JPS6265694A - 超分泌性酵母変異株および該変異株からポリペプチドを産生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 近年の組換えＤＮＡ工学の発展により、大規模発酵にお
いて生育可能な細菌や酵母の主な４Ｌ物からの遺伝子発
現が可能となって来ている。この生命工学は幾多の努力
を経て工業的規模で可能な発酵プロセスに発展し、これ
により、従来動物や人間の組織から単離されねばならな
かった酵素やホルモンの様な蛋白質を微生物により産出
することができる。多くの場合、この様な発酵プロセス
における費用の大部分は、可能な限り純粋な状態で所望
の生成物を回収するための工程にかかるものである。通
常、所望の生成物を他の細胞成分から単離しそして精製
する前に、微生物を破砕しそしてその内容物を変性体に
溶解しなくてはならない。

これらの工程は生成物の最終価格を更に上げることにな
る。

この様な冗長な精製工程を避けるための１つの方法は、
微生物を変異せしめてその発酵中に直接生育培地中に所
望の生成物を分泌し得る様にすることである。この様に
すれば、生育した細胞を単に簡単な遠心分離又はろ過工
程によって除去することにより、生成物を直接にかつ比
較的純粋な形で得ることができる。

酵母サッカロミセス・セレビジエは蛋白質生成物の分泌
製造の目的での微生物としてしばしば使用されている。

というのはこれは何世紀もの長い開裂パンならびに醸造
工業の分野で使用されており、この種を大規模に生育さ
せることについては良く知られているからである。又、
これが産生ずる大部分の蛋白質が分泌可能であることも
知られている。

しかしながら、異種構造の遺伝子から蛋白質生成物を産
生じそして分泌させるためにサッカロミセス・セレビジ
エを使用しようとする従来の試みは雑多な結果となって
しまっている。蛋白質生成物の分泌収率は、発現遺伝子
ならびに該遺伝子発現のため選ばれたプロモーターおよ
びシグナル配列の双方に依存するものであった。

（Ｈ４ｔｚｅｍａｎ、　Ｒ，Ａ、、　Ｌｅｕｎｇ＋　Ｄ
、Ｗ、、　Ｐｅｒｒｙ、　１．、　、＋、１ｋｏｈｒ、
　Ｈ，Ｊ、＋Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｉｔ、　Ｌ、およびＧｏ
ｅｄｄｅｌ、　Ｄ。

Ｖ３等著ｒｓｃｉｅｎｃｅ　、１−２１−９．　６２０
−６２５（１９８３年）　　；　Ｂｉｔｔｅｒ、　Ｇ、
　Ａ、、　Ｃｈｅｕ、　Ｋ、　Ｋ、。

Ｂｏｕｋ、　Ａ、　Ｒ，および１、ａｔ、　Ｐ、−Ｉｆ
、等著ｒＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｕ、［ＪＳＡ−１８３，、
５３３０−５３３４（１９８４年）　　；　Ｂｒａｋｅ
、＾、　Ｊ、、　Ｍｅｒｒｙ−ｗｅａｔｔｒｅｒ、　Ｊ
、　Ｐ、、　Ｃｏ１ｔ、　１１．　Ｇ、、　１ｌｅｌｅ
ｅｒｌｅｉｎ、　Ｖ。

Ａ−＋　Ｍａｐａｉａｒｚ、　Ｐ、　Ｒ，。

Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈ、　ｃ、　Ｔ、、　ｌ１ｒｄｅａ
、　Ｍ、　ｓ、ｌ　Ｖａｌｅｕｚｕｅｌａ。

Ｐ、およびＢｕｒｒ、　Ｐ、　Ｊ、等著ｒＰｒｏｃ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡＪ−β−１−，４６４２−４６４６（１９８４年
）：およびＢｒａｋｅ、　Ａ、　Ｊ、、　Ｃｏｕｓｅｕ
ｓ、　Ｌ、　Ｓ、、　Ｕｒｄｅａ＋Ｍ、　Ｓ、、νａｌ
ｅｕｚｕｅｌａ、　Ｐ、　１１．　Ｔ、等による欧州特
許出願公告第０１２１８８４号（１９８４年）参照、）
通常、ある特殊な蛋白質はかなり良好な製造レヘルで得
ることが可能であるが、生成した全体量の小部分のみが
実際に培地中に遊離体として得られるにすぎない場合が
多い。多くの！に成蛋白質は細胞内にそのまま留まり、
そしてこの種にみられる細胞内液胞中に存在することが
多い。酵母における分泌は分枝進行すると考えられる。

すなわち、分泌された酵母蛋白質のあるものは液胞中に
分泌されたままであり、また他のものは原形質膜から周
辺質さらにはその外部へと分泌される。

（Ｓｈｅｃｋｍａｎ＋　Ｒ，、Ｎｏｖｉｃｋ、　Ｐ、、
　５ｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｎ、ＩＪｏｎｅｓ、　
Ｅ、　Ｗ、およびＢｒｏａｃｈ＋　Ｊ、　Ｒ，等線「酵
母サッカロミセス・セレビジエの分子生物学（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓ
ｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）　Ｊ　　（コールドスプリングハーバ−研究所（ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、コールドスプリング、ニューヨーク（１９８１
年）、第３６１−３９８頁参照。）明らかに、異質遺伝
子の蛋白質生成物のあるものは、液胞分枝中に分泌され
ている。

Ｒｏｔｔｒｓｔｅｉｎ＋　Ｊ、　Ｈ，および５ｔｅＶｅ
ｎＳ＋↑、１１（米国定期会合の遺伝子学会における発
表）　　（１９８４年８月３１日）ならびにＥｍｒ、　
Ｓ、　（酵母発現ベクターシンポジウムにおける発表）
（バンバリーセンター（Ｂａｕｂｕｒｙ　Ｃｅｎｔｅｒ
）　、コールドスプリングハーバ−研究所、１９８４年
６月２１日−２４日）の最近の研究によれば、酵母分泌
進行における酵母蛋白質の分子内局在に影響を及ぼすホ
スト細胞変異体が単離されることが示された。天然酵母
蛋白質（カルボキシペプチダーゼＹ）および２種の酵母
蛋白質の融合体（カルボキシペプチダーゼＹとインベル
ターゼ）は両方とも、ホスト細胞突然変異生成および選
択により、液胞から細胞外に再分泌された。しかしなが
ら、これらの選択法のいずれによっても生成された変異
株を使用して異種蛋白質を分泌生成する事は未だ実際に
行われてはいない。更に又そのいずれの場合においても
、特定の蛋白質の細胞外分泌を可能ならしめるために突
然変異体細胞を選択することには多大な困難があった。

この研究方法は必須でない遺伝子生成物の定量的スクリ
ーニング分析からは大きくかけはなれたものであり、又
得られた変異株の分布についても強力な偏見をもたらし
得るものである。又これらの研究はいずれも分泌蛋白質
自体の収率向上のためのものではなく、むしろ酵母分泌
の一般的研究のために変異体を単離する事を目的とする
ものであった。

あるグループはある種の酵母株に関連したキラー毒素を
過分泌する酵母変異株を単離する方法を発表している。

（Ｂｕｓｓｅｙ、　Ｉｔ、、　５ｔｅｉｎｎｕｅｔｚ＋
　Ｏ，および５ａｖｉｌｌｅ、　Ｄ、等著［最新遺伝子
学Ｊ　　（ｃｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）　７　、
　４４９　４５６　（１９８３年）参照。）しかしなが
らこのグループは、毒素の蛋白質分解速度を減少し、あ
るいは産生細胞の細胞壁に結合した量を減少する染色体
変異体の単離にのみ成功したにすぎない。そして、酵母
分泌進行中のこのポリペプチドの実際の転座は遂行され
ていなかった。

本発明の目的は、蛋白質の様なポリペプチドの分泌能の
増加した変異体酵母細胞を提供することにある。

本発明の他の目的は、蛋白質の様なポリペプチドの分泌
能の増加した変異体酵母細胞を選択するための該細胞の
スクリーニング法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、蛋白質の様な異種ポリペプチ
ドの遺伝子を有する組換えプラスミドの全部又は一部で
形質転換した酵母細胞からの分泌によって、蛋白質の様
な異種ポリペプチドを製造する方法を提供することにあ
る。

本発明の更に他の目的は、蛋白質の様な異種ポリペプチ
ドを産４Ｉミし分泌するサッカロミセス・セレビジエの
変異株を提供することにある。

本発明者らは蛋白質の様な異種ポリペプチドを効率良く
分泌可能な能力を有する酵母の変異株が得られることを
発見した。酵母細胞中に蛋白質化成物を産生ずる際に、
その産生４に酸物は必要に応じて化学処理されそして細
胞ｌΔ養培地中に抽出される。

本発明によれば、成熟蛋白質（Ａ蛋白質）の様な所望の
ポリペプチド生成物を超う替芯性酵母細胞から高収率で
得る事が出来、これは該酵母細胞から分泌されたポリペ
プチド１成物を収築する事により行われる。該酵母細胞
は、形質転換可能な出発酵母株をｉＩ訳し、次にこの酵
母株を突然変異Ｕ゛しめて変異細胞を生成するかあるい
は自然変異により変異細胞を生成することによって得る
ことができる。この変異細胞は異種ポリペプチドを分泌
する様に形質転換される。この変異細胞は次に、出発株
が分泌する量よりも２倍以上多い量の前記異種ポリペプ
チドを分泌する様に形質転換された所望の細胞を選択す
る様にスクリーニングされる。

こうして最終的に得られた細胞を培養して高収量の異種
ポリペプチドを得る。この最終細胞は培養前にその組換
えプラスミドを矯正して再度所望のポリペプチド生成物
を産生じ得る遺伝子で形質転換する事も出来るし、ある
いは又、矯正する事なく更に他のポリペプチド産生用遺
伝子で形質転換する事も出来る。又ある場合には、原株
を形質転換する遺伝子として、その超分泌性変異株中に
所望のポリペプチド生成物を産生ずる様な遺伝子を使用
しても良い。

前記変異細胞は、突然変異誘発の前または後に形質転換
する事ができる。

好ましくはポリペプチドはプロキモシンである。

理由は、その生成ならびに分泌が、突然変異により生成
した超分泌性変異株の同定のためのスクリーニング分析
において簡昨にしかも効率良く測定し得るためである。

サッカロミセス・セレビジエは形質転換されるのに好ま
しい酵母種である。この酵母株はこの株に導入される遺
伝子にとって最も好ましいものである形質発現および分
泌のためのＤＮＡ配列を有している。第２の形質転換工
程すなわち他の形質転換株に変換する工程では、好まし
くは所望の異種ポリペブチ＋”　＜好ましくは成熟蛋白
質である）を分泌可能とする様な遺伝子を導入する。

本発明によれば、所望のポリペプチド生成物を産生ずる
超分泌性株である変異酵母株が提供され、これらは通常
の酵母株よりも異種ポリペプチドあるいは蛋白質の分泌
能が高い。驚（べき事には、その変異株は、生成物の発
現レベルが該超分泌性株を変異誘発した原株と通常同様
であるか否かにかかわらず、所望の生成物に対して超分
泌性である。

本発明は、超分泌性酵母株を選択するためのスクリーニ
ング法を提供する。この方法は、酵母細胞を固体の栄養
基板上に拡散してプロキモシンの遺伝子で形質転換した
個々のコロニーを生育させることから成る。肉眼で見え
る程度に生育した後に基板からとり除き、カゼイン含有
溶液を一ト張りとしての固化物質に加える。このカゼイ
ン含有液は好ましくはミルクであり、固化物質は好まし
くはアガロースである。次の培養工程でクロット生成が
認められ、このクロットを生成する細胞を超分泌性酵母
株として使用するために回収する。

本発明のスクリーニング法は好ましくは前記した形質転
換、突然変異誘発および選択工程の全過程を行うことに
より遂行する。選択工程の後に超分泌性株を矯正しそし
て再度形質転換する事ができ、あるいは又ある場合には
、効率的なスクリーニング法を促進した使用生成物が所
望の最終生成物であり、この場合更に付加的な形質転換
は不用である。

種々の成熟蛋白質やポリペプチドを得るために特に好ま
しいものであるとして見出されたサン力ロミセス・セレ
ビシェの特殊な超分泌性株としては、ｌ９８５年４月５
日にＡ　Ｔ　ＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託したＡ　’ｒ
ＣＣ寄記番号陽２０７５０．２０７５２および２０７５
２を挙げることができる。本明細書中で述べている様に
、これらの株は、ポリペブチ１゛および特殊な成熟蛋白
質生成物を産生ずる様に、プロキモシン遺伝子を他の公
知の遺伝子で交換した細胞を含有するものである。この
様に、特別に意図されたポリペブチ１′を生成するため
に、寄託しである株を更に形質転換する様に従来技術や
方法を使用する事もできる。驚くべき事には、ある種の
特定のポリペプチド生成物を高レベルで分泌する株に所
望のＤＮＡ分節を与えると、他のポリペプチド生成物を
高レベルで産生ずる事が見出された。

本文記載の方法は公知の実験装置を使用して簡単に行う
事が出来、そして通常は低い産生能しか持たない酵母株
から高収率の所望のポリペプチドならびに特殊な成熟蛋
白１Ｔ４ト成物を得る事が出来るのであり、これが本発
明の特徴の１つである。

（通常の株は例えこれらがその変異株と同様に多くの生
成物を産律発現し得たとしても、その変異株よりも分泌
量が少ないからである。）又本発明によれば、特に好ま
しい高分泌性の酵母株が得られ、そしてこれらは更に多
数の異なるポリペプチド生成物を生成する様に適当に形
質転換した時に有用であり、これが本発明の更に別の特
徴である。

プロキモシンは超分泌性細胞を同定するためのスクリー
ニングにおいて使用するための遺伝子生成物としては特
に好ましい物であるが、多くの場合は、プロキモシン以
外の生成物が要求される。

この様な場合には、その選択した超分泌性株を、その超
分泌性細胞群からプロキモシン遺伝物質を含有しない細
胞を更に公知法により選択することにより矯正する事が
できる。こうして矯正し選択された細胞は更に最初に形
質転換する際に使用した様な公知の形質転換法、例えば
、それに限定されるものではないが、伊藤、幅用、材用
および木村等著「細菌学ジャーナルｊ１５３．１６３−
１６８　（１９８３年）に記載の塩化リチウム法：Ｓｈ
ｅｒｍａｔ＋＋　Ｆ、、　Ｆｉｎｋ、　Ｇ、　Ｒ，およ
び旧ｃｋｓ、　Ｊ、　８゜等著［酵母遺伝学における方
法、実験様便覧（Ｍｅｔｈｏｄ＠７ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　
Ｇｅｖｅｔｉｃｓ　１．ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ）１（コールドスプリングハーバ−ｔｉｌｔ　究’
Ｔ’Ｊｔ　、コールドスプリングハーバ−、ニューヨー
ク）（１９８１年）に記載のスフェロプラスト法：ある
いは前記細胞を融合して他の形質転換株を生成する方法
等によって更に形質転換する事ができる。

最終的に形質転換された超分泌性細胞が生育している培
地からの所望の生成物の単離は公知の方法によって行う
ことができる。例えば、液体の場合には培養培地は細胞
から物理的に分離する事ができ、そして得られた最終生
成物の性質に依存して、該培地をろ過、カラム分離等の
処理に付する。

本発明の前記したあるいは他の目的は、更に下記の記載
ならびに添付図面から、当業者にとって充分明らかであ
ろう。

本文中に於いて下記の用語は以下に記載する様にそれぞ
れ周知の意味を有するものである。

本文記載の突然変異生成（あるいは誘発）とは例えば化
学物質または放射線照射の様な突然変異原で酵母細胞を
処理するか、あるいは酵母細胞に新しいＤＮＡ物質を導
入するかして、いずれにせよ遺伝子変換を誘発せしめる
操作を意味する。

変異体酵母細胞とは、遺伝子変換の結果作られた酵母細
胞を意味する。

分泌とは、ポリペプチドまたは蛋白質生成物を原形質膜
だけを通してあるいは更に酵母の細胞壁を通して周囲の
培地中に放出することを意味する。

分泌シグナル配列とは、化学処理されるべきポリペプチ
ド前駆体および細胞の分泌進行中に局在されるべき成熟
蛋白質に必須であるポリペブチドのアミノ基末端に結合
した疎水性アミノ酸残基の配列順序を意味する。これと
は別に、分泌シグナル配列は、該アミノ酸残基配列をコ
ードするＤＮＡ配列を意味することもある。このＤＮＡ
配列は翻訳開始コドン（ＡＴＧ）と成熟形ポリペプチド
のコード領域との間に局在する。

化学処理とは、（ａ）ポリペブチド又は蛋白質からその
シグナル配列を欠落せしめあるいは蛋白質分解開裂せし
めて該ポリペプチド又は蛋白質を成熟形として産生じ、
そして（または）　（ｂ）オリゴ糖を、成熟蛋白質中に
本来存在しているかあるいは付加されたグルコシル化配
列によってもたらされ得るグリコシル化認識配列に付加
・ロしめる作用操作を意味する。

成熟蛋白質とは、実際に細胞によって分泌された蛋白質
生成物の形態を意味するものである。

（ボリペブチ］゛又は蛋白質の）前駆体とは、成熟形蛋
白質に結合したシグナル配列を有する細胞中に合成され
たポリベプチド又は蛋白質を意味する。この前駆体を引
き続き化学処理する事によりその成熟ポリペプチド又は
蛋白質になるのである。

矯正とは、酵母株からプラスミドの全コピーを除去する
処理を意味する。

形質転換可能な酵母株とは、異種ＤＮＡを導入可能な酵
母細胞を意味する。

蛋白質の分泌レヘルはとりわけそのホスト株および該蛋
白質を発現する特定のＤＮＡ配列によって調節される。

内部産生した蛋白質生成物を非常に低レベルでしか分泌
し得ない通常の酵母細胞を突然変異せしめて後に、突然
変異していない株よりも少なくとも２倍以上の分泌能を
有する変異株を選択することができ、この様な変異体細
胞が１超分泌性」であると認められる。

酵母からの遺伝子産物の分泌生産のためにこの「超分泌
性」株を使用する事は、蛋白質産生遺伝子を酵母中に発
現せしめた時に、その前駆体がシグナル配列を有するポ
リペプチドが産生されるがしばしばその分泌効率が不充
分である様な場合に有利である。この様な蛋白質の例と
しては、プロキモシン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）、
プロインシュリン、プロウロキナーゼ（ＰＶＫ）、α一
１−抗トリプシン、組織プラスミノゲン活性化因子（Ｔ
ＤＡ）、インターロイキン−２　（ＩＬ−２）およびヒ
ト成長ホルモン（ＨＧ旧が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。

本文記載の遺伝子操作によって作った酵母株の例として
は現在ＡＴＣＣに寄託中の培養菌株（ＡＴＣＣ　；　ｌ
　２　３　０　１，　Ｐａｒｋ　ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ
＋Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げら
れる。これら培養菌株は受理番号１１ｋｌ２０７５０　
（菌株表示ＣＧＹ　１２８５）、階２０７５］　　（菌
株表示ＣＧＹ　Ｉ　０　８３）、階２０７５２　（菌株
表示ＣＧＹｌ２９＋）およびＩＩｋｌ２０７５３　（菌
株表示ＣＧＹ９９Ｂ）として同定されており、これらは
１９８５年４月５口にコラボレイティブ・リサーチ社（
ｃｏｌ　ＩａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ，　Ｉ
ｎｃ．）によって寄託されたものである。

以下に詳しく述べる様に、本発明に於いて変異せしめる
菌株としては、ＤＮＡで形質転換可能でありそして形質
転換体をｉｌｌ訳し得る様な適当な遺伝子マーカーを有
しているかあるいは有する様に形質転換され得る酵母株
ならばいずれも使用する事ができる。超分泌性株である
事の認識は、それが所望の遺伝子産物を発現し分泌する
ために必要なＤＮＡ配列を有しているかあるいは、有す
る様に形質転換せしめ得るかという事である。酵母株を
変異誘発せしめた後に、新たに「超分泌性」株として見
出された株をそうでない株から単離するためにスクリー
ニングが必要である。

突然変異株生成は公知の方法によって、例えばエチルメ
タンマルホネー）　（ＥＭＳ）やニトロソグアニジンの
様な沢山の公知の化学変異原のいずれをも使用して行う
ことができる。又菌株又はその混合物はＤＮＡを破壊す
る様な放射線照射、例えば紫外線、Ｘ−線又は分子線の
照射によっても変異誘発せしめる事ができる。更に又新
しいＤＮＡ物質の導入によっても変異誘発せしめる事も
出来る。この様なりＮＡ動物質高コピー数のプラスミド
ヘクターに結合した酵母ＤＮＡの断片が含有していても
良い。これらＤＮＡ変換の種々の態様によって、プロモ
ーターの新しい組合わせができそして（または）所望の
遺伝子との分泌シグナル配列が生まれ、あるいは与えら
れた制限エキソヌクレアーゼでの消化とそれにひき続く
エキソヌクレアーゼでの制限消化およびＤＮＡリガーゼ
での処理によって生まれる様なりＮＡの分節間の新しい
接合ともなり得る。これとは別に又、該変換によって、
試験管内変異生成技術の種々の態様によって導入したプ
ロモーター／分泌シグナル配列／遺伝子配列から成るＤ
ＮＡ配列を新たに導入変換することもできる。　（Ｓｈ
ｏｒｔｌｅ、　Ｄ、、　Ｄｉｍａｉｏ、　ｒｌ。

およびＮａｔｔｉａｎｓ、　Ｄ、寄著ｒＡｎｎ、　Ｒｅ
ｖ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１５．２６５−２９４　　
（１９８１年）参照。）形質転換実験においで変胃誘発
廿１−めるべき酵母株中に、沢山の新たに変換した酵母
ＤＮＡを導入することができる。

異種の変異細胞を得るために効果的な変異誘発処理を行
った後には、所望の変異体細胞を同定し単離するために
スクリーニングを行う。本発明におけるスクリーニング
は形質発現されるべき外来遺伝子とその発現および分泌
に必要なＤＮＡ配列との両方の存在下に行われる。遺伝
子産物は分析可能な物質でなくてはならない。本発明に
おい°ζ、遺伝子は好ましくはプロキモシンと酵母から
のその発現と分泌を可能にするｆ）ＮＡ配列とから成る
。

この様なりＮＡ配列は酵母トリオースホスフェートイソ
メラーゼ遺伝子（ＴＰＩ）からの５′−例領域、あるい
は他の酵母遺伝子例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（
ＰＧＫ）　、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬＩ）、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＡＤＩｌｌ）あるいはインへルタ
ーゼ（ＳＵＣ２）等からの同様な領域の様なプロモータ
ー配列を含有する。又、インへルターゼ、酸ホスファタ
ーゼ又はα−融合因子の様な分泌酵母遺伝子のアミノ末
端部分のコード領域となり得る分泌シグナル配列（又“
前”配列としても知られている）も存在する。この様な
分泌シグナル配列は又、プロキモシンの“前”配列、合
成“前”配列又は２種又はそれ１太）二の公知の“前”
配列の部分を組合わせて成る新しい“前”配列の様な非
酵母遺伝子からの同様な機能を有する配列ともなり得る
。

次のプロキモシン産生酵母株の変異生成によって、変異
誘発された酵母細胞は寒天板上で生育される。この培養
板は通常酵母の培養に使用され得るたくさんの培地のい
ずれから成るものであっても良い。「酵母遺伝学におけ
る方法、実験用便覧」（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、、　Ｆ
ｉｎｋ、　Ｇ、　Ｂ、およびｆｌｉｃｋｓ、　Ｊ、　Ｂ
。

等著）（１９８１年）に記載のｒＳＤ％」培地を培地と
して使用するのが好ましく、この培地は、成長過程の後
半には停止する用にそのｐａｌを酵母コロニー近くに調
整する様に生育酵母菌の酸性度を限定的に調節する能力
を有する。これによりプロキモシン（菌株から実際に分
泌された産物）のキモシン（該酵素の活性型）への変換
が容易であり従ってその活性化工程が不用である。

細胞は好ましくは、１−１０コロニー／ｄの生育密度と
なる様に栄養寒天板−ヒに拡散される。又ある場合には
より高い密度となる様に拡散された法が好都合な場合も
ある。植菌後にこの培養板を４８〜９６時間の間３０℃
で培養させる。尚、場合によってはこの温度は１５℃位
に低いかあるいは３７℃位に高くても良い。この様な温
度範囲は例えば、高温や低温に感受性のある変異体の単
離や試験をしようとする場合に適応されるものである。

しかしながら通常は温度が３０’Ｃからはずれてこれ以
外である場合には最適生育のためにはその生育時間が長
くなるのが普通である。

酵母細胞は、例えばろ紙の様な吸収性物質で作った滅菌
板状物を、細胞が生育している寒天板培地の表面に当て
てその寒天板培地から分離する。

可視細胞が全部分離されるまでこの吸収作業をくり帰す
。各々の寒天板培地から吸収分離した板状物を好ましく
は減菌ペトリ皿中に保存しこれを以後の変異体細胞の回
収に使用する。

この時点で、あらかしめ酵母コロニーの丁度真下におい
てあってその栄養寒天板培地中に存在する活Ｐ１キモシ
ンの量を定量するのが好ましい。通常キモシン活性を定
量するためには、試験物質のサンプルを特定の体積のミ
ルクの中に入れてそのミルクが凝固し、あるいはクロッ
トを形成するのに要した時間を測定することによって行
われる。

しかしながら、受面積の部分を定置しようとする時の固
体表面の場合には、ミルクをその表面に直接加えるのが
好ましい。それぞれ受面積の表面にだけミルクを加えれ
ば良いのであるが、このミルクの量は、表面に加えた後
に速やかに固化し得る様な溶融アガロースの様な反応剤
とミルクとを混合する事によって効果的に限定する事が
可能である。凝固ミルクは通常の半透明ミルク／アガロ
ース混合物中の不透明部分として目視可能である。

こうして、溶融アガロース、脱脂乾燥ミルク、ＣａＣ１
□、ＮａＰＯ４およびペプスタチンを含有するミルク−
アガロースに張りを各培養板の表面−トに注ぎそして固
化さ−ｌる。プロテアーゼ抑制剤であるペプスタチンは
、変異株を他の存在する菌株や変異前の分泌活性を有す
るＤＮＡ構造からスクリーニングすることが可能な様に
前記上張り混合物中に加える。ペプスタチンを加えない
と、細胞の湿潤重量１ｇにつきＱ、１ｊｉｉ位の凝固活
性を示すにすぎないわずかな分泌能を有するコロニー上
に急速に強い不透明部分が形成されてしまう。

ペプスタチンを加えると、キモシン活性が部分的に抑制
され、そして非変異株ｍｌ　Ｎｏ．一上に不透明部分が
形成されるのはそわほど強烈でなく、その様な不透明部
分が形成されるには数時間を要する様になる。従って、
変異株コロニーが容易に同定し得るのである。使用され
るペプスタチンのＶは０〜１００ｍｇ／ｍＩ！の範囲で
変える事ができるが、その使用量は抑制されるべき分泌
活性の存在レベルならびに変異株中にあるべき分泌活性
の所望のレベルとに依って変えることができる。脱脂乾
燥ミルクの濃度は、所望の不透明部分の強度および該部
分を生成するのに要する時間に依って、２〜２０％ｗ　
／　ｖの範囲で変える事ができる。

ミルクアガロース上張りを含有する培養板の各々は好ま
しくは室温（２５℃）で培養されるが、培養温度範囲は
Ｏ〜４０′Ｃの範囲であっても良い。

凝固ミルクの第１の不透明部分が認められたならば直ち
にその位置を書き留めておくべきである。

そうしておかないとこれらの部分は大量のキモシンを分
泌したコロニーの部分とほとんど同様になってしまうか
らである。この培養工程は、少なくとも微弱なクロット
がコロニーの大部分に相当する培養板の部分全体に生成
するまで続けられる。

この微弱クロットの存在によってろ紙複製物を栄養寒天
板に関して定位置におくことができ、そして、迅速に形
成されたかあるいは特に大きいか又は強烈であるクロッ
トに相当するろ紙複製物上のコロニーの同定が容易とな
る。

強烈に又迅速に形成するクロットに相当するコ０ニーか
ら細胞が栄養寒天板上に筋状に出現しそして個々のコロ
ニーが形成されるまで培養した後に、各推定変異株から
のいくつかの独立したコロニーについてその分泌キモシ
ン活性を定量する。

これは色々な方法で行うことができるが、特に大量の菌
株をかなり短時間の内に定置できる様な迅速な方法を使
用するのが好ましい。その１つの方法は、単離されたコ
ロニーからの細胞を使用してその１区画を栄養寒天板上
に植菌しそしてこの栄養板を密集して生育した酵母の区
画が現われるまで１Δ養する方法である。この区画から
の細胞を次に緩衝液中にけん濁させそして氷上で培養す
る。

このけん濁液のサンプルを次に特定の体積の再加水され
た脱脂乾燥ミルクに加えそして、振とうしながら３０℃
で培養し、ミルクが凝固するまでに要した時間を書き留
めておく。菌株の分泌活性は凝固に要した時間と使用し
た細胞数との積で定数を除することによって求められる
。

この測定は好ましくは各推定変異株からの少なくとも３
つのコロニーについて行うのが良く、そしてその結果を
平均して当該菌株の分泌活性の正確な測定値を得る。任
意に省略することは、通常菌株が超分泌性表現型を有す
ると認められる活性レヘルの場合に限られる。本発明の
目的のためには、この省略は変異誘発していない背景菌
株の分泌活性の２倍が認められた場合に限られる。

たくさんの超分泌性株が同定された後に、通常これらの
菌株を種々の遺伝学的分析に付し生成した変異株の型を
決定する。酵母遺伝子学の一般的な技術および前記した
定量分析法をその決定に使用することができ、こうして
、生成した変異株の超分泌性表現型が単一変異の結果に
よるものであるかどうか、あるいはその変異形成が優性
であるかそれとも劣性であるか、あるいは異種変異体の
染色体局在があるかどうか、またあるいは劣性変異体の
種々の対応対が互いに相補しあっているかどうか等を決
定する。又、細胞成長を成さしめる（即ち、超分泌性株
を異種の遺伝子型に変換する）様なた（さんの非特異的
変異体を含まない超分泌性株を得るために、超分泌性株
と変異していない９　ζ 菌株とを融合せしめて得られた２倍体株を胞子形成せし
めることも可能である。更に又、１つより多くの超分泌
性の変異体を含有する多変異株を単離するために、互い
に異種の相補群の変異体を含有する超分泌性株を融合・
υ′しめて、得られた２倍体の胞子形成を成さしめるこ
とも可能である。この様な多変異株は、単一変異株より
もしばしばより効率的にプロキモシン又は他の異種蛋白
質を分泌することがある。又、超分泌性株を、その含有
プラスミドを除去して後に、あるいはこれに加えて、他
のプロモーター／シグナル配列／遺伝子の組合わせから
成る別の組換え配列で形質転換する事も可能である。こ
の方法で単離されて超分泌性株も又本文記載の変異誘発
やスクリーニングの付加工程における出発株として使用
することができる。

実施例１ 本例においては、ＡＴＣＣに１９８５年４月５日に寄託
された酵母株ＣＧＹ９９Ｂ　（受理番号階２０７５３と
して同定されている）を出発菌株として使用した。ＣＧ
Ｙ９９８は、第１図に示すプラスミドｐｃＧｓ５１４を
含有する背景菌株ＣＧＹ３３９　（融合型：α、ｈｉｓ
４−２９、ｕｒａ３−５２、ｐｅｐ４−３）を伴う。こ
のプラスミドはｒＧｅｎｅＪ　２７．３５−４６　（１
９８４年）（Ｇｏｆｆ、　Ｃ＋　Ｇ、＋Ｍｓｉｒ、　Ｄ
、　Ｔ、＋　ｋｏｈｕｓ、　Ｔ、、　Ｇｒａｖｉｕｓ。

Ｔ、　Ｃ，、Ｓｍ１ｊｈ、Ｒ，Ａ、、　Ｙａｍａｓａｋ
ｉ、　Ｅ、およびＴａｕｎｔｏｎ−Ｒｉｇｂｙ＋　Ａ、
等著）に記載の、酵母／Ｅ。

コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐ　ＣＧ５４
０から誘導されたものである。一方、ｐｃｃｓ４０は良
く知られた細菌プラスミドｐＢＲ３２２から誘導され、
そしてこれがＥ、コリ中で増殖可能であるためにアンピ
シリン耐性遺伝子（Ａｍｐ”）とこのプラスミドからの
複製起源（ｏｒｉ）を含有している。選択マーヤーとし
ての酵母ＵＲＡ３および酵母２ＭｒＣＲＯＮプラスミド
からの複製起源を含有させることによって、酵母中の増
殖がより確実なものとなる。　（Ｉｃｅ　Ｉ　ＩＪ　２
１．　５０１−５０８　（１９８０年）　　（Ｂｒｏａ
ｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，およびｆｌｉｃｋｓ、　Ｊ、　Ｂ、
等著）参照。）ｐｃＧｓ５１４中において、制限エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲ１（！：Ｓａ　ｌ　ｌとの切断位
置の間のｐＲｒ？３２２ＤＮＡの領域は、以下に述べる
順序のＤＮＡ分節から成るほぼ２１００の塩基対のｌ’
）ＮＡによって置換されている。ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ａ
ｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、Ｊ上、４２３ｉ５１　　（１９
８２年）（八１ｂｅｒ、　Ｔ、およびｋａｉｖａｓａｋ
ｉ、　Ｇ、等著）に記載の、隣接配列のＲＮＡ転写をプ
ロモートする酵母トリオースホスフェートイソメラー　
ゼ遺伝子（ｐＴＰＴ）の５′−側領域から約８５０の塩
基対；１５塩基対の合成りＮＡアダプター；該アダプタ
ーと一緒になって、インへルターゼのアミノ末端領域を
コードしそしてその分泌シグナル配列を含有する酵母５
ＵＣ２遺伝子からの７９塩基対（ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊｌｌ、１９４３−１９５４　（１
９８３年）（Ｔａｕｓｓｉｇ、　Ｒ，およびＣａｒｌｓ
ｏｎ、　Ｍ、等著参照）；および別のアミノ末端メチオ
ニン残基を含有するプロキモシンの全相補ＤＮＡ　（ｃ
ＤＮＡ）配列（ｒＧｅｎｅＪ　１９，１２７−１３８　
（１９８２年）　　（Ｍｏ１ｒ、　Ｄ、　Ｔ、、　Ｍａ
ｏ、　Ｊ、−ｉ、、　Ｓｃｈｕｍｍ、　Ｊ。

Ｗ、、　Ｖｏｖｉｓ、　Ｇ、　Ｆ、、　Ａｆｆｏｒｄ、
　Ｂ、　Ｌ、およびＴａｕｎＬｏｎ−Ｒｉｇｂｙ、　Ａ
、等著）参照）。例えばＣＧＹ９９８の様な酵母株はこ
のプラスミドで形質転換されると、プロートモシンとし
て約０．２％のその細胞蛋白質を発現する。しかしなが
ら、この様な変異していない酵母株を使用したのではわ
ずかに１〜２％のプロキモシン（０，００２〜０．００
４％の細胞蛋白質）が培地中に分泌されるにすぎない。

本例において行うスクリーニング分析は、プロキモシン
が酵母株ＣＧＹ９９８からこの様な低レベルで発現され
分泌されるということ、そして又このプロキモシンの活
性はこの細胞のコロニー生育のために使用した栄養寒天
板にミルク／アガロース上張り成分を加えることによっ
て定量できるということの事実に基づいて行うものであ
る。この分析はかなり定置的であるので、すでに幾分か
分泌している背景細胞の中でより多くのキモシン活性を
分泌している細胞を同定することができる。

１、突然変異誘発 Ｓｈｅｒｍａｎ等の方法（前記文献、１９８１年）に従
って、菌株ＣＧＹ９９８山来細胞をエチルメタンスルホ
タートで変異誘発−ロしめた。スクリーニング実験には
約３０１１以−Ｌもの期間が必要であるので、整除数の
変異細胞を４０％（ｕ／Ｖ）のグリセロール中で７０℃
で冷凍し、そして１回に１つ当てを解凍して使用した。

２、変異細胞のスクリーニング 変異細胞を、１つの培養板につき約１００コロニーが実
験上７１ｉ成する様な密度で、それぞれＳＩ）培地（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ等著前記文献（１９８１年）に記載）を約
２５ｍ１含有する９ｃｍの栄養寒天板−Ｌにばらまいた
。３０℃で３「１間牛育させた後に、９ｃｍの滅菌した
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ｍ　１３紙ディスクで吸
収することによって細胞のコロニーを寒天板の表面から
除いた。各寒天板からの増殖ろ紙１枚を以後の変異株細
胞の回収に使用した。

水と溶融アガロース（０，２５％Ｗ／Ｖ）と１５［ｉ乾
燥ミルク（５％Ｗ／Ｖ）とＣａＣ１ｚ　　（５ｍＭ）と
ＮａＰＯ４（５０ｍＭ、ｐｉｆ、５．８）とベブスクチ
ン（２０ｍｇ／ｍｌりとから成る混合物８ｍｌを次にそ
の寒天板の表面に注ぎそして固化させた。室温で４時間
培養する間に、酵母コロニーから分泌されたキモシンを
吸収した寒天板の部分に相当して、凝固ミルクの不透明
な部分がこの上張り混合物中に観察された。特に強烈で
あるか又は特に迅速に形成されたクロットがみられ、こ
れに相応する酵母コロニーを増殖ろ紙から回収した。

これらのコロニーを次に更に正確な定量分析に付して分
泌キモシン活性の定量をし、その出発菌株よりもかなり
高い分泌活性を有するコロニーを推定超分泌性変異株と
した。全部で１２０，０００の変異コロニーがスクリー
ニングされ、そして３９の変異株が超分泌性株であるこ
とが判明した。

３、変異株の分析 ａ０分泌活性 変異株の分泌活性は、細胞の高密度区画をＳＤ栄養寒天
板−Ｌで３日間３０℃で生育させることによって測定す
る。この区画の約１ｃｍ”からの細胞を寒天板からかき
落しそして０．４ｍｌ！の５０ｍＭＮａＰＯ，緩衝液（
ｐＨ５，８）中に０℃で１時間再けん濁させた。このけ
ん濁液Ｑ、１ｍ／を次に１ｍＮの再加水した脱脂乾燥ミ
ルクに加えそして３０℃で振とうしながら培養し、その
ミルクが凝固するまでに要した時間を記録した。菌株の
分泌活性は次式に従って算出される。

Ｘ　Ｋ （式中、Ｔは凝固時間（分）であり、Ｋはクレット（Ｋ
ｌｅｔｔ）色度計で測定した、に１＝１００希釈度の細
胞けん濁液の濃度（距離０．６ｃｍ、緑色フィルター＃
５４）であり、そしてＳＡは細胞の湿重量１ｇに対する
キモシン活性の単位（Ｖ／ｇ）で表した分泌活性である
。）ここでキモシン活性の単位は、ミルク１０ｍ＃を１
００秒で凝固するのに要する活性量として定義づけられ
るものである。この式によればクレット色度計で測定し
て濃度５０を持つ細胞けん濁液１１は湿重量約１ｇの細
胞を含有することになる。

通常この測定は推定変異株の３または４個の別々のコロ
ニーに関して行い、その得られた値を平均して行った。

そしてその平均分泌活性（ＳＡ）が０．５０ｖ／ｇ以上
の場合にその株を超分泌性株として分類した。（ｃＧＹ
９９８は、この分析で特有的にＯ１＋５ｖ／ｇ〜０．２
５ｖ／ｇの間の分泌活性を有する。）この分析で新たに
単離された変異株の最高分泌活性は１．５ｖ／ｇである
ことが観察された。大部分の変異株は０．６〜０゜９ｖ
／ｇの間の分泌活性を有していた。

ｂ、優り劣性 上記の基準に合致した菌株中の超分泌性変異株について
、これらを非変異株ＣＧＹ２６５　　（α。

ｕｒａ３−５２．ｌｅｕ、１）と融合しこうして得られ
たブラスミ１ｐｃＧｓ５１４を有する２倍体の分泌活性
を定量することによって、これらが優性であるか又は劣
性であるかに分類した。この実験に供した３９の菌株の
内１４株が０．２５Ｖ／ｇよりも低い分泌活性を持つ２
倍体を形成し、これらは劣性変異株として分類した。残
りの株は全部０．２５ｖ／ｇとその親株の分泌活Ｐ［値
との間の分泌活性値を持つ２倍体を形成した。その超分
泌性親株よりも高い分泌活性を有する２倍体株は全く観
察されなかった。

Ｃ６劣性変異株の相補性 劣性変異株に関して、超分泌性変胃株とこれと反対の融
合型の超分泌性株とを融合するごとによって、これらを
相補性群に分類した。（該株は前記工程（ｂ）で形成し
た２倍体を胞子形成り−しめて誘導したものである。）
２つの株の超分泌性（ｓ　ｓ　ｃ）変異体は、その生成
した２倍体が０゜５０　ｖ／ｇより少ない分泌活性を有
する場合に相補性があると言う。相補性がないとされた
各対の変異株は同じ遺伝子を持つと推定され、これらは
同一の群に分類した。この様にして９個の劣性超分泌性
変異株を３つの相補性群（ｓｓｃｌ、５ｓＣ２および５
ｓｃ３）に分類した。（後記第１表参照。）各群の変異
株の個々の対立ｊｌ伝子はそれぞれ５ｓｃｌ−１，５ｓ
ｃｌ−２等として表示した。さらに５個の変異株が、反
対の融合型の株から得られる株全部と相補性のある第４
群となる。

これらを５ｓｃＸとして表示した。この第４群は実際１
個以上の相補性を有する群であって、そして１個以」二
の遺伝子の変異体から成っている。

ｄ、変異生成背址からのｓｓｃ変異株の分離変異誘発工
程中に生成する他の変異株から単離されたｓｓｃ変異株
を分離するために、新たに単離された変異株を反対の融
合型の非変異背景株と交叉させ、そして生成した２倍体
を胞子形成せしめた。この交叉の結果の超分泌性子孫（
その親変異株に近い分泌活性を有するもの）を同定しそ
して再度非変異株と交叉しそして胞子形成せしめた。

この第２回目の異型交叉の結果の超分泌性株は原親株の
ＳＳＣ変異性を有しているが、その他は他の変異誘発作
用は受けていないと推定された。この方法は又、更に別
の所望の性質を持った新しい超分泌性株を作り出すため
に、種々のＳＳＣ変異体を別の種々の背景菌株中に導入
するためにも用いることができる。

ｅ、５ｓｃｌ／５ｓｃｌ及１ｕｓｓｃ２／５ｓｃ２）電
体の胞子形成不能 この工程において、それぞれ５ｓｃｌ相補性群に変異体
を有する２つの株又はそれぞれ５ｓｃ２相補性群に変異
体を有する２つの株を融合することによって得られた２
倍体酵母株は、胞子形成培地中で培養した時に、１ｆｆ
ｌ常の４胞子ａｓｃｉを形成し得ないことが観察された
。実際にこれらの２倍体中にはあったとしてもごくわず
かな胞子しか形成されないか又はほとんど形成されず、
非相補性の５ｓｃｌと５ＳＣ２との変異体は胞子形成し
得ない事を示している。この様な胞子形成不能の現象は
、原変異株を数回交叉処理して得たものも含めて、５ｓ
ｃｌ又は５ｓｃ２変異体を有する全部の株に見られ、従
ってこれより、簡争な融合および胞子形成試験をするこ
とによって、その菌株がプロキモシンを発現し分泌する
か否かにかかわりなくある特定の菌株が５ｓｃｌ又は５
ＳＣ２変異体を含有しているかどうかを決定することが
できる。

ｆ、多変累耕分泌性株 責なる相補性群からのｓｓｃ変異体を含有する菌株を融
合する事によって作った２倍体株を胞子形成・口しめ、
こうして得られた半数体柱をプロキモシン分泌能をＩｉ
Ｉ認するために分析した。多くの場合、両親のいずれか
よりも高い分泌活性を有する半数体柱が得られた。最も
高い分泌活性（５゜Ｏｕ／ｇまで）を有する株を、両親
からの変異体を含有するものであると推定した。５ｓｃ
ｌおよび５ＳＣ２の両方の相補性群の変異体を含有する
ものであると確信された菌株については、前記工程（ｅ
）に記載の胞子形成試験によって両度異体の存在が確認
された。

ｇ、良異体株から（Ｊ）、　ｐ　ＣＧ影５」」ｐ除去ｐ
ｃＧｓ５１４の様なプラスミドは細胞分裂中に常にその
両方の娘細胞中に分配されるわけではないので、変異株
は、これらをこのプラスミドの持つ野性のｔＪ　ＲＡ　
３遺伝子の選択発現を成さない培地−１−で数世代培養
することによって簡単にしかも効果的にこのプラスミド
を除去することができる。通常この遺伝子は変異株中の
ｕｒａ３−５２変異体に相補的に作用する。栄養培＋１
！！（ＹＰｒｌ。

Ｓｈｅｒｍａｎ等著の前記参考文献（１９８１年）参照
）上で生育させたコロニーについて、これを１回に１個
使用して、付加的にウラシルを含むかあるいは含まない
ようにした最少１Ｆ５地十で生育可能であるかどうかの
試験をした。ｔＪ　ＲＡ−コ１：に一についてはそのキ
モシン分泌活１ノＮｏ．関して２回試験をしくというの
はプラスミＩ゛の除去によってこれらの菌株からプロキ
モシン遺伝子も除去されてしまうからである）、そして
種々の変異株の矯正様として使用に供した。これらの矯
正様は別のプロモーター／シグナル配列／遺伝子の組合
ね・口を含有するプラスミｌで形質転換することができ
る。

上記した方法で作った酵母株については、その培養株を
ＡＴＣＣに寄託しである。これらの培養株は、寄託番号
階２０７５０　（菌株表示ＣＧＹ　１２８５）（融合型
；α、ｕｒａ３−５２、ｐｅｐ４−３．５ｓｃｌ−１）
、隘２０７５２　（菌株表示ＣＧＹ１９２１）（融合型
；α、ｕ　ｒ　ａ　３−５２、ｈｉｓ４−２９、ｐｅｐ
４−３．５ＳＣ２１）、ｌ１ｋ１２０７５１　（菌株表
示ＣＧＹ１０８３）（融合型、；：　α、ｕｒａ３−５
２、ｈｉｓ４−２７、ｐｅｐ４−３．５ｓｃ３−１）で
あり、これらは１９８５年４月５０にコラボレイティブ
・リサーチ社によって寄託された。これら３つの菌株は
、これらがｓｓｃ変異株のそれぞれ３つの相補性群の内
の１津の変異体の例を含むので代表例として選択された
のである。

例２　　（ウシ成長ホルモンの増強分泌能）本例におい
ては、そのプロキモシン分泌能が改良されて強力である
として選択された変異体酵母株が、キモシン以外の異種
蛋白質の産生にも有用である事を示す。この様にこれら
の変異株は、酵母から分泌されるいかなる蛋白質の産生
にも有用に使用することができるのである。

プラスミドｐＣＧＳ５１４とはその約２１００の塩基対
のｐＴＰＩ−３ＵＣ２−プロキモシン配列（第１図参照
）の代わりに、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）の完全コー
ド配列ならびにそのアミノ末端分泌シグナル又は酵母Ｇ
ＡＬＩ遺伝子のプロモーター領域に結合した［ｐｒｅｌ
配列を有している点に於いて異なるが他は該プラスミド
ｐ　ＣＧ５５１４と同じである、組換えＤＮＡプラスミ
（ｐＣＧＳ４−４７　（Ｇｏ　ｆ　ｆ等著の−１−記文
献（１９８４年）に記載）を使用して伊藤等によるＬ　
ｉ　Ｃ１法（上記文献参照）によって４種の酵母株を形
質転換してウラシル原栄養体を作った。１つの菌株Ｃ，
ＧＹ３３９＜融合型：α、ｈｉｓ４−２７、ｕｒａ３−
５２、ｐｏｐ４−３）は超分泌性表現型を有しない野性
型抑制株であった。（即ちこれは遺伝子型ｓｓｃ＋であ
る。）（ＩＩの２つの菌株ＣＧＹ１２８５（融合型；α
、ｕｒａ３　５２、ｐｅｐ４−３．５ｓｃｌ　　１＞お
よびＣＧＹ　１２９１　（融合型：α、ｈｉｓ４−２７
、ｕｒａ３　５２、ｐｅｐ４−１、ｓ　ｓ　ｃ　２−１
　）は、これらは各々これら菌株によって分泌されるプ
ロキモシンの量を増加するものであるとして知られてい
る単一変異体（ｓｓｃｌ−１又は５ＳＣ２−１）を含有
している。第４番目の菌株ＣＣＹＩ２９３（融合型：α
、ｕｒａ３−５２、ｐ　ｅ　ｐ　４−３、ｓｓｃｌ−１
、ｓ　ｓ　ｃ　２−１　）はこれらの両方の変異体を含
有しており、どちらかの変異体だけを含有している菌株
よりも更に高い効率でプロキモシンを分泌することが知
られている。全部で３つの超分泌性株を前記例１と同様
の工程により作り、そして予じめプラスミｌ”ｐｃＧｓ
５１４を除去しておいた。

これら４つの菌株の各々から単離された形質転換コロニ
ーを、炭素およびエネルギー源としてのガラクトースを
含有する寒天板上の両分中で生育させた。（ガラクトー
ス上での生育は、ｐ　ＣＧ　５４４７のＧＡＬＩプロモ
ーターからの発現のために必要である。）９６時間培養
した後に、各形質転換株から約１００ｍｇの細胞をその
寒天板からかきをった。そしてこれらを０．５ｍ／の１
００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８，０）　中へケン
濁させた。簡単な遠心分離操作によってこのけん濁液か
ら細胞を除去した後に、その−にずみ部分を真空下で凍
結しそして蒸発乾燥させた。

この乾燥ペレットを次に４　Ｑ　ｕｌのＳ　ＯＳ　緩衝
液サンプル（ｃａｅｍｍｌｉ、　Ｖ、　Ｄ、およびＰａ
ｖｒｅ、　Ｍ著ｒＪ、　Ｎ１ｏｌ、　［ｌｉｏ＋、」−
８−０，５７５５９９（１’１７３年）記載）に再けん
濁さセて、Ｔｏｗｂｉｎ、　＋１．ｌ５ｔａｅｈｅ　ｌ
ｉｎ、　Ｔ、およびＧｏｒｄｏｎ、　Ｊ、等著ｒＰｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｔＪＳＡＪ　７１５
．　４３５０　４３５４　　（１９７９年）に記載の方
法に従って免疫浸出性分析に付した。各ナンプルのウシ
成長ホルモン（ＢＧ旧の量は、各けん濁液中に最初から
存在した細胞の湿重量で除するごとによって３１算した
細胞のＩｇ当りの分泌蛋白質の量と、同じ免疫浸出法に
おける純粋標準値とを比較することにより算出した。結
果を下記の表に示す。

背量菌株　　　分泌量（ぺイヤ　　分泌Ｑ　（’、ｊ＋
　（７）量ＣＧＹ３３９　　　Ｓ　ｓ　ｃ　＋　　　　
ｌ　ＯＯｍｇ／　ｇＣＧＹ１２８５　５ｓｃｌ−１１８
００ｍｇ／ｇＣＧＹ１２９１　５ｓｃ２−１　２００ｍ
ｇ／ｇＣＧＹ１２９３　　ｓｓｃ＋−１，２００ｍｇ／
ｇｓ　ｓ　ｃ　２−１ これから５ｓｃｌ−］変変異体は酵母からウシら　２ 成長ホルモンを分泌する分泌能を改善するのに大変効果
的であることが明らかである。５Ｓ０２−１はその改善
効果はさほど見られないが、しかしＳＳＣ変異体のない
場合の少なくとも２倍の分泌量であり、そして同−菌株
中にこれら２つの変異体がある場合にはその効果はこれ
ら２つの変異体がそれぞれ個々に別々にある場合の菌株
の合計とほぼ等しくなっている。

例３（プロウロキナーゼの増強分泌能）本例はプロウロ
キナーゼの分泌能に関する例示であり、そしてここでは
そのプロキモシン分泌能が改良されて強力であるとして
選択された変異体酵母株が、酵母から分泌されうるいか
なる蛋白質の産生にも一般的に有用である事実を更に立
証するものである。

組換えＤＮＡプラスミドｐＣＧＳ６９６は、プラスミド
ｐＣＧＳ５１４とはその約１３００の塩基対のＳ　Ｕ　
Ｃ２−プロキモシン配列（第１図参照）の代わりに、プ
レプロウロキナーゼ（ｐｒｅＰＶＫ）の完全コード配列
（Ｉｌｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、、　Ｈｏｌｍｅｓ。

Ｗ、　Ｅ、およびνｅｈａｒ、　Ｇ、　Ａ、等の英国特
許出廟第２．１２１．０５０号「機能的ヒ［ウロキナー
ゼ蛋白質の産生」参照）ならびにそのアミン末端分泌シ
グナルまたはｒｐｒｅｊ配列および転写終止領域を含有
する酵母５ＵＣ２遺伝子からの９００塩基対ＤＮＡ断片
（Ｇｏｆｆ等著の前記文献参照）を有する点において異
なるが他は該ブラスミＩ″ｐＣＧＳ５１４と同じプラス
ミドである。このプラスミドｐＣＧＳ６９６を使用して
、伊藤等によるＬｉＣｌ法（上記文献参照）によって４
種の酵母株を形質転換してウラシル源栄養体を作った。

１つの菌株ＣＧＹ３３９　（融合型：α、ｈｉｓ４−２
７、ｕｒａ３−５２、ｐｅｐ４−３）は超分泌性表現型
を有しない野性型抑制株であった。（即ちこれは遺伝子
型ｓｓｃ十である。）他の２つの菌株ＣＧＹＩ２８５　
　（融合型：α、＋１ｒａ３５２、ｐｅｐ４−３．５ｓ
ｃｌ−１）およびＣＧＹ１２９１　　（融合型：α、ｈ
ｉｓ４−２７、ｕｒａ３−５２、ｐｅｐ４−Ｌ　５ｓｃ
２−１）は、これらは各々これら菌株によって分泌され
るプロキモシンの世を増加するものであるとして知られ
ている単一変異体（ｓ　ｓ　ｃ　１−１又は５ｓｃ２−
１）を含有している。第４番口の菌株ＣＧＹ　１４６３
（融合型：α、ｕｒａ３−５２．１ｅｕ２−３．１１２
、ｐｅｐ４−３．５ｓｃｌ−２，５ｓｃ２−１）はこれ
ら両方の変異体を含有しており、どちらかの変異体だけ
を含有している菌株よりも更に高い効率でプロキモシン
を分泌することが知られている。全部で３つの超分泌性
株を前記例１と同様の工程により作り、そして予めプラ
スミドｐＣＧＳ５１４を除去しておいた。

これら４つの菌株の各々から単離された形質転換コロニ
ーをＳＤ培地とレクチンとヒスチジンとを含有する寒天
板上の両分中で生育させた。７２時間培養した後に、各
形質転換株から約２００〜４００ｍｇの細胞をその寒天
板からかき取った。

そしてＱ、５ｍｌの５０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７
，０＞と１００ｍＭ塩化ナトリウムの中へけん濁させた
。約２５μｌの各細胞けん濁液をウシプラスミノーゲン
を豊富に含むフィブリンアガロース板のウェルに加えた
。　（Ｉｉｒａｋｍａｎ、　ｐ、著［繊維素溶解（Ｆｉ
ｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）　Ｊ　　（Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ
　ａｎｄｌｌｏｌｋｅｍａ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）第
１１２４頁（１９６７年）参照。）各サンプルのプロウ
ロキナーゼ（ＰＶＫ）の繊熔単位の数は、生成した繊溶
帯とこれと同じフィブリン板上の純粋標準体により生成
した繊溶帯とを比較することにより算出した。細胞１ｇ
当り分泌されたＰＶＫの鼠は、各けん濁液中に最初から
存在した細胞の）Ｖ重量で除するごとによって計算され
た。結果を下記の表に示す。

背景菌株　　　分泌遺伝子型　　分泌ｐｙ３−ψ鼠ＣＧ
Ｙ３３９　　　ｓｓｃ＋　　　　検出不能ＣＧＹ１２８
５　５ｓｃｌ−１３，７ｕ／ｇＣＧＹ１２９１　５ｓｃ
２−１　　５．Ｄｕ／ｇＣＧＹ１４６３　５ｓｃｌ−１
，６，６ｕ／ｇ５ｃ２−１ これから５ｓｃｌ−１および５ｓｃ２−１変異体型は酵
母からＰＶＫを分泌する分泌能を改善するのに大変効果
的であることが明らかである。同−菌株中にこれら２つ
の変異体がある場合の効果ら　６ はこれら２つの変異体がそれぞれ個々に別々にある場合
よりも高い。

以上本発明について実施例を以て具体的に説明をしたが
、本発明はこれらに限定されるものではなく、他の色々
の変形、変法が可能であることば言うまでもない。以上
の実施例の中では、超分泌性変異株からのプロキモシン
、ウシ成長ホルモンおよびプロウロキナーゼの産生およ
び分泌について特に例示した。しかしながら本発明はこ
れらに限定されるものではなく、他の哺乳類その他を起
源として他の種々のポリペプチド遺伝子産物、例えばヒ
ト成長ホルモン（ＨＧＨ）、プロインシュリン、組織プ
ラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、α−１＝抗トリ
プリジンおよびインターロイキン−２等も所望の超分泌
性変異株により産生され分泌され得るのである。

下記の第１表は対立遺伝子数を表示し、かつ１９の劣性
超分泌性（ｓｓｃ）変異体の相補作用を示すものである
。

本 順穆　　　　　　（１５０）　　　　３５０　３３１　
　　３１５　　２３７（注） （１）分泌活性は、細胞湿重１１ｇ当りのミルク凝固活
性の単位で表わした。（ｍｕ／ｇ）それぞれの親の分泌
活性はかっこの中に表示した。

（２）この略表示（ｘｓｓｃｌ−］）はｒｓｓｃｌ−１
変異体を含有する試験性と交叉した場合」を意味する。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換えＤＮＡプラスミドｐｃＧｓ５１４の構造
を示すものであり、このプラスミドを構成する種々の分
節の相対位置ならびに起源（細菌プラスミドＤＮＡ、酵
母ＤＮＡおよびｃＤＮＡ）を示し、さらにこれら分節の
ある部分のヌクレオチド配列を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、超分泌性酵母細胞から分泌されたポリペプチド生成
   物を回収することによって該酵母細胞から所望のポリペ
   プチド生成物を高収率で得る方法において、前記酵母細
   胞を形質転換可能な出発酵母株から選択することによっ
   て得てこの酵母細胞を突然変異誘発せしめて変異体細胞
   を形成し、該変異体細胞を異種ポリペプチドを分泌する
   様に形質転換し、こうして形質転換した変異体細胞をス
   クリーニングして前記出発株により分泌される量の２倍
   よりも多い量の前記異種ポリペプチドを分泌する最終目
   的細胞を決定し、そして該最終目的細胞を培養して所望
   の前記異種ポリペプチドを高収率で得る事を特徴とする
   前記方法。 ２、該変異体細胞を突然変異誘発の前に形質転換させる
   、前記特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、該変異体細胞を突然変異誘発の後に形質転換させる
   、前記特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、該ポリペプチドがプロキモシンである。前記特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ５、該酵母がサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈ
   ａｒｏ　ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。 前記特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、該形質転換可能な出発酵母株が形質発現ならびに分
   泌用のＤＮＡ配列を有するものである、前記特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 ７、更にスクリーニングによって得られた該変異体細胞
   を矯正しそして第２の形質転換工程を施して所望の異種
   ポリペプチドを分泌する分泌能を有する遺伝子を導入す
   る工程を含有する、前記特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。 ８、該変異体細胞により分泌された該異種ポリペプチド
   がプロモキシンであり、該最終ポリペプチド生成物がウ
   シ成長ホルモンである、前記特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ９、該最終ポリペプチド生成物が成熟蛋白質である、前
   記特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、ポリペプチド生成物を産生する超分泌性株であっ
   て、そして、形質転換可能な出発酵母株を選択し、該酵
   母株を突然変異誘発せしめて変異体細胞を形成し、該変
   異体細胞を異種ポリペプチドを分泌する様に形質転換し
   、こうして形質転換した変異体細胞をスクリーニングし
   て前記出発株により分泌される量の２倍よりも多い量の
   異種ポリペプチドを分泌する最終目的細胞を決定するこ
   とによって得られたものである事を特徴とする変異体酵
   母株。 １１、該工程が該変異体細胞をその突然変異誘発の前に
   形質転換するものである、前記特許請求の範囲第１０項
   に記載の変異体酵母株。 １２、該工程が該変異体細胞をその突然変異誘発の後に
   形質転換するものである、前記特許請求の範囲第１０項
   に記載の変異体酵母株。 １３、該ポリペプチドがプロキモシンである、前記特許
   請求の範囲第１０項に記載の変異体酵母株。 １４、該形質転換された細胞によって産生された該異種
   ポリペプチドが該ポリペプチド生成物と異なるものであ
   る、前記特許請求の範囲第１０項に記載の変異体酵母株
   。 １５、酵母株ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
   Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）前記Ｎｏ．２
   ０７５０（菌株表示ＣＧＹ１２８５）。 １６、酵母株ＡＴＣＣＮｏ．２０７５１（菌株表示ＣＧ
   Ｙ１０８３）。 １７、酵母株ＡＴＣＣＮｏ．２０７５２（菌株表示ＣＧ
   Ｙ１２９１）。 １８、酵母株ＡＴＣＣＮｏ．２０７５３（菌株表示ＣＧ
   Ｙ９９８）。 １９、酵母株ＡＴＣＣＮｏ．２０７５３（菌株表示ＣＧ
   Ｙ９９８）の組換えＤＮＡ。 ２０、異種遺伝子産物の分泌能が強化された酵母株を選
   択する方法において、該方法が、 （ａ）形質転換可能な酵母株を選択し、 （ｂ）該酵母株を突然変異せしめ、 （ｃ）該変異株をスクリーニングして非変異細胞よりも
   少なくとも２倍以上の量の外来遺伝子産物を分泌する細
   胞を決定し、そして、 （ｄ）遺伝子産物の分泌能が強化された変異体酵母細胞
   を単離することから成る事を特徴とする前記方法。 ２１、該遺伝子産物がプロキモシンである、前記特許請
   求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２、選択された形質転換可能な酵母株がプロキモシン
   の遺伝子を含有するものである、前記特許請求の範囲第
   ２０項に記載の方法。 ２３、選択された形質転換可能な酵母株が形質発現およ
   び分泌用のＤＮＡ配列を含有するものである、前記特許
   請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２４、選択された酵母株がＣＧＹ９９８（ＡＴＣＣＮｏ
   ．２０７５３）である、前記特許請求の範囲第２０項に
   記載の方法。 ２５、外来遺伝子産物の分泌能が強化された酵母株を選
   択する方法において、該方法が、 （ａ）プロキモシンの遺伝子と形質発現および分泌のた
   めのＤＮＡ配列とを有する酵母株を選択し、 （ｂ）この酵母株をエチルメタンマルホネート突然変異
   せしめ、 （ｃ）該変異株をスクリーニングして非変異細胞よりも
   少なくとも２倍以上の量の外来遺伝子産物を分泌する細
   胞を決定し、そして、 （ｄ）こうしてスクリーニングされた細胞を使用して外
   来蛋白質を産生することから成る、前記方法。 ２６、該スクリーニングが細胞からの分泌物のミルク凝
   固活性を測定する工程を含むものである、前記特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ２７、該ミルクに更にペプスタチンを加えるものである
   、前記特許請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２８、該成熟蛋白質が形質転換された該変異細胞から得
   られた異種ポリペプチドとは異なるものである、前記特
   許請求の範囲第９項に記載の方法。 ２９、異種ポリペプチドの遺伝子で形質転換された時に
   、その変異体細胞が誘導される出発酵母細胞よりも高レ
   ベルでポリペプチドを分泌する変異体細胞を得るために
   突然変異せしめた酵母細胞。 ３０、超分泌性酵母細胞を選択する方法において、所望
   の酵母細胞をプロキモシン遺伝子で形質転換し、そして
   ミルク凝固活性に基づいてスクリーニングする工程から
   成る前記方法。 ３１、超分泌性酵母株を選択するためのスクリーニング
   において、 （ａ）酵母細胞を固体の栄養基板上に拡散させ、そして
   プロキモシン遺伝子で形質転換された個々のコロニーを
   生育させ、 （ｂ）可視程度に生育したものを該基板から除き、 （ｃ）カゼイン含有溶液を固化物質体に加えて上張りを
   形成し、 （ｄ）０°〜４０℃で培養し、 （ｃ）クロットの生成が認められた後に、この様なクロ
   ットを形成した細胞のコロニーを回収して超分泌性酵母
   株として使用する、ことから成る工程を含む、前記スク
   リーニング法。 ３２、工程（ａ）の該酵母細胞を突然変異せしめる、前
   記特許請求の範囲第３１項に記載のスクリーニング法。 ３３、工程（ｅ）で回収された細胞を更に融合せしめて
   、より高い分泌特性を有する遺伝的に別種の細胞を得る
   ことから成る、前記特許請求の範囲第３１項に記載のス
   クリーニング法。 ３４、融合酵母細胞の少なくとも１方が超分泌性酵母細
   胞である様に選んだ酵母細胞を融合することによって得
   た超分泌性酵母細胞。 ３５、該融合用酵母細胞が更に異種遺伝子を持っている
   ことから成る、前記特許請求の範囲第３４項に記載の超
   分泌性酵母細胞。 ３６、酵母有機体と異種の蛋白質をコードする機能性Ｄ
   ＮＡを含有する酵母発現プラスミドｐＣＧＳ５１４。 ３７、酵母有機体と異種の蛋白質がプロキモシンである
   、前記特許請求の範囲第３６項に記載の酵母発現プラス
   ミド。 ３８、該変異体細胞によって分泌された該異種ポリペプ
   チドがプロキモシンでありそして該最終ポリペプチド生
   成物がプロウロキナーゼである、前記特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 ３９、酵母有機体と異種の蛋白質がウシ成長ホルモンで
   ある、前記特許請求の範囲第３６項に記載の酵母発現プ
   ラスミド。 ４０、酵母有機体と異種の蛋白質がプロウロキナーゼで
   ある、前記特許請求の範囲第３６項に記載の酵母発現プ
   ラスミド。 ４１、酵母有機体と異種の蛋白質をコードする機能性Ｄ
   ＮＡを含有する酵母発現プラスミドｐＣＧＳ４４７。 ４２、酵母有機体と異種の蛋白質がウシ成長ホルモンで
   ある、前記特許請求の範囲第４１項に記載の酵母発現プ
   ラスミド。 ４３、酵母有機体と異種の蛋白質をコードする機能性Ｄ
   ＮＡを含有する酵母発現プラスミド。 ４４、酵母有機体と異種の蛋白質がプロウロキナーゼで
   ある、前記特許請求の範囲第４３項に記載の酵母発現プ
   ラスミド。