JPS626685A - プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵母α因子遺伝子のプロモーターならびにリ
ーダー配列を含有するプラスミドに存する。

（発明の構成） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を備え、ま
た、食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生
活と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子
工学に於ける宿主としての開発が期待されている。

しかし、酵母の細胞表層は、細胞膜の外側に強固な細胞
壁を有するため、遺伝子組換え技術によって生産された
有用物質（異種蛋白質）の精製が困難な場合が多く、精
製を簡略化するために、生産物を菌体外に分泌させる系
の開発が望まれている。また、分泌生産は連続培養が可
能となり、大幅な生産量の増加が期待され、更に菌体内
プロテアーゼによる生産物の分解が防止される等そのメ
リットは大きい。

本発明者等は、酵母を宿主とする遺伝子組換え技術にお
いて、菌体内で生産された有用物質を効率よく分泌させ
ることのできるプロモーター及びリーダー配列を探索し
た結果、本発明を達成したもので、その要旨は、酵母サ
ッカロマイセス・イタリカスα因子遺伝子のプロモータ
ー配列及びリーダー配列を含有するプラスミドに存する
。

本発明の詳細な説明するに、本発明に於けるα因子遺伝
子は、酵母サッカロマイセス・イタリカス株（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　１ｔａｌｉｃｕｓ、　ＩＦＯ０２
５３）由来のものであり、サッカロマイセス・イタリカ
スの染色体遺伝子から単離することができる。

サッカロマイセス・イタリカスのα因子遺伝子は、本発
明者等の研究の結果、例えば、Ｃｅ１ｌ、３０巻、９３
７頁（１９８２’）に記載されている、周知のサツカロ
マイセス・セレビシェのα因子遺伝子とは、６３塩基対
からなるスペーサーと成熟α因子の単位が５回繰り返し
ていること（サツカロマイセス・セレビシェのα因子遺
伝子では４回の繰り返しからなる）、及び塩基配列にお
いて、２塩基対相違している等の違いがあることが判明
した。

更に、適当なプラスミド・ベクター上において、サッカ
ロマイセス・イタリカスα因子遺伝子の主要部を占める
、プロモーター配列及びリーダー配列の後に、所望の蛋
白質をコードする外来遺伝子を挿入して宿主中で発現さ
せた場合、目的とする蛋白質を効率よく分泌させること
ができることが判明した。

以下に、サッカロマイセス・イタリカスのα因子遺伝子
の単離、及びヒトのβ−エンドルフィン遺伝子（以下β
Ｅ　ＤＮＡという）をマーカーとして使用し、このα因
子遺伝子のプロモーター配列及びリーダー配列を含んだ
、本発明の複合プラスミドの調製法と有用性について詳
細に説明する。

［α因子を含む遺伝子の単１＊］ プラスミドｐＬｓｌＩ　（４，４ｋｂ）の調製詳細は後
記実施例に記載するが、サッカロマイセス・イタリカス
の染色体遺伝子をＥｃｏＲＩで切断し、２　ｋｂ前後の
ＤＮＡ断片をプラスミドρＬＩＣＩ３　（Ｐｈ−ａｒｍ
ａｃｉａ社カタログ、Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｗｉｃａ
ｌｓ　、　２７頁、２７−４９７３記載）のＥｃｏＲ１
部位に挿入して、大腸菌を形質転換し、挿入ＤＮＡを含
む白色のコロニーを集め、サツカロマイセス・セレビシ
ェのα因子遺伝子ＭＦα１及びＭＦα２と相同な下記の
１６塩基のヌクレオチド ５　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３（α因子の
Ｃ末端側の−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｎｅｔ−Ｔｙｒ
に相当する） をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行
ない、陽性のコロニーを選択する。次いで、プラスミド
　ＤＮＡを分離し、サッカロマイセス・イタリカスのα
因子遺伝子を含むプラスミドρＬＳ１１（４，４ｋｂ）
を選択採取する。

このプラスミドをＥｃｏＲＩで切断することにより、α
因子を含む遺伝子（１，７ｋｂ）が得られる（第１図参
照）。

［分泌ベクターの構築］ （１）サツカロマイセス・セレビシェのα因子遺伝子を
含むプラスミドｐＬｓＯＩ　（４，４ｋｂ）の調製酵母
サツカロマイセス・セレビシェの染色体遺伝子をＥｃｏ
ＲＩで切断し、２　ｋｂ前後のＤＮＡ断片をプラスミド
ｐＵｃ１３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社カタログ、Ｐ−Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　２？頁、２７−４９７３
記載）のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、大１ｉ？ｌｒを形
質転換し、挿入ＤＮＡを含む白色のコロニーを集め、上
記酵母のα因子遺伝子ＭＦａｌ及び肝α２と相同な下記
の　１６塩基のヌクレオチド ５　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３（α因子の
Ｃ末端側の−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ４ｙｒに
相当する） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを
行ない、陽性のコロニーを選択する。

次いでプラスミド　ＤＮＡを分離して、サツカロマイセ
ス・セレビシェのα因子遺伝子を含むプラス。

ミドｐＬｓＯ１（４，４ｋｂ）を選択採取する。

（２）プラスミドｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）の調
製プラスミドＹＲρ７　［５，７ｋｂ　、酵母のＴＲＰ
Ｉを含むＤＮＡ断片と　ｐＢＲ３２２を結合したプラス
ミド、Ｎａ　−ｔｕｒｅ、２８２巻、３９〜４３頁（１
９７９）記載］をＥｃｏＲＩで部分切断し粘着末端を充
填した後、連結してＶＲｐ７の一方のＥｃｏＲＩサイト
が除去されたｐＲＥＩ０３２　（５，８ｋｂ）を調製す
る。

（３）プラスミド　ρＵＣ８−βＥ　（２，９ｋｂ　）
の調製プラスミド　ｐＶＴ３−２４　［特開昭５８−９
２６９６号公報、２頁記載、βＥ　ＤＮＡを含む］をＩ
ｆ　ａ　ｅ　ｍで切断して、Ｂ　Ｅ　ＤＮＡ　（９３ｂ
ｐ）を含む　１６０　ｂｐのＨａｅｍ　〜Ｈａｅ■断片
を採取する。

一方、ファージ旧３ｍｐ？　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅ　−５ｅａｒｃｈ　９巻、３０９〜３２１頁
記載　）のＲＦ　Ｉ　　ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）をＨｉ
ｎｃＩＩで切断し、エタノールに溶解する旧ｎｃｌＩ　
〜）Ｉｉｎａｌｌ断片５’ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣ３
’を除いた旧ｎｃＩＩ部位に、上記βＥ　ＤＮＡを含む
１６０　ｌａｐのＤＮＡ断片を連結し大腸菌を形質転換
する。形質転換株から　ＲＦ　Ｉ　　ＤＮＡを調製し、
これをＢａｗｌ（Ｉで切断して得られた　１７２　ｂｐ
のＢａｍ）Ｉ　Ｉ　〜ＢａｍＨＩ断片を、プラスミドｐ
Ｕｃ８［Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｌ＋　Ｌａ
ｂｏ　−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、発行のＢＲＬカ
タログ（Ａｕｇｕｓｔ　１゜１９８３　）、Ｃａｔ　／
　Ｎｏ、５３５９ＳＡ記載］のＢａｍＨＩサイトに挿入
してｐＵｃ８−βＥ　（２，９ｋｂ　）を得る。

（４）プラスミド　ｐＲＥＩ０４６　（７，４ｋｂ　）
の調製ｐＬｓＯ１（４，４ｋｂ　）の、プロモーター及
びリーダー配列を含むＥｃｏＲＩ〜旧ｎｄｍ（＋、４　
ｋｂ　）とｐｔＪｃ８−βＥ　（２，９ｋｂ）の旧ｎｄ
ｌｌｌ　〜ＥｃｏＲＩ断片（０，２ｋｂ、βＥ　ＤＮＡ
を含む）とを、ｐＲＥ１０３２　（！５．ｓ　ｋｂ）の
ＥｃｏＲＩ切断部位に連結してｐＲＥＩ０４６（７，４
ｋｂ　）を得る。（第２図参照） （５）プラスミドｐＲＥ１０５２　（５，２ｋｂ）の調
製ｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）のＴＲＰＩを含むＥ
ｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　１斬片（０，８ｋｂ　）と、２μ
ｍプラスミドの複製開始点を含むＰｓｔ　Ｉ〜ＥｃｏＲ
Ｉ断片（２ｋｂ　）と、ｂＢＲ３２２のＰｖｕ　ＩＩ　
〜ＥｃｏＲＩ断片（２，３ｋｂ　）とを、ノ連結してｐ
ＲＥ＋０５１　（５，１ｋｂ）を作製した後ＥｃｏＲ１
で部分切断し、粘着末端を充填後連結して、ｐＲＥ　１
０５１の一方のＥｃｏＲＩ切断部位を欠いたρＲＥＩ０
５２　（５，２ｋｂ　）を得る。（第３図参照）（６）
プラスミドｐＲＥ１０５９　（６，８ｋｂ　）の調製前
記（４）で得たｐＲＥ「０４６のプロモーター配列、リ
ーダー配列及びβＥ　ＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ〜Ｓ
ｍａ　Ｉ断片（１，６ｋｂ）と、ｐＬｓＯｌ　（４，４
ｋｂ）の、ターミネータ−配列を含む旧ｎｃＩＩ〜Ｅｃ
ｏＲＩ断片（０，３ｋｂ）とを採取する。

一方、ｐＲＥ１０５２　（５，２ｋｂ）をＥｃｏＲＩで
切断し、次いてバクチリアルアルカリンフォスフ、アタ
ーゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔａｓｅ、ＢＡＰ）を加えて末端のリン酸基を
外した後、これを、上記二つのＤＮＡ断片と連結してプ
ラスミドρＲＥＩ０５９　（６，８ｋｂ　）を得る。（
第４図参照） （７）プラスミドｐＲＥ１０８６　（６，８ｋｂ　）の
調製ｐＲＥＩ０５９をＥｃｏＲＩ及びＡａｔＩＩで切断
して得られるＥｃｏＲＩ　〜Ａａｔ■断片、ｐＲＥＩ０
５９を旧ｎｄｍ及びＡａｔｌｌで切断して得られる旧ｎ
ｄｌＩＩ〜ＡａｔＩ［断片並びに、１）ＬＳＯｌｌｌｔ
ＥｃｏＲＩ及び１ｌｉｎｄｌＩ［で切断して得られるＥ
ｃｏＲＩ−）１ｉｎｄｍ断片の３種のＤＮＡ断片を連結
してプラスミドρＲＥＩ０８６　（６，８ｋｂ　’）を
得る。（第５図参照） （発明の効果） プラスミドｐＲＥ１０８６は、βＥ　ＤＮＡ配列を、第
１図に示す本発明のサッカロマイセス・イタリカスα因
子遺伝子のプロモーター配列及びリーダー配列（１，１
ｋｂ　）の後に挿入したものである。このプラスミドを
、例えば、酵母サツカロマイセス・セレビシェＹＮＮ２
Ｔ株に導入し、形質転換株を培養すると、後記実施例に
示すように、高い効率でβ−エンドルフィンを培！！液
中に分泌させることができる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次の１〜■の方法によった。

■［制限酵素による　ＤＮＡの切断と回収］制限酵素に
よる切断用緩衝液は、下記４種類を用い（１）〜（３）
の使い分けは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅ−ｒｉ
ａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（＋９８１）（Ｃｏｌｄ　ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に従った
。また切断条件は、２単位／μｇＤＮＡの制限酵素を用
い、３７℃または６５℃、３０分間処理する。

次いで、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　のトリス塩酸ｐＨ８
，０及び１　ｍＭのＥ［ｌＴＡからなる）で飽和したフ
ェノールで１回抽出し、エーテルでフェノールを除き、
２倍容のエタノールを加えて一２０℃で３０分間放置し
た後、遠心分離してＤＮＡを回収する。

（１）低塩濃度緩衝液 １０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４）　、　１０　ｌ
ＩＭの硫酸マグネシウム及び１　ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。

（２）中塊濃度緩衝液 ５０　ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリス塩酸（ｐｉ（
７，４）ｌｏｍＭの硫酸マグネシウム及び１　ｍＭのジ
チオスレイトールからなる。

（３）高塩濃度緩衝液 １００　ｒａ門のＮａＣｌ　、５０　ｍＭのトリス塩酸
（ｐＨ７，４）及び１０　ｍＭの硫酸マグネシウムから
なる。

（４）制限酵素Ｓｍａ　Ｉ用緩衝液 ２０　ｍＭのＫＣＩ、１０　ｍ阿のトリス塩酸（ａｌｌ
　８．０）、＋０１Ｈの硫酸マグネシウム及びｌＩＩＭ
のジチオスレイトールからなる。

■［大ｍＭｃ　Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＩＩＢＩＯＩからのプ
ラスミドＤＮＡの調製］ （１）ミニ調製法（ｍ１ｎｉ　ｐｒｅｐ法）　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７巻、１５１３〜１５２３
頁（１９７９）］大腸菌１１８　Ｉ　０１を宿主とし、
０．５１のし一ブロス（１０ｇのペプトン、５ｇのイー
スト・エキス、Ｉｇのグルコース、５ｇのＮａＣ１／　
Ｉからなる　ｐｉ　７．２）を用いて一夜間培養し、遠
心分離して集菌した菌体を、１００μｍの溶液Ａ（５０
ｍＭのグルコース、１０ＲＩＨのＥＤＴＡ、２５ｍＭの
トリス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２Ｂ／ａ＋ｌ
からなる）に懸濁し室温で３０分間放置する。

次いで氷水中で２００μｍの溶液Ｂ［：ＩＸの５Ｏ５（
ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．２８のＮａＯＨ］
を加えて振盪してし、同時にＤＮＡの変性を行う。

１５０μｍの３Ｍ酢酸ソーダ溶液を加え水冷後、遠心分
離し、上溝に冷エタノールを加え、−２０℃に冷却して
遠心分離し、沈澱を集める。

沈澱を、溶液Ｃ（５０ｍＭのトリス塩酸及び０．１門の
酢酸ソーダからなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エ
タノールを加え、沈澱する　ＤＮＡを洗浄し、減圧下乾
燥し一２０℃で保存する。

（２）大量調製法 ２００１のし一ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬
剤を含む）に大腸菌ＨＢＩＯＩを植菌し、−夜間培養し
、集菌後、１５　ｍｌの５ＴＥＳ緩衝液［ＴＥＳ緩衝液
（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４）　、１　ｍＭの
ＥＤＴＡ及び５０　ｍＭのＮａＣｌからなる）に２５χ
のサッカロースを添加したもの］に懸濁し、ＥＤＴＡ、
リゾチーム及びリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を夫
々　３０　ａ＋Ｍ、　６００７１ｇ　／ａ＋ｌ及び５０
　μｇ／ｍｌ加え、更に氷水中でプロナーゼＥを５００
μｇ　／ｍｌ添加する。次いで、ＳＤＳを　ｔＸとなる
ように加え、３７℃で振盪し、氷水中に戻し、ＮａＣｌ
を終濃度ＩＭとなるように添加した後、遠心分離し、上
清に、２倍容の冷エタノールを加え、−２０℃に保持し
遠心分離してＤＮＡを沈澱として回収し、減圧下乾燥し
、−２０℃で保存する。

ｍ［Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結］ 連結する２個のＤＮＡ断片は、ｌμｇ　７１０μｍにな
るように、連結用緩衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（＋）
８７．５）　、６．６　ｎ＋Ｍの塩化マグネシウム、１
０　ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解し６５
℃で１０分間処理した後、４℃で６６μＨのＡＴＰ　（
アデノシントリフオスフェート）を加え、更にＴ４リガ
ーゼを粘着末端の場合は０．１単位／μｇ　ＤＮＡ、ま
た平滑末端の場合は１単位／μｇ　ＤＮＡになるように
加えて４℃で！８時間反応させた後、６５℃で１０分間
処理する。

■大腸菌の形質転換（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ　Ｇｅ　−ｎｅｔｉｃｓ（１９８１）　（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｖｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）
］５１のＬ−プロスに、大腸菌ＨＢＩＯＩを植菌し、−
夜間培養する。この０．２１を２Ｏｎ＋１のＬ−ブロス
に植え、３７℃でクレットユニットが６０に達するまで
振盪培養する。菌体を集め氷冷した５０　ｍＭの塩化カ
ルシウムと１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）とから
なる緩衝液１０　ｎ＋１に懸濁し、３０分間氷冷する。

遠心分離した面体を１１の塩化カルシウム溶液に懸濁し
、この０．１１を　１０μｍのＤＮＡ溶液と混合し０℃
で３０分間、４２℃で２分間インキュベートした後、１
．５１のし一ブロスを加え３７℃で３０分間培養し、こ
の０．１　ｍｌを寒天培地に植える。

ｖｃｓｔヌクレアーゼによる　ＤＮＡ粘着末端の除去］
粘着末端を持つＤＮＡを、２００μｍの高塩濃度緩衝液
［３０箇台の酢酸ソーダ（ｐ）Ｉ　４．２５）　、０．
３　ＨのＮａＣ１及び４ｍＭの硫酸亜鉛からなる］に溶
解し、Ｓｔヌクレアーゼを２０単位／μｇ　ＤＮＡ加え
、２２℃で４０分間処理し、ＴＥ緩衝液で飽和したフェ
ノールで抽出処理した後、エーテルでフェノールを除き
、冷エタノールを加え、−２０℃に冷却し、遠心分離に
より、沈澱したＤＮＡを回収する。

Ｖｌ　［Ｒａｍ　Ｈｌリンカーノリン酸化］ＢａｍＨＩ
リンカ−（８，Ｒ，Ｌ社製）５’　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧ
Ｇ　３’ ＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ は、末端にリン酸基が付いていないので、Ｔ４キナ−ゼ
でリン酸化を行なった。

３　ｎ　ｍｏｌのＢａｍＨＩリンカ−を、４１μ＋の８
０ｍＭ１−リス塩酸（ｐＨ７，５）及び１２　ｍＭの塩
化マグネシウムに溶解し、６０℃で１０分間インキュベ
ートした後、３７℃で１０　ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールと、２０　ｍＭのＡＴＰを加え、更に１０単位の
Ｔ４キナーゼを添加して３７℃で３０分間処理した後、
−２０℃で保存する。

■［ＢａｍＨＩリンカ−の平滑末端への連結］平滑末端
のＤＮＡ断片＜　１．２　ｐ　ｍｏｌ末端）と上記■て
リン酸化したＢａｍＨＩリンカ−（１００ｐ　ｎ＋ｏｌ
末端）を連結用緩衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７
，５）　、　６．６　ｎ＋Ｍの塩化マグネシウム、１０
　ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解し、１単
位のＴ４リガーゼを加え４℃で１８時間反応後、ｆｌａ
ｍＨＩで処理して余分のＢａｍＨＩリンカ−を除き、Ｔ
Ｅ）ｉ！　ｆｆｉ液で飽和したフェノールでＤＮＡを抽
出し、エーテルでフェノールを除去後エタノール沈殿で
ＤＮＡを回収する。

■［プラスミド　ＤＮＡのバクチリアルアルカリンフォ
スファターゼ（ＢＡＰ　）処理］ プラスミド　ＤＮＡの自己連結を阻止するため、プラス
ミド　ＤＮＡの制限酵素部位とＤＮＡ断片との連結に先
だって、プラスミド　ＤＮＡを予めＲＡＰで処理する。

制限酵素で切断したプラスミド　ＤＮＡ（１０ｐ　ａｎ
ａ１５　末端）を２００μｍのＢＡＰ緩衝液［１０■門
のトリス塩酸（ｐＨ８，０）及び０．１　ａ＋ＭのＥ［
ｌＴＡからなる］に溶解し、ｌＯＯ単位のＢＡＰを加え
、６５℃で１時間反応後、ＴＥＩＩ街液で飽和した・フ
ェノールで抽（１出処理し、エーテルでフェノールを除
去し、エタノール沈澱によりプラスミド　ＤＮＡを回収
する。

実施例 （１）プラスミドｐＬｓＯ１（４，４ｋｂ）の調製サツ
カロミセス・セレビシェ　ＩＦｏ　１１３６の染色体遺
伝子５００μｇを５００μｍの緩衝液［１００ｍＭのト
リス塩酸（ｐＨ７，５）、５０　ｍＭのＮａＣ１，１０
ｏ＋Ｍの塩化マグネシウム及びＩ　ｎ＋Ｍのジチオスレ
イトールからなる］中で１５単位のＥｃｏＲＩで３７℃
、１夜間処理して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾配遠心
にかけ、２　ｋｂ前後の［ｌＮＡ断片を集めた。これを
プラスミドρＵＣｌ３をＥｃｏＲＩを用いて切断した断
片ｌμｇとＴ４リガーゼ２単位を用いて連結し、得られ
たプラスミドで大Ｉ！菌ＪＭ８３株を形質転換し、アン
ピシリン耐性株を選択した。

合成オリゴヌクレオチド ５　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３’をプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ない、陽
性のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを分離し、制
限酵素による解析と塩基配列の決定により、Ｃｅ１ｌ、
３０巻、９３７頁（１９８２）の記載と一致する塩基配
列を有するサツカロマイセス・セレビシェのα因子遺伝
子を含むプラスミドρＬＳＯＩ（４，４ｋｂ）を選択採
取した。

ｆ２）プラスミドｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）の調
製プラスミドＹＲｐ７　（５，７ｋｂ　）をＥｃｏＲＩ
で部分明所し、粘着末端を充填した後、Ｔ４リガーゼで
連結してＹＲｐ７の一方のＥｃｏＲＩサイトが除去され
たｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）を調製した。

（３）プラスミド　ｐＵｃ８−βＥ　（２，９ｋｂ　）
の調製プラスミド　ｐＹＴ３−２４をＨａｅＩＩ［で切
断して、βＥＤＮＡ　（９３ｂｐ　’）を含む＋６０　
ｂｌ）のＨａｅ［［Ｉ　〜Ｈａｅｍ断片を採取した。

一方、ファージ旧３ｍｐ？のＲＦＩＤＮＡをＨｉｎｃＩ
Ｉで切断し、エタノールを添加してエタノールに溶解す
る断片５’　ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣ（（旧ｎｃ■〜
Ｈｉｎｃ■）を除去した後、Ｈｉｎｃ１１部位に、上記
βＥ　ＤＮＡを含む１６０　ｂｐのＨａｅｍ〜Ｈａｅｍ
断片をＴ４リガーゼで連結し、これを大腸菌８８１０１
株に導入した。得られた形質転換株から　ＤＮＡを調製
し、これをＢａｍ＋ＨＩで切断し、得られたＢａｍＨＩ
　−Ｂａａ＋　Ｉｆ　Ｅ断片を、プラスミド　ｐｕｃｓ
のＢａｍＨＩサイトに挿入してｐｕｃａ−βＥ　（２，
９ｋｂ　）を得た。

（４）プラスミドｐＲＥ１０４６　（７，４ｋｂ　）の
調製（イ）　　ＩＩＬｓＯＩ　（４，４ｋｂ　’）をＥ
ｃｏＲＩ及び旧ｎｉｊｍで切断してプロモーター配列及
びリーダー配列を含むＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄｕｌ断片
（１，４ｋｂ）を得た。

（ロ）　ｐｕｃａ−βＥ（２，９ｋｂ）を　旧ｎｄｌＩ
Ｉ及び１ｃｏＲＩで切断して旧ｎｄｍ　〜ＥｃｏＲＩ断
片（０，２ｋｂ　’）を得た。

（ハ）ｐＲＥＩ０３２　（５，８ｋｂ）をＥｃｏＲＩで
切断し、これを上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片
とＴ４リカー　セラ用イテ連結Ｌ／　テｐＲＥ１０４６
　（７，４ｋｂ　’）を得た。

（５）プラスミドｐＲＥ１０５２　（５，２ｋｂ　）の
調製（イ）　ｐＲＥＩ０３２　（５，８ｋｂ）をＥｃｏ
ＲＩ及びＰｓｔｌで切断してＴＲＰＩを含むＥｃｏＲＩ
　〜Ｐｓｔ　Ｉ断片（ｏ、８ｋｂ　）を得た。

（ロ）２μｍプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、その粘
着末端を充填して平滑末端とした後、ＰｓｔＩで切断し
て複！！間始点を含むＰｓｔ　Ｉ　＝　ＥｃｏＲＩ断片
（２ｋｂ）を得た。

くハ）上記（イ、）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片を、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ　ＩＩで切断したＰ
ｖｕｌｌ　〜ＥｃｏＲＩ断片（２，３ｋｂ　）と共にＴ
４リガーゼにより連結してｐＲＥ１０５１　（５，１ｋ
ｈ　）を作製しＥｃｏＲＩで部分切断した後、粘着末端
を充填して平滑末端としてＴ４リガーゼで連結し、一方
のＥｃｏＲＩ切断部位を欠失した　ｐＲＥＩ０５２　（
５，２ｋｂ　）を得た。

（６）プラスミＦ　ｐＲＥＩ　０５９　（６，８ｋｂ　
ン（ＯＲ製（イ）　ｐＲＥ１０４６　（７，４ｋｂ　）
をＥｃｏＲＩ及びＳｍａ　Ｉで切断し、得られたプロモ
ーター配列、リーダー配列及びβＥ　ＤＮＡ配列を含む
ＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａｌ断片（＋、６ｋｂ）を採取した
。

（ロ）ｐｔ、ｓｏｔ　（４，４ｋｂ）をＨｉｎｃＩｉ及
びＥｃｏＲＩで切断しターミネータ−配列を含むＨｉｎ
ｃＩＩ〜ＥｃｏＲ１断片（０，３ｋｂ　）を採取した。

（ハ）　ｐＲε＋０５２　（５，２ｋｂ　）をＥｃａＲ
Ｉで切断し、ＢＡＰを加えて末端のリン酸基を外した後
、上記（イ）及び（ロ）で得た［）ＮＡ断片とＴ４リガ
ーゼを用いて連結してプラスミドｐＲＥＩ０５９　（６
，８ｋｈ　）を得た。

（７）プラスミド　ｐＬｓｌｌ　（−４，４ｋｂ）の調
製サツカロミセス・イタリカス　ＩＦＯ０２５３の染色
体遺伝子ｓｏｏｕｇを、５００μ＋の緩衝液［１００ｍ
Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７，５）、５０　ｍＭのＮａＣｌ
　、１０　ｍＭの塩化マグネシウム及び１　ｍＭのジチ
オスレイトールからなる］中で１５単位のＥｃｏＲＩで
３７℃、１夜間処理して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、２　ｋｂ前後のＤＮＡ断片を集めた。こ
れをプラスミド　ｐＵｃ１３をＥｃｏＲＩを用いて切断
した断片ｌμｇとＴ４リガーゼ２単位を用いて連結し、
得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ８３株を形質転換し、
アンピシリン耐性株を選択した。

合成オリゴヌクレオチド ５　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３＃をプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ない、陽
性のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを分離した。

このプラスミドＤＮＡは、制限酵素による解析と塩基配
列の決定により、Ｃｅ１ｌ、３０巻、９３７頁（１９８
２’）に記載されている、サッカ５０マイセス・セレビ
シェのα因子遺伝子と異なり、６３塩基対からなるスペ
ーサーと成熟α因子の単位が５回繰り返しており、また
、サツカロマイセス・セレビシェのα因子遺伝子とは、
２塩基対の違いがある、サツカロミセス・イタリカスの
α因子遺伝子を含むプラスミドｐＬｓ１１　（４，４ｋ
ｂ　）を選択採取した。

（８）プラスミドｐＲＥＩ０８８　（６，８ｋｂ　）の
調製ｐＲＥ　ｌ　０５９をＥｃｏＲＩ及びＡａｔｌｌ切
断してＥｃｏＲＩ　〜ＡａｔＩＩ断片（５，Ｏｋｂ）を
得た。また、ｐＲＥ＋０５９を）１ｉｎｄｌＩ［及びＡ
ａｔＩＩで切断してＨｉｎｄＩＩＩ−ＡａｔＩＩ断片（
０，６ｋｂ　）を得た。更に、ｐＬｓｌｌをＥｃｏＲＩ
及び１１ｉｎｄｌｌｌで切断してＥｃｏＲＩ〜旧ｎｄｌ
［Ｉ断片（１，２ｋｂ　’）を得た。これら３種のＤＮ
Ａ断片をＴ４リガーゼで連結してプラスミドｐＲＥ１０
８６　（６，８ｋｂ　）を得た。

（９）プラスミド　ｐＲＥ１０８Ｂによる酵母サツカロ
マイセス・セレビシェＹＮＮ２７株の形質転換サツカロ
ミセスΦセレビシェＹＮＮ２７株を、ＹＰ口培地（ＩＫ
の酵母エキス、２χのペプトン及び２χのグルコースか
らなる　）で−夜間培養した培養液０．５　ｍｌ　ｆｔ
　　２０　ｍｌ）　ＹＰＤ培地に植え、３０’Ｃチクレ
ットユニット６０まで１ｔｉｌｔ培養する。この　１０
　ｍｌを遠心分離して得た菌体を　１０　ｍｌのＴＥ）
ｉｉ衝液で洗浄し、１１のＴＥ緩衝液に懸濁する。この
０．５　ｍｌに０．５１の０．２Ｍ酢酸リチウム、１０
　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）及び　１　ｍＭ　（
７）ＥＤＴＡヲ加え、３０’Ｃテ１時間保持した後、氷
水中で冷却する。

得られた菌体懸濁液１００μｍに１ｏμｇのｐＲＥ　＋
０８６ヲ含むＴＥ緩衝液１０μ＋を加えθ℃テ３゜分間
保持した後、２００μｍの７０！ポリエチレングリコー
ル４０００溶液を加え、３０℃で１時間、次いで４２℃
で５分間保持した後、集菌し、０．５　ｍｌの水で洗浄
後０．３　ｍｌの水に懸濁し、プレート　１枚に０．１
１植える。

（１０）β−エンドルフィンの分泌量 上記（９）で得たプラスミドｐＲＥ１０８６を含むサツ
カロミセス・セレビシェＹＮＮ２７株を　２日間培養し
た後、遠心分離し、上清について、β−エンドルフィン
［ＲＩＡ　］キットＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ
ｅａｒ社、力、タログ番号ＮＥＫ　−００３’）を使用
し、カタログ記載の方法に従ってラジオイムノアッセイ
を行なった結果、上溝中のβ−エンドルフィン量は２４
１．０ｎｇ／ｍ　ｌであった。

なお前記のプラスミド　ｐＲＥ１０５９により、同機に
妙ツカロマイセス・セレビシェＶＮＮ２７株を形質転−
し、培養後、遠心分離した上清について、上記と同一方
法により測定したβ−エンドルフィン量は、２３３．７
　ｎｇ／ｍｌであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、サツカロマイセス・ウバルムα因子遺伝子の
配列を示す模式図、第２〜第５図は本発明における複合
プラスミドの構成ルートを示す模式図であって、図中、
ＥはＥｃｏＲＩを、Ｈは旧ｎｄｍを、Ｓ！、ｔＳａｌｌ
を、ＰはＰｓｔｌを、８はＢａｍＨＩを、Ｐｖは　Ｐｖ
ｕ　Ｕを、Ｓｍは　Ｓｍａ　　Ｉを、ＨｃはＨｉｎｃＩ
Ｉを、×はＸｂａ　Ｉを、ＡはＡａｔｌｌを夫々示す。 出願人　工業技術院長　　等　々　力　　速射２図 Ｉ−Ｉ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母サッカロマイセス・イタリカスα因子遺伝子
   のプロモーター配列及びリーダー配列を含有するプラス
   ミド。