JPS628440B2 - - Google Patents
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- JPS628440B2 JPS628440B2 JP52049641A JP4964177A JPS628440B2 JP S628440 B2 JPS628440 B2 JP S628440B2 JP 52049641 A JP52049641 A JP 52049641A JP 4964177 A JP4964177 A JP 4964177A JP S628440 B2 JPS628440 B2 JP S628440B2
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、ボルデテラ（Bordetella）属に属す
る微生物を培養し、培養物（培養培地もしくは菌
体）から蛋白質様の生物学的活性成分を採取する
ことから成る生物学的活性画分（以下、“活性画
分”と略称する）の製法、及びこの活性画分を有
効成分とする糖尿病治療及び予防薬、免疫調節剤
もしくは交換神経β受容体遮断剤に係る。 本発明に於ける“生物学的活性”とは、インシ
ユリン分泌増強活性、免疫増強活性及び交換神経
β受容体遮断活性（以下、単にそれぞれＡ，Ｂ及
びＣ活性と略称する）を意味し、各活性の生物学
的定義は後記実施例１−１項、同２−１項及び同
３−１項にそれぞれ示す通りである。 本発明活性画分の薬理作用は次の通り要約され
る。 活性画分は、哺乳動物のインシユリン分泌を
それが必要のときに随時促進し、且つ血糖値を
正常値に維持するという驚嘆すべき薬理作用を
有し、血糖値が異常に高い値を示している所謂
糖尿病症状を示す場合には、この活性画分の投
与により数日以内にその血糖値は正常値に戻
り、その作用は１箇月以上にわたり持続するこ
とが判明した。これ等の作用は現在知られてい
るいかなる糖尿病治療薬にもなく、しかも既存
の糖尿病治療薬の有する低血糖になるという極
めて危険な副作用もなく、また、生体外から与
えるインシユリンの場合に問題となる効果の持
続性についても、はるかに長い持続性を示し、
従つて各種糖尿病の治療および予防薬として極
めて有用である。 活性画分は、抗体産生を増強し、細胞性免疫
を高める作用を有し、しかも極めて微量で免疫
作用を調節するという驚くべき薬理作用を有
し、従つて免疫機能の異常によるとおもわれる
疾患、たとえば悪性腫瘍、再生不良性貧血、リ
ウマチ関節炎、腎炎、ベーチエツト氏病、重症
性筋無力症、遅延型アレルギー等に対して有用
な薬剤になることが判明した。 活性画分は哺乳動物で起るエピネフリン（ア
ドレナリン）で誘起される高血糖を、ほぼ完全
に抑制するという驚くべき薬理作用を有するこ
とから本物質には交換神経β受容体の遮断作用
があることが判明した。従つて交換神経の異常
に基く各種疾患、例えば本態性高血圧等の高血
圧症、狭心症不整脈等の治療薬および予防薬と
して極めて有用である。 本発明活性画分、病原性細菌として公知のボル
デテラ（Bordetella）属に属する微生物を固形培
地又は液体培地にて培養し、その菌体もしくは培
地から前記生物学的活性成分を採取することによ
り得られる。 菌体ならびに培養物からの生物学的活性成分の
有利な採取および精製は、溶解度法、クロマトグ
ラフイー法、分子篩法、電気泳動法および生物学
的方法の１つ又は、これ等の方法の組合せなど、
当該分野で汎用の多くの分別精製方法により達成
され得、従つて本発明は特定の採取精製法に何等
限定されるものではない。 しかし乍ら、本発明者の知見によれば、活性画
分の極めて有利な採取精製方法の１例としてカラ
ムクロマトグラフ法を例示した得、この場合、微
生物の培養上清液は、ハイドロキシアパタイト、
カルボキシメチルセフアロースCL−6B、Ｐ−ア
セトキシマーキユリアニリン−セフアロース
6MB、セフアデツクスＧ−50、セフアデツクス
Ｇ−75、セフアデツクスＧ−100、セフアデツク
スＧ−150、セフアデツクスＧ−200、バイオゲル
Ｐ−100、バイオゲルＰ−150、バイオゲルＰ−
200、コンカナバリンＡ−セフアロース4B、セフ
アロース6B、DEAE−セフアロース、セフアク
リルＳ−200、及び抗IAP抗体−セフアロース4B
などの充填材より成るカラムを通される。 活性成分はこれらのカラムに極めて選択的に吸
着され、次いで適切に選択された溶出液により溶
離されて活性画分を与える。 特に、後記実施例４に示す、ハイドロキシアパ
タイトカラム、カルボキシメチルセフアロース
CL−6Bカラム及びＰ−アセトキシマーキユリア
ニリン−セフアロース6MBカラムの組合せによ
る活性成分の分取精製法が極めて効果的である。 因みに、ボルデテラ（Bordetella）属に属する
微生物の培養菌体は、加熱等の適当なる方法にて
弱毒・不活化されたのち、何等の精製手段を更に
施すことなしに500億個で後記する糖尿病治療薬
として所要の力価である100〜500単位程度は充分
に保証し得るので医薬として使用可能であり、本
発明はこのワクチンにも係るものである。 菌体ならびに培地等の培養物から上述した採取
精製方法の一つ又は二つ以上の組み合せ方法によ
り得られた活性画分は、その培養に使用した菌
株、培養方法、更には、採取精製方法等により異
なるが、いずれも蛋白質様物質であり、ゲルろ過
法による分子量は10000〜250000、糖質０〜25重
量％、脂質０〜25重量％及び、ときには核酸
（260nmのUV吸収により検知）を含み、等電点PH
４〜190の範囲にあり、その詳細な化学的、生物
学的諸特徴は後記各実施例に示す通りである。 本発明活性画分を産生するボルデテラ属の微生
物は、百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症
菌として周知であり、他方、これらの病源菌を、
培地組成の変更、紫外線、Ｘ線等の各種放射線照
射又は変異誘起剤の適用等の慣用の各種手段で変
異せしめて得られる変異株をも包含する。 培養方法としては、液体振盪培養方法が活生及
び収率の点で好ましいが、他の方法によることも
妨げない。 なお、ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性
質、培養条件等は、 Bergy′s Manual of Determinative
Bacteriology 第８版1974年Baltimore：The Williams ＆
Willkns CO.， Ｊ・Exp・Med.129：523〜550（1969）、細菌
学実習提要：第３版第６頁以下、昭和47年（丸善
(株)発行）、等に記載されている。 こうして得られる本発明(A)，(B)，(C)活性画分
は、糖尿病の治療および予防薬、免疫調節剤およ
び交換神経β受容体遮断剤として極めて有用であ
り、人体に対する有効量は、活性画分の比活性に
応じて固形物として、Ａ活性用途においては約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（体重）の
範囲であり、Ｂ活性用途については約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（体重）、
Ｃ活性用途については約0.01EU／Kg（体重）〜
数100EU／Kg（体重）の範囲である。 患者に対する投与方法は、各活性用途とも静脈
内投与が最も有効であり、その他腹腔内、筋肉内
および皮下投与、あるいは消化管内への直接投
与、経口投与、直腸内投与および舌下、皮内、鼻
粘膜、動脈、リンパ乃至管投与も有効である。 投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐
剤、腸溶・胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示
し得る。注射液の最も単純な組成を例示すれば、
Ａ活性10000Units、NaCl9mgおよび滅菌蒸留水で
１mlとしたものをあげ得る。 なお、患者に対する上記投与方法ならびに投与
形態の適応は、各活性用途とも成人、小児、老人
の別、あるいは人種性別等による区別はない。 更に、本明細書において以下、活性画分は、活
性成分含有液体およびこれを凍結乾燥処理等で乾
燥して得られる活性成分含有個体の両者を意味す
るものとする。例えば、注射薬液は両者のいずれ
を出発材料としても得られることは自明であろ
う。 又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめる
ことのない任意の他成分を混合し得ることも当業
者にとり自明であろう。 次に、本発明活性画分の各種物性に付き詳述す
る。 存在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解
性白色または淡褐色粉末であり、約３〜５mg／ml
までは室温で水に溶解、6NHCl中では不溶性白沈
を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、メ
ルカプトエタノール、システイン溶液に溶解す
る。冷時（４℃）、精製活性物質の溶液に硫安、
ドライアイス・アセトンあるいはエタノール、ト
リクロル酢酸、塩化亜鉛溶液及びその他の類種の
金属イオンを含む溶液等の添加により、各々白
濁、沈澱を生ずる。水とクロロホルムあるいはｎ
−ブタノール混合液では不溶性となり両液の界面
に集まる。 本活性画分の水溶液を80℃以上に加温すると白
濁する。0.5MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に対し本活性画分を溶解し、次いで蒸留水
を外液として透析すると、一時白濁するが透析の
続行により完全に再溶解し、白濁は消失する。ま
た、高濃度溶液では0.01M酢酸緩衝液（PH4.5）
に対し、徹底的に透析すると淡褐色に着色して溶
解することもある。 組 成： 蛋白質40重量％以上、糖質25重量％以下、脂質
25重量％以下であり、260nmのUV吸収で核酸が
検知される場合もある。 尚、各成分の測定方法は下記各文献に依つた。 蛋白質 Lowry，O.H.，N.J.Rosebrough，A.L.Farr，
and R.J.Randall. J.Biol，Chem.193：265 1951 糖 質 Phenol−H2SO4法 Dubois，M.，K.A.Giles，J.K.Hamilton，P.A.
Rebers，and、F.Smith. Anal.Chem.28 350，1956 脂 質 総脂質、結合脂質はクロロホルム、クロロホル
ム−メタノール、ヘペタンに加水分解の前後に物
質を抽出し、Marsh and Weinsteinの方法で測
定 J.B.Marsh and D.B.Weinstein：J.Lipid Res.
，７ 574，1966 蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ／
100μＭ；6NHClで110℃、16又は24時間加水分
解）： アスパラギン酸（Asp）7.5〜7.9、スレオニン
（Thr）6.8〜7.6、セリン（Ser）5.9〜7.6、グル
タミン酸（Glu）9.7〜10.8、プロリン（Pro）5.5
〜6.4、グリシン（Gly）8.7〜9.6、アラニン
（Ala）9.1〜10.8、シスチン／２（Cys／２）1.5
〜2.6、バリン（Val）5.6〜6.6、メチオニン
（Met）2.5〜3.3、イソロイシン（Ile）3.6〜4.1、
ロイシン（Leu）7.5〜8.0、チロシン（Tyr）5.1
〜6.6、フエニルアラニン（Phe）3.3〜3.9、リジ
ン（Lye）3.1〜4.4、ヒスチジン（His）1.4〜
1.6、アルギニン（Arg）6.1〜6.6であつた。 等電点PH： 活性画分の等電点はPH４〜10であるが、その大
部分はPH７〜９であり、一部分PH47のものもあ
る。 デイスク電気泳動パターン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度
7.5％、PH4.3ゲル、試料30μｇ、通電4mA、２時
間／ゲル１本、アミドブラツク10Bによる染色、
７％酢酸溶液による脱色の条件下でのデイスク電
気泳動において、 距離（スペーサー・ゲル先端を基準として） 2.3±0.2cmの位置に大部分の精製活性物質がバ
ンドを与えた。また一部のものは、PH8.3ゲルに
おいて陽極に移動するものが認められた。 実施例 １ インシユリン分泌増強活性 １−１ 活性測定法 活性画分の活性は種々のインシユリン分泌刺
激物質に対する動物の反応性で測定出来るが、
通常はグルコースを刺激物質として用いる。 Γ 検定用使用動物 ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ） Γ 試験方法 各力価の活性画分を生理食塩液に溶解し、そ
の0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入
し、３日後にインシユリン分泌増強活性を測
定する。なお実験開始前18〜20時間絶食させ
る。測定方法は、ラツト尾静脈より0.1mlの
血液を採取後、直ちに30％グルコース溶液を
体重100ｇ当り１ml腹腔内に投与し、正確に
15分後、0.1mlの血液を再び採取する。イン
シユリン分泌増強活性は、グルコース投与
前、後の血糖値および血中インシユリン値の
差より求める。血糖値はグルコースオキシダ
ーゼ法、インシユリンは二抗体法にて測定す
る。 尚、以下の薬理試験で使用の静注液も上記
と同一組成より成る。血糖値及びインシユリ
ンの測定方法は夫々下記文献及びキツトによ
る。 血糖値：グルコースオキシダーゼ法 Bergmeyer，H.−U.，and Bernet，E.in
“Methods of enzymatic analysis”
Bergmeyer，H.−U.，eds，New York
Academic press Ｐ 123（1963） グルコスタツト インシユリン：二抗体法 Morgan，C.R.，and Razarow，A.Diabetes
12 115（1963） インシユリンリアキツト−ダイナボツト社製 まず以下の式に従つて活性物質（活性画分）投
与群及び対照群ラツトの△Ｉ／△Ｇ値を求める。 △Ｉ／△Ｇ（μＵ／mg） ＝グルコース投与後の血中インシユリン値（μＵ／ml）−グルコース投与前の血中インシユリン／グルコース投与後
の血糖値（mg／ml）−グルコース投与前の血糖値（mg／ml） ／グルコース投与後の血中インシユリン値（μＵ／ml）−グルコース投与前の血中インシユリン値（μＵ／ml） 尚、血糖値を活性の計算に用いるのは分泌され
るインシユリン量が血糖値によつて大きく影響さ
れるためである。 次に活性物質の力価は、 単位（Unit）＝（本物質投与群ラツトの平均△Ｉ／△Ｇ−対照群の平均△Ｉ／△Ｇ／対照群の平均△Ｉ／△Ｇ）×10
0 で求める。 本物質の比活性は力価単位を、重量で除したも
のとする。 １−２ Ａ活性に関する薬理効果の要約 本活性画分はインシユリン分泌増強活性を主
作用とし、その他に耐糖能の良化作用、インシ
ユリン分泌活性、ストレプトゾトシン誘起糖尿
病の治癒を促進する作用、更に遺伝性糖尿病の
耐糖能を改善するなぢ、薬理的に有用な効果が
みられる。更に、これらの作用は本活性画分の
１回きりの投与で、いずれも数週間から数ケ月
にわたつて持続する。これらの活性はマウス・
ラツト及び犬において詳細に検討されたが、各
種共に全く同様の規象が観察されることから本
物質の薬理作用には種差は影響しないと考えら
れる。 本活性画分は主に糖尿病治療薬として有用と
考えられるが、現在糖尿病に対する薬物療法
は、インシユリン注射あるいは血糖降下薬の経
口投与のみでいずれも対症療法にすぎず、殆ん
ど不治の病と言つてさしつかえない。しかもイ
ンシユリン注射のために毎日通院しなければな
らない繁雑さがあり、血糖降下薬の投与では血
糖値の異常低下の発現が常に危険視されてい
る。本活性画分の特徴は、これ自身インシユリ
ン分泌活性を有するのみならず血糖値をいろい
ろな条件で高めた時（高血糖状態、特に摂食時
に類するグルコース負荷時）にのみ血中インシ
ユリンを増加させて血糖値をすみやかに正常に
戻す作用があり、更に、この物質の利点として
は、１回投与で数週間から数ケ月にわたつて活
性が持続することである。従つて血糖値に対す
るインシユリン分泌の反応が低下した様な場合
には、この活性画分投与によりインシユリン分
泌が再賦活化される。以上の点より、本活性画
分は糖尿病、糖尿病の合併症及び糖尿病が起因
となる様々な成人病の治療薬としてばかりでな
く、前糖尿病状態への適用や、現在全く治療法
がなく悲惨な状態にある若年型糖尿病の予防及
び治療薬ならびに診断薬として有用である。 １−３ インシユリン分泌増強活性 この作用は本活性画分の主たる作用の１つで
あるが、ラツト（ウイスター系雄性）、イヌ
（ビーグル犬、雄雌）について実験を行つた。 ラツト 実験条件は活性測定法の項と同様であるが本活
性画分投与３日目に各インシユリン分泌刺激物質
に対する反応性を正常群と比較した（第１表）。
最も生理的な因子であるグルコース投与では、グ
ルコースの投与経路の違いにもかかわらず、対照
群に比し顕著な血中インシユリン濃度の増加がみ
られた。またグルカゴン（１mg／Kg）、エピネフ
リン（200μｇ／Kg）などのホルモン刺激に対す
る反応性も著明に増加していた。更に現在臨床で
使用されている血糖降下薬であるトルブタミド
（200mg／Kg）、グリベンクラミド（２mg／Kg）の
インシユリン分泌活性の増強もみられた。以上の
知見から、本活性画分投与はインシユリン分泌刺
激物質に対する生体の反応性を著しく増強するこ
とが確認された。
る微生物を培養し、培養物（培養培地もしくは菌
体）から蛋白質様の生物学的活性成分を採取する
ことから成る生物学的活性画分（以下、“活性画
分”と略称する）の製法、及びこの活性画分を有
効成分とする糖尿病治療及び予防薬、免疫調節剤
もしくは交換神経β受容体遮断剤に係る。 本発明に於ける“生物学的活性”とは、インシ
ユリン分泌増強活性、免疫増強活性及び交換神経
β受容体遮断活性（以下、単にそれぞれＡ，Ｂ及
びＣ活性と略称する）を意味し、各活性の生物学
的定義は後記実施例１−１項、同２−１項及び同
３−１項にそれぞれ示す通りである。 本発明活性画分の薬理作用は次の通り要約され
る。 活性画分は、哺乳動物のインシユリン分泌を
それが必要のときに随時促進し、且つ血糖値を
正常値に維持するという驚嘆すべき薬理作用を
有し、血糖値が異常に高い値を示している所謂
糖尿病症状を示す場合には、この活性画分の投
与により数日以内にその血糖値は正常値に戻
り、その作用は１箇月以上にわたり持続するこ
とが判明した。これ等の作用は現在知られてい
るいかなる糖尿病治療薬にもなく、しかも既存
の糖尿病治療薬の有する低血糖になるという極
めて危険な副作用もなく、また、生体外から与
えるインシユリンの場合に問題となる効果の持
続性についても、はるかに長い持続性を示し、
従つて各種糖尿病の治療および予防薬として極
めて有用である。 活性画分は、抗体産生を増強し、細胞性免疫
を高める作用を有し、しかも極めて微量で免疫
作用を調節するという驚くべき薬理作用を有
し、従つて免疫機能の異常によるとおもわれる
疾患、たとえば悪性腫瘍、再生不良性貧血、リ
ウマチ関節炎、腎炎、ベーチエツト氏病、重症
性筋無力症、遅延型アレルギー等に対して有用
な薬剤になることが判明した。 活性画分は哺乳動物で起るエピネフリン（ア
ドレナリン）で誘起される高血糖を、ほぼ完全
に抑制するという驚くべき薬理作用を有するこ
とから本物質には交換神経β受容体の遮断作用
があることが判明した。従つて交換神経の異常
に基く各種疾患、例えば本態性高血圧等の高血
圧症、狭心症不整脈等の治療薬および予防薬と
して極めて有用である。 本発明活性画分、病原性細菌として公知のボル
デテラ（Bordetella）属に属する微生物を固形培
地又は液体培地にて培養し、その菌体もしくは培
地から前記生物学的活性成分を採取することによ
り得られる。 菌体ならびに培養物からの生物学的活性成分の
有利な採取および精製は、溶解度法、クロマトグ
ラフイー法、分子篩法、電気泳動法および生物学
的方法の１つ又は、これ等の方法の組合せなど、
当該分野で汎用の多くの分別精製方法により達成
され得、従つて本発明は特定の採取精製法に何等
限定されるものではない。 しかし乍ら、本発明者の知見によれば、活性画
分の極めて有利な採取精製方法の１例としてカラ
ムクロマトグラフ法を例示した得、この場合、微
生物の培養上清液は、ハイドロキシアパタイト、
カルボキシメチルセフアロースCL−6B、Ｐ−ア
セトキシマーキユリアニリン−セフアロース
6MB、セフアデツクスＧ−50、セフアデツクス
Ｇ−75、セフアデツクスＧ−100、セフアデツク
スＧ−150、セフアデツクスＧ−200、バイオゲル
Ｐ−100、バイオゲルＰ−150、バイオゲルＰ−
200、コンカナバリンＡ−セフアロース4B、セフ
アロース6B、DEAE−セフアロース、セフアク
リルＳ−200、及び抗IAP抗体−セフアロース4B
などの充填材より成るカラムを通される。 活性成分はこれらのカラムに極めて選択的に吸
着され、次いで適切に選択された溶出液により溶
離されて活性画分を与える。 特に、後記実施例４に示す、ハイドロキシアパ
タイトカラム、カルボキシメチルセフアロース
CL−6Bカラム及びＰ−アセトキシマーキユリア
ニリン−セフアロース6MBカラムの組合せによ
る活性成分の分取精製法が極めて効果的である。 因みに、ボルデテラ（Bordetella）属に属する
微生物の培養菌体は、加熱等の適当なる方法にて
弱毒・不活化されたのち、何等の精製手段を更に
施すことなしに500億個で後記する糖尿病治療薬
として所要の力価である100〜500単位程度は充分
に保証し得るので医薬として使用可能であり、本
発明はこのワクチンにも係るものである。 菌体ならびに培地等の培養物から上述した採取
精製方法の一つ又は二つ以上の組み合せ方法によ
り得られた活性画分は、その培養に使用した菌
株、培養方法、更には、採取精製方法等により異
なるが、いずれも蛋白質様物質であり、ゲルろ過
法による分子量は10000〜250000、糖質０〜25重
量％、脂質０〜25重量％及び、ときには核酸
（260nmのUV吸収により検知）を含み、等電点PH
４〜190の範囲にあり、その詳細な化学的、生物
学的諸特徴は後記各実施例に示す通りである。 本発明活性画分を産生するボルデテラ属の微生
物は、百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症
菌として周知であり、他方、これらの病源菌を、
培地組成の変更、紫外線、Ｘ線等の各種放射線照
射又は変異誘起剤の適用等の慣用の各種手段で変
異せしめて得られる変異株をも包含する。 培養方法としては、液体振盪培養方法が活生及
び収率の点で好ましいが、他の方法によることも
妨げない。 なお、ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性
質、培養条件等は、 Bergy′s Manual of Determinative
Bacteriology 第８版1974年Baltimore：The Williams ＆
Willkns CO.， Ｊ・Exp・Med.129：523〜550（1969）、細菌
学実習提要：第３版第６頁以下、昭和47年（丸善
(株)発行）、等に記載されている。 こうして得られる本発明(A)，(B)，(C)活性画分
は、糖尿病の治療および予防薬、免疫調節剤およ
び交換神経β受容体遮断剤として極めて有用であ
り、人体に対する有効量は、活性画分の比活性に
応じて固形物として、Ａ活性用途においては約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（体重）の
範囲であり、Ｂ活性用途については約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（体重）、
Ｃ活性用途については約0.01EU／Kg（体重）〜
数100EU／Kg（体重）の範囲である。 患者に対する投与方法は、各活性用途とも静脈
内投与が最も有効であり、その他腹腔内、筋肉内
および皮下投与、あるいは消化管内への直接投
与、経口投与、直腸内投与および舌下、皮内、鼻
粘膜、動脈、リンパ乃至管投与も有効である。 投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐
剤、腸溶・胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示
し得る。注射液の最も単純な組成を例示すれば、
Ａ活性10000Units、NaCl9mgおよび滅菌蒸留水で
１mlとしたものをあげ得る。 なお、患者に対する上記投与方法ならびに投与
形態の適応は、各活性用途とも成人、小児、老人
の別、あるいは人種性別等による区別はない。 更に、本明細書において以下、活性画分は、活
性成分含有液体およびこれを凍結乾燥処理等で乾
燥して得られる活性成分含有個体の両者を意味す
るものとする。例えば、注射薬液は両者のいずれ
を出発材料としても得られることは自明であろ
う。 又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめる
ことのない任意の他成分を混合し得ることも当業
者にとり自明であろう。 次に、本発明活性画分の各種物性に付き詳述す
る。 存在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解
性白色または淡褐色粉末であり、約３〜５mg／ml
までは室温で水に溶解、6NHCl中では不溶性白沈
を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、メ
ルカプトエタノール、システイン溶液に溶解す
る。冷時（４℃）、精製活性物質の溶液に硫安、
ドライアイス・アセトンあるいはエタノール、ト
リクロル酢酸、塩化亜鉛溶液及びその他の類種の
金属イオンを含む溶液等の添加により、各々白
濁、沈澱を生ずる。水とクロロホルムあるいはｎ
−ブタノール混合液では不溶性となり両液の界面
に集まる。 本活性画分の水溶液を80℃以上に加温すると白
濁する。0.5MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に対し本活性画分を溶解し、次いで蒸留水
を外液として透析すると、一時白濁するが透析の
続行により完全に再溶解し、白濁は消失する。ま
た、高濃度溶液では0.01M酢酸緩衝液（PH4.5）
に対し、徹底的に透析すると淡褐色に着色して溶
解することもある。 組 成： 蛋白質40重量％以上、糖質25重量％以下、脂質
25重量％以下であり、260nmのUV吸収で核酸が
検知される場合もある。 尚、各成分の測定方法は下記各文献に依つた。 蛋白質 Lowry，O.H.，N.J.Rosebrough，A.L.Farr，
and R.J.Randall. J.Biol，Chem.193：265 1951 糖 質 Phenol−H2SO4法 Dubois，M.，K.A.Giles，J.K.Hamilton，P.A.
Rebers，and、F.Smith. Anal.Chem.28 350，1956 脂 質 総脂質、結合脂質はクロロホルム、クロロホル
ム−メタノール、ヘペタンに加水分解の前後に物
質を抽出し、Marsh and Weinsteinの方法で測
定 J.B.Marsh and D.B.Weinstein：J.Lipid Res.
，７ 574，1966 蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ／
100μＭ；6NHClで110℃、16又は24時間加水分
解）： アスパラギン酸（Asp）7.5〜7.9、スレオニン
（Thr）6.8〜7.6、セリン（Ser）5.9〜7.6、グル
タミン酸（Glu）9.7〜10.8、プロリン（Pro）5.5
〜6.4、グリシン（Gly）8.7〜9.6、アラニン
（Ala）9.1〜10.8、シスチン／２（Cys／２）1.5
〜2.6、バリン（Val）5.6〜6.6、メチオニン
（Met）2.5〜3.3、イソロイシン（Ile）3.6〜4.1、
ロイシン（Leu）7.5〜8.0、チロシン（Tyr）5.1
〜6.6、フエニルアラニン（Phe）3.3〜3.9、リジ
ン（Lye）3.1〜4.4、ヒスチジン（His）1.4〜
1.6、アルギニン（Arg）6.1〜6.6であつた。 等電点PH： 活性画分の等電点はPH４〜10であるが、その大
部分はPH７〜９であり、一部分PH47のものもあ
る。 デイスク電気泳動パターン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度
7.5％、PH4.3ゲル、試料30μｇ、通電4mA、２時
間／ゲル１本、アミドブラツク10Bによる染色、
７％酢酸溶液による脱色の条件下でのデイスク電
気泳動において、 距離（スペーサー・ゲル先端を基準として） 2.3±0.2cmの位置に大部分の精製活性物質がバ
ンドを与えた。また一部のものは、PH8.3ゲルに
おいて陽極に移動するものが認められた。 実施例 １ インシユリン分泌増強活性 １−１ 活性測定法 活性画分の活性は種々のインシユリン分泌刺
激物質に対する動物の反応性で測定出来るが、
通常はグルコースを刺激物質として用いる。 Γ 検定用使用動物 ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ） Γ 試験方法 各力価の活性画分を生理食塩液に溶解し、そ
の0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入
し、３日後にインシユリン分泌増強活性を測
定する。なお実験開始前18〜20時間絶食させ
る。測定方法は、ラツト尾静脈より0.1mlの
血液を採取後、直ちに30％グルコース溶液を
体重100ｇ当り１ml腹腔内に投与し、正確に
15分後、0.1mlの血液を再び採取する。イン
シユリン分泌増強活性は、グルコース投与
前、後の血糖値および血中インシユリン値の
差より求める。血糖値はグルコースオキシダ
ーゼ法、インシユリンは二抗体法にて測定す
る。 尚、以下の薬理試験で使用の静注液も上記
と同一組成より成る。血糖値及びインシユリ
ンの測定方法は夫々下記文献及びキツトによ
る。 血糖値：グルコースオキシダーゼ法 Bergmeyer，H.−U.，and Bernet，E.in
“Methods of enzymatic analysis”
Bergmeyer，H.−U.，eds，New York
Academic press Ｐ 123（1963） グルコスタツト インシユリン：二抗体法 Morgan，C.R.，and Razarow，A.Diabetes
12 115（1963） インシユリンリアキツト−ダイナボツト社製 まず以下の式に従つて活性物質（活性画分）投
与群及び対照群ラツトの△Ｉ／△Ｇ値を求める。 △Ｉ／△Ｇ（μＵ／mg） ＝グルコース投与後の血中インシユリン値（μＵ／ml）−グルコース投与前の血中インシユリン／グルコース投与後
の血糖値（mg／ml）−グルコース投与前の血糖値（mg／ml） ／グルコース投与後の血中インシユリン値（μＵ／ml）−グルコース投与前の血中インシユリン値（μＵ／ml） 尚、血糖値を活性の計算に用いるのは分泌され
るインシユリン量が血糖値によつて大きく影響さ
れるためである。 次に活性物質の力価は、 単位（Unit）＝（本物質投与群ラツトの平均△Ｉ／△Ｇ−対照群の平均△Ｉ／△Ｇ／対照群の平均△Ｉ／△Ｇ）×10
0 で求める。 本物質の比活性は力価単位を、重量で除したも
のとする。 １−２ Ａ活性に関する薬理効果の要約 本活性画分はインシユリン分泌増強活性を主
作用とし、その他に耐糖能の良化作用、インシ
ユリン分泌活性、ストレプトゾトシン誘起糖尿
病の治癒を促進する作用、更に遺伝性糖尿病の
耐糖能を改善するなぢ、薬理的に有用な効果が
みられる。更に、これらの作用は本活性画分の
１回きりの投与で、いずれも数週間から数ケ月
にわたつて持続する。これらの活性はマウス・
ラツト及び犬において詳細に検討されたが、各
種共に全く同様の規象が観察されることから本
物質の薬理作用には種差は影響しないと考えら
れる。 本活性画分は主に糖尿病治療薬として有用と
考えられるが、現在糖尿病に対する薬物療法
は、インシユリン注射あるいは血糖降下薬の経
口投与のみでいずれも対症療法にすぎず、殆ん
ど不治の病と言つてさしつかえない。しかもイ
ンシユリン注射のために毎日通院しなければな
らない繁雑さがあり、血糖降下薬の投与では血
糖値の異常低下の発現が常に危険視されてい
る。本活性画分の特徴は、これ自身インシユリ
ン分泌活性を有するのみならず血糖値をいろい
ろな条件で高めた時（高血糖状態、特に摂食時
に類するグルコース負荷時）にのみ血中インシ
ユリンを増加させて血糖値をすみやかに正常に
戻す作用があり、更に、この物質の利点として
は、１回投与で数週間から数ケ月にわたつて活
性が持続することである。従つて血糖値に対す
るインシユリン分泌の反応が低下した様な場合
には、この活性画分投与によりインシユリン分
泌が再賦活化される。以上の点より、本活性画
分は糖尿病、糖尿病の合併症及び糖尿病が起因
となる様々な成人病の治療薬としてばかりでな
く、前糖尿病状態への適用や、現在全く治療法
がなく悲惨な状態にある若年型糖尿病の予防及
び治療薬ならびに診断薬として有用である。 １−３ インシユリン分泌増強活性 この作用は本活性画分の主たる作用の１つで
あるが、ラツト（ウイスター系雄性）、イヌ
（ビーグル犬、雄雌）について実験を行つた。 ラツト 実験条件は活性測定法の項と同様であるが本活
性画分投与３日目に各インシユリン分泌刺激物質
に対する反応性を正常群と比較した（第１表）。
最も生理的な因子であるグルコース投与では、グ
ルコースの投与経路の違いにもかかわらず、対照
群に比し顕著な血中インシユリン濃度の増加がみ
られた。またグルカゴン（１mg／Kg）、エピネフ
リン（200μｇ／Kg）などのホルモン刺激に対す
る反応性も著明に増加していた。更に現在臨床で
使用されている血糖降下薬であるトルブタミド
（200mg／Kg）、グリベンクラミド（２mg／Kg）の
インシユリン分泌活性の増強もみられた。以上の
知見から、本活性画分投与はインシユリン分泌刺
激物質に対する生体の反応性を著しく増強するこ
とが確認された。
【表】
【表】
犬
犬に本活性画分を静脈内に投与し、３日後にグ
ルカゴン（25μｇ／Kg体重、静注）あるいはグル
コース（0.3ｇ／Kg体重、静注）刺激を行いイン
シユリン分泌増強活性を調べた。実験開始前18時
間絶食した。 グルカゴン刺激時の実験結果を第２表に示し
た。50U（活性画分として、以下同様）／Kg（体
重）で弱いながらグルカゴン投与５分後にインシ
ユリン分泌の増強が対照群と比較してみられ、投
与量の増加と共にインシユリン分泌の増強がみら
れ、1000U／Kgでほぼ反応は最高に達した。以上
の結果以外にも、グルコース（経口投与、静脈内
投与）及びエピネフリンによつても同様にインシ
ユリン分泌作用の増強がみられたことから、犬に
おいてもインシユリン分泌刺激物質に対する反応
性が本活性画分の投与により著しく高まつている
と考えられる。
ルカゴン（25μｇ／Kg体重、静注）あるいはグル
コース（0.3ｇ／Kg体重、静注）刺激を行いイン
シユリン分泌増強活性を調べた。実験開始前18時
間絶食した。 グルカゴン刺激時の実験結果を第２表に示し
た。50U（活性画分として、以下同様）／Kg（体
重）で弱いながらグルカゴン投与５分後にインシ
ユリン分泌の増強が対照群と比較してみられ、投
与量の増加と共にインシユリン分泌の増強がみら
れ、1000U／Kgでほぼ反応は最高に達した。以上
の結果以外にも、グルコース（経口投与、静脈内
投与）及びエピネフリンによつても同様にインシ
ユリン分泌作用の増強がみられたことから、犬に
おいてもインシユリン分泌刺激物質に対する反応
性が本活性画分の投与により著しく高まつている
と考えられる。
【表】
１−４ グルコース負荷後の耐糖能良化作用
ラツト、犬において経口的にグルコースを負
荷し、負荷後の血糖値の減衰と血中インシユリ
ン値の増加を測定し耐糖能を判定した。18〜20
時間絶食後にグルコースをラツトでは0.5ｇ／
100ｇ体重、イヌでは15ｇ／犬投与した。 ラツト、イヌで本活性画分処置群では対照群
に比較し、血中グルコースの上昇は著明に抑制
される一方、血中インシユリン値は明らかな増
加をみせ、その後血糖値の正常化と一致してイ
ンシユリン値はグルコース負荷前の値にすみや
かに戻り、インシユリンの過剰分必による低血
糖の発現はみられなかつた（第３乃至第４
表）。従つて、本活性画分処置動物では、耐糖
能が著しく良化していることが示された。
荷し、負荷後の血糖値の減衰と血中インシユリ
ン値の増加を測定し耐糖能を判定した。18〜20
時間絶食後にグルコースをラツトでは0.5ｇ／
100ｇ体重、イヌでは15ｇ／犬投与した。 ラツト、イヌで本活性画分処置群では対照群
に比較し、血中グルコースの上昇は著明に抑制
される一方、血中インシユリン値は明らかな増
加をみせ、その後血糖値の正常化と一致してイ
ンシユリン値はグルコース負荷前の値にすみや
かに戻り、インシユリンの過剰分必による低血
糖の発現はみられなかつた（第３乃至第４
表）。従つて、本活性画分処置動物では、耐糖
能が著しく良化していることが示された。
【表】
【表】
１−５ 薬理活性の作用持続性
本活性画分の各薬理活性は投与数時間後から
発現し３〜７日目に最高に達しその后徐々に各
活性は低下するがラツト（500Unit）を用いて
の作用の持続性の実験結果について述べる。 ラツトで本活性画分投与１，３，７，14，
21，42および60日目にインシユリン分泌増強活
性を調べた。その結果42日目においてもなお充
分な増強活性が示された（第５表）。 以上の結果から用量の関係でその作用の強弱
はあるが、作用は数週間から数ケ月持続すると
考えられる。
発現し３〜７日目に最高に達しその后徐々に各
活性は低下するがラツト（500Unit）を用いて
の作用の持続性の実験結果について述べる。 ラツトで本活性画分投与１，３，７，14，
21，42および60日目にインシユリン分泌増強活
性を調べた。その結果42日目においてもなお充
分な増強活性が示された（第５表）。 以上の結果から用量の関係でその作用の強弱
はあるが、作用は数週間から数ケ月持続すると
考えられる。
【表】
実施例 ２
免疫増強活性
２−１ 活性測定法
活性画分のＢ活性は種々の実験系に於いて測
定可能であるが、１例として液性抗体産生系に
於けるアジユバント活性による方法を下記に示
す。 Γ 検定用使用動物 ウイスター系雌性ラツト（体重200±10ｇ） ウイスター系雄性ラツト（体重250±20ｇ） Γ 試験方法 ブタ回虫（Ascuris suuw）より得たタンパ
ク質にジニトロフエノール基を結合させたジ
ニトロフエニール−アスカリス（DNP−
AS）を抗原とし、その１mgと種々の活性画
分を生理食塩水0.5mlに溶解し、エーテル麻
酔下で雌性ラツトの前後肢の足洶に皮内注射
し、一次免疫とする。また対照として、
DNP−AS1mgを百日咳死菌1010個を含む生理
食塩溶液0.5mlに溶解し前述と同様に感作し
一次免疫とする。一次免疫後５日目にDNP
−AS0.5mgを含む生理食塩水0.5mlをエーテ
ル麻酔下に、ラツト背筋内に注射し、その後
３日目に血清中の抗DNP−AS抗体価を測定
する。測定方法は、ラツト尾静脈より0.0ml
の血液を、あらかじめヘパリン加生理食塩液
0.2mlを入れた試験管に採取混合し、４℃
3000r.p.m.15分間遠心分離後、上清を採取
し、これを５倍希釈血清とする。次に、得ら
れた血清中の抗体価を多田らの方法※により
受身皮膚アナフイラキシー反応を用いて測定
する。血清中の抗体価は５mm以上の青色斑を
示す血清の最高希釈倍数を以つて示し、各標
品の抗体産生増強活性力価は2024倍の抗体価
を示す活性を1000unitとする。比活性は力価
単位を重量で除したものとする。 ※ Tada，T.and Okumura，K. J.Immunol.，106 1002.（1971） 用量−反応関係： 後記実施例４で得られた精製標品の用量反応関
係を以下に示す。 投与量（ng／rat） 抗DNP−AS抗体価※ 62 X32 125 X128 250 X1024 500 X4048 1000 X8096 ※各５例の平均値 ２−２ 実施例４で得られた精製標品のマウスに
於けるヒツジ赤血球に対する抗体産生増強活性
精製標品の500Unitsと、ヒツジ赤血球２×108
個を含むハンクス氏液0.1mlをC57B／6Jマウス
の足蹠皮内に注射し、注射２週間後、マウスの
尾静脈より採血し、血清を得、血清中の赤血球
凝集抗体価を測定した。抗体価の測定は、各血
清を生理食塩水溶液で倍々希釈した液0.1ml
に、２％ヒツジ赤血球生理食塩液0.01mlを加え
よく混和後、37℃、２時間インキユベーシヨン
後の凝集像を観察し、凝集の認められる血清の
最大希釈倍数を以つて血清中の抗体価とした。
その結果、ヒツジ赤血球単独で免疫した場合の
血清中の抗ヒツジ赤血球抗体価は64倍であるの
に対し、本精製標品とともに免疫した場合には
抗体価は2048倍を示し、あきらかに、抗体産生
の増強がみられた。従つて、本精製標品はヒツ
ジ赤血球に対する抗体産生においてあきらか
に、アジユバント活性を示すことからも、免疫
機能に異常をきたした種々疾患に対し、その治
療に有用と結論される。 実施例 ３ 交換神経β受容体遮断活性 交換神経作動薬、アドレナリン（エピネフリ
ン）のβ受容体を介する作用は糖質及び脂質代謝
に重要な変化をおこす（例えば血糖上昇、血中遊
離脂肪酸上昇など）のみならずこの物質代謝謝変
動の結果は心臓や平滑筋などに及ぼすβ作用とよ
く一致することが知られている。本活性画分投与
動物ではエピネフリンの血糖上昇が顕著に抑制さ
れることから当然β受容体遮断作用があると考え
られる。従つて、交換神経β受容体遮断活性（以
下Ｃ活性）は、エピネフリンの血糖上昇作用が活
性画分投与ラツトでどの程度抑制されるかで決定
した。 ３−１ 活性測定法 ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ）
に各力価の活性画分を生理食塩液に溶解しその
0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入し翌
日Ｃ活性を測定した。なお実験開始前18−20時
間動物は絶食させた。測定はラツト尾静脈より
0.02mlの血液を採取後直ちに−エピネフリン
200μｇ／Kg体重皮下に投与し１時間後再び血
液を採取して血糖値を測定する。血糖値の測定
方法は実施例１と同様である。 Γ Ｃ活性の計算方法 活性画分投与群ラツト及び対照群ラツトの
エピネフリン投与前、後の血糖値の差を夫々
ΔＧT、ΔＧCとし投与群のエピネフリン高血
糖抑制率を以下の式で求める； 抑制率（％）＝（ΔＧＣ−ΔＧＴ／ΔＧＣ）×100 活性画分投与群の血糖上昇率が対照群に比べ
50％減弱するＣ活性を1EUnitと決めた。 比活性はEUnit／μｇ（乾燥重量）とした。 用量−反応関係 実施例４で得られた活性画分のＣ活性の用量反
応関係を以下に示す。
定可能であるが、１例として液性抗体産生系に
於けるアジユバント活性による方法を下記に示
す。 Γ 検定用使用動物 ウイスター系雌性ラツト（体重200±10ｇ） ウイスター系雄性ラツト（体重250±20ｇ） Γ 試験方法 ブタ回虫（Ascuris suuw）より得たタンパ
ク質にジニトロフエノール基を結合させたジ
ニトロフエニール−アスカリス（DNP−
AS）を抗原とし、その１mgと種々の活性画
分を生理食塩水0.5mlに溶解し、エーテル麻
酔下で雌性ラツトの前後肢の足洶に皮内注射
し、一次免疫とする。また対照として、
DNP−AS1mgを百日咳死菌1010個を含む生理
食塩溶液0.5mlに溶解し前述と同様に感作し
一次免疫とする。一次免疫後５日目にDNP
−AS0.5mgを含む生理食塩水0.5mlをエーテ
ル麻酔下に、ラツト背筋内に注射し、その後
３日目に血清中の抗DNP−AS抗体価を測定
する。測定方法は、ラツト尾静脈より0.0ml
の血液を、あらかじめヘパリン加生理食塩液
0.2mlを入れた試験管に採取混合し、４℃
3000r.p.m.15分間遠心分離後、上清を採取
し、これを５倍希釈血清とする。次に、得ら
れた血清中の抗体価を多田らの方法※により
受身皮膚アナフイラキシー反応を用いて測定
する。血清中の抗体価は５mm以上の青色斑を
示す血清の最高希釈倍数を以つて示し、各標
品の抗体産生増強活性力価は2024倍の抗体価
を示す活性を1000unitとする。比活性は力価
単位を重量で除したものとする。 ※ Tada，T.and Okumura，K. J.Immunol.，106 1002.（1971） 用量−反応関係： 後記実施例４で得られた精製標品の用量反応関
係を以下に示す。 投与量（ng／rat） 抗DNP−AS抗体価※ 62 X32 125 X128 250 X1024 500 X4048 1000 X8096 ※各５例の平均値 ２−２ 実施例４で得られた精製標品のマウスに
於けるヒツジ赤血球に対する抗体産生増強活性
精製標品の500Unitsと、ヒツジ赤血球２×108
個を含むハンクス氏液0.1mlをC57B／6Jマウス
の足蹠皮内に注射し、注射２週間後、マウスの
尾静脈より採血し、血清を得、血清中の赤血球
凝集抗体価を測定した。抗体価の測定は、各血
清を生理食塩水溶液で倍々希釈した液0.1ml
に、２％ヒツジ赤血球生理食塩液0.01mlを加え
よく混和後、37℃、２時間インキユベーシヨン
後の凝集像を観察し、凝集の認められる血清の
最大希釈倍数を以つて血清中の抗体価とした。
その結果、ヒツジ赤血球単独で免疫した場合の
血清中の抗ヒツジ赤血球抗体価は64倍であるの
に対し、本精製標品とともに免疫した場合には
抗体価は2048倍を示し、あきらかに、抗体産生
の増強がみられた。従つて、本精製標品はヒツ
ジ赤血球に対する抗体産生においてあきらか
に、アジユバント活性を示すことからも、免疫
機能に異常をきたした種々疾患に対し、その治
療に有用と結論される。 実施例 ３ 交換神経β受容体遮断活性 交換神経作動薬、アドレナリン（エピネフリ
ン）のβ受容体を介する作用は糖質及び脂質代謝
に重要な変化をおこす（例えば血糖上昇、血中遊
離脂肪酸上昇など）のみならずこの物質代謝謝変
動の結果は心臓や平滑筋などに及ぼすβ作用とよ
く一致することが知られている。本活性画分投与
動物ではエピネフリンの血糖上昇が顕著に抑制さ
れることから当然β受容体遮断作用があると考え
られる。従つて、交換神経β受容体遮断活性（以
下Ｃ活性）は、エピネフリンの血糖上昇作用が活
性画分投与ラツトでどの程度抑制されるかで決定
した。 ３−１ 活性測定法 ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ）
に各力価の活性画分を生理食塩液に溶解しその
0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入し翌
日Ｃ活性を測定した。なお実験開始前18−20時
間動物は絶食させた。測定はラツト尾静脈より
0.02mlの血液を採取後直ちに−エピネフリン
200μｇ／Kg体重皮下に投与し１時間後再び血
液を採取して血糖値を測定する。血糖値の測定
方法は実施例１と同様である。 Γ Ｃ活性の計算方法 活性画分投与群ラツト及び対照群ラツトの
エピネフリン投与前、後の血糖値の差を夫々
ΔＧT、ΔＧCとし投与群のエピネフリン高血
糖抑制率を以下の式で求める； 抑制率（％）＝（ΔＧＣ−ΔＧＴ／ΔＧＣ）×100 活性画分投与群の血糖上昇率が対照群に比べ
50％減弱するＣ活性を1EUnitと決めた。 比活性はEUnit／μｇ（乾燥重量）とした。 用量−反応関係 実施例４で得られた活性画分のＣ活性の用量反
応関係を以下に示す。
【表】
３−２ 活性画分投与モルモツト心房におけるイ
ソプロテレノールの筋収縮力増強作用の減弱 実施例４で得られた標品1EU（上記活性測定
法に基く）をモルモツト（体重約350ｇ）前肢
静脈内に注入し、３日後撲殺放血し、心臓をす
ばやく取り出した。右心房を切りとり直ちに
Locke氏液（NaCl120mM，KCl5.6mM，
CaCl22.2mM，MgCl22.1mM，NaHCO325mM
グルコース10mMを含み95％O2−５％CO2でガ
ス置換する）10mlを含むマグネス管に懸垂し
た。全ての心房標本には0.5ｇの重りをつけ、
筋収縮力はトランスデユーサで記録した。 ｌ−イソプロテレノール（β−作動薬）
2ng／ml（最終濃度）で対照群の心房は約20±
１％（ｎ＝５）の収縮力の増加がみられたのに
対し活性画分投与モルモツト心房では14±１％
と有意にイソプロテレノールの作用は減弱し
た。同時に行つたプロプラノロール（β−遮断
薬）存在下ではイソプロテレノールの作用は半
分に減弱した。従つて、活性画分投与モルモツ
トではプロプラノロール添加と類似のβ遮断状
態が生じていることが確認された。 ３−３ 作用持続性 活性画分の薬理活性は投与数時間後から発現
し３〜14日目に最高に達しその后徐々の活性は
低下するがラツトを用いての作用持続性はエピ
ネフリン高血糖抑制率で調べた。
ソプロテレノールの筋収縮力増強作用の減弱 実施例４で得られた標品1EU（上記活性測定
法に基く）をモルモツト（体重約350ｇ）前肢
静脈内に注入し、３日後撲殺放血し、心臓をす
ばやく取り出した。右心房を切りとり直ちに
Locke氏液（NaCl120mM，KCl5.6mM，
CaCl22.2mM，MgCl22.1mM，NaHCO325mM
グルコース10mMを含み95％O2−５％CO2でガ
ス置換する）10mlを含むマグネス管に懸垂し
た。全ての心房標本には0.5ｇの重りをつけ、
筋収縮力はトランスデユーサで記録した。 ｌ−イソプロテレノール（β−作動薬）
2ng／ml（最終濃度）で対照群の心房は約20±
１％（ｎ＝５）の収縮力の増加がみられたのに
対し活性画分投与モルモツト心房では14±１％
と有意にイソプロテレノールの作用は減弱し
た。同時に行つたプロプラノロール（β−遮断
薬）存在下ではイソプロテレノールの作用は半
分に減弱した。従つて、活性画分投与モルモツ
トではプロプラノロール添加と類似のβ遮断状
態が生じていることが確認された。 ３−３ 作用持続性 活性画分の薬理活性は投与数時間後から発現
し３〜14日目に最高に達しその后徐々の活性は
低下するがラツトを用いての作用持続性はエピ
ネフリン高血糖抑制率で調べた。
【表】
実験の結果Ｃ活性は２ケ月以上持続することが
明らかになつた。 実施例 ４ 百日咳Ｉ相菌東浜株（Bordetlla pertussis
PhaseI，Tohama Strain）の凍結乾燥保存菌株
（北里大学薬学部微生物学教室提供）を脱繊維馬
血液を20％含むBordet−Gengou培地（BG培地）
で37℃３日間培養した後、BG斜面培地で37℃20
〜24時間培養し、下記第６表に組成を示すイオン
交換樹脂加半合成液体培地（Cohen−Wheelerの
変法液体培地＝CW培地）200mlを分注した500ml
の振盪コルベンに１白金耳接種し、37℃20〜24時
間振盪培養した。 この培養液の菌量を分光光度計（波長650nm）
で測定し、加えた時の菌量が最終濃度0.07〜0.15
×109個／mlとなるようにイオン交換樹脂CW倍
地１を分注した２の振盪コルベンに加え、37
℃48時間振盪培養（振盪回数100〜120回／分）を
行なつた。 得られた48時間振盪培養液を56℃で30分間加温
した後、４℃で遠心分離（15000rpm）して培養
上清液と菌体とに分離した。
明らかになつた。 実施例 ４ 百日咳Ｉ相菌東浜株（Bordetlla pertussis
PhaseI，Tohama Strain）の凍結乾燥保存菌株
（北里大学薬学部微生物学教室提供）を脱繊維馬
血液を20％含むBordet−Gengou培地（BG培地）
で37℃３日間培養した後、BG斜面培地で37℃20
〜24時間培養し、下記第６表に組成を示すイオン
交換樹脂加半合成液体培地（Cohen−Wheelerの
変法液体培地＝CW培地）200mlを分注した500ml
の振盪コルベンに１白金耳接種し、37℃20〜24時
間振盪培養した。 この培養液の菌量を分光光度計（波長650nm）
で測定し、加えた時の菌量が最終濃度0.07〜0.15
×109個／mlとなるようにイオン交換樹脂CW倍
地１を分注した２の振盪コルベンに加え、37
℃48時間振盪培養（振盪回数100〜120回／分）を
行なつた。 得られた48時間振盪培養液を56℃で30分間加温
した後、４℃で遠心分離（15000rpm）して培養
上清液と菌体とに分離した。
【表】
【表】
蒸留水を加え総量1000mlとし20％NaOH水溶液
でPH7.2に調整後、陰イオン交換樹脂（ダイヤイ
オンSA−20AP：三菱化成(株)製）３ｇを加え121
℃で15〜20分間高圧蒸気滅菌して使用した。 前記のようにして得られた培養上清10をハイ
ドロキシアパタイトカラム（カラムサイズ５×２
cm、流速60ml／hr）に通し、次いで0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）100mlで洗浄し、更に0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）300mlを流す。最終的に0.1M
リン酸緩衝液（0.5M塩化ナトリウムを含む。PH
7.0）を流速15ml／hrで流し、活性物質を溶出し
た。その活性画分をポリエチレングリコール（平
均分子量20000）で約15mlまで濃縮した後、蒸留
水２に対し４回計24時間透析し、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）１に対して４回計24時間透析
平衡化する。これを同一緩衝液で平衡化したカル
ボキシメチルセフアロースCL−6B（フアルマシ
アフアインケミカルス社製、カラムサイズ：1.5
×10cm）カラムに通した。このカラムに吸着され
ない物質には全く活性は存在しなかつたが、次い
でリン酸緩衝液のモル濃度を0.1MにPHを7.0に上
げ、更に塩化ナトリウム0.5Mを加えて溶出され
た蛋白質に一致した活性画分が得られた。この活
性画分を約10mlに濃縮し、次いで蒸留水２に対
して４回計24時間透析した。更に0.01M酢酸緩衝
液（0.1M塩化ナトリウム含有PH4.5、又は0.1M塩
化リチウム−塩酸PH4.5）１に対して４回計24
時間透析平衡化した。この溶液を同一緩衝液で平
衡化した、Ｐ−アセトキシマーキユリアニリン−
セフアロース6MB（下記注の調整法参照、サイ
ズ：1.2×８cm（カラムに流速５ml／hrで流し同
一緩衝液で充分に洗浄（約200ml使用）した後、
吸着された物質は0.01M−システインを加えた同
一緩衝液で溶出した。ここで非吸着部には活性物
質は全く含まれず、最終溶出部に集中して得られ
た。この活性画分を蒸留水２に対して６回計48
時間透析後、凍結乾燥して淡褐色粉末7.3mgを得
た。本品は第１図に示す如くデイスク電気泳動
（PH4.3ゲル使用）で単一なバンドを与え、等電点
PHは7.8±0.5を示した。またその組成は、蛋白質
約92重量％、糖質1.8〜5.6重量％及び脂質０〜２
重量％であり、かつアミノ酸組成および組成比
は、第７表に示す通りであつた。また、ゲル過
法（バイオゲルｐ−150使用、カラムサイズ：1.8
×95cm、緩衝液：0.01M酢酸緩衝液PH4.5）によ
り分子量は51000±4300と推定された。以上の精
製工程における活性の回収率、精製度等は第８表
に示す通りであつた。またSDS電気泳動（１％
SDS、１％メルカプトエタノール、4M尿素）で
第２図の如く３つのバンドを与えた。Ａ活性は
1349U／μｇ、Ｂ活性は1421U／μｇ、Ｃ活性は
1.3EU／μｇであり急性毒性値LD50はマウス〓
232μｇ／Kg、マウス♀174μｇ／Kgであつた。 注 Ｐ−アセトキシマーキユリアニリン
（PAMA）−セフアロース6MBの調製法： CNBr−活性化セフアロース6MB（フアルマシ
アフアインケミカルス社製）４ｇを10-3N HCl1
を用い、グラスフイルター上で洗浄、膨潤を繰
り返す。別に0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液
（0.5M塩化ナトリウム含有、PH8.3）の60％ジメ
チルホルムアミド溶液50mlに172mg（0.5mM）の
Ｐ−アセトキシマーキユリアニリンを溶解したも
のを調製しておく。ゲルの洗浄、膨潤が完了した
ら直ちにこの溶液を加え、室温（22〜25℃）で２
時間よく振盪混合する。反応終了後同一緩衝液で
よく洗浄後、1Mエタノールアミン（PH9.0）50ml
をゲルに加え室温で２時間よく振盪混合する。次
いでゲルをグラスフイルターで吸収過し、
0.1M硼酸緩衝液（PH8.5）１と0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）１で交互に数回に分けて洗浄し、最終
的に0.01M酢酸緩衝液（0.1M塩化ナトリウム含有
PH4.5）又は0.1M塩化リチウム−塩酸緩衝液（PH
4.5）で平衡化して使用する。また予め１％メル
カプトエタノールを含む同緩衝液でゲルを処理し
た後、同緩衝液で充分に洗浄して平衡化し、使用
する。
でPH7.2に調整後、陰イオン交換樹脂（ダイヤイ
オンSA−20AP：三菱化成(株)製）３ｇを加え121
℃で15〜20分間高圧蒸気滅菌して使用した。 前記のようにして得られた培養上清10をハイ
ドロキシアパタイトカラム（カラムサイズ５×２
cm、流速60ml／hr）に通し、次いで0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）100mlで洗浄し、更に0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）300mlを流す。最終的に0.1M
リン酸緩衝液（0.5M塩化ナトリウムを含む。PH
7.0）を流速15ml／hrで流し、活性物質を溶出し
た。その活性画分をポリエチレングリコール（平
均分子量20000）で約15mlまで濃縮した後、蒸留
水２に対し４回計24時間透析し、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）１に対して４回計24時間透析
平衡化する。これを同一緩衝液で平衡化したカル
ボキシメチルセフアロースCL−6B（フアルマシ
アフアインケミカルス社製、カラムサイズ：1.5
×10cm）カラムに通した。このカラムに吸着され
ない物質には全く活性は存在しなかつたが、次い
でリン酸緩衝液のモル濃度を0.1MにPHを7.0に上
げ、更に塩化ナトリウム0.5Mを加えて溶出され
た蛋白質に一致した活性画分が得られた。この活
性画分を約10mlに濃縮し、次いで蒸留水２に対
して４回計24時間透析した。更に0.01M酢酸緩衝
液（0.1M塩化ナトリウム含有PH4.5、又は0.1M塩
化リチウム−塩酸PH4.5）１に対して４回計24
時間透析平衡化した。この溶液を同一緩衝液で平
衡化した、Ｐ−アセトキシマーキユリアニリン−
セフアロース6MB（下記注の調整法参照、サイ
ズ：1.2×８cm（カラムに流速５ml／hrで流し同
一緩衝液で充分に洗浄（約200ml使用）した後、
吸着された物質は0.01M−システインを加えた同
一緩衝液で溶出した。ここで非吸着部には活性物
質は全く含まれず、最終溶出部に集中して得られ
た。この活性画分を蒸留水２に対して６回計48
時間透析後、凍結乾燥して淡褐色粉末7.3mgを得
た。本品は第１図に示す如くデイスク電気泳動
（PH4.3ゲル使用）で単一なバンドを与え、等電点
PHは7.8±0.5を示した。またその組成は、蛋白質
約92重量％、糖質1.8〜5.6重量％及び脂質０〜２
重量％であり、かつアミノ酸組成および組成比
は、第７表に示す通りであつた。また、ゲル過
法（バイオゲルｐ−150使用、カラムサイズ：1.8
×95cm、緩衝液：0.01M酢酸緩衝液PH4.5）によ
り分子量は51000±4300と推定された。以上の精
製工程における活性の回収率、精製度等は第８表
に示す通りであつた。またSDS電気泳動（１％
SDS、１％メルカプトエタノール、4M尿素）で
第２図の如く３つのバンドを与えた。Ａ活性は
1349U／μｇ、Ｂ活性は1421U／μｇ、Ｃ活性は
1.3EU／μｇであり急性毒性値LD50はマウス〓
232μｇ／Kg、マウス♀174μｇ／Kgであつた。 注 Ｐ−アセトキシマーキユリアニリン
（PAMA）−セフアロース6MBの調製法： CNBr−活性化セフアロース6MB（フアルマシ
アフアインケミカルス社製）４ｇを10-3N HCl1
を用い、グラスフイルター上で洗浄、膨潤を繰
り返す。別に0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液
（0.5M塩化ナトリウム含有、PH8.3）の60％ジメ
チルホルムアミド溶液50mlに172mg（0.5mM）の
Ｐ−アセトキシマーキユリアニリンを溶解したも
のを調製しておく。ゲルの洗浄、膨潤が完了した
ら直ちにこの溶液を加え、室温（22〜25℃）で２
時間よく振盪混合する。反応終了後同一緩衝液で
よく洗浄後、1Mエタノールアミン（PH9.0）50ml
をゲルに加え室温で２時間よく振盪混合する。次
いでゲルをグラスフイルターで吸収過し、
0.1M硼酸緩衝液（PH8.5）１と0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）１で交互に数回に分けて洗浄し、最終
的に0.01M酢酸緩衝液（0.1M塩化ナトリウム含有
PH4.5）又は0.1M塩化リチウム−塩酸緩衝液（PH
4.5）で平衡化して使用する。また予め１％メル
カプトエタノールを含む同緩衝液でゲルを処理し
た後、同緩衝液で充分に洗浄して平衡化し、使用
する。
【表】
【表】
実施例 ５
百日咳Ｉ相菌東浜株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を、実施例４と同様
に犂盪培養後、菌体を分離して、培養上清液10
を得た。この培養上清液にPH6.0になるまで、低
温下で20％塩化亜鉛液を添加し（最終濃度１
％）、沈澱物をリン酸緩衝液にとかし、透析膜に
入れ、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）と平衡化
後、カルボキシメチルセフアロースCL−6B（以
下、CM−セフアロースと略称す）に通した。吸
着物質を0.5M−NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で溶出した。得られた溶出液を二分した。
一方の液はコロジオンバツクによりろ過し、外液
を蒸留水に対して透析処理後、凍結乾燥し、2M
−尿素および0.5M−NmCl含有0.1M−リン酸緩衝
液に可溶化後、セフアデツクスＧ−50を用いゲル
ろ過を行ない、活性画分を得た。 ついでこの活性画分を凍結乾燥処理して、かつ
色調白色粉末３mgを得た。 分子量：15000±3000 組成：蛋白質90重量％以上、糖質約５重量％、脂
質３重量％、デイスク電気泳動パターン：PH4.3
ゲルで陰極側に移動する。 Ａ活性：500U／μｇ、 LD50：〓522μｇ／Kg Ｂ活性：450U／μｇ、 ♀405μｇ／Kg Ｃ活性：0.22EU／μｇ 他方のCM−セフアローズ溶出液は蒸留水に対
して、透析処理後、凍結乾燥してBioゲルＰ−100
によりゲルろ過を行ない活性画分を得、凍結乾燥
粉末９mgを得た。 分子量：115000±15000 組成：蛋白質75重量％以上、糖質約10重量％、脂
質10重量％ デイスク電気泳動：PH4.3ゲルで陰極側に移動す
る。 Ａ活性 ：630U／μｇ Ｂ活性 ：320U／μｇ Ｃ活性 ：0.82EU／μｇ LD50： 〓 432μｇ／Kg ♀ 350μｇ／Kg 実施例 ６ 百日咳Ｉ相菌東浜株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
培養後、菌体を分離して培養上清液を得た。 ２の培養上清液に50％塩化亜鉛溶液40mlを撹
拌しながな氷水中で加え、２時間撹拌後、４℃、
5000r.p.m.5分間遠心分離し、沈澱部分を10％リ
ン酸ナトリウム溶液25mlにて２回抽出し、次いで
４℃、8000r.p.m.、20分間遠心分離し、上清液を
得る。得られた上清を蒸留水２にて４回、24時
間透析後、濃縮し、更に2M尿素を含有する0.1M
リン酸緩衝液（PH8.0）１にて３回、24時間透
析する。次いで、同緩衝液で平衡化したジエチル
アミノエチルセルロースカラム（1.2×15cm）に
通した。このカラムでは、目的とする活性物質は
吸着されず、素通り画分に得られた。この画分を
透析後、濃縮し、2M尿素を含む0.05Mリン酸緩
衝液（PH6.0）に対し透析し、同一緩衝液で平衡
化した、CM−セフアロースカラム（1.2×12.5
cm）に通した。このカラムに吸着されない物質に
は、全く活性は存在しなかつたが、次いでリン酸
緩衝液のモル濃度を0.1Mに、PHを７に上げる
と、溶出された蛋白質に一致した活性画分が得ら
れた。ここで得られた活性画分を２分した。一方
はそのまま、2M尿素を含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−200カ
ラム（1.5×50cm）を通し、単一な蛋白ピークが
得られ、活性はこの画分に一致した。ここに得ら
れた画分を、凍結乾燥すると淡黄色粉末を1.4mg
得た。この物は蒸留水２にて５回、40時間透析
後、デイスク電気泳動的（PH4.3ゲル）では陰極
側へ泳動された。組成は蛋白質85重量％以上、糖
質は7.1重量％、脂質は4.9重量％、ゲル過法に
よる推定分子量は145000±15000等電点PHは8.0±
0.5であつた。この画分のＡ活性は803Units／μ
ｇ、Ｂ活性950U／μｇ，Ｃ活性0.95EU／μｇ，
LD50：〓320μｇ／Kg、♀232μｇ／Kgであつ
た。CM−セフアロースカラムクロマトにより得
られた画分の他方を蒸留水１にて３回、12時間
透析し、濃縮後、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に対して透析を行ない、同一緩衝液であらかじめ
平衡化させたコンカナバリンＡセフアロースカラ
ム（1.2×８cm）に通した。充分同緩衝液で洗滌
し、0.5M塩化ナトリウムを含む同一緩衝液（PH
7.0）で目的とする活性画分が、蛋白質ピークに
一致して得られた。活性画分を、濃縮後、2M尿
素を含む0.1Mリン酸緩衝液に対し透析平衡化
し、同一緩衝液で平衡化した、セフアデツクスＧ
−200カラム（1.5×50cm）に通した。その結果、
単一の蛋白ピークが得られ、活性もこのピークに
一致した。蒸留水２にて５回、45時間透析後、
凍結乾燥して、淡黄色粉末0.6mgを得た。分子量
は95000±15000と推定される。この画分は、デイ
スク電気泳動的にPH4.3ゲルで単一のバンドを与
える、組成は蛋白質約95重量％、糖質は検出され
ず、脂質は、約3.2重量％である。等電点PHは7.8
±0.5でアミノ酸組成及びアミノ酸組成比は第９
表に示す通りであつた。 Ａ活性 ： 1013U／μｇ Ｂ活性 ： 1120U／μｇ Ｃ活性 ： 1.3EU／μｇ LD50 ： 〓 247μｇ／Kg ♀ 185μｇ／Kg
学薬学部微生物学教室提供）を、実施例４と同様
に犂盪培養後、菌体を分離して、培養上清液10
を得た。この培養上清液にPH6.0になるまで、低
温下で20％塩化亜鉛液を添加し（最終濃度１
％）、沈澱物をリン酸緩衝液にとかし、透析膜に
入れ、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）と平衡化
後、カルボキシメチルセフアロースCL−6B（以
下、CM−セフアロースと略称す）に通した。吸
着物質を0.5M−NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で溶出した。得られた溶出液を二分した。
一方の液はコロジオンバツクによりろ過し、外液
を蒸留水に対して透析処理後、凍結乾燥し、2M
−尿素および0.5M−NmCl含有0.1M−リン酸緩衝
液に可溶化後、セフアデツクスＧ−50を用いゲル
ろ過を行ない、活性画分を得た。 ついでこの活性画分を凍結乾燥処理して、かつ
色調白色粉末３mgを得た。 分子量：15000±3000 組成：蛋白質90重量％以上、糖質約５重量％、脂
質３重量％、デイスク電気泳動パターン：PH4.3
ゲルで陰極側に移動する。 Ａ活性：500U／μｇ、 LD50：〓522μｇ／Kg Ｂ活性：450U／μｇ、 ♀405μｇ／Kg Ｃ活性：0.22EU／μｇ 他方のCM−セフアローズ溶出液は蒸留水に対
して、透析処理後、凍結乾燥してBioゲルＰ−100
によりゲルろ過を行ない活性画分を得、凍結乾燥
粉末９mgを得た。 分子量：115000±15000 組成：蛋白質75重量％以上、糖質約10重量％、脂
質10重量％ デイスク電気泳動：PH4.3ゲルで陰極側に移動す
る。 Ａ活性 ：630U／μｇ Ｂ活性 ：320U／μｇ Ｃ活性 ：0.82EU／μｇ LD50： 〓 432μｇ／Kg ♀ 350μｇ／Kg 実施例 ６ 百日咳Ｉ相菌東浜株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
培養後、菌体を分離して培養上清液を得た。 ２の培養上清液に50％塩化亜鉛溶液40mlを撹
拌しながな氷水中で加え、２時間撹拌後、４℃、
5000r.p.m.5分間遠心分離し、沈澱部分を10％リ
ン酸ナトリウム溶液25mlにて２回抽出し、次いで
４℃、8000r.p.m.、20分間遠心分離し、上清液を
得る。得られた上清を蒸留水２にて４回、24時
間透析後、濃縮し、更に2M尿素を含有する0.1M
リン酸緩衝液（PH8.0）１にて３回、24時間透
析する。次いで、同緩衝液で平衡化したジエチル
アミノエチルセルロースカラム（1.2×15cm）に
通した。このカラムでは、目的とする活性物質は
吸着されず、素通り画分に得られた。この画分を
透析後、濃縮し、2M尿素を含む0.05Mリン酸緩
衝液（PH6.0）に対し透析し、同一緩衝液で平衡
化した、CM−セフアロースカラム（1.2×12.5
cm）に通した。このカラムに吸着されない物質に
は、全く活性は存在しなかつたが、次いでリン酸
緩衝液のモル濃度を0.1Mに、PHを７に上げる
と、溶出された蛋白質に一致した活性画分が得ら
れた。ここで得られた活性画分を２分した。一方
はそのまま、2M尿素を含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−200カ
ラム（1.5×50cm）を通し、単一な蛋白ピークが
得られ、活性はこの画分に一致した。ここに得ら
れた画分を、凍結乾燥すると淡黄色粉末を1.4mg
得た。この物は蒸留水２にて５回、40時間透析
後、デイスク電気泳動的（PH4.3ゲル）では陰極
側へ泳動された。組成は蛋白質85重量％以上、糖
質は7.1重量％、脂質は4.9重量％、ゲル過法に
よる推定分子量は145000±15000等電点PHは8.0±
0.5であつた。この画分のＡ活性は803Units／μ
ｇ、Ｂ活性950U／μｇ，Ｃ活性0.95EU／μｇ，
LD50：〓320μｇ／Kg、♀232μｇ／Kgであつ
た。CM−セフアロースカラムクロマトにより得
られた画分の他方を蒸留水１にて３回、12時間
透析し、濃縮後、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に対して透析を行ない、同一緩衝液であらかじめ
平衡化させたコンカナバリンＡセフアロースカラ
ム（1.2×８cm）に通した。充分同緩衝液で洗滌
し、0.5M塩化ナトリウムを含む同一緩衝液（PH
7.0）で目的とする活性画分が、蛋白質ピークに
一致して得られた。活性画分を、濃縮後、2M尿
素を含む0.1Mリン酸緩衝液に対し透析平衡化
し、同一緩衝液で平衡化した、セフアデツクスＧ
−200カラム（1.5×50cm）に通した。その結果、
単一の蛋白ピークが得られ、活性もこのピークに
一致した。蒸留水２にて５回、45時間透析後、
凍結乾燥して、淡黄色粉末0.6mgを得た。分子量
は95000±15000と推定される。この画分は、デイ
スク電気泳動的にPH4.3ゲルで単一のバンドを与
える、組成は蛋白質約95重量％、糖質は検出され
ず、脂質は、約3.2重量％である。等電点PHは7.8
±0.5でアミノ酸組成及びアミノ酸組成比は第９
表に示す通りであつた。 Ａ活性 ： 1013U／μｇ Ｂ活性 ： 1120U／μｇ Ｃ活性 ： 1.3EU／μｇ LD50 ： 〓 247μｇ／Kg ♀ 185μｇ／Kg
【表】
実施例 ７
百日咳Ｉ相菌前野株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を、BG培地で37
℃、３日間培養した後BG斜面培地で37℃20〜24
時間培養した。この菌、１白金耳を第10表に組成
を示す炭末加半合成培地（炭末加Cohen
Wheelerの変法固形培地＝CA培地）に接種し、
37℃、48時間培養後１％カザミノ酸溶液（カザミ
ノ酸１％、NaCl 0.35％ PH7.2）にかき取り、比
濁定量（波長650nm）によつて10bil／mlの菌液
に調製した。 0.2％炭末加CWの変法液体培地（組成は第11表
に示す）100mlを分注した２ルービンに加えた
時の菌量が最終濃度0.07〜0.15×109cells／mlに
なるように、調製した菌液を加え培地がルービン
の表面に広く薄く広がるようにルービンをふせた
状態で静置し37℃、４日間静置培養を行つた。培
養後菌体を分離した培養上清液を得た。得られた
上清２に、50％ZnCl2溶液40mlを撹拌しながら
低温下で加え、約２時間撹拌後、４℃で遠心分離
（5000r.p.m.×5min）し、沈殿を10％Na2HPO4溶
液50ml（３回に分けて抽出）で抽出（氷で冷しな
がら各1.5hr.撹拌）し、４℃で遠心分離（8000r.
p.m.×20min.）を行ない上清を得る。得られた
上清を透析（２、４回、計24hr.）濃縮し（約
５mlまで濃縮）、希酢酸溶液でPH6.0とし氷水中30
分撹拌後、４℃で遠心分離（12500r.p.m×
40min.）する。上清にさらに酢酸を加えてPH3.5
とし、（氷水中撹拌1hr.）生じた沈殿を遠心分離
した（12500r.p.m×40分）沈殿をあわせ、2M尿
素含有0.25M、リン酸緩衝液PH8.3）10mlを加
え、１時間氷水中で撹拌し、４℃で遠心分離
（12500r.p.m×40min）し、上清を透析（２４
回計24hr.）する。濃縮後、2M尿素を含む0.05M
リン酸緩衝液（PH5.5）に対し透析し（１、３
回計12hr.）、同一緩衝液であらかじめ平衡化した
CM−セフアロース（カラムサイズ1.9×７cm）に
通す。2M尿素を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH
6.0）でカラムを洗い、さらにリン酸塩濃度を、
0.1Mに上げPHも7.0に上げて溶出すると蛋白質ピ
ークに一致した活性が得られた。この活性画分を
透析（２、５回、48hr.）濃縮後、更に2M尿素
を含む0.1Mリン酸緩衝液PH7.0に対し透析平衡化
（２、３回、12hr.）する。つぎに同一緩衝液で
平衡化した。セフアデツクスＧ−200カラム（2.8
×95cm）に通した。分子量145000±15000（後に
マーカーを流して決定）に単一ピークとして得ら
れ、活性はこのピークに一致した。この活性画分
を透析（２、５回、48hr.）後、凍結乾燥し、
淡黄褐色粉末2.1mgを得た。本品は、PH4.3ゲルの
デイスクの電気泳動で陰極側に泳動され、組成
は、蛋白質約64重量％、糖質約23.5重量％、脂質
約12.3重量％であつた。 Ａ 活性 ：759U／μｇ Ｂ 〃 ：858U／μｇ Ｃ 〃 ：0.77EU／μｇ LD50 ：〓 289μｇ／Kg ♀ 200μｇ／Kg
学薬学部微生物学教室提供）を、BG培地で37
℃、３日間培養した後BG斜面培地で37℃20〜24
時間培養した。この菌、１白金耳を第10表に組成
を示す炭末加半合成培地（炭末加Cohen
Wheelerの変法固形培地＝CA培地）に接種し、
37℃、48時間培養後１％カザミノ酸溶液（カザミ
ノ酸１％、NaCl 0.35％ PH7.2）にかき取り、比
濁定量（波長650nm）によつて10bil／mlの菌液
に調製した。 0.2％炭末加CWの変法液体培地（組成は第11表
に示す）100mlを分注した２ルービンに加えた
時の菌量が最終濃度0.07〜0.15×109cells／mlに
なるように、調製した菌液を加え培地がルービン
の表面に広く薄く広がるようにルービンをふせた
状態で静置し37℃、４日間静置培養を行つた。培
養後菌体を分離した培養上清液を得た。得られた
上清２に、50％ZnCl2溶液40mlを撹拌しながら
低温下で加え、約２時間撹拌後、４℃で遠心分離
（5000r.p.m.×5min）し、沈殿を10％Na2HPO4溶
液50ml（３回に分けて抽出）で抽出（氷で冷しな
がら各1.5hr.撹拌）し、４℃で遠心分離（8000r.
p.m.×20min.）を行ない上清を得る。得られた
上清を透析（２、４回、計24hr.）濃縮し（約
５mlまで濃縮）、希酢酸溶液でPH6.0とし氷水中30
分撹拌後、４℃で遠心分離（12500r.p.m×
40min.）する。上清にさらに酢酸を加えてPH3.5
とし、（氷水中撹拌1hr.）生じた沈殿を遠心分離
した（12500r.p.m×40分）沈殿をあわせ、2M尿
素含有0.25M、リン酸緩衝液PH8.3）10mlを加
え、１時間氷水中で撹拌し、４℃で遠心分離
（12500r.p.m×40min）し、上清を透析（２４
回計24hr.）する。濃縮後、2M尿素を含む0.05M
リン酸緩衝液（PH5.5）に対し透析し（１、３
回計12hr.）、同一緩衝液であらかじめ平衡化した
CM−セフアロース（カラムサイズ1.9×７cm）に
通す。2M尿素を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH
6.0）でカラムを洗い、さらにリン酸塩濃度を、
0.1Mに上げPHも7.0に上げて溶出すると蛋白質ピ
ークに一致した活性が得られた。この活性画分を
透析（２、５回、48hr.）濃縮後、更に2M尿素
を含む0.1Mリン酸緩衝液PH7.0に対し透析平衡化
（２、３回、12hr.）する。つぎに同一緩衝液で
平衡化した。セフアデツクスＧ−200カラム（2.8
×95cm）に通した。分子量145000±15000（後に
マーカーを流して決定）に単一ピークとして得ら
れ、活性はこのピークに一致した。この活性画分
を透析（２、５回、48hr.）後、凍結乾燥し、
淡黄褐色粉末2.1mgを得た。本品は、PH4.3ゲルの
デイスクの電気泳動で陰極側に泳動され、組成
は、蛋白質約64重量％、糖質約23.5重量％、脂質
約12.3重量％であつた。 Ａ 活性 ：759U／μｇ Ｂ 〃 ：858U／μｇ Ｃ 〃 ：0.77EU／μｇ LD50 ：〓 289μｇ／Kg ♀ 200μｇ／Kg
【表】
【表】
【表】
実施例 ８
百日咳菌Ｉ相菌3779B株Bordetella pertussis
Phase Ｉ、3779B Strain）実施例４と同様の培
養法により得られた48時間振盪培養液に25％チメ
ロサールを１／10000容量添加し、56℃で30分間
加温した後、４℃で遠心分離（15000rpm30分
間）して、培養上清を得た。得られた培養上清10
を、透析用セロフアンチユーブに入れ、0.5M
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に対し
て、４℃１晩透析した。透析後Diafloメンプラン
PM−30、（透過分子量限界30000アミコン社製）
を用いて、限外ろ過を行い、約40mlまで濃縮し
た。膜を通過した外液にドライアイスで冷却した
エタノールを最終濃度40％（Ｖ／Ｖ）になるよう
に滴下し析出する沈殿物を遠心分離（3000rpm15
分間、４℃）にて得た。この得られた沈殿物を
0.5M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）２
mlに溶解し４℃１晩前述のリン酸緩衝液に透析後
0.5M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
平衡化したセフアデツクスG75（1.5×50cm）で
ゲルろ過を行つた。その結果分子量30000、前後
の位置に溶出するタンパク質ピークに一致して目
的活性画分が得られた。 得られた活性画分を透析後（蒸留水に対し48時
間）、凍結乾燥して白色調微粉末2.5mgを得た。ゲ
ルろ過による分子量は29000±3000であり本物質
の組成は総重量に対し、タンパク質約75重量％、
糖質約23重量％、脂質約１重量％よりなり、核酸
は、検出されなかつた。デイスク電気泳動（PH
43）において陰極側に泳動した。Ａ活性250U／
μｇ、Ｂ活性350U／μｇ、Ｃ活性0.18EU／μｇ
LD50〓884μｇ／Kg、♀707μｇ／Kgである。 また上記限外ろ過で濃縮した内液を、0.5M
NaCl含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し
た、セフアデツクスＧ−150（4.9×89cm）でゲル
ろ過した。得られた活性画分を集め、前述の
Diafloメンブランで10mlまで濃縮し、この液を再
び前述のリン酸緩衝液でもつて平衡化した
Sephadex Ｇ−150（カラムサイズ2.6×95cm）
で、再ゲルろ過を行い活性画分を得た。その結果
分子量65000前後の位置に溶出するタンパク質ピ
ークに一致して活性画分が得られ、透析後凍結乾
燥粉末4.5mgを得た。分子量は65000±6000で化学
組成は、総重量に対しタンパク質約55重量％、糖
質約25重量％、脂質約20重量％、よりなり核酸
は、検出されなかつた。デイスク電気泳動（PH
4.3）において陰極側に泳動した。 Ａ活性 300U／μｇ Ｂ活性 360U／μｇ Ｃ活性 0.25EU／μｇ LD50 ： 〓 660μｇ／Kg ♀ 541μｇ／Kg 実施例 ９ 百日咳Ｉ相菌東浜株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を実施例４と同様に振盪培養し、菌体
を分離して、培養上清液５を得た。培養上清液
のPHを6NHClにて4.0に調整する。あらかじめ活
性化した、CMセフアロース（フアルマシア社
製）を５ｇ／100mlの割合で加えスターラーにて
１時間撹拌する。目的画分はCM−セフアロース
に吸着されるのでCMセルロース部分を集め
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で２回洗浄する。
その後CM−セフアロースを1MのNaClを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に懸濁し約２時間ス
ターラーにて撹拌し上清液を得る。上清液を一昼
夜蒸留水にて透析し凍結乾燥した。 凍結乾燥粉末を0.01Mリン酸緩衝液に溶解し、
リン酸緩衝液で平衡化したCM−セフアロースカ
ラム（３×15cm）に通しリン酸緩衝液PH及モル濃
度、食塩濃度の勾配をつけ溶出を行ない目的画分
は0.5M−NaCl含有0.1M−リン酸緩衝液（PH7.5）
で溶出される蛋白質ピークとして得られた。得ら
れた画分は一昼夜蒸留水に透析後、凍結乾燥しそ
の後、凍結乾燥粉末は約100mlの0.01Mリン酸緩
衝液に溶解し限外濃縮（Amicon社製透過分子量
限界30000、メンプレンタイプDiaflo PM−30）
した内液及び外液に活性が認められたので内液を
Sephadex Ｇ−150（３×100cm）、外液をG50に
（２×65cm）通した。その結果蛋白質ピークに一
致した活性を得た。G150から得られた画分1.9mg
をとし、G50から得られた画分0.8mgをとす
る。得られた凍結乾燥粉末の分子量は約71000
±1000、は約12000±3000である。の組成
は、蛋白質が82重量％、糖質約10重量％、脂質は
約８重量％、で核酸は検出されない。 については、蛋白質が65重量％、糖質約20重
量％、脂質約15重量％であり、核酸は検出されな
い。，ともPH4.3のデイスク電気泳動で陰極
側にバンドを認める。 画分の活性 画分の活性 Ａ ： 400U／μｇ Ａ 250U／μｇ Ｂ ： 740U／μｇ Ｂ 450U／μｇ Ｃ ： 0.34EU／μｇ
Ｃ 0.15EU／μｇ LD50：〓 732μｇ／Kg LD50〓 904μｇ／Kg 〃 ：♀ 496μｇ／Kg ♀ 796μｇ／Kg 実施例 10 百日咳相菌No.22株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を実施例４と同様に培養し、菌体を分
離し、得られた上清を精製の出発材料とした。上
清５に０℃下で最終濃度60％になるようにアセ
トンを加え撹拌し、直ちに3000r.p.m.15分間遠心
分離した。得られた沈殿はアセトン粉末とし、こ
れを0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）10mlに溶解し
カルボキシメチルセフアデツクスＧ−25（２×20
cm、流速40ml／hr）に添加した。0.5M塩化ナト
リウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で溶出
される画分に活性が集約され溶出された。この画
分を集め濃縮後、0.5M塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）１で計３回、２日
間透析後、同一緩衝液で平衡化したセフアデツク
スＧ−100（２×90cm、流速20ml／hr）でゲルク
ロマトグラフイーを行なつた。その結果分子量
45000前後の位置（45300±5500，３回の平均）ピ
ークを示す蛋白質成分と一致して活性画分を得、
凍結乾燥粉末1.2mgを得た。得られた物質の化学
組成はタンパク質85重量％、以上糖質約12重量％
からなりポリアクリルアミドデイスク電気泳動
（PH4.3）で陰極側へ移行した。Ａ活性は453U／
μｇ、Ｂ活性は300U／μｇ、Ｃ活性は0.44EU／
μｇであり、LD50はマウス〓420μｇ／Kg、マウ
ス♀380μｇ／Kgである。 実施例 11 百日咳菌相菌の凍結乾燥保存菌を実施例４と
同様の培養法により得られた48時間振盪培養液を
56℃、30分間、加熱後15000rpm4℃、30分間遠心
分離し得られた上清を精製の出発材料とした。上
清20に、氷冷下で撹拌しながらドライアイスで
冷却したアセトンを、最終濃度60％になるよう
徐々に加え析出した沈殿物を、3000rpm0℃、15
分間遠心分離し回収した。得られた沈殿物を蒸留
水10mlに溶解懸濁し、これを、0.01Mリン酸緩衝
液（PH6.0）１で３回、２日間透析し、析出し
た不溶物を遠心分離し除去後、同一緩衝液で、平
衡化したCM−セフアロースカラム（２×20cm）
に添加し流速20ml／hrで溶出分離操作を行なつ
た。目的とする活性画分は0.5M塩化ナトリウム
を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で溶出される
タンパク質ピークと一致して得られた。次いで、
この画分を濃縮後、0.5M塩化ナトリウム0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）１で５回、２日間透析
後、得られた試料溶液２mlを同一緩衝液にて平衡
化したバイオゲルＰ−100カラム（1.2×80cm）に
添加し流速24ml／hrでゲルクロマトグラフイーを
行なつた。その結果分子量55000±5000の位置に
溶出するタンパク質ピークに一致して目的とする
活性物質が得られ凍結乾燥粉末1.16mgを得た。得
られた活性画分は、タンパク質91重量％以上、糖
質約4.1重量％からなり、脂質および核酸は、検
出されなかつかた。Ａ活性は38U／μｇ、Ｂ活性
は25U／μｇ、Ｃ活性は0.02EU／μｇであり、
LD50はマウス〓1560μｇ／Kg、マウス♀1660μ
ｇ／Kgである。 実施例 12 百日咳相菌No.41株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
培養し得られた48時間振盪培養液を56℃、30分間
加熱後15000r.p.m.4℃、30分間遠心分離し、得ら
れた上清を精製の出発材料とした。上清５に氷
冷下で撹拌しながら、エタノールを最終濃度35％
になるまで徐々に加え、得られた沈殿を3000r.p.
m.0℃、15分間遠心分離し回収した。次いで沈殿
を0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）10mlに溶解し、
同一緩衝液１で計３回、２日間透析し、析出し
た不溶物を遠心分離で除去後、前述の緩衝液で平
衡化したCM−セフアロースカラム（２×20cm）
に添加し、流速40ml／hrで溶出操作を行つた。活
性画分は0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）で溶出されるタンパク質ピーク
と一致して得られる。そこで得られた活性画分を
濃縮後0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）１で計３回、２日間透析後、得
られた試料２mlを同一緩衝液で平衡化したセフア
デツクスG.−100カラム（２×90cm）によりクロ
マトグラフイーを行つた。その結果、分子量
36500±4000の位置に溶出するタンパク質ピーク
に一致して目的活性画分が得られ凍結乾燥粉末
1.34mgを得た。得られた物質はタンパク質80±２
重量％、糖質16±３重量％よりなり脂質及核酸は
含まれない。またデイスク電気泳動（PH4.3）に
おいて陰極側に泳動する。さらに、そのＡ活性は
380U／μｇ、Ｂ活性は200U／μｇ、Ｃ活性は
0.40EU／μｇであり、LD50はマウス〓560μｇ／
Kg、マウス♀580μｇ／Kgである。 実施例 13 百日咳相菌東浜株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
振盪培養後、菌体を分離して、培養上清液10に
（NH4）2SO4を90％飽和まで添加後、一晩４℃にて
放置し遠沈（10000rpm30分）により沈殿物を集
める。この沈殿物を1M−NaCl液で抽出、遠心分
離後、上清液を蒸留水を外液として透析し、さら
に2M−尿素含有0.01M−リン酸緩衝液（PH8.0）
で平衡化後、DEAE−セルロース（３×18cm）に
添加し、通過（非吸着）液と、2M−尿素、0.5M
−NaCl含有0.1M−リン酸緩衝液（PH6.0）で溶出
される両活性画分を得た。そこで更に精製するた
め非吸着活性画分を濃縮後、セフアロース−6B
にてゲルろ過を行ない、活性画分を凍結乾燥し、
かつ色調微粉末2.1mgを得た。 分子量はゲルろ過法により230000±20000と推
定され、電気泳動（PH4.3ゲル）にて陰極側に移
動するバンドを認める。組成は蛋白質70重量％、
以上糖質７〜13重量％、脂質６〜10重量％であ
る。 Ａ活性は500U／μｇ、Ｂ活性は450U／μｇ、
Ｃ活性は0.71EU／μｇであり、LD50はマウス〓
670μｇ／Kg、マウス♀580μｇ／Kgである。 一方2M−尿素0.5M−NaCl含有0.1M−リン酸緩
衝液（PH6.0）で溶出される活性画分を濃縮後セ
フアデツクスＧ−75を用いてゲルろ過を行ない、
低分子側に蛋白質ピークと一致した活性画分を得
た。活性画分を凍結乾燥し白色微粉末6.5mgを得
た。 分子量は36000±4000であり、組成は蛋白質90
重量％以上糖質6.5〜7.5重量％、脂質5.3〜6.7重
量％である。電気泳動（PH8.3ゲル）にて陽極側
にわずかに移動する。 Ａ活性は350U／μｇ、Ｂ活性は480U／μｇ、
Ｃ活性は0.09EU／μｇであり、LD50はマウス〓
448μｇ／Kg、マウス♀340μｇ／Kgである。 実施例 14 百日咳相菌前野株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
振盪培養後菌体分離して培養上清を得た。この培
養上清液２を、6NHClでPH7.5に調整したの
ち、2M塩化カルシウム溶液を沈殿が生じなくな
るまで（約400ml）加え、30分間撹拌後、４℃で
遠心分離（4000r.p.m.×７分間）し、沈殿に20ml
の水を加えたのち、30％硫酸をPH5.0となるよう
に撹拌しながら加え、1hr撹拌後４℃で遠心分離
（4000r.p.m.×７分間）し、上清をとる。この上
清液を透析（外液２、５回、45hr）濃縮し（約
10mlまで濃縮）、2M尿素を含有する0.05Mリン酸
緩衝液（PH5.5）に対し、充分に透析平衡化（２
、５回、48hr.）し、（沈殿が生じた場合は遠心
分離（4000r.p.m.×7min.）する）同一緩衝液で
平衡化したCM−セフアロースカラム（1.8×17
cm）に通し、同一緩衝液を流しカラムを洗滌後順
次PHを上げる。ついで2M尿素を含む0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.0）で最終溶出部に、蛋白質ピーク
と一致した活性がみられた。この活性画分を透析
（２、３回、12時間）し、濃縮、2M尿素を含む
0.1Mリン酸緩衝液PH7.0に対し透析平衡化（２
、５回、48hr.）し、同一緩衝液で平衡化した
セフアデツクスＧ−200カラム（カラムサイズ2.8
×95cm）を通す。活性部分は、分子量115000と推
定される部分に集中しており、（後のゲルろ過に
よる分子量推定で115800±15000と決定された。）
この画分を透析（２、５回、48hr.）後、凍結
乾燥して0.8PHの淡褐色粉末を得た。 この物は、デイスク電気泳動PH4.3ゲルにおい
て陰極側に移動した。化学組成は蛋白質75重量％
以上、糖質12.5〜16.9重量％で、脂質は6.8〜7.2
重量％であつた。 Ａ活性は600U／μｇ、Ｂ活性は550U／μｇ、
Ｃ活性は0.47EU／μｇであり、LD50はマウス〓
490μｇ／Kg、マウス♀390μｇ／Kgである。 実施例 15 百日咳相菌No.22株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例７と同様に
液体静置培養し、遠心分離後培養上清液10を得
た。この培養上清液を1N−HClでPH6.0に調整
後、ハイドロキンアパタイトカラムに通した。カ
ラムを0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後吸
着物質を0.5M−NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で溶出した。得られた活性画分を含む溶液
を、透析膜に入れて蒸留水を外液として透析し、
次いで0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）にて平衡化
したCM−セフアロースカラムに添加した。
0.01M、および0.05M−リン酸緩衝液（PH6.0）で
洗浄後、1M−NaCl含有0.2Mリン酸緩衝液（PH
8.0）で溶出される蛋白質に一致した活性画分が
得られた。更に精製するために得られた活性画分
を水に対して透析後凍結乾燥し、4M−尿素、
0.5M−NaClを含む0.1M−リン酸緩衝液（PH7.0）
に可溶化後、Biogel−P200にてゲルろ過を行ない
活性画分は凍結乾燥し、白色微粉末約11.3mgを得
た。 分子量は95000±11000であり 組成はタンパク質91±1.0重量％ 糖質７±0.7
重量％ 脂質２±1.2重量％であり、デイスク電
気泳動（PH4.3ゲル）にて陰極側に移動する。 Ａ活性は900U／μｇ、Ｂ活性は970U／μｇ、
Ｃ活性は0.99EU／μｇであり、LD50はマウス〓
260μｇ／Kg、マウス♀185μｇ／Kgである。 実施例 16 百日咳相菌東浜株の凍結乾燥保存菌株（北里
大学薬学部微生物学教室提供）をBG培地で37
℃、３日間培養後、BG斜面培地で37℃ 20〜24
時間培養した後、表７−１で組成を示す炭未加半
合成固形培地（Cohen−Wheealerの変法固型培
地）200mlを分注した２のルービンに１白金耳
接種し、37℃ 48時間培養後、菌体を取り除いた
寒天培地に0.5M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH６）100mlを加え凍結融解し遠心分離後
（15000rpm×30分間）上清液を得る。上清液をあ
らかじめ0.01Mリン酸緩衝液（PH６）で平衡化し
たハイドロキシアパタイトカラム（４×３cm）に
通す。目的画分はハイドロキシアパタイトに吸着
されるので、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）で洗
いついで0.5M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で溶出した。得られた活性画分を凍結乾
燥し透過分子量限界8000の透析膜に入れた後一昼
夜蒸留水及び0.01Mクエン酸緩衝液（PH4.0）に
て透析した。上記透析後の活性画分を含む溶液を
0.01Mクエン酸緩衝液（PH4.0）で平衡化したＰ
−セルロース（セルバ製）に通した。目的物質は
Ｐ−セルロースに吸着され順次クエン酸緩衝液の
PH及びモル濃度及び食塩濃度を段階的に上げ、
0.1Mのクエン酸緩衝液（PH6.0）で目的画分を効
率よく溶出させた。更に精製を進めるため活性画
分を濃縮後、1MのNaClを含む0.1Mクエン酸緩衝
液（PH6.0）であらかじめ平衡化したバイオゲル
Ｐ−150カラム（2.2×75cm）に通した。ゲルろ過
法による推定分子量約70000±10000の位置に蛋白
質ピークと一致した活性画分を得る。本方法で得
られた（2.1mg）活性画分の組成は蛋白質約40重
量％であり糖質約25重量％及び脂質25重量％を含
む。又核酸によると思われる260nmの吸収もみら
れ若干の核酸を含むものと考えられる。PH4.3ゲ
ルデイスク電気泳動では陰極側にかなり尖鋭なバ
ンドが認められる。本物質のＡ活性は約700U／
μｇ、Ｂ活性600U／μｇ、Ｃ活性0.63EU／μｇ
であり、マウスLD50値は〓330μｇ／Kg、♀204
μｇ／Kgであつた。 実施例 17 百日咳相菌前野株を実施例４と同様に48時
間、37℃で培養後遠心分離し、上清液10を得
た。上清液に6N−HClを加えてPHを6.0に調整
後、ハイドロキシアパタイトカラム（2.5×４
cm）に通した。実施例４と同様に吸着された物質
は0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で溶出した。目的活性画分を含む溶液
を、約10mlまで濃縮後、蒸留水１で４回、24時
間透析し、ついで2M尿素を含む0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0）１で（４回、24時間）平衡化し同
一緩衝液で平衡化したセフアロース6B（2.7×70
cm）カラムに通した。目的物質を含む画分を濃縮
し、透析後、遠心分離15000rpm30分間し、上清
に関し密度勾配等電点分離を行つた。キヤリア
ー・アンホライン（PH６〜10）の平均最終濃度は
１％で電気泳動は４℃で、定電圧500V、30時間
行い、各画分１mlづつを採取した。目的活性画分
は、PH8.0付近をピークの中心とし、PH7.5〜8.5に
わたる蛋白質部分に一致した部分に活性が認めら
れた。得られた画分を凍結乾燥して、褐色調微粉
末1.18mgを得た。ゲルろ過法による分子量は
65000±6000で組成は蛋白質95重量％以上糖質は
約2.5重量％含むが、脂質は検出限界以下であ
る。ポリアクリルアミドデスク電気泳動（PH
4.3）で陰極側に先鋭なバンドを示した。Ａ活性
は850U／μｇ、Ｂ活性は800U／μｇ／Ｃ活性は
0.83EU／μｇである。マウスにおける急性毒性
値（LD50）は〓310μｇ／Kg、♀240μｇ／Kgであ
る。 実施例 18 百日咳相菌3779B株の凍結乾燥保存菌（北里
大学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様
に振盪培養後、菌体を分離した培養上清液10を
1N−塩酸でPH6.0に調整後ハイドロキシアパタイ
トカラム（２×４cm）に通し、0.01M−リン酸緩
衝液（PH6.0）および0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で不純物を洗浄後、0.5M−NaCl含有0.1M−リン
酸緩衝液（PH7.0）で溶出した蛋白質に一致した
活性画分が得られた。この活性画分にはまだ微量
の不純物を含むため、次に調製用デイスク電気泳
動装置（カナルコ社製）にて精製を行つた。分離
用PH4.3ゲル、3mAで10hr通電し活性画分を溶出
した。さらにこの溶液を透析、濃縮後、セフアク
リル−Ｓ−200（２×90cm）（フアルマシア社製）
にてゲル過を行い蛋白質ピークと一致した活性
画分を得、凍結乾燥により淡褐色粉末５mgを得
た。 分子量： 55000±8000 組 成： 蛋白質90重量％以上、糖質７〜９重
量％、脂質１重量％以下 デイスク電気泳動パターン： PH4.3ゲルにて陰極側に移動するシン
グルバンド 等電点： 7.5±0.5 Ａ活性は900U／μｇ、Ｂ活性は1050U／μ
ｇ、Ｃ活性は0.95EU／μｇである アミノ酸組成： 第12表に示す。 マウスにおける急性毒性値（LD50）は〓293μ
ｇ／Kg、♀は204μｇ／Kgであつた。
Phase Ｉ、3779B Strain）実施例４と同様の培
養法により得られた48時間振盪培養液に25％チメ
ロサールを１／10000容量添加し、56℃で30分間
加温した後、４℃で遠心分離（15000rpm30分
間）して、培養上清を得た。得られた培養上清10
を、透析用セロフアンチユーブに入れ、0.5M
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に対し
て、４℃１晩透析した。透析後Diafloメンプラン
PM−30、（透過分子量限界30000アミコン社製）
を用いて、限外ろ過を行い、約40mlまで濃縮し
た。膜を通過した外液にドライアイスで冷却した
エタノールを最終濃度40％（Ｖ／Ｖ）になるよう
に滴下し析出する沈殿物を遠心分離（3000rpm15
分間、４℃）にて得た。この得られた沈殿物を
0.5M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）２
mlに溶解し４℃１晩前述のリン酸緩衝液に透析後
0.5M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
平衡化したセフアデツクスG75（1.5×50cm）で
ゲルろ過を行つた。その結果分子量30000、前後
の位置に溶出するタンパク質ピークに一致して目
的活性画分が得られた。 得られた活性画分を透析後（蒸留水に対し48時
間）、凍結乾燥して白色調微粉末2.5mgを得た。ゲ
ルろ過による分子量は29000±3000であり本物質
の組成は総重量に対し、タンパク質約75重量％、
糖質約23重量％、脂質約１重量％よりなり、核酸
は、検出されなかつた。デイスク電気泳動（PH
43）において陰極側に泳動した。Ａ活性250U／
μｇ、Ｂ活性350U／μｇ、Ｃ活性0.18EU／μｇ
LD50〓884μｇ／Kg、♀707μｇ／Kgである。 また上記限外ろ過で濃縮した内液を、0.5M
NaCl含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し
た、セフアデツクスＧ−150（4.9×89cm）でゲル
ろ過した。得られた活性画分を集め、前述の
Diafloメンブランで10mlまで濃縮し、この液を再
び前述のリン酸緩衝液でもつて平衡化した
Sephadex Ｇ−150（カラムサイズ2.6×95cm）
で、再ゲルろ過を行い活性画分を得た。その結果
分子量65000前後の位置に溶出するタンパク質ピ
ークに一致して活性画分が得られ、透析後凍結乾
燥粉末4.5mgを得た。分子量は65000±6000で化学
組成は、総重量に対しタンパク質約55重量％、糖
質約25重量％、脂質約20重量％、よりなり核酸
は、検出されなかつた。デイスク電気泳動（PH
4.3）において陰極側に泳動した。 Ａ活性 300U／μｇ Ｂ活性 360U／μｇ Ｃ活性 0.25EU／μｇ LD50 ： 〓 660μｇ／Kg ♀ 541μｇ／Kg 実施例 ９ 百日咳Ｉ相菌東浜株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を実施例４と同様に振盪培養し、菌体
を分離して、培養上清液５を得た。培養上清液
のPHを6NHClにて4.0に調整する。あらかじめ活
性化した、CMセフアロース（フアルマシア社
製）を５ｇ／100mlの割合で加えスターラーにて
１時間撹拌する。目的画分はCM−セフアロース
に吸着されるのでCMセルロース部分を集め
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で２回洗浄する。
その後CM−セフアロースを1MのNaClを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に懸濁し約２時間ス
ターラーにて撹拌し上清液を得る。上清液を一昼
夜蒸留水にて透析し凍結乾燥した。 凍結乾燥粉末を0.01Mリン酸緩衝液に溶解し、
リン酸緩衝液で平衡化したCM−セフアロースカ
ラム（３×15cm）に通しリン酸緩衝液PH及モル濃
度、食塩濃度の勾配をつけ溶出を行ない目的画分
は0.5M−NaCl含有0.1M−リン酸緩衝液（PH7.5）
で溶出される蛋白質ピークとして得られた。得ら
れた画分は一昼夜蒸留水に透析後、凍結乾燥しそ
の後、凍結乾燥粉末は約100mlの0.01Mリン酸緩
衝液に溶解し限外濃縮（Amicon社製透過分子量
限界30000、メンプレンタイプDiaflo PM−30）
した内液及び外液に活性が認められたので内液を
Sephadex Ｇ−150（３×100cm）、外液をG50に
（２×65cm）通した。その結果蛋白質ピークに一
致した活性を得た。G150から得られた画分1.9mg
をとし、G50から得られた画分0.8mgをとす
る。得られた凍結乾燥粉末の分子量は約71000
±1000、は約12000±3000である。の組成
は、蛋白質が82重量％、糖質約10重量％、脂質は
約８重量％、で核酸は検出されない。 については、蛋白質が65重量％、糖質約20重
量％、脂質約15重量％であり、核酸は検出されな
い。，ともPH4.3のデイスク電気泳動で陰極
側にバンドを認める。 画分の活性 画分の活性 Ａ ： 400U／μｇ Ａ 250U／μｇ Ｂ ： 740U／μｇ Ｂ 450U／μｇ Ｃ ： 0.34EU／μｇ
Ｃ 0.15EU／μｇ LD50：〓 732μｇ／Kg LD50〓 904μｇ／Kg 〃 ：♀ 496μｇ／Kg ♀ 796μｇ／Kg 実施例 10 百日咳相菌No.22株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を実施例４と同様に培養し、菌体を分
離し、得られた上清を精製の出発材料とした。上
清５に０℃下で最終濃度60％になるようにアセ
トンを加え撹拌し、直ちに3000r.p.m.15分間遠心
分離した。得られた沈殿はアセトン粉末とし、こ
れを0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）10mlに溶解し
カルボキシメチルセフアデツクスＧ−25（２×20
cm、流速40ml／hr）に添加した。0.5M塩化ナト
リウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で溶出
される画分に活性が集約され溶出された。この画
分を集め濃縮後、0.5M塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）１で計３回、２日
間透析後、同一緩衝液で平衡化したセフアデツク
スＧ−100（２×90cm、流速20ml／hr）でゲルク
ロマトグラフイーを行なつた。その結果分子量
45000前後の位置（45300±5500，３回の平均）ピ
ークを示す蛋白質成分と一致して活性画分を得、
凍結乾燥粉末1.2mgを得た。得られた物質の化学
組成はタンパク質85重量％、以上糖質約12重量％
からなりポリアクリルアミドデイスク電気泳動
（PH4.3）で陰極側へ移行した。Ａ活性は453U／
μｇ、Ｂ活性は300U／μｇ、Ｃ活性は0.44EU／
μｇであり、LD50はマウス〓420μｇ／Kg、マウ
ス♀380μｇ／Kgである。 実施例 11 百日咳菌相菌の凍結乾燥保存菌を実施例４と
同様の培養法により得られた48時間振盪培養液を
56℃、30分間、加熱後15000rpm4℃、30分間遠心
分離し得られた上清を精製の出発材料とした。上
清20に、氷冷下で撹拌しながらドライアイスで
冷却したアセトンを、最終濃度60％になるよう
徐々に加え析出した沈殿物を、3000rpm0℃、15
分間遠心分離し回収した。得られた沈殿物を蒸留
水10mlに溶解懸濁し、これを、0.01Mリン酸緩衝
液（PH6.0）１で３回、２日間透析し、析出し
た不溶物を遠心分離し除去後、同一緩衝液で、平
衡化したCM−セフアロースカラム（２×20cm）
に添加し流速20ml／hrで溶出分離操作を行なつ
た。目的とする活性画分は0.5M塩化ナトリウム
を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で溶出される
タンパク質ピークと一致して得られた。次いで、
この画分を濃縮後、0.5M塩化ナトリウム0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）１で５回、２日間透析
後、得られた試料溶液２mlを同一緩衝液にて平衡
化したバイオゲルＰ−100カラム（1.2×80cm）に
添加し流速24ml／hrでゲルクロマトグラフイーを
行なつた。その結果分子量55000±5000の位置に
溶出するタンパク質ピークに一致して目的とする
活性物質が得られ凍結乾燥粉末1.16mgを得た。得
られた活性画分は、タンパク質91重量％以上、糖
質約4.1重量％からなり、脂質および核酸は、検
出されなかつかた。Ａ活性は38U／μｇ、Ｂ活性
は25U／μｇ、Ｃ活性は0.02EU／μｇであり、
LD50はマウス〓1560μｇ／Kg、マウス♀1660μ
ｇ／Kgである。 実施例 12 百日咳相菌No.41株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
培養し得られた48時間振盪培養液を56℃、30分間
加熱後15000r.p.m.4℃、30分間遠心分離し、得ら
れた上清を精製の出発材料とした。上清５に氷
冷下で撹拌しながら、エタノールを最終濃度35％
になるまで徐々に加え、得られた沈殿を3000r.p.
m.0℃、15分間遠心分離し回収した。次いで沈殿
を0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）10mlに溶解し、
同一緩衝液１で計３回、２日間透析し、析出し
た不溶物を遠心分離で除去後、前述の緩衝液で平
衡化したCM−セフアロースカラム（２×20cm）
に添加し、流速40ml／hrで溶出操作を行つた。活
性画分は0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）で溶出されるタンパク質ピーク
と一致して得られる。そこで得られた活性画分を
濃縮後0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）１で計３回、２日間透析後、得
られた試料２mlを同一緩衝液で平衡化したセフア
デツクスG.−100カラム（２×90cm）によりクロ
マトグラフイーを行つた。その結果、分子量
36500±4000の位置に溶出するタンパク質ピーク
に一致して目的活性画分が得られ凍結乾燥粉末
1.34mgを得た。得られた物質はタンパク質80±２
重量％、糖質16±３重量％よりなり脂質及核酸は
含まれない。またデイスク電気泳動（PH4.3）に
おいて陰極側に泳動する。さらに、そのＡ活性は
380U／μｇ、Ｂ活性は200U／μｇ、Ｃ活性は
0.40EU／μｇであり、LD50はマウス〓560μｇ／
Kg、マウス♀580μｇ／Kgである。 実施例 13 百日咳相菌東浜株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
振盪培養後、菌体を分離して、培養上清液10に
（NH4）2SO4を90％飽和まで添加後、一晩４℃にて
放置し遠沈（10000rpm30分）により沈殿物を集
める。この沈殿物を1M−NaCl液で抽出、遠心分
離後、上清液を蒸留水を外液として透析し、さら
に2M−尿素含有0.01M−リン酸緩衝液（PH8.0）
で平衡化後、DEAE−セルロース（３×18cm）に
添加し、通過（非吸着）液と、2M−尿素、0.5M
−NaCl含有0.1M−リン酸緩衝液（PH6.0）で溶出
される両活性画分を得た。そこで更に精製するた
め非吸着活性画分を濃縮後、セフアロース−6B
にてゲルろ過を行ない、活性画分を凍結乾燥し、
かつ色調微粉末2.1mgを得た。 分子量はゲルろ過法により230000±20000と推
定され、電気泳動（PH4.3ゲル）にて陰極側に移
動するバンドを認める。組成は蛋白質70重量％、
以上糖質７〜13重量％、脂質６〜10重量％であ
る。 Ａ活性は500U／μｇ、Ｂ活性は450U／μｇ、
Ｃ活性は0.71EU／μｇであり、LD50はマウス〓
670μｇ／Kg、マウス♀580μｇ／Kgである。 一方2M−尿素0.5M−NaCl含有0.1M−リン酸緩
衝液（PH6.0）で溶出される活性画分を濃縮後セ
フアデツクスＧ−75を用いてゲルろ過を行ない、
低分子側に蛋白質ピークと一致した活性画分を得
た。活性画分を凍結乾燥し白色微粉末6.5mgを得
た。 分子量は36000±4000であり、組成は蛋白質90
重量％以上糖質6.5〜7.5重量％、脂質5.3〜6.7重
量％である。電気泳動（PH8.3ゲル）にて陽極側
にわずかに移動する。 Ａ活性は350U／μｇ、Ｂ活性は480U／μｇ、
Ｃ活性は0.09EU／μｇであり、LD50はマウス〓
448μｇ／Kg、マウス♀340μｇ／Kgである。 実施例 14 百日咳相菌前野株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様に
振盪培養後菌体分離して培養上清を得た。この培
養上清液２を、6NHClでPH7.5に調整したの
ち、2M塩化カルシウム溶液を沈殿が生じなくな
るまで（約400ml）加え、30分間撹拌後、４℃で
遠心分離（4000r.p.m.×７分間）し、沈殿に20ml
の水を加えたのち、30％硫酸をPH5.0となるよう
に撹拌しながら加え、1hr撹拌後４℃で遠心分離
（4000r.p.m.×７分間）し、上清をとる。この上
清液を透析（外液２、５回、45hr）濃縮し（約
10mlまで濃縮）、2M尿素を含有する0.05Mリン酸
緩衝液（PH5.5）に対し、充分に透析平衡化（２
、５回、48hr.）し、（沈殿が生じた場合は遠心
分離（4000r.p.m.×7min.）する）同一緩衝液で
平衡化したCM−セフアロースカラム（1.8×17
cm）に通し、同一緩衝液を流しカラムを洗滌後順
次PHを上げる。ついで2M尿素を含む0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.0）で最終溶出部に、蛋白質ピーク
と一致した活性がみられた。この活性画分を透析
（２、３回、12時間）し、濃縮、2M尿素を含む
0.1Mリン酸緩衝液PH7.0に対し透析平衡化（２
、５回、48hr.）し、同一緩衝液で平衡化した
セフアデツクスＧ−200カラム（カラムサイズ2.8
×95cm）を通す。活性部分は、分子量115000と推
定される部分に集中しており、（後のゲルろ過に
よる分子量推定で115800±15000と決定された。）
この画分を透析（２、５回、48hr.）後、凍結
乾燥して0.8PHの淡褐色粉末を得た。 この物は、デイスク電気泳動PH4.3ゲルにおい
て陰極側に移動した。化学組成は蛋白質75重量％
以上、糖質12.5〜16.9重量％で、脂質は6.8〜7.2
重量％であつた。 Ａ活性は600U／μｇ、Ｂ活性は550U／μｇ、
Ｃ活性は0.47EU／μｇであり、LD50はマウス〓
490μｇ／Kg、マウス♀390μｇ／Kgである。 実施例 15 百日咳相菌No.22株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例７と同様に
液体静置培養し、遠心分離後培養上清液10を得
た。この培養上清液を1N−HClでPH6.0に調整
後、ハイドロキンアパタイトカラムに通した。カ
ラムを0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後吸
着物質を0.5M−NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で溶出した。得られた活性画分を含む溶液
を、透析膜に入れて蒸留水を外液として透析し、
次いで0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）にて平衡化
したCM−セフアロースカラムに添加した。
0.01M、および0.05M−リン酸緩衝液（PH6.0）で
洗浄後、1M−NaCl含有0.2Mリン酸緩衝液（PH
8.0）で溶出される蛋白質に一致した活性画分が
得られた。更に精製するために得られた活性画分
を水に対して透析後凍結乾燥し、4M−尿素、
0.5M−NaClを含む0.1M−リン酸緩衝液（PH7.0）
に可溶化後、Biogel−P200にてゲルろ過を行ない
活性画分は凍結乾燥し、白色微粉末約11.3mgを得
た。 分子量は95000±11000であり 組成はタンパク質91±1.0重量％ 糖質７±0.7
重量％ 脂質２±1.2重量％であり、デイスク電
気泳動（PH4.3ゲル）にて陰極側に移動する。 Ａ活性は900U／μｇ、Ｂ活性は970U／μｇ、
Ｃ活性は0.99EU／μｇであり、LD50はマウス〓
260μｇ／Kg、マウス♀185μｇ／Kgである。 実施例 16 百日咳相菌東浜株の凍結乾燥保存菌株（北里
大学薬学部微生物学教室提供）をBG培地で37
℃、３日間培養後、BG斜面培地で37℃ 20〜24
時間培養した後、表７−１で組成を示す炭未加半
合成固形培地（Cohen−Wheealerの変法固型培
地）200mlを分注した２のルービンに１白金耳
接種し、37℃ 48時間培養後、菌体を取り除いた
寒天培地に0.5M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH６）100mlを加え凍結融解し遠心分離後
（15000rpm×30分間）上清液を得る。上清液をあ
らかじめ0.01Mリン酸緩衝液（PH６）で平衡化し
たハイドロキシアパタイトカラム（４×３cm）に
通す。目的画分はハイドロキシアパタイトに吸着
されるので、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）で洗
いついで0.5M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で溶出した。得られた活性画分を凍結乾
燥し透過分子量限界8000の透析膜に入れた後一昼
夜蒸留水及び0.01Mクエン酸緩衝液（PH4.0）に
て透析した。上記透析後の活性画分を含む溶液を
0.01Mクエン酸緩衝液（PH4.0）で平衡化したＰ
−セルロース（セルバ製）に通した。目的物質は
Ｐ−セルロースに吸着され順次クエン酸緩衝液の
PH及びモル濃度及び食塩濃度を段階的に上げ、
0.1Mのクエン酸緩衝液（PH6.0）で目的画分を効
率よく溶出させた。更に精製を進めるため活性画
分を濃縮後、1MのNaClを含む0.1Mクエン酸緩衝
液（PH6.0）であらかじめ平衡化したバイオゲル
Ｐ−150カラム（2.2×75cm）に通した。ゲルろ過
法による推定分子量約70000±10000の位置に蛋白
質ピークと一致した活性画分を得る。本方法で得
られた（2.1mg）活性画分の組成は蛋白質約40重
量％であり糖質約25重量％及び脂質25重量％を含
む。又核酸によると思われる260nmの吸収もみら
れ若干の核酸を含むものと考えられる。PH4.3ゲ
ルデイスク電気泳動では陰極側にかなり尖鋭なバ
ンドが認められる。本物質のＡ活性は約700U／
μｇ、Ｂ活性600U／μｇ、Ｃ活性0.63EU／μｇ
であり、マウスLD50値は〓330μｇ／Kg、♀204
μｇ／Kgであつた。 実施例 17 百日咳相菌前野株を実施例４と同様に48時
間、37℃で培養後遠心分離し、上清液10を得
た。上清液に6N−HClを加えてPHを6.0に調整
後、ハイドロキシアパタイトカラム（2.5×４
cm）に通した。実施例４と同様に吸着された物質
は0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）で溶出した。目的活性画分を含む溶液
を、約10mlまで濃縮後、蒸留水１で４回、24時
間透析し、ついで2M尿素を含む0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0）１で（４回、24時間）平衡化し同
一緩衝液で平衡化したセフアロース6B（2.7×70
cm）カラムに通した。目的物質を含む画分を濃縮
し、透析後、遠心分離15000rpm30分間し、上清
に関し密度勾配等電点分離を行つた。キヤリア
ー・アンホライン（PH６〜10）の平均最終濃度は
１％で電気泳動は４℃で、定電圧500V、30時間
行い、各画分１mlづつを採取した。目的活性画分
は、PH8.0付近をピークの中心とし、PH7.5〜8.5に
わたる蛋白質部分に一致した部分に活性が認めら
れた。得られた画分を凍結乾燥して、褐色調微粉
末1.18mgを得た。ゲルろ過法による分子量は
65000±6000で組成は蛋白質95重量％以上糖質は
約2.5重量％含むが、脂質は検出限界以下であ
る。ポリアクリルアミドデスク電気泳動（PH
4.3）で陰極側に先鋭なバンドを示した。Ａ活性
は850U／μｇ、Ｂ活性は800U／μｇ／Ｃ活性は
0.83EU／μｇである。マウスにおける急性毒性
値（LD50）は〓310μｇ／Kg、♀240μｇ／Kgであ
る。 実施例 18 百日咳相菌3779B株の凍結乾燥保存菌（北里
大学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様
に振盪培養後、菌体を分離した培養上清液10を
1N−塩酸でPH6.0に調整後ハイドロキシアパタイ
トカラム（２×４cm）に通し、0.01M−リン酸緩
衝液（PH6.0）および0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で不純物を洗浄後、0.5M−NaCl含有0.1M−リン
酸緩衝液（PH7.0）で溶出した蛋白質に一致した
活性画分が得られた。この活性画分にはまだ微量
の不純物を含むため、次に調製用デイスク電気泳
動装置（カナルコ社製）にて精製を行つた。分離
用PH4.3ゲル、3mAで10hr通電し活性画分を溶出
した。さらにこの溶液を透析、濃縮後、セフアク
リル−Ｓ−200（２×90cm）（フアルマシア社製）
にてゲル過を行い蛋白質ピークと一致した活性
画分を得、凍結乾燥により淡褐色粉末５mgを得
た。 分子量： 55000±8000 組 成： 蛋白質90重量％以上、糖質７〜９重
量％、脂質１重量％以下 デイスク電気泳動パターン： PH4.3ゲルにて陰極側に移動するシン
グルバンド 等電点： 7.5±0.5 Ａ活性は900U／μｇ、Ｂ活性は1050U／μ
ｇ、Ｃ活性は0.95EU／μｇである アミノ酸組成： 第12表に示す。 マウスにおける急性毒性値（LD50）は〓293μ
ｇ／Kg、♀は204μｇ／Kgであつた。
【表】
実施例 19
百日咳相菌東浜株を実施例４と同様に培養し
遠心分離後、沈殿する菌体を得た。得られた菌体
を蒸留水で均一な浮遊液とし、15000rpmで、30
分間遠心分離して洗浄した。この菌体を再び蒸留
水で均一な浮遊液とした後、比濁定量（波長
650nm）で200bil／mlの濃厚菌液とした。 0.5M−NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で希釈して100bil／mlの菌液とし、この菌液10ml
に４℃で超音波（20KHz）を10分間作用して、上
清と菌体とに分離した。この上清を二分し一方
は、0.5M−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で平衡化したセフアロース6B（3.2×90cm）
に他方はCMセルロース（2.0×20cm）に通した。 セフアロース6Bでゲルろ過して得たものは分
子量は180000±20000の位置に溶出する蛋白質ピ
ークに一致して目的活性画分が得られた。この活
性画分は透析後、凍結乾燥し、白色調粉末を0.70
mg得た。化学組成は蛋白質50.3〜60.2重量％、糖
質22〜28重量％、脂質17.5〜22.5重量％で、波長
260nmで核酸と思われる吸収が認められた。デイ
スク電気泳動（PH8.3）においては、わずかに陽
極側に泳動した。Ａ活性は400U／μｇ、Ｂ活性
は280U／μｇ、Ｃ活性は0.45EU／μｇである。
マウスにおける急性毒性値（LD50）は〓807μ
ｇ／Kg、♀694μｇ／Kgである。 一方、あらかじめ0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.0）で、平衡化したCM−セフアロースカラムに
通した画分については、目的物質は吸着され順
次、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）でカラムを洗い0.5M−NaCl含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で溶出した。この活
性画分を集め濃縮し、0.5M−NaCl含む0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で平衡化したセフアロース6B
（3.2×90cm）でゲルろ過を行つた。 その結果、分子量は160000±20000に溶出する
蛋白質ピークに一致して活性画分が得られた。こ
の活性画分は透析後凍結乾燥し、淡黄色調白色粉
末0.28mgを得た。化学組成は、蛋白質56〜61重量
％、糖質15〜19重量％、脂質18〜22重量％で、波
長260nmで核酸と思われる吸収が認められた。デ
イスク電気泳動（PH4.3）においては陰極側に泳
動した。Ａ活性は550U／μｇでＢ活性は470U／
μｇ、Ｃ活性は0.78EU／μｇである。マウスに
おける急性毒性値（LD50）は〓706μｇ／Kg、♀
で612μｇ／Kgである。 実施例 20 百日咳相菌坂入株、バラ百日咳菌17903株気
管支敗血症菌Ｌ−３株の凍結乾燥保存菌を、実施
例４と同様に各々培養後、遠心分離して各々の菌
体を得た。得た菌体は蒸留水で１回洗浄後、再び
蒸留水で均一な浮遊液として比濁定量（波長
650nm）で百日咳相菌は300bil／ml、パラ百日
咳菌は200bil／ml、気管支敗血症菌は、200bil／
mlの濃厚菌液とした。 各菌株について、下記の操作を同様に行つた。
0.5M−NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
各々を希釈して100bil／mlの菌液にし、この菌液
10mlを４℃で超音波処理（20KHz、10分間）して
菌体を破壊した。 超音波処理後、遠心分離（15000rpm30分間）
し、上清と沈渣とに分離した。この上清を二分
し、一方は、0.5M−NaCl含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0）で平衡化したセフアロース6B（3.2×
90cm）に、他方はCMセルロースカラム（2.0×10
cm）に通した。セフアロース6Bでゲルろ過して
得られたものの分子量は百日咳相菌で180000±
30000、パラ百日咳菌で200000±20000、気管支敗
血症菌で200000±30000であつた。各々得られた
活性画分は透析後、凍結乾燥した。百日咳相菌
は白色粉末0.65mgが得られその化学組成は、蛋白
質45〜50重量％、糖質20〜25重量％、脂質23〜28
重量％で波長260nmでの吸収が認められた。Ａ活
性は30U／μｇ、Ｂ活性1.2U／μｇ、Ｃ活性
0.01EU／μｇである。マウスにおける急性毒性
値は〓♀共に2500μｇ／Kg以上である。 パラ百日咳菌は白色粉末0.47mgが得られ、その
化学組成は蛋白質55〜60重量％、糖質18〜23重量
％、脂質20〜25重量％で、波長260nmで核酸と思
われる吸収が認められた。Ａ活性は21U／μｇ、
Ｂ活性は35U／μｇ、Ｃ活性は0.01EU／μｇで
ある。マウスにおける急性毒性値（LD50）は〓で
2500μｇ／Kg、♀で2400μｇ／Kgである。 気管支敗血症菌は淡黄色粉末0.31mgが得られ、
その化学組成は蛋白質50〜55重量％、糖質20〜26
重量％、脂質18〜25重量％で、波長260nmで核酸
と思われる吸収が認められた。 このもののＡ活性は15U／μｇ、Ｂ活性は
0U／μｇ、Ｃ活性は0.02EU／μｇであつた。
LD50はマウス雄1846μｇ／Kg（体重）雌1605μ
ｇ／Kg（体重）であつた。百日咳相菌、パラ百
日咳菌、気管支敗血症菌は共にデイスク電気泳動
（PH8.3）において陽極側にわずかに泳動した。 一方あらかじめ、0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.0）で平衡化したCM−セフアロースカラムに通
した画分については目的物質は吸着され、順次
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.0）でカラムを洗い0.5M−NaClを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で溶出した。この活
性画分を集め濃縮し、0.5M−NaCl含有0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で平衡化したセフアロース6B
（3.2×90cm）でゲルろ過を行つた。その結果、得
られたものの分子量は、百日咳相菌で160000±
30000、パラ百日咳菌で170000±20000、気管支敗
血症菌で190000±20000であつた。 各々得られた活性画分は透析後、凍結乾燥し
た。百日咳相菌からは、淡黄色粉末0.18mgが得
られその化学組成はタンパク質50〜58重量％、糖
質17〜22重量％、脂質20〜26重量％で波長260nm
に核酸によるとおもわれる吸収が認められた。Ａ
活性は45U／μｇ、Ｂ活性は5.2U／μｇ、Ｃ活性
は0.03EU／μｇであつた。LD50はマウス雄2500
μｇ／Kg（体重）以上、雌2500μｇ／Kg（体重）
以上であつた。 パラ百日咳菌からは、淡黄色粉末0.09mgが得ら
れ、その化学組成は、タンパク質55〜65重量％、
糖質12〜18重量％、脂質17〜22重量％で波長260
mmに核酸によるとおもわれる吸収が認められた。
Ａ活性は25U／μｇ、Ｂ活性は94U／μｇ、Ｃ活
性は0.04EU／μｇであつた。LD50はマウス雄
2500μｇ／Kg（体重）以上、雌2500μｇ／Kg（体
重）であつた。 気管支敗血症菌からは、淡黄色粉末0.06mgが得
られその化学組成はタンパク質53〜58重量％、糖
質16〜20重量％、脂質14〜18重量％で、波長
260nmに核酸によるとおもわれる吸収が認められ
た。 Ａ活性は20U／μｇ、Ｂ活性は0U／μｇ、Ｃ
活性は0.08EU／μｇであつた。LD50はマウス雄
2500μｇ／Kg（体重）以上、雌2500μｇ／Kg（体
重）以上であつた。 得られた活性画分は百日咳相菌、パラ百日咳
菌、気管支敗血症菌は共に、デイスク電気泳動
（PH4.3）において、陰極側に泳動した。 実施例 21 百日咳相菌No.41株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例17と同様に
して、炭末加寒天培地で37℃、48時間培養した。
菌体を集め洗浄後、菌体10ｇを２％TritonX−
100，lmM EDTA，0.5M NaClを含む0.1M Tris
−HCl緩衝液（PH8.0）550mlに懸濁し、テフロン
ホモジナイザーを用いて４℃５時間撹拌を行つた
後、40000ｇ、20分間遠心分離後上清を集めた。
次いで得られた上清500mlに50％塩化亜鉛溶液20
mlを加え２時間撹拌後、5000rpm、４℃、５分間
遠心分離して得られた沈殿に10％リン酸二ナトリ
ウム溶液25mlを加え30分間撹拌後、8000rpm、４
℃、20分間遠心分離し上清28mlを得、これを蒸留
水１に３回、２日間透析し凍結乾燥を行い、粉
末試料2.3ｇを得た。これを数回に分けて８％シ
ヨ糖溶液（1M NaClを含む0.025Mリン酸緩衝液
PH8.0）0.2mlに懸濁し10〜20％のシヨ糖密度勾配
層６mlの最上層に加え、40000rpm、17時間４℃
（SW−65−Ti−ローター、ペツクマンL4超遠心
分離機）でシヨ糖密度勾配遠心分離を行つた。そ
の結果最初のタンパク質ピークにのみ一致して目
的とする活性物質が認められた。この活性画分溶
液を集め、その10倍量の希酢酸溶液（PH4.0）に
24時間透析し、凍結乾燥して濃縮する。次いでこ
の濃縮液をデンプンゾーン電気泳動（デンプンブ
ロツク30×1.0×5.0cm、0.1M酢酸緩衝液PH4.0）
装置で４℃、300V、10〜12mA、10時間陰極方向
へ泳動を行い泳動後デンプン層を0.5cm幅に等間
隔に切つて取り出し、各切片を試験管に入れ、
0.15M NaClを含む、0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlで抽出し、タンパク質ならびに各活性
を測定した。その結果、陽極から２番目のタンパ
ク質ピークと一致し目的とする活性が認められ
た。さらにこの活性画分を0.01M酢酸緩衝液（PH
4.0）１で３回２日間透析後の試料溶液1.8mlを
同一緩衝液で平衡化したバイオゲルＰ−200カラ
ム（1.5×75cm）でゲルクロマトグラフイーを行
つた。その結果分子量115000±15000のタンパク
質ピークに一致して目的とする活性物質を得た。
活性画分を凍結乾燥し褐色調白色微粉末2.4mgを
得た。活性画分はタンパク質75重量％、糖質６〜
10重量％、脂質12〜16重量％からなり、更に
UV260nmに核酸と思われる肩がみられた。デイ
スク電気泳動（PH4.3）で陰極側に移動し、等電
点は約8.0±0.4であつた。 Ａ活性は750U／μｇ、Ｂ活性は888／μｇ、Ｃ
活性は0.79EU／μｇであつた。LD50はマウス雄
410μｇ／Kg（体重）、雌360μｇ／Kg（体重）で
あつた。 実施例 22 百日咳相菌東浜株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を実施例16と同様の炭末加半合成固形
培地（37℃、72時間）で培養し得られた菌体10ｇ
（湿重量）を1M−NaCl、4M尿素を含む0.02M
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）100mlに懸濁し、ガラ
スホモジナイザーで４℃、１時間撹拌を行なつた
後40000G20分間遠心分離後上清を集める。得ら
れた上清を氷水中で撹拌しながら冷エタノールを
徐々に加え、終濃度40％とする。氷水中に１時間
放置後０℃5000rpm15分間遠心分離を行い、上清
と沈渣を得る。次いで上清は蒸留水１で２日間
３回透析後濃縮し、さらに0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.0）１で３回２日間透析を行ない、同一緩
衝液で平衡化したカルボキシメチルセフアデツク
スＧ−50カラム（２×20cm）に添加した流速20
ml／hrで溶出分離を行つた。目的とする活性画分
は、0.5M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）で溶出されるタンパク質ピークと一致し
て得られた。そこで、この活性画分を集め濃縮後
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）１で３回２日間
透析し、同一緩衝液にて平衡化した、コンカナバ
リンＡ−セフアロース4B（1.8×15cm）に添加
し、流速18ml／hrで溶出分離を行つた。 0.5M−NaCl及び0.2M−α−メチル−Ｄ−マン
ノシドを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で溶
出されるタンパク質ピークに一致し、目的とする
活性物質を得た。ここで得られた画分を濃縮後
0.5M−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に透析し、同一緩衝液で平衡化した、セフアデツ
クスＧ−75カラム（1.5×80cm）でゲルクロマト
グラフイーを行なつた。その結果、分子量26000
前後に位置するタンパク質ピークに一致して、目
的とする活性画分3.0mgを得た。組成は蛋白質85
重量％、糖質約１重量％、脂質約10重量％からな
り、核酸は含まれない。Ａ活性は250U／μｇ、
Ｂ活性は170U／μｇ、Ｃ活性は0.23EU／μｇで
あり、LD50はマウス雄1043μｇ／Kg（体重）、雌
980μｇ／Kg（体重）である。他方エタノール画
分により得られた沈渣を希酢酸溶液（PH4.0）に
溶解懸濁し、同一溶液で１３回24時間透析後、
凍結乾燥して濃縮する。次いでこの濃縮液を、デ
ンプンゾーン・電気泳動（デンプンブロツク30×
0.8×５cm、0.1M酢酸緩衝液PH4.0）装置で４℃、
300V、10〜12mA、10時間陰極方向へ泳動を行な
い、泳動後、デンプン層を0.5cm幅に等間隔に切
つて取り出し、各切片を試験管に入れ0.15M−
NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液１mlで抽出しタン
パク質ならびに各活性を測定した。その結果陽極
から２番目のタンパク質ピークに一致し目的とす
る活性が認められた。さらにこの活性画分を
0.01M酢酸緩衝液１で３回、２日間透析後の試
料溶液1.8mlを同一緩衝液で平衡化したバイオゲ
ルＰ−200カラム（1.5×75cm）でゲルクロマトグ
ラフイーを行なつた。その結果分子量90000±
10000のタンパク質ピークに一致して目的とする
活性物質２mgを得た。活性画分はタンパク質90重
量％以上、糖質２〜５重量％、UV，260nmに核
酸によると思われる肩が見られた。デイスク電気
泳動（PH4.3）で陰極側に移動し、等電点PHは8.5
±0.5であり、Ａ活性は550U／μｇ、Ｂ活性は
640U／μｇ、Ｃ活性は0.50EU／μｇであり、
LD50はマウス〓520μｇ／Kg（体重）、♀474μ
ｇ／Kg（体重）であつた。 実施例 23 百日咳相菌東浜株を実施例16に従つて炭末加
半合成固形培地（CA培地）で37℃、48時間培養
後菌体をかき取り、菌体を除去したCA培地を凍
結融解し、15000rpm30分間遠心分離し、上清を
得た。この上清10に４℃で50％ポリエチレング
リコール溶液を撹拌しつつ１添加し、１時間放
置後35000ｇで30分間遠沈して沈殿を分取する。
この集めた沈殿に1.0M−NaClを含む0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.0）200mlを加え、テフロンホモジ
ナイザーで懸濁液とし、懸濁液を15000rpm30分
間遠心分離し上清と沈渣に分け、沈渣は1.0M−
NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）60mlで
３回抽出し、この抽出液を上清と混ぜ、この液10
mlを0.2M−リン酸緩衝液（PH8.0）に対し４℃１
晩透析した後、0.2M−リン酸緩衝液（PH8.0）で
平衡化した。デンプンブロツク（長さ50cm、幅10
cm、高さ1.5cm）を用い、４℃で電気泳動した。
デンプン支持体は１cm幅に切り取り、1.0M−
NaClを含む0.05M−リン酸緩衝液（PH8.0）10ml
で各々を抽出した。 その結果、３つの主な蛋白質ピークに分かれ、
目的活性物は陰極側に泳動した。活性画分を集め
濃縮したもの0.2mlを1.0M−NaClを含む0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）の10〜20％蔗糖密度勾配に
重ね、超遠心し得られた目的活性画分を集め濃縮
し、1.0M−NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対して透析後、再び蔗糖密度勾配遠心
し、目的活性画分を集めた。このものを透析後、
凍結乾燥し、白色粉末2.00mgを得た。ゲル過法
による分子量は118000±7500であり化学組成は、
タンパク質約47重量％、糖質約25重量％、脂質約
20重量％でデイスク電気泳動（PH4.3）では陰極
側に泳動された。 Ａ活性は820U／μｇ、Ｂ活性は970U／μｇ、
Ｃ活性は0.68EU／μｇであつた。LD50値はマウ
ス雄279μｇ／Kg、雌204μｇ／Kg。 実施例 24 百日咳相菌3779B株の凍結乾燥保存菌（北里
大学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様
に振盪培養後、菌体分離して、培養上清液20を
得た。この培養上清液に最終濃度が0.02％になる
ようにチメロサールを添加した後50％塩化亜鉛溶
液400mlを加え、一晩４℃で撹拌し、沈殿を析出
させる。遠心分離により沈殿を集め、沈殿物を10
％リン酸二ナトリウム溶液で抽出後、遠心分離に
より上清を集め、0.5M−NaCl含有0.1M−Tris緩
衝液（PH10）で平衡化後、20mlに濃縮しその６ml
を塩化セシウム密度勾配液に積層し、４℃、
50000ｇ、3.5時間遠沈した。密度勾配は0.5M−
NaClを含む0.1M Tris緩衝液（PH10）中に６mlの
塩化セシウム密度1.5、1.3、1.25、および1.2から
なつている。遠心後得られた活性画分を0.5M−
NaCl含有0.1M−Tris緩衝液（PH10）に対して透
析した。更に精製するために上記緩衝液で平衡化
したBio Gel Ｐ−200（２cm×90cm）を用いてゲ
ル過を行つた。 流出は４℃で、15ml／hrの速さで流し、活性画
分を得た。活性画分を凍結乾燥し、淡黄色粉末１
mgを得た。 分子量は、SDS電気泳動パターンより90000±
6000と推定され、化学組成は蛋白質98重量％以上
であり糖質及び脂質は検出されなかかた。デイス
ク電気泳動パターンはPH4.3ゲルで陰極側に泳動
される尖鋭なバンドを認めた。 等電点PHは9.5±0.5であり、アミノ酸組成及び
組成比は第13表に示した。 活性は、Ａ活性960U／μｇ、Ｂ活性770U／μ
ｇ、Ｃ活性1.8EU／μｇでありLD50はマウス〓
242μｇ／Kg、♀175μｇ／Kgであつた。
遠心分離後、沈殿する菌体を得た。得られた菌体
を蒸留水で均一な浮遊液とし、15000rpmで、30
分間遠心分離して洗浄した。この菌体を再び蒸留
水で均一な浮遊液とした後、比濁定量（波長
650nm）で200bil／mlの濃厚菌液とした。 0.5M−NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で希釈して100bil／mlの菌液とし、この菌液10ml
に４℃で超音波（20KHz）を10分間作用して、上
清と菌体とに分離した。この上清を二分し一方
は、0.5M−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で平衡化したセフアロース6B（3.2×90cm）
に他方はCMセルロース（2.0×20cm）に通した。 セフアロース6Bでゲルろ過して得たものは分
子量は180000±20000の位置に溶出する蛋白質ピ
ークに一致して目的活性画分が得られた。この活
性画分は透析後、凍結乾燥し、白色調粉末を0.70
mg得た。化学組成は蛋白質50.3〜60.2重量％、糖
質22〜28重量％、脂質17.5〜22.5重量％で、波長
260nmで核酸と思われる吸収が認められた。デイ
スク電気泳動（PH8.3）においては、わずかに陽
極側に泳動した。Ａ活性は400U／μｇ、Ｂ活性
は280U／μｇ、Ｃ活性は0.45EU／μｇである。
マウスにおける急性毒性値（LD50）は〓807μ
ｇ／Kg、♀694μｇ／Kgである。 一方、あらかじめ0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.0）で、平衡化したCM−セフアロースカラムに
通した画分については、目的物質は吸着され順
次、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）でカラムを洗い0.5M−NaCl含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で溶出した。この活
性画分を集め濃縮し、0.5M−NaCl含む0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で平衡化したセフアロース6B
（3.2×90cm）でゲルろ過を行つた。 その結果、分子量は160000±20000に溶出する
蛋白質ピークに一致して活性画分が得られた。こ
の活性画分は透析後凍結乾燥し、淡黄色調白色粉
末0.28mgを得た。化学組成は、蛋白質56〜61重量
％、糖質15〜19重量％、脂質18〜22重量％で、波
長260nmで核酸と思われる吸収が認められた。デ
イスク電気泳動（PH4.3）においては陰極側に泳
動した。Ａ活性は550U／μｇでＢ活性は470U／
μｇ、Ｃ活性は0.78EU／μｇである。マウスに
おける急性毒性値（LD50）は〓706μｇ／Kg、♀
で612μｇ／Kgである。 実施例 20 百日咳相菌坂入株、バラ百日咳菌17903株気
管支敗血症菌Ｌ−３株の凍結乾燥保存菌を、実施
例４と同様に各々培養後、遠心分離して各々の菌
体を得た。得た菌体は蒸留水で１回洗浄後、再び
蒸留水で均一な浮遊液として比濁定量（波長
650nm）で百日咳相菌は300bil／ml、パラ百日
咳菌は200bil／ml、気管支敗血症菌は、200bil／
mlの濃厚菌液とした。 各菌株について、下記の操作を同様に行つた。
0.5M−NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
各々を希釈して100bil／mlの菌液にし、この菌液
10mlを４℃で超音波処理（20KHz、10分間）して
菌体を破壊した。 超音波処理後、遠心分離（15000rpm30分間）
し、上清と沈渣とに分離した。この上清を二分
し、一方は、0.5M−NaCl含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0）で平衡化したセフアロース6B（3.2×
90cm）に、他方はCMセルロースカラム（2.0×10
cm）に通した。セフアロース6Bでゲルろ過して
得られたものの分子量は百日咳相菌で180000±
30000、パラ百日咳菌で200000±20000、気管支敗
血症菌で200000±30000であつた。各々得られた
活性画分は透析後、凍結乾燥した。百日咳相菌
は白色粉末0.65mgが得られその化学組成は、蛋白
質45〜50重量％、糖質20〜25重量％、脂質23〜28
重量％で波長260nmでの吸収が認められた。Ａ活
性は30U／μｇ、Ｂ活性1.2U／μｇ、Ｃ活性
0.01EU／μｇである。マウスにおける急性毒性
値は〓♀共に2500μｇ／Kg以上である。 パラ百日咳菌は白色粉末0.47mgが得られ、その
化学組成は蛋白質55〜60重量％、糖質18〜23重量
％、脂質20〜25重量％で、波長260nmで核酸と思
われる吸収が認められた。Ａ活性は21U／μｇ、
Ｂ活性は35U／μｇ、Ｃ活性は0.01EU／μｇで
ある。マウスにおける急性毒性値（LD50）は〓で
2500μｇ／Kg、♀で2400μｇ／Kgである。 気管支敗血症菌は淡黄色粉末0.31mgが得られ、
その化学組成は蛋白質50〜55重量％、糖質20〜26
重量％、脂質18〜25重量％で、波長260nmで核酸
と思われる吸収が認められた。 このもののＡ活性は15U／μｇ、Ｂ活性は
0U／μｇ、Ｃ活性は0.02EU／μｇであつた。
LD50はマウス雄1846μｇ／Kg（体重）雌1605μ
ｇ／Kg（体重）であつた。百日咳相菌、パラ百
日咳菌、気管支敗血症菌は共にデイスク電気泳動
（PH8.3）において陽極側にわずかに泳動した。 一方あらかじめ、0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.0）で平衡化したCM−セフアロースカラムに通
した画分については目的物質は吸着され、順次
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.0）でカラムを洗い0.5M−NaClを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で溶出した。この活
性画分を集め濃縮し、0.5M−NaCl含有0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で平衡化したセフアロース6B
（3.2×90cm）でゲルろ過を行つた。その結果、得
られたものの分子量は、百日咳相菌で160000±
30000、パラ百日咳菌で170000±20000、気管支敗
血症菌で190000±20000であつた。 各々得られた活性画分は透析後、凍結乾燥し
た。百日咳相菌からは、淡黄色粉末0.18mgが得
られその化学組成はタンパク質50〜58重量％、糖
質17〜22重量％、脂質20〜26重量％で波長260nm
に核酸によるとおもわれる吸収が認められた。Ａ
活性は45U／μｇ、Ｂ活性は5.2U／μｇ、Ｃ活性
は0.03EU／μｇであつた。LD50はマウス雄2500
μｇ／Kg（体重）以上、雌2500μｇ／Kg（体重）
以上であつた。 パラ百日咳菌からは、淡黄色粉末0.09mgが得ら
れ、その化学組成は、タンパク質55〜65重量％、
糖質12〜18重量％、脂質17〜22重量％で波長260
mmに核酸によるとおもわれる吸収が認められた。
Ａ活性は25U／μｇ、Ｂ活性は94U／μｇ、Ｃ活
性は0.04EU／μｇであつた。LD50はマウス雄
2500μｇ／Kg（体重）以上、雌2500μｇ／Kg（体
重）であつた。 気管支敗血症菌からは、淡黄色粉末0.06mgが得
られその化学組成はタンパク質53〜58重量％、糖
質16〜20重量％、脂質14〜18重量％で、波長
260nmに核酸によるとおもわれる吸収が認められ
た。 Ａ活性は20U／μｇ、Ｂ活性は0U／μｇ、Ｃ
活性は0.08EU／μｇであつた。LD50はマウス雄
2500μｇ／Kg（体重）以上、雌2500μｇ／Kg（体
重）以上であつた。 得られた活性画分は百日咳相菌、パラ百日咳
菌、気管支敗血症菌は共に、デイスク電気泳動
（PH4.3）において、陰極側に泳動した。 実施例 21 百日咳相菌No.41株の凍結乾燥保存菌（北里大
学薬学部微生物学教室提供）を実施例17と同様に
して、炭末加寒天培地で37℃、48時間培養した。
菌体を集め洗浄後、菌体10ｇを２％TritonX−
100，lmM EDTA，0.5M NaClを含む0.1M Tris
−HCl緩衝液（PH8.0）550mlに懸濁し、テフロン
ホモジナイザーを用いて４℃５時間撹拌を行つた
後、40000ｇ、20分間遠心分離後上清を集めた。
次いで得られた上清500mlに50％塩化亜鉛溶液20
mlを加え２時間撹拌後、5000rpm、４℃、５分間
遠心分離して得られた沈殿に10％リン酸二ナトリ
ウム溶液25mlを加え30分間撹拌後、8000rpm、４
℃、20分間遠心分離し上清28mlを得、これを蒸留
水１に３回、２日間透析し凍結乾燥を行い、粉
末試料2.3ｇを得た。これを数回に分けて８％シ
ヨ糖溶液（1M NaClを含む0.025Mリン酸緩衝液
PH8.0）0.2mlに懸濁し10〜20％のシヨ糖密度勾配
層６mlの最上層に加え、40000rpm、17時間４℃
（SW−65−Ti−ローター、ペツクマンL4超遠心
分離機）でシヨ糖密度勾配遠心分離を行つた。そ
の結果最初のタンパク質ピークにのみ一致して目
的とする活性物質が認められた。この活性画分溶
液を集め、その10倍量の希酢酸溶液（PH4.0）に
24時間透析し、凍結乾燥して濃縮する。次いでこ
の濃縮液をデンプンゾーン電気泳動（デンプンブ
ロツク30×1.0×5.0cm、0.1M酢酸緩衝液PH4.0）
装置で４℃、300V、10〜12mA、10時間陰極方向
へ泳動を行い泳動後デンプン層を0.5cm幅に等間
隔に切つて取り出し、各切片を試験管に入れ、
0.15M NaClを含む、0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlで抽出し、タンパク質ならびに各活性
を測定した。その結果、陽極から２番目のタンパ
ク質ピークと一致し目的とする活性が認められ
た。さらにこの活性画分を0.01M酢酸緩衝液（PH
4.0）１で３回２日間透析後の試料溶液1.8mlを
同一緩衝液で平衡化したバイオゲルＰ−200カラ
ム（1.5×75cm）でゲルクロマトグラフイーを行
つた。その結果分子量115000±15000のタンパク
質ピークに一致して目的とする活性物質を得た。
活性画分を凍結乾燥し褐色調白色微粉末2.4mgを
得た。活性画分はタンパク質75重量％、糖質６〜
10重量％、脂質12〜16重量％からなり、更に
UV260nmに核酸と思われる肩がみられた。デイ
スク電気泳動（PH4.3）で陰極側に移動し、等電
点は約8.0±0.4であつた。 Ａ活性は750U／μｇ、Ｂ活性は888／μｇ、Ｃ
活性は0.79EU／μｇであつた。LD50はマウス雄
410μｇ／Kg（体重）、雌360μｇ／Kg（体重）で
あつた。 実施例 22 百日咳相菌東浜株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を実施例16と同様の炭末加半合成固形
培地（37℃、72時間）で培養し得られた菌体10ｇ
（湿重量）を1M−NaCl、4M尿素を含む0.02M
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）100mlに懸濁し、ガラ
スホモジナイザーで４℃、１時間撹拌を行なつた
後40000G20分間遠心分離後上清を集める。得ら
れた上清を氷水中で撹拌しながら冷エタノールを
徐々に加え、終濃度40％とする。氷水中に１時間
放置後０℃5000rpm15分間遠心分離を行い、上清
と沈渣を得る。次いで上清は蒸留水１で２日間
３回透析後濃縮し、さらに0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.0）１で３回２日間透析を行ない、同一緩
衝液で平衡化したカルボキシメチルセフアデツク
スＧ−50カラム（２×20cm）に添加した流速20
ml／hrで溶出分離を行つた。目的とする活性画分
は、0.5M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）で溶出されるタンパク質ピークと一致し
て得られた。そこで、この活性画分を集め濃縮後
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）１で３回２日間
透析し、同一緩衝液にて平衡化した、コンカナバ
リンＡ−セフアロース4B（1.8×15cm）に添加
し、流速18ml／hrで溶出分離を行つた。 0.5M−NaCl及び0.2M−α−メチル−Ｄ−マン
ノシドを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で溶
出されるタンパク質ピークに一致し、目的とする
活性物質を得た。ここで得られた画分を濃縮後
0.5M−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に透析し、同一緩衝液で平衡化した、セフアデツ
クスＧ−75カラム（1.5×80cm）でゲルクロマト
グラフイーを行なつた。その結果、分子量26000
前後に位置するタンパク質ピークに一致して、目
的とする活性画分3.0mgを得た。組成は蛋白質85
重量％、糖質約１重量％、脂質約10重量％からな
り、核酸は含まれない。Ａ活性は250U／μｇ、
Ｂ活性は170U／μｇ、Ｃ活性は0.23EU／μｇで
あり、LD50はマウス雄1043μｇ／Kg（体重）、雌
980μｇ／Kg（体重）である。他方エタノール画
分により得られた沈渣を希酢酸溶液（PH4.0）に
溶解懸濁し、同一溶液で１３回24時間透析後、
凍結乾燥して濃縮する。次いでこの濃縮液を、デ
ンプンゾーン・電気泳動（デンプンブロツク30×
0.8×５cm、0.1M酢酸緩衝液PH4.0）装置で４℃、
300V、10〜12mA、10時間陰極方向へ泳動を行な
い、泳動後、デンプン層を0.5cm幅に等間隔に切
つて取り出し、各切片を試験管に入れ0.15M−
NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液１mlで抽出しタン
パク質ならびに各活性を測定した。その結果陽極
から２番目のタンパク質ピークに一致し目的とす
る活性が認められた。さらにこの活性画分を
0.01M酢酸緩衝液１で３回、２日間透析後の試
料溶液1.8mlを同一緩衝液で平衡化したバイオゲ
ルＰ−200カラム（1.5×75cm）でゲルクロマトグ
ラフイーを行なつた。その結果分子量90000±
10000のタンパク質ピークに一致して目的とする
活性物質２mgを得た。活性画分はタンパク質90重
量％以上、糖質２〜５重量％、UV，260nmに核
酸によると思われる肩が見られた。デイスク電気
泳動（PH4.3）で陰極側に移動し、等電点PHは8.5
±0.5であり、Ａ活性は550U／μｇ、Ｂ活性は
640U／μｇ、Ｃ活性は0.50EU／μｇであり、
LD50はマウス〓520μｇ／Kg（体重）、♀474μ
ｇ／Kg（体重）であつた。 実施例 23 百日咳相菌東浜株を実施例16に従つて炭末加
半合成固形培地（CA培地）で37℃、48時間培養
後菌体をかき取り、菌体を除去したCA培地を凍
結融解し、15000rpm30分間遠心分離し、上清を
得た。この上清10に４℃で50％ポリエチレング
リコール溶液を撹拌しつつ１添加し、１時間放
置後35000ｇで30分間遠沈して沈殿を分取する。
この集めた沈殿に1.0M−NaClを含む0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.0）200mlを加え、テフロンホモジ
ナイザーで懸濁液とし、懸濁液を15000rpm30分
間遠心分離し上清と沈渣に分け、沈渣は1.0M−
NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）60mlで
３回抽出し、この抽出液を上清と混ぜ、この液10
mlを0.2M−リン酸緩衝液（PH8.0）に対し４℃１
晩透析した後、0.2M−リン酸緩衝液（PH8.0）で
平衡化した。デンプンブロツク（長さ50cm、幅10
cm、高さ1.5cm）を用い、４℃で電気泳動した。
デンプン支持体は１cm幅に切り取り、1.0M−
NaClを含む0.05M−リン酸緩衝液（PH8.0）10ml
で各々を抽出した。 その結果、３つの主な蛋白質ピークに分かれ、
目的活性物は陰極側に泳動した。活性画分を集め
濃縮したもの0.2mlを1.0M−NaClを含む0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）の10〜20％蔗糖密度勾配に
重ね、超遠心し得られた目的活性画分を集め濃縮
し、1.0M−NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対して透析後、再び蔗糖密度勾配遠心
し、目的活性画分を集めた。このものを透析後、
凍結乾燥し、白色粉末2.00mgを得た。ゲル過法
による分子量は118000±7500であり化学組成は、
タンパク質約47重量％、糖質約25重量％、脂質約
20重量％でデイスク電気泳動（PH4.3）では陰極
側に泳動された。 Ａ活性は820U／μｇ、Ｂ活性は970U／μｇ、
Ｃ活性は0.68EU／μｇであつた。LD50値はマウ
ス雄279μｇ／Kg、雌204μｇ／Kg。 実施例 24 百日咳相菌3779B株の凍結乾燥保存菌（北里
大学薬学部微生物学教室提供）を実施例４と同様
に振盪培養後、菌体分離して、培養上清液20を
得た。この培養上清液に最終濃度が0.02％になる
ようにチメロサールを添加した後50％塩化亜鉛溶
液400mlを加え、一晩４℃で撹拌し、沈殿を析出
させる。遠心分離により沈殿を集め、沈殿物を10
％リン酸二ナトリウム溶液で抽出後、遠心分離に
より上清を集め、0.5M−NaCl含有0.1M−Tris緩
衝液（PH10）で平衡化後、20mlに濃縮しその６ml
を塩化セシウム密度勾配液に積層し、４℃、
50000ｇ、3.5時間遠沈した。密度勾配は0.5M−
NaClを含む0.1M Tris緩衝液（PH10）中に６mlの
塩化セシウム密度1.5、1.3、1.25、および1.2から
なつている。遠心後得られた活性画分を0.5M−
NaCl含有0.1M−Tris緩衝液（PH10）に対して透
析した。更に精製するために上記緩衝液で平衡化
したBio Gel Ｐ−200（２cm×90cm）を用いてゲ
ル過を行つた。 流出は４℃で、15ml／hrの速さで流し、活性画
分を得た。活性画分を凍結乾燥し、淡黄色粉末１
mgを得た。 分子量は、SDS電気泳動パターンより90000±
6000と推定され、化学組成は蛋白質98重量％以上
であり糖質及び脂質は検出されなかかた。デイス
ク電気泳動パターンはPH4.3ゲルで陰極側に泳動
される尖鋭なバンドを認めた。 等電点PHは9.5±0.5であり、アミノ酸組成及び
組成比は第13表に示した。 活性は、Ａ活性960U／μｇ、Ｂ活性770U／μ
ｇ、Ｃ活性1.8EU／μｇでありLD50はマウス〓
242μｇ／Kg、♀175μｇ／Kgであつた。
【表】
【表】
実施例 25
百日咳相菌東浜株（北里大学薬学部微生物学
教室提供）を炭末加半合成固形培地（37℃、48時
間培養）にて実施例16と同様に培養し、集めた菌
体５ｇ（湿重量）を300mlの蒸留水に懸濁し、30
分間56℃に加温し冷却後チメロサールを最終濃度
0.01％になるように加え、遠心分離（15000rpm
×30分間）して採取した菌体をさらに4M尿素、
1M塩化ナトリウムを含む蒸留水に懸濁し、20K
Hzで５分間超音波装置（トミー精工社製）で菌体
を破壊した。この懸濁液を遠心分離（15000rpm
×30分間）して沈殿を分離した上清液に飽和近傍
まで固体硫安を添加し一昼夜４℃にて撹拌後遠心
分離（10000rpm×30分間）で沈殿部分を集め、
得られた沈殿を4M尿素を含む1M食塩溶液に溶解
し、不溶の残渣はろ過し捨てた後超遠心分離
（105000G1時間、日立製）にて上清液を得た。活
性画分を含む溶液を、５％から20％のしよ糖密度
勾配にかけ、35000回転、16時間超遠沈を行なつ
た。得られた画分を透析後、凍結乾燥し褐色調微
粉末1.1mgを得た。 ゲルろ過法による分子量は95000±15000であつ
た。化学組成は、蛋白質約60重量％、糖質５±２
重量％、脂質約20重量％で核酸も検出された。 なお、PH4.3のデイスク電気泳動で陰極側にバ
ンドが認められる。マウスによる急性毒性は
LD50 〓279μｇ／Kg、♀204μｇ／Kg、Ａ活性
は400U／μｇ、Ｂ活性は542U／μｇ、Ｃ活性は
0.38EU／μｇであつた。 実施例 26 実施例４により得られた精製標品（以下IAPと
略称する）500μｇを含む0.16M−塩化ナトリウ
ム溶液10mlを完全フロインドアジユバント10mlと
混和しエマルジヨンを作製する。その１mlをウサ
ギの足蹠および皮内に注射し免疫した。注射は１
週間に１回、計３回行い、最終注射後10日目に抗
IAP抗体の産生が認められたウサギを頚動脈より
全採血し抗IAP抗体ウサギ血清とした。 IAP−セフアロース4Bカラム（1.2×８cm）（注
１参照）を0.15M−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4）を流して十分洗浄したのち上記で得
られた、抗IAP抗体ウサギ血清を加え流速20ml／
hrで流し、含まれる抗体を免疫吸着体に結合さ
せ、次いで同一緩衝液を流して結合した抗体以外
の血清タンパク質を十分洗い流す。次いで3M−
NaSCNを含む0.15M−NaCl溶液で吸着体に結合
した抗IAP抗体を溶出し、抗体を含む画分を集め
10-3M-アンモニア水（PH8.3）に対し、SCN-イ
オンが検出されなくなるまで透析し、凍結乾燥を
行い、精製抗IAP抗体150mgを得た。 抗IAP抗体−セフアロース4BによるIAPの精製 抗IAP抗体−セフアロース4Bカラム（1.8×13
cm）（注２参照）に、培養上清２（6N−HClで
PH7.0に調整）を流速20ml／hrで流し次いで0.1M
−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で充
分に洗浄（約200ml）後、2mMのEDTA−0.15M
−NaClを含む0.1Mグリシン−HCl緩衝液（PH
3.0）を流速60ml／hrで溶出し、溶出液は直ちに
1Mグリシン緩衝液（PH11.5）で中和した。活性
画分を集め透析（５、３回、48hr）し、凍結乾
燥して淡渇色粉末1.3mgを得た。 デイスク電気泳動は、PH4.3ゲルで単一のバン
ドを与え、組成は蛋白質98重量％以上で糖質、脂
質及び核酸は検出されなかつた。またゲル過に
よる分子量では55000±5000と推定された。アミ
ノ酸組成は第14表にあげる通りであつた。 Ａ活性957U／μｇ、Ｂ活性1050U／μｇおよ
びＣ活性1.18EU／μｇであり、マウス静注での
急性毒性（LD50）は〓241μｇ／Kg（体重）、♀
165μｇ／Kg（体重）である。 （注１） IAP−セフアロース4B調整法 CNBr−活性化セフアロース4B（フアルマシア
フアインケミカルス社製）４ｇを10-3N HCl1
を用い、グラスフイルター上で洗浄、膨潤を繰り
返す。別に実施例４によつて精製されたIAP20mg
を、0.5M NaClを含む0.1M炭酸水素ナトリウム
緩衝液（PH8.3）20mlに溶解したものを調整して
おき、ゲルの洗浄膨潤が完了したら直ちにIAP溶
液を加え、室温（20〜25℃）で２時間よく振盪し
混合する。反応後、グラスフイルターでゲルを吸
引過し、同一緩衝液で数回洗浄し、余分なIAP
を除き、次に1Mエタノールアミン（PH9.0）溶液
50mlを加えて室温で２時間よく振盪、混合する。
反応後、上記緩衝液500mlで数回に分けて洗浄
し、次に0.5M NaClを含む0.1M酢酸緩衝液（PH
4.0）500mlで数回に分けて洗浄（この操作を緩衝
液、PHを変えて３回繰り返す）、最終的に使用緩
衝液１で洗浄し使用する。（保存は４℃〜８
℃） （注２） 抗IAP抗体−セフアロース4B調整法 CNBr−活性化セフアロース4B（フアルマシア
フアインケミカルス社製）10ｇを10-3N HCl2
を用い、グラスフイルター上で洗浄、膨潤を繰り
返す。別に精製抗IAP抗体100mgを0.5M NaClを
含む0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液（PH8.3）50
mlに溶解したものを調整しておき、ゲルの洗浄膨
潤が完了したら直ちに抗IAP抗体溶液を加え室温
（22〜25℃）で２時間、よく振盪混合する。反応
後、グラスフイルターでゲルを吸引過し、同一
緩衝液で数回洗浄し、余分な抗IAP抗体を除き、
次に1Mモノエタノールアミン（PH9.0）溶液100
mlを加えて、室温で２時間振盪混合する。反応
後、上記緩衝液で数回洗浄し、次に0.5M NaClを
含む0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）１で洗浄（この
操作を緩衝液、PHを変えて３回繰り返す）、最終
的に使用緩衝液１で洗浄し使用する。（保存は
４℃〜８℃）
教室提供）を炭末加半合成固形培地（37℃、48時
間培養）にて実施例16と同様に培養し、集めた菌
体５ｇ（湿重量）を300mlの蒸留水に懸濁し、30
分間56℃に加温し冷却後チメロサールを最終濃度
0.01％になるように加え、遠心分離（15000rpm
×30分間）して採取した菌体をさらに4M尿素、
1M塩化ナトリウムを含む蒸留水に懸濁し、20K
Hzで５分間超音波装置（トミー精工社製）で菌体
を破壊した。この懸濁液を遠心分離（15000rpm
×30分間）して沈殿を分離した上清液に飽和近傍
まで固体硫安を添加し一昼夜４℃にて撹拌後遠心
分離（10000rpm×30分間）で沈殿部分を集め、
得られた沈殿を4M尿素を含む1M食塩溶液に溶解
し、不溶の残渣はろ過し捨てた後超遠心分離
（105000G1時間、日立製）にて上清液を得た。活
性画分を含む溶液を、５％から20％のしよ糖密度
勾配にかけ、35000回転、16時間超遠沈を行なつ
た。得られた画分を透析後、凍結乾燥し褐色調微
粉末1.1mgを得た。 ゲルろ過法による分子量は95000±15000であつ
た。化学組成は、蛋白質約60重量％、糖質５±２
重量％、脂質約20重量％で核酸も検出された。 なお、PH4.3のデイスク電気泳動で陰極側にバ
ンドが認められる。マウスによる急性毒性は
LD50 〓279μｇ／Kg、♀204μｇ／Kg、Ａ活性
は400U／μｇ、Ｂ活性は542U／μｇ、Ｃ活性は
0.38EU／μｇであつた。 実施例 26 実施例４により得られた精製標品（以下IAPと
略称する）500μｇを含む0.16M−塩化ナトリウ
ム溶液10mlを完全フロインドアジユバント10mlと
混和しエマルジヨンを作製する。その１mlをウサ
ギの足蹠および皮内に注射し免疫した。注射は１
週間に１回、計３回行い、最終注射後10日目に抗
IAP抗体の産生が認められたウサギを頚動脈より
全採血し抗IAP抗体ウサギ血清とした。 IAP−セフアロース4Bカラム（1.2×８cm）（注
１参照）を0.15M−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4）を流して十分洗浄したのち上記で得
られた、抗IAP抗体ウサギ血清を加え流速20ml／
hrで流し、含まれる抗体を免疫吸着体に結合さ
せ、次いで同一緩衝液を流して結合した抗体以外
の血清タンパク質を十分洗い流す。次いで3M−
NaSCNを含む0.15M−NaCl溶液で吸着体に結合
した抗IAP抗体を溶出し、抗体を含む画分を集め
10-3M-アンモニア水（PH8.3）に対し、SCN-イ
オンが検出されなくなるまで透析し、凍結乾燥を
行い、精製抗IAP抗体150mgを得た。 抗IAP抗体−セフアロース4BによるIAPの精製 抗IAP抗体−セフアロース4Bカラム（1.8×13
cm）（注２参照）に、培養上清２（6N−HClで
PH7.0に調整）を流速20ml／hrで流し次いで0.1M
−NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で充
分に洗浄（約200ml）後、2mMのEDTA−0.15M
−NaClを含む0.1Mグリシン−HCl緩衝液（PH
3.0）を流速60ml／hrで溶出し、溶出液は直ちに
1Mグリシン緩衝液（PH11.5）で中和した。活性
画分を集め透析（５、３回、48hr）し、凍結乾
燥して淡渇色粉末1.3mgを得た。 デイスク電気泳動は、PH4.3ゲルで単一のバン
ドを与え、組成は蛋白質98重量％以上で糖質、脂
質及び核酸は検出されなかつた。またゲル過に
よる分子量では55000±5000と推定された。アミ
ノ酸組成は第14表にあげる通りであつた。 Ａ活性957U／μｇ、Ｂ活性1050U／μｇおよ
びＣ活性1.18EU／μｇであり、マウス静注での
急性毒性（LD50）は〓241μｇ／Kg（体重）、♀
165μｇ／Kg（体重）である。 （注１） IAP−セフアロース4B調整法 CNBr−活性化セフアロース4B（フアルマシア
フアインケミカルス社製）４ｇを10-3N HCl1
を用い、グラスフイルター上で洗浄、膨潤を繰り
返す。別に実施例４によつて精製されたIAP20mg
を、0.5M NaClを含む0.1M炭酸水素ナトリウム
緩衝液（PH8.3）20mlに溶解したものを調整して
おき、ゲルの洗浄膨潤が完了したら直ちにIAP溶
液を加え、室温（20〜25℃）で２時間よく振盪し
混合する。反応後、グラスフイルターでゲルを吸
引過し、同一緩衝液で数回洗浄し、余分なIAP
を除き、次に1Mエタノールアミン（PH9.0）溶液
50mlを加えて室温で２時間よく振盪、混合する。
反応後、上記緩衝液500mlで数回に分けて洗浄
し、次に0.5M NaClを含む0.1M酢酸緩衝液（PH
4.0）500mlで数回に分けて洗浄（この操作を緩衝
液、PHを変えて３回繰り返す）、最終的に使用緩
衝液１で洗浄し使用する。（保存は４℃〜８
℃） （注２） 抗IAP抗体−セフアロース4B調整法 CNBr−活性化セフアロース4B（フアルマシア
フアインケミカルス社製）10ｇを10-3N HCl2
を用い、グラスフイルター上で洗浄、膨潤を繰り
返す。別に精製抗IAP抗体100mgを0.5M NaClを
含む0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液（PH8.3）50
mlに溶解したものを調整しておき、ゲルの洗浄膨
潤が完了したら直ちに抗IAP抗体溶液を加え室温
（22〜25℃）で２時間、よく振盪混合する。反応
後、グラスフイルターでゲルを吸引過し、同一
緩衝液で数回洗浄し、余分な抗IAP抗体を除き、
次に1Mモノエタノールアミン（PH9.0）溶液100
mlを加えて、室温で２時間振盪混合する。反応
後、上記緩衝液で数回洗浄し、次に0.5M NaClを
含む0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）１で洗浄（この
操作を緩衝液、PHを変えて３回繰り返す）、最終
的に使用緩衝液１で洗浄し使用する。（保存は
４℃〜８℃）
【表】
【表】
第１〜２図は、本発明実施例４の実験説明図で
ある。
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ゲルろ過法による分子量が10000〜250000、
Lowry法による蛋白質が40重量％以上、フエノー
ル・硫酸法による糖質が25重量％以下、マーシユ
ーワインスタイン法による脂質が25重量％以下、
蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ／
100μＭ）はアスパラギン酸：7.5〜7.9、スレオ
ニン：6.8〜7.6、セリン：5.9〜7.6、グルタミン
酸：9.7〜10.8、プロリン：5.5〜6.4、グリシン：
8.7〜9.6、アラニン：9.1〜10.8、シスチン／２：
1.5〜2.6、バリン：5.6〜6.6、メチオニン：2.5〜
3.3、イソロイシン：3.6〜4.1、ロイシン：7.5〜
8.0、チロシン：5.1〜6.6、フエニルアラニン：
3.3〜3.9、リジン：3.1〜4.4、ヒスチジン：1.4〜
1.6及びアルギニン：6.1〜6.6で、ポリアクリルア
ミドゲル（ポリアクリルアミド濃度：7.5％、PH
4.3）電気泳動に於いて陰極側に単一なバンドを
与え、且つ等電点がPH４〜10を示すインシユリン
分泌増強活性、免疫増強活性及び交感神経β受容
体遮断活性を有する蛋白質様活性画分。 ２ ボルデテラ（Bordetella）属に属する微生物
を培養し、培養物を溶解度法、クロマトグラフイ
ー法、分子篩法、電気泳動法及び生物学的方法の
一つ又はこれらの組合せの分別精製法で処理する
することを特徴とするゲルろ過法による分子量が
10000〜250000、Lowry法による蛋白質が40重量
％以上、フエノール・硫酸法による糖質が25重量
％以下、マーシユーワインスタイン法による脂質
が25重量％以下、蛋白質成分のアミノ酸組成及び
組成比（μＭ／100μＭ）はアスパラギン酸：7.5
〜7.9、スレオニン：6.8〜7.6、セリン：5.9〜
7.6、グルタミン酸：9.7〜10.8、プロリン：5.5〜
6.4、グリシン：8.7〜9.6、アラニン：9.1〜
10.8、シスチン／２：1.5〜2.6、バリン：5.6〜
6.6、メチオニン：2.5〜3.3、イソロイシン：3.6
〜4.1、ロイシン：7.5〜8.0、チロシン：5.1〜
6.6、フエニルアラニン：3.3〜3.9、リジン：3.1
〜4.4、ヒスチジン：1.4〜1.6及びアルギニン：
6.1〜6.6で、ポリアクリルアミドゲル（ポリアク
リルアミド濃度：7.5％、PH4.3）電気泳動に於い
て陰極側に単一なバンドを与え、且つ等電点がPH
４〜10を示すインシユリン分泌増強活性、免疫増
強活性及び交感神経β受容体遮断活性を有する蛋
白質様活性画分の製法。 ３ ゲルろ過法による分子量が10000〜250000、
Lowry法による蛋白質が40重量％以上、フエノー
ル・硫酸法による糖質が25重量％以下、マーシユ
ーワインスタイン法による脂質が25重量％以下、
蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ／
100μＭ）はアスパラギン酸：7.5〜7.9、スレオ
ニン：6.8〜7.6、セリン：5.9〜7.6、グルタミン
酸：9.7〜10.8、プロリン：5.5〜6.4、グリシン：
8.7〜9.6アラニン：9.1〜10.8、シスチン／２：
1.5〜2.6、バリン：5.6〜6.6、メチオニン：2.5〜
3.3、イソロイシン：3.6〜4.1、ロイシン：7.5〜
8.0、チロシン：5.1〜6.6、フエニルアラニン：
3.3〜3.9、リジン：3.1〜4.4、ヒスチジン：1.4〜
1.6及びアルギニン：6.1〜6.6で、ポリアクリルア
ミドゲル（ポリアクリルアミド濃度：7.5％、PH
4.3）電気泳動に於いて陰極側に単一なバンドを
与え、且つ等電点がPH４〜10を示すインシユリン
分泌増強活性、免疫増強活性及び交感神経β受容
体遮断活性を有する蛋白質様活性画分を有効成分
とする糖尿病治療乃至予防薬。 ４ ゲルろ過法による分子量が10000〜250000、
Lowry法による蛋白質が40重量％以上、フエノー
ル・硫酸法による糖質が25重量％以下、マーシユ
ーワインスタイン法による脂質が25重量％以下、
蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ／
100μＭ）はアスパラギン酸：7.5〜7.9、スレオ
ニン：6.8〜7.6、セリン：5.9〜7.6、グルタミン
酸：9.7〜10.8、プロリン：5.5〜6.4、グリシン：
8.7〜9.6、アラニン：9.1〜10.8、シスチン／２：
1.5〜2.6、バリン：5.6〜6.6、メチオニン：2.5〜
3.3、イソロイシン：3.6〜4.1、ロイシン：7.5〜
8.0、チロシン：5.1〜6.6、フエニルアラニン：
3.3〜3.9、リジン：3.1〜4.4、ヒスチジン：1.4〜
1.6及びアルギニン：6.1〜6.6で、ポリアクリルア
ミドゲル（ポリアクリルアミド濃度：7.5％、PH
4.3）電気泳動に於いて陰極側に単一なバンドを
与え、且つ等電点がPH４〜10を示すインシユリン
分泌増強活性、免疫増強活性及び交感神経β受容
体遮断活性を有する蛋白質様活性画分を有効成分
とする免疫調節剤。 ５ ゲルろ過法による分子量が10000〜250000、
Lowry法による蛋白質が40重量％以上、フエノー
ル・硫酸法により糖質が25重量％以下、マーシユ
ーワインスタイン法による脂質が25重量％以下、
蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ／
100μＭ）はアスパラギン酸：7.5〜7.9、スレオ
ニン：6.8〜7.6、セリン：5.9〜7.6、グルタミン
酸：9.7〜10.8、プロリン：5.5〜6.4、グリシン：
8.7〜9.6、アラニン：9.1〜10.8、シスチン／２：
1.5〜2.6、バリン：5.6〜6.6、メチオニン：2.5〜
3.3、イソロイシン：3.6〜4.1、ロイシン：7.5〜
8.0、チロシン：5.1〜6.6、フエニルアラニン：
3.3〜3.9、リジン：3.1〜4.4、ヒスチジン：1.4〜
1.6及びアルギニン：6.1〜6.6で、ポリアクリルア
ミドゲル（ポリアクリルアミド濃度：7.5％、PH
4.3）電気泳動に於いて陰極側に単一なバンドを
与え、且つ等電点がPH４〜10を示すインシユリン
分泌増強活性、免疫増強活性及び交感神経β受容
体遮断活性を有する蛋白質様活性画分を有効成分
とする交感神経β受容体遮断剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4964177A JPS53136592A (en) | 1977-04-28 | 1977-04-28 | Production of biologically active fraction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4964177A JPS53136592A (en) | 1977-04-28 | 1977-04-28 | Production of biologically active fraction |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53136592A JPS53136592A (en) | 1978-11-29 |
| JPS628440B2 true JPS628440B2 (ja) | 1987-02-23 |
Family
ID=12836827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4964177A Granted JPS53136592A (en) | 1977-04-28 | 1977-04-28 | Production of biologically active fraction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS53136592A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5883629A (ja) * | 1981-11-10 | 1983-05-19 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | アジュバント |
| JPS59157029A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-09-06 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 動物用・住血原虫病不活化ワクチン |
-
1977
- 1977-04-28 JP JP4964177A patent/JPS53136592A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS53136592A (en) | 1978-11-29 |
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