JPS6285854A - 酵素電極の再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産呈上■且朋立互 本発明は、共有結合法によって酵素を固定化した固定化
酵素膜を下地電極の検出端に装着し、酵素の作用による
物質変化を下地電極で検知するようにした酵素電極の再
生方法に関する。

・　の　′Ｉ−び−口が解ン　しようとする、ｊｒ！占
酵素電極は、酵素を水不溶性膜状担体に固定化し、酵素
の繰り返し使用を可能とした固定化酵素膜と、下地電極
とを組み合わせたもので、臨床化学分析、食品分析等の
分野で実用化されているものである。

この場合、担体への酵素の固定化方法としては、酵素を
担体に物理的に封止する包括法や物理吸着させる方法よ
りも、担体表面に架橋用官能基を導入し、この官能基と
酵素蛋白の末端基とを反応させることによって固定化す
る共有結合法の方が、酵素の脱落を防いで酵素の長期安
定性を高めるために好ましい。従って、酵素電極の固定
化酵素膜としては、従来より膜状担体に酵素を共有結合
法によ−って固定化したものが多用されている。

上述したように、酵素電極は酵素を繰り返し使用できる
ものであるが、それにも限界があり、実際には電極の長
期使用によって酵素活性は低下してしまう。この場合、
酵素活性の低下原因としては、酵素の高次構造の安定性
が次第に失なわれることによる酵素の失、活の他、担体
からの酵素の脱落、熱変化やｐＨ変化による酵素の変性
、活性阻害物質との接触、蛋白質の付着、微生物等によ
る酵素の分解などの多くのものが考えられる。

従来このように酵素活性が低下した場合、酵素膜を使い
捨てにして新しいものと交換することが行なわれている
。しかし、このような方法を採用した場合、酵素電極の
ランニングコストが高くつく上、交換用の酵素膜の保存
が面倒であり、しかも酵素膜を交換する際に酵素膜の下
地電極への装着状態が微妙に変り、電極特性が変化する
という問題が生じる。

このため、酵素活性が低下した時に酵素膜を交換するこ
となく、酵素膜を再生して再使用することが望まれてい
るが、従来酵素電極を再生することについては全く研究
されていない。

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、酵素電極の
酵素活性が低下した場合に電極を容易に再生することが
できる方法を提供することを目的とする。

５　占をｎ：するための　　　び 即ち、本発明は上記目的を達成するため、共有結合法に
よって酵素を固定化した固定化酵素膜を下地電極の検出
端に装着した酵素電極の上記固定化酵素膜装着部を酵素
液に浸漬して、酵素液中の酵素を固定化酵素膜に固定化
するようにしたものである。

この場合、共有結合法とは、担体表面に酵素蛋白の末端
基と温和な条件で反応する架橋用官能基を導入し、この
担体表面の官能基と酵素蛋白の末端基との反応によって
酵素を担体に固定化する方法を指し、例えば担体表面に
アルキルアルデヒド基を導入し、シンフ塩基反応により
固定化する方法や、カルボキシル基等を導入し、ペプチ
ド結合によって固定化する方法などが挙げられるが、本
発明によれば酵素が失活したり担体表面から脱落するこ
と等によって酵素膜が劣化した場合、酵素電極の酵素膜
装着検出端を酵素液に浸漬することにより、担体表面の
架橋用官能基と酵素液中の酵素蛋白末端基とが反応して
担体に酵素が新たに固定化され、これによって電極が再
生されるものである。

ここで、酵素液に酵素電極の酵素膜装着部を浸漬する場
合の方法、条件等に特に限定はないが、常温において浸
漬し、更に酵素液を撹拌することが好ましい。なお、浸
漬時間に制限はなく、酵素膜の種類、酵素の種類等に応
じて種々変更し得る。

また、本発明方法は、共有結合法による酵素膜を下地電
極の検出端に装着した酵素電極であればいずれのものに
対しても良好に適用されるが、特に共有結合法によって
酵素を固定化した微粉末担体を該酵素の蛋白分子が通過
可能な分画分子量を有する保持膜に担持させてなる固定
化酵素膜を用いた酵素電極に好適に使用され、この酵素
電極を効果的に再生し得る。即ち、このような酵素電極
においては、微粉末担体表面に官能基を導入し、この担
体表面に酵素を固定化しているので、官能基が通常の電
極使用条件で極めて安定であると共に、保持膜を酵素の
蛋白分子が通過し得るため、酵素活性が低下した場合、
電極の検出端を酵素液に浸漬することにより、酵素蛋白
分子が保持膜を通過して担体の位置に到達し、この担体
に固定化され、酵素膜が容易に再生されるものである。

なお、上述した酵素電極は、共有結合法によって酵素を
固定化した微粉末担体を該酵素の蛋白分子が通過可能な
分画分子量を有する保持膜に担持させた酵素膜を用いた
ものであり、この場合微粉末担体の材質、性状は特に制
限されないが、微粉末ガラスを用いることが特に好まし
く、例えばミクロ孔径が４５０人程度の多孔質ガラスを
粒径３〜４μｍの微粉末に調整したもの等を好適に使用
し得る。また、上記保持膜の材質、性状も特に限定され
ない。本酵素電極において、保持膜は微粉末担体を膜状
に展開する目的を持つと共に、試料液と直接接触する外
膜としても機能するものであり、従って、保持膜として
は測定時に基質が通過し得ると共に、再生時に酵素蛋白
分子が通過し得るものであればいずれのものでも使用し
得る。例えば、酵素としてグルコースオキシターゼを用
いる場合、保持膜としてはアセチルセルロース、再生セ
ルロース、混合セルロース等からなるミクロ孔径が１〜
１０μ程度の親水性濾過膜を好適に用いることができる
。なお、保持膜に微粉末担体を担持させる方法に制限は
ない。また、微粉末担体は保持膜表面に均一に膜状に分
散させることが好ましい。更に、保持膜のミクロ孔径を
適宜選択することにより、電極感度を調整することがで
きる。

次に、実施例により本発明を具体的に示す。

大嵐炭 第１図は本発明方法の実施に用いる酵素電極の一例を示
す。このグルコース酵素電極１において、２は酸素電極
（下地電極）、３は酸素電極２の検知極、４は酸素電極
２の先端部に配設されたガス透過膜、５は内部液である
。また６は第２図に示すように、ミクロ孔径が１〜１０
μｍ程度の親水性濾過膜（保持膜）７表面に共有結合法
によってグルコースオキシターゼを固定化した微粉末多
孔性ガラス（微粉末担体）８を担持させてなる固定化酵
素膜である。この酵素膜６は、検知極３の先端面とほぼ
同形状に形成されており、検知極３先端面に対向した状
態で、かつその酵素担持側面がガス通過膜４に当接した
状態で酸素電極２先端部に配置されていると共に、この
酵素膜５を覆ってポリプロピレン製ネット９が酸素電極
２に取り付けられ、これにより酵素膜５がネット９によ
って酸素電極２先端部に装着、固定されている。

なお、上記酵素膜６は、具体的には下記方法で製造した
。

即ち、まずミクロ孔径が約４５０人の多孔性ガラスをボ
ールミルで粉砕した後、粒径３〜４μｍオーダーのもの
を分級して採取し、これを担体８とする。次いで、上記
微粉末ガラス８を純水中に懸濁させると共に、この懸濁
液をアセチルセルロース、再生セルロース、混合セルロ
ース等からなるミクロ孔径１１００ｐｐ度の親水性濾過
膜７に吸引炉遇させ、膜７表面部の微細孔に粉末ガラス
８を充填することにより、膜７表面に粉末ガラス７を膜
状に均一に分散し、担持させる。次に、ガラス８を担持
させた保持膜７をシランカップリング剤であるＴ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランで処理してこれにアルキ
ルアミノ基を導入した後、更にグルタルアルデヒドで処
理してアルキルアルデヒド基を導入する。更に、保持膜
７を常温においてグルコースオキシターゼを溶かしたｐ
Ｈ７，０のりん酸緩衝液に浸漬することにより、架橋用
官能基と酵素末端のアミノ基とがシッフ塩基生成反応を
行ない、これによって酵素が固定化され、酵素膜６が得
られるものである。なお、この場合微粉末ガラス８に上
記と同様の方法で予め酵素を固定化した後、このガラス
８を同様の方法でが過膜７に担持させるようにしても差
支えない。

次に、上記酵素電極ｌを用いて下記方法により再生実験
を行なった。即ち、電極１を０．ＩＮＨＣ７！水溶液、
０．１ＮＮａＯＨ水溶液及び約９０℃の水にそれぞれ１
時間浸漬して酵素膜６をそれぞれ劣化させる。次に、劣
化して１００ｐｐｍ、　２００ｐｐＩ１１のグルコース
標準液に対して殆ど出力を示さなくなった電極１の先端
部を０．０１モルのりん酸系緩衝液（ｐｌ＋７．０　）
　５０ｍＡ中にグリコースオキシターゼ（１４０ユニツ
ト／■）を１０■溶かした溶液中に常温で浸漬し、溶液
を１時間攪拌して再生した後、電極を純水でよく洗浄し
、再び１１００ｐｐ。

２００ｐｐｍのグルコース標ｔ＄液に浸漬して出力を９
周べた。

結果を第３図（ＨＣＩ溶液に浸漬した場合）、第４図（
ＮａＯＨ溶液に浸漬した場合）及び第５図（熱水に浸漬
した場合）に示す。図中ａば劣化前、ｂは劣化後、Ｃは
再生後の出力を表わすが、再生後の出力は劣化前の出力
とほぼ同じレベルであり、本発明方法によれば電極ｌが
良好に再生されることが認められた。

なお、再生した電極ｌの出力の経時安定性を調べたとこ
ろ、１ケ月以上安定であることが確認され、上記再生方
法が実用的に有効であることが確認された。

光凱■涜来 以上説明したように、本発明方法によれば、共有結合法
による酵素膜を用いた酵素電極の酵素活性が低下した場
合にこれを簡単に再生できるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施に用いる酵素電極の一例を示す部
分断面図、第２図は同電極の酵素膜を示す断面図、第３
図、第４図及び第５図はそれぞれ本発明方法により電極
を処理した結果を示すグラフである。 １・・・酵素電極、２・・・酸素電極（下地電極）、６
・・・固定化酵素膜。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、共有結合法によって酵素を固定化した固定化酵素膜
   を下地電極の検出端に装着した酵素電極の上記固定化酵
   素膜装着部を酵素液に浸漬して、酵素液中の酵素を固定
   化酵素膜に固定化するようにしたことを特徴とする酵素
   電極の再生方法。