチ
レンスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリホスフ
エイトエステル、ポリビニルスルホン酸、ポリス
チレンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸等の合成
高分子ポリアニオンのようなものが挙げられる。

また、吸着目的物質である低比重リポ蛋白質
は、直径が約200Åと言う巨大なリポ蛋白である
ため、高分子ポリアニオン部の構造は鎖状構造で
あることが好ましく、吸着材表面から長く伸びて
いる方が好ましい。また、高分子ポリアニオン部
中の負電荷を示す置換基の密度は、分子量1000の
単位に少なくとも１個負電荷を示す置換基がある
のが好ましく、分子量300の単位に１個以上がさ
らに好ましく、分子量70から200の単位に１個あ
るのが望ましい。ここで言う分子量には、負電荷
を示す置換基の分子量も含む。また、負電荷を示
す官能基の中では、カルボキシル基が特に良好な
吸着性能を示す。高分子ポリアニオン部の分子量
は、小さくなると低比重リポ蛋白質をあまり吸着
しなくなるので、少なくとも25000は必要であ
る。好ましいのは30000以上であり、より好まし
くは50000から250000の範囲である。

高分子ポリアニオン部が持つ多数個の負電荷が
低比重リポ蛋白質の多数点を認識することによ
り、強いクーロン力で低比重リポ蛋白質を結合す
ると考えられる。

以下、本発明の吸着材を製造する方法につい
て、担体を活性化し、リガンドを結合する通常の
アフイニテイ−クロマトグラフイー用吸着材の製
造方法にしたがつた製造方法を例に挙げて説明す
る。

担体は分子量が25000以上である高分子ポリア
ニオンが固定できればよく、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる
場合には、時に担体へのアルブミンの非特異的吸
着が生じるため、親水性担体の方が好ましい結果
を与える。

不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸
状、膜状等いずれの公知の形状も用いうるが、分
子量が25000以上の高分子ポリアニオンの保持
量、吸着材としての取扱い性よりみて、粒子状、
繊維状のものが好ましい。

粒子状担体としては、平均粒径25μｍないし
2500μｍの範囲にあることが好ましい。平均粒径
はJIS−Ｚ−8801に規定されるフルイを用いて流
水中で分級した後、各級の上限粒径と下限粒径の
中間値を各級の粒径とし、その重量平均として平
均粒径を算出する。また、粒子形状は球形が好ま
しいが、特に限定されるものではない。平均粒径
が2500μｍ以上では、低比重リポ蛋白質の吸着量
および吸着速度が低下するし、25μｍ以下では、
凝固系の活性化、血球粘着をおこしやすい。使い
うる粒子状担体としては、アガロース系、デキス
トラン系、セルロース系、ポリアクリルアミド
系、ガラス系、シリカ系、活性炭素等が挙げられ
るが、ゲル構造を有する親水性担体が良好な結果
を与える。また、通常固定化酵素、アフイニテイ
クロマトグラフイに用いられる公知の担体は、特
別な限定なく使用することができる。ここで、担
体の蛋白質排除限界分子量は200万以上あること
が必要であり、250万から1000万が好ましく、300
万から700万の範囲にあるのがさらに好ましい。

粒子状担体としては、多孔性粒子、特に多孔性
重合体を用いることもできる。本発明で用いられ
る多孔性重合体粒子は、その表面に分子量25000
以上の高分子ポリアニオンを固定化しうるもので
あり、平均孔径200Åないし3000Å、より好まし
くは250Åないし1000Åの範囲、望ましくは300か
ら700Åの範囲にあるものである。重合体組成
は、ポリアミド系、ポリエステル系、ポリウレタ
ン系、ビニル化合物の重合体等、多孔性構造をと
りうる公知の重合体を用いることができるが、特
に親水性モノマーにより親水化したビニル化合物
系多孔性重合体粒子が好ましい結果を与える。

本発明の吸着材は、体液の浄化治療用に用いら
れるので、体液を流したときに目詰まりが起らな
いことが必要である。したがつて、本発明に用い
られる担体は硬質担体であることが好ましく、合
成高分子担体、無機担体等が好ましく用いられ
る。ここで言う硬質担体とは、外力を加えたと
き、担体の物性値が一定値以上を保持するものを
言うが、具体的には、ゲルを直径10mm、長さ50mm
の容器に充填し、通水するとき、カラムの入口圧
力と出口圧力との差が、200mmHgの状態でゲルの
体積減少率が10％以下であるのが好ましい。

前記多孔性構造は、平均孔径200Åないし3000
Åの範囲にあるのが好ましいが、平均孔径が小さ
すぎる場合には、吸着される低比重リポ蛋白質の
量が少なく、大きすぎる場合には、重合体粒子の
強度が低下し、かつ表面積が減少するため実用的
ではない。ここで、表面積は少なくとも10m²／ｇ
以上であることが好ましく、55m²／ｇ以上である
ことがさらに好ましい。望ましくは100m²／ｇ以
上である。

平均孔径の測定は水銀圧入式ポロシメーターに
よつた。この方法は、多孔性物質に水銀を圧入し
てゆき、浸入した水銀量から気孔量を、圧入に要
する圧力から孔径を求める方法であり、40Å以上
の孔を測定することができる。本発明の孔とは、
孔径が40Å以上の表面からの連通孔と定義する。
平均孔径は、孔径をｒ、ポロシメーターで測定し
た累積気孔量をＶとしたとき、dV／dlogrの値が
最大となるときのｒの値とする。

繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が１
μｍないし50μｍ、より好ましくは５μｍから25
μｍの範囲にあるものがよい。繊維径が大きすぎ
る場合には、低比重リポ蛋白質の吸着量および吸
着速度が低下するし、小さすぎる場合には、凝固
系の活性化、血球粘着、目づまりをおこしやす
い。用いうる繊維状担体としては、再生セルロー
ス系繊維、ナイロン、アクリル、ポリエステル等
公知の繊維を一般に用いることができる。

高分子ポリアニオンを不溶性担体の表面に固定
する方法は、共有結合、イオン結合、物理吸着、
包理あるいは重合体表面への沈澱不溶化等あらゆ
る公知の方法を用いることができるが、高分子ポ
リアニオンの溶出性から考えると、共有結合によ
り、固定、不溶化して用いることが好ましい。そ
のため通常固定化酵素、アフイニテイクロマトグ
ラフイで用いられる公知の担体の活性化方法およ
びリガンドの結合方法を用いることができる。

活性化方法を例示すると、ハロゲン化シアン
法、エピクロルヒドリン法、ビスエポキシド法、
ハロゲン化トリアジン法、ブロモアセチルブロミ
ド法、エチルクロロホルマート法、１・1′−カル
ボニルジイミダゾール法等をあげることができ
る。本発明の活性化方法は、リガンドのアミノ
基、水酸基、カルボキシル基、チオール基等の活
性水素を有する求核反応基と置換および／または
付加反応できればよく、上記の例示に限定される
ものではないが、化学的安定性、熱的安定性等を
考慮すると、エポキシドを用いる方法が好まし
く、特にエピクロルヒドリン法が推奨できる。

また、シリカ系、ガラス系等のシラノール基を
持つ担体については、各種シランカツプリング剤
が好ましく用いられる。

担体に本発明で言う高分子ポリアニオンを２種
類以上結合してもさしつかえない。高分子ポリア
ニオンの担体に対する固定量は10μｇ／ml以上必
要であり、100μｇ／mlから40mg／／mlの範囲が
好ましく、0.5mg／mlから20mg／mlの範囲がさら
に好ましい。

以上本発明吸着材の製造方法としては、担体を
活性化した後、高分子ポリアニオンを結合する方
法について詳細に説明したが、本発明は、これに
限定されるものではない。

例えば、本発明で言う高分子ポリアニオン部を
有する重合性モノマーや架橋剤を用いて重合（共
重合）する方法、架橋重合体粒子に、さらに後架
橋する時点で高分子ポリアニオン部を有する架橋
剤を用いる方法等も採用することができる。ま
た、高分子ポリアニオンを活性化した後に担体と
結合する方法も採用することができる。

すなわち、本発明は、吸着材表面に高分子ポリ
アニオン部を有することにより、その効果を発揮
するものであり、製造方法に左右されるものでは
ない。

本発明低比重リポ蛋白質吸着材は、体液の導出
入口を備えた容器内に充填保持されて使用される
のが一般的である。

図面において、１は本発明低比重リポ蛋白質吸
着材を納めてなる吸着装置の一例を示すものであ
り、円筒２の一端開口部に、内側にフイルター３
を張つたパツキング４を介して体液導入口を有す
るキヤツプ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部
に内側にフイルター３′を張つたパツキング４′を
介して体液導出口７を有するキヤツプ８をネジ嵌
合して容器を形成し、フイルター３および３′の
間隙に吸着材を充填保持させて吸着材層９を形成
してなるものである。

吸着材層９には、本発明低比重リポ蛋白質吸着
材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合も
しくは積層してもよい。他の吸着材としては、例
えば、幅広い吸着能を有する活性炭のようなもの
を用いることができる。これにより吸着材の相乗
効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材
層９の容積は、体外循環に用いる場合、50〜400
ml程度が適当である。本発明の装置を体外循環で
用いる場合には、大略次の二通りの方法がある。
一つには、体内から取り出した血液を遠心分離器
もしくは膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と
血球成分とに分離した後、血漿成分を該装置に通
過させ、浄化した後、血球成分と合わせて体内に
もどす方法であり、他の１つは体内から取り出し
た血液を直接該装置に通過させ、浄化する方法で
ある。

また、血液もしくは血漿の通過速度について
は、該吸着材の吸着能率が非常に高いため、吸着
材の粒度を粗くすることができ、また充填度を低
くできるので、吸着材層の形状に如何にかゝわり
なく、高い通過速度を与えることができる。その
ため多量の体液処理をすることができる。

体液の通液方法としては、臨床上の必要に応
じ、あるいは設備の装置状況に応じて、連続的に
通液してもよいし、また断続的に通液使用しても
よい。

本発明の吸着材は、以上述べてきたように、体
液中の低比重リポ蛋白を高率かつ選択的に吸着除
去し、該吸着材を用いた吸着装置は非常にコンパ
クトであると共に簡便かつ安全である。そして、
血漿蛋白中の免疫グロブリンフイブリノーゲン、
補体等、重要な役割りを持つ成分を非選択的に吸
着することが少なく、高い効率で低比重リポ蛋白
質を吸着でき、さらに凝固線溶、補体系を活性化
することが少ない。

本発明は、高脂血症等の体液を浄化、再生する
一般的な用法に適用可能であり、高脂血症に起因
した症患の安全で確実な治療に有効である。

以下実施例により、本発明の実施の態様を詳細
に説明する。

実施例 １ 担体として、平均細孔径が400Å、細孔の表面
積が90m²／ｇのシリカゲル2.5ｇ（10ml）を３−
グリシドキシプロピルトリメトキシシランの20重
量％アセトン溶液62.5ml中に入れ、50℃で振とう
しながら40時間反応させた。この後、充分量のア
セトンで洗浄後、蒸留水で洗浄し、0.1M炭酸バ
ツフアー（PH9.8）で置換した。

次に、この活性化ゲルをアルギン酸ナトリウム
（分子量32000〜240000）200mgを含む0.1M炭酸バ
ツフアー100ml中に懸濁した。50℃で20時間、振
とうしながら反応させ、その後、室温で１週間静
置した。この後、充分水洗して低比重リポ蛋白質
吸着材を得た。

アルギン酸ナトリウムの固定量は6.7mg／mlge
であつた。

吸着実験は、ヒト血漿５容と吸着材１容を混合
し、37℃、３時間インキユベートした。吸着後の
低比重リポ蛋白をヘパリン−カルシウム沈澱法に
て、免疫グロブリンＧ（IgG）、免疫グロブリン
Ａ（IgA）、補体C3cをシングルラジアルイムノデ
イフユージヨン法にて測定した。

その結果、吸着前の低比重リポ蛋白質が400
mg／dl、IgGが1100mg／dl、IgAが250mg／dl、
C3cが90mg／dlであつたのに対し、吸着後の血漿
では、低比重リポ蛋白質が吸着前の血漿濃度の19
％に下つたが、IgG、IgA、C3cは、それぞれ92
％、83％、78％とあまり下らなかつた。

比較例 １ 実施例１と同様にして得た活性化ゲルをヘパリ
ンナトリウム（分子量7000〜20000）200mgを含む
0.1M炭酸バツフアー100ml中に懸濁し、実施例１
と同様に固定化反応を行なつた。ヘパリンナトリ
ウムの固定量は7.1mg／mlgelであつた。

得られた吸着材を用いて、実施例１と同様に吸
着実験を行なつた結果、吸着後の血漿中、低比重
リポ蛋白質は吸着前の70％にしか下らなかつた。
IgG、IgA、C3cは、それぞれ90％、89％、76％
であつた。

実施例 ２ 実施例１と同様にして得た活性化ゲルをポリガ
ラクツロン酸（分子量60000〜80000）200mgを含
む0.1M炭酸バツフアー100ml中に懸濁し、実施例
１と同様に固定化反応を行なつた。

ポリガラクツロン酸ナトリウムの固定量は6.8
mg／mlgelであつた。

得られた吸着材を低比重リポ蛋白質吸着材とし
て残用し、実施例１と同様に吸着実験を行なつ
た。その結果、吸着後の血漿中、低比重リポ蛋白
質は吸着前の25％に下つたのに対し、IgG、
IgA、C3cは、それぞれ90％、85％、80％とあま
り下らなかつた。

実施例 ３ 実施例１と同様にして得た活性化ゲルをヒアル
ロン酸ナトリウム（分子量100000〜10000000）
200mgを含む0.1M炭酸バツフアー100ml中に懸濁
し、実施例１と同様に固定化反応を行なつた。

ヒアルロン酸ナトリウムの固定量は5.4mg／ml
gelであつた。

得られた吸着材を低比重リポ蛋白質吸着材とし
て使用し、実施例１と同様に吸着実験を行なつ
た。その結果、吸着後の血漿中、低比重リポ蛋白
質は吸着前の25％に下つたのに対し、IgG、
IgA、C3cは、それぞれ85％、82％、76％とあま
り下らなかつた。

実施例 ４ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ（Ｘ＝0.40）、酢酸エチル100ｇ、ヘプタ
ン100ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度500）7.5ｇお
よび２・2′−アゾビスイソブチロニトリル3.8ｇ
よりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１
重量％、リン酸二水素ナトリウム二水和物0.05重
量％およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物
1.5重量％を溶解した水400mlとをフラスコに入
れ、十分撹拌したのち、65℃で18時間、さらに75
℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合を行ない、粒状
共重合体を得た。過水洗、ついでアセトン抽出
後、カセイソーダ46.5ｇおよびメタノール２よ
りなる溶液中で40℃で18時間、共重合体のエステ
ル交換反応を行なつた。

得られたゲルの平均粒径は150μｍ、単位重量
あたりのビニルアルコール単位（ｑ OH）は
9.0meq／ｇ、比表面積は60m²／ｇ、デキストラ
ンによる排除限界分子量は６×10⁵であつた。

次に、得られたゲル10ｇ（乾燥重量）をジメチ
ルスルホキシド120ml中に懸濁し、これにエピク
ロルヒドリン78.3ml、30％水酸化ナトリウム10ml
を加え、30℃で５時間撹拌しながら活性化反応を
行なつた。反応後ジメチルスルホキシドで洗浄
し、水洗し、吸引脱水した。次に、この活性化ゲ
ルをアルギン酸ナトリウム2.0ｇを含む0.1M炭酸
ナトリウムバツフアー（PH9.8）1000ml中に懸濁
した。50℃で20時間、撹拌しながら固定化反応を
行ない、その後、60.6mg／mlのトリス（ヒドロキ
シエチル）アミノメタン溶液33mlを加え、さらに
50℃５時間、撹拌しながらブロツキング反応（残
存活性基をブロツクする）を行つた。この後、充
分水洗して低比重リポ蛋白質吸着材を得た。この
吸着材に固定されたアルギン酸ナトリウムの量は
8.9mg／mlgelであつた。

該吸着材をもとのゲル粒子と比較して光学顕微
鏡で観察したところ、カケ、クダケ等の破壊はみ
られなかつた。

この吸着材を内径10mm、長さ50mmのカラム２本
に充填し、１本にはACD加血漿を0.4ml／minの
流速で20ml、もう１本にはACD加血液を0.7ml／
minの流速で35ml流した。いずれのカラムも充填
体積の低下、目詰まり、流量低下はみられず、カ
ラム前後の圧力差も血漿で10mmHg以下、血液で
も10〜20mmHgの範囲であつた。

カラム通過前後の血漿蛋白および血液血球成分
の変動を調べたところ、血漿では、吸着後の低比
重リポ蛋白質は21％に下つたが、IgG、IgA、
C3cは、それぞれ93％、85％、77％とあまり下ら
なかつた。

また、血液では、カラム通過前後の赤血球、白
血球、血小板の濃度に有意な差は認められなかつ
た。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明低比重リポ蛋白質吸着材を使用し
た吸着装置の１例を示す断面図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 不溶性担体表面に、リガンドとして分子量が
   25000以上である高分子ポリアニン部を有するこ
   とを特徴とする低比重リポ蛋白質吸着材。 ２ 分子量が25000以上である高分子ポリアニオ
   ン部が、鎖状構造の高分子ポリアニオン部である
   特許請求の範囲第１項記載の低比重リポ蛋白質吸
   着材。 ３ 分子量が25000以上である高分子ポリアニオ
   ン部が、負電荷を示す置換基を分子量1000当りに
   少なくとも１個持つた高分子ポリアニオン部であ
   る特許請求の範囲第１項記載の低比重リポ蛋白質
   吸着材。