JPS6285853A - 酵素電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童朶上卯■貝公団 本発明は、固定化酵素膜を下地電極の検出端に装着し、
酵素の作用による物質変化を下地電極で検知するように
した酵素電極に関し、更に詳述すると、酵素活性の寿命
が長く、しかも酵素活性が低下した場合に容易に再生す
ることができる酵素電極に関する。

Ｕの技術及び発呼か算火（イーよ、−髪とする問題２弘
酵素電極は、酵素を水不溶性膜状担体に固定化し、酵素
の繰り返し使用を可能とした固定化酵素膜と、下地電極
とを組み合わせたもので、臨床化学分析、食品分析等の
分野で実用化されているものである。

この場合、担体への酵素の固定化方法としては、酵素を
担体に物理的に封止する包括法や、物理吸着させる方法
よりも、担体表面に架橋用官能基を導入し、この官能基
と酵素蛋白の末端基とを反応させることによって固定化
する共有結合法の方が、酵素の脱落を防いで酵素の長期
安定性を高めるために好ましい。従って、酵素電極の固
定化酵素膜としては、従来より膜状担体に酵素を共有結
合法によって固定化したものが多用されれている。

上述したように、酵素電極は酵素を繰り返し使用できる
ものであるが、それにも限界があり、実際には電極の長
期使用によって酵素活性は低下してしまう。この場合、
酵素活性の低下原因としては、酵素の高次構造の安定性
が次第に失なわれることによる酵素の失活の他、担体か
らの酵素の脱落、熱変化やｐｌ＋変化による酵素の変性
、活性阻害物質との接触、蛋白質の付着、微生物等によ
る酵素の分解などの多くのものが考えられる。

また、このように酵素活性が低下した場合、酵素膜を使
い捨てにして新しいものと交換することが従来行なわれ
ているが、このような方法を採用した場合、酵素電極の
ランニングコストが高くつく上、交換用の酵素膜の保存
が面倒であり、しかも酵素膜を交換する際に酵素膜の下
地電極への装着状態が微妙に変り、雪掻特性が変化する
という問題が生じる。

このため、酵素活性の寿命が可及的に長く、しかも酵素
活性が低下した時に酵素膜を交換することなく、酵素膜
を再生して再使用することのできる酵素電極が望まれる
が、従来酵素電極を再生することについての有効な提案
は何らなされていないのが実情であった。

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、酵素活性が
長時間安定である上、酵素活性が低下した場合に劣化し
た酵素膜を容易に再生することができる酵素電極を提供
することを目的とする。

朋可脱禾１すＵヌａひ知■月λ叉仏作四即ち、本発明ら
は、上記目的を達成するため共有結合法による酵素膜を
用いた電極を再生することにつき種々検討を行ない、共
有結合法による酵素膜が下記（ａ）〜（Ｃ）の条件を満
たせば、この酵素膜が劣化した場合に電極の検出端を酵
素液に浸漬するだけで、担体表面の架橋用官能基と酵素
の末端基とを反応させて酵素を担体に固定化することが
でき、酵素膜を再生できることに想到した。

（ａ）担体表面の架橋用官能基そのものが脱離したり、
陰画されるようなことがあれば、再生は不可能となる。

従って、担体に導入される官能基は通常の酵素電極の使
用条件で充分に安定していること。

（ｂ）担体上の架橋用官能基と酵素の末端基との反応は
特別の条件を必要とせず、水中或いは緩衝液中において
室温に近い温和な条件で進行すること。

（ｃ）電極を酵素液に浸漬した時、酵素蛋白分子が担体
の架橋用官能基部位に容易に到達すること。

しかしながら、膜状担体に共有結合法によって酵素を固
定化した通常の酵素膜は上記条件を充分満足しないため
、更に検討を行なった結果、共有結合法によって酵素を
固定化したガラス等の微粉末担体を酵素の蛋白分子が通
過可能な分画分子量を存する保持膜に担持させることに
より、上記各条件を満たし、しかも酵素が長時間安定な
酵素膜が得られること、従ってこの酵素膜を用いること
により、酵素寿命が長く、しかも検出端を酵素液に浸漬
するだけで簡単に再生し得る電極が得られることを知見
し、本発明をなすに至ったものである。

従って、本発明は、固定化酵素膜を下地電極の検出端に
装着した酵素電極において、上記固定化酵素膜として、
共有結合法によって酵素を固定化した微粉末担体を該酵
素の蛋白分子が通過可能な分画分子量を有する保持膜に
担持させてなるものを用いたことを特徴とする酵素電極
を提供することを目的とする。

本発明酵素電極においては、微粉末担体表面に官能基を
導入し、この担体表面に酵素を固定化しているので、有
効表面積が大きく、酵素゛活性の寿命が非常に長い。ま
た官能基が通常の電極使用条件で安定あると共に、保持
膜を酵素の蛋白分子が通過し得るため、酵素活性が低下
した場合、電極の検出端を酵素液に浸漬することにより
、酵素蛋白分子が保持膜を通過して担体の位置に到達し
、この担体に固定化され、酵素膜が容易に再生されるも
のである。

以下、本発明につき更に詳しく説明する。

本発明の酵素電極は、上述したように、共有結合法によ
って酵素を固定化した微粉末担体を該酵素の蛋白分子が
通過可能な分画分子量を有する保持膜に担持させた酵素
膜を用いたものであり、この場合微粉末担体の材質、性
状は特に制限されないが、微粉末ガラスを用いることが
特に好ましく、例えばミクロ孔径が４５０人程度の多孔
質ガラスを粒径３〜４μｍの微粉末に調製したもの等を
好適に使用し得る。なお、本発明において共有結合法と
は、担体表面に酵素蛋白の末端基と温和な条件で反応す
る架橋用官能基を導入し、この担体表面の官能基と酵素
蛋白の末端基との反応によって酵素を担体に固定化する
方法を指し、例えば担体表面にアルキルアルデヒド基を
導入し、シッフ塩基反応により固定化する方法や、カル
ボキシル基等を導入し、ペプチド結合によって固定化す
る方法などが挙げられる。

また、上記保持膜の材質、性状も特に限定されない。本
発明において、保持膜は微粉末担体を膜状に展開する目
的を持つと共に、試料液と直接接触する外膜としても機
能するものであり、従って保持膜としては測定時に基質
が通過し得ると共に、再生時に酵素蛋白分子が通過し得
るものであればいずれのものでも使用し得る。例えば酵
素としてグルコースオキシターゼを用いる場合、保持膜
としてはアセチルセルロース、再生セルロース、混合セ
ルロース等からなるミクロ孔径が１〜１０μｍ程度の親
水性？Ｐ　ｉＵ　ＩＩ々を好適に用いることができる。

なお、保持膜に微粉末担体を保持させる方法に制限はな
い。また、微粉末組体は保持膜表面に均一に膜状に分散
させることが好ましい。更に、保持膜のミクロ孔径を適
宜選択することにより、電極感度を調整することができ
る。

次に、実施例により本発明を具体的に示す。

」Ｍ 第１図は本発明の一実施例に係るグルコース酵素電極１
を示すもので、図中２は酸素電極（下地電極）、３は酸
素電極２の検知極、４は酸素電極２の先端部に配設され
たガス透過膜、５は内部液である。また、６は第２図に
示すように、ミクロ孔径が１〜１０μｍ程度の親水性が
過膜（保持膜）７表面に共有結合法によってグルコース
オキシターゼを固定化した微粉末多孔性ガラス（微粉末
担体）８を担持させてなる固定化酵素膜である。この酵
素膜６は、検知極３の先端面とほぼ同形状に形成されて
おり、検知極３先端面に対狗した状態で、かつその担体
８担持側面がガス透過膜４に当接した状態で酸素電極２
先端部に配置されていると共に、この酵素膜６を覆って
ポリプロピレン製ネット９が酸素電極２に取り付けられ
、これにより酵素膜６がネット９によって酸素電極２先
端部に挿着、固定されている。

なお、上記酵素膜６は、具体的には下記方法で製造した
。

即ち、まずミクロ孔径が約４５０人の多孔性ガラスをボ
ールミルで粉砕した後、粒径３〜４μｍオーダーのもの
を分級して採取し、これを担体８とする。次いで、上記
微粉末ガラス８を純水中に懸濁させると共に、この）懸
濁液をアセチルセルロース、再生セルロース、混合セル
ロース等からなるミクロ孔径１〜１０μｍ程度の親水性
′Ｕ５過膜７に吸引濾過させ、膜７表面部の微細孔に粉
末ガラス８を充填することにより、膜７表面に粉末ガラ
ス７を膜状に均一に分散し、担持させる。次に、ガラス
８を担持させた保持膜７をシランカップリング剤である
γ−アミノプロピルトリエトキシシランで処理してこれ
にアルキルアミノ基を導入した後、更にグルタルアルデ
ヒドで処理してアルキルアルデヒド基を導入する。更に
、保持膜７を常／詰においてグルコースオキシターゼを
）容かしたｐＨ７，０のリン酸緩衝液に浸漬することに
より、架橋用官能基と酵素末端のアミノ基とがシッフ塩
基生成反応を行ない、これによって酵素が固定化され、
酵素膜６が得られるものである。なお、この場合微粉末
ガラス８に上記と同様の方法で予め酵素を固定化した後
、このガラス８を同様の方法でｌ濾過膜７に担持させる
ようにしても差支えない。

上記実施例の酵素電極１においては、ガラス粉末８の表
面に官能基を導入し、このガラス粉末８表面に酵素を固
定化しているので、酵素活性の寿命が非常に長い。また
、官能基が酸、アルカリ、１００℃程度の高温に対して
安定で、従って通常の使用条件では極めて安定であると
共に、保持膜７をグルコースオキシターゼ酵素蛋白分子
が通過し得るため、酵素膜６の酵素活性が低下した場合
、酵素電極１の先端部をグルコースオキシターゼ酵素液
に常温で浸漬することにより、酵素蛋白分子が保持膜７
を通過して保持膜７上面のガラス微粉末８の位置に到達
し、このガラス粉末８に固定化されて酵素膜が容易に再
生される。しかも、酵素膜６を検知極３の先端面とほぼ
同形状に形成し、検知極３の先端面に対向して配設した
ので、極めて良好に再生が行なわれるものである。

なお、上記実施例においては保持膜７としてミクロ孔径
１〜１０μｍ程度の濾過膜を用いたが、これは再生する
際にグルコースオキシターゼ酵素蛋白分子の微粉末担体
８への到達を可能ならしめるためである。しかし、通常
測定時は、この保持膜７の機能は基質であるグルコース
を通過させることにあるので、それ以外の蛋白等の巨大
分子は通過しない方が酵素膜６を保護する上で好ましい
。

そこで、この酵素膜６の外部にミクロ孔径が０、Ｏ１μ
ｍ程度のガード膜を通常取り付けておいて、電極１の再
生操作を行なう時だけこのガード膜を取り外すようにす
ることも可能である。

次に、上記酵素電極１の直線応答性、再生可能性、活性
寿命をそれぞれ調べた。

（１）直線応答性 ミクロ孔径が０．０１５μｍ及び１２．０μｍの２種類
のが過膜７を用いて電極１をそれぞれ作成し、直線応答
性を調べた。結果を第３図（ミクロ孔径０．０１５μｍ
の場合）及び第４図（ミクロ孔径″ｉ２．０μｍの場合
）に示す。

（２）再生可能性 電極１を０．ＩＮ）ＩＩ水溶液、０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈ水溶液及び約９０℃の水にそれぞれ１時間浸漬して酵
素膜６をそれぞれ劣化させる。次に、劣化して１００ｐ
ｐｍ　、２００ｐｐｍのグルコース標準液に対して殆ど
出力を示さなくなった電極１の先端部を０．０１モルの
りん酸系緩衝液（ｐＨ７，０）　５０　ｍ７！中にグル
コースオキシクーゼ（１４０ユニツト／■）を１０ｍｇ
溶かした溶液中に常温で浸漬し、溶液を１時間攪拌して
再生した後、電極を純水でよく洗浄し、再び１００ｐｐ
ｍ　、　２００ｐｐｍのグルコース標準液に浸漬して出
力を調べた。

結果を第５図（ＩＩ（ｌ溶液に浸漬した場合）、第６図
（Ｎ　ａ　ＯＩＩｌ溶液浸漬した場合）及び第７図（熱
水に浸漬した場合）に示す。図中ａは劣化前、ｂは劣化
後、Ｃは再生後の出力を表わすが、再生後の出力は劣化
前の出力とほぼ同じレベルであり、電極１が良好に再生
されていることが認められる。

なお、再生した電極１の出力の経時安定性を調べたとこ
ろ１ケ月以上安定であることが確認され、上記再生操作
が実用的に有効であることが確認された。

（３）活性寿命 上記電極１を常温において常時、約３００ｐｐｍ濃度の
グルコース溶液中に浸漬して保持し、随時１００ｐｐｍ
　、　　２００ｐｐｍのグルコース標準液を用いてその
出力を調べたところ、第８図に示すように１年に亘って
酵素活性は殆ど低下せず、本発明酵素膜の活性寿命が極
めて長いことが認められた。

発明の詳細 な説明したように、本発明の酵素電極は、酵素活性の寿
命が長く、しかも酵素活性が低下した場合に容易に再生
することができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に係る酵素電極を示す部分断
面図、第２図は同側の酵素膜を示す断面図、第３図及び
第４図はそれぞれ本発明電極の直線応答性を示すグラフ
、第５図、第６図及び第７図はそれぞれ本発明電極を再
生処理した結果を示すグラフ、第８図は本発明電極の出
力の経時変化を示すグラフである。 ■・・・酵素電極、２・・・酸素電橋（下地電極）、６
・・・固定化酵素膜、７・・・保持膜、８微粉末世体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固定化酵素膜を下地電極の検出端に装着した酵素電
   極において、上記固定化酵素膜として、共有結合法によ
   って酵素を固定化した微粉末担体を該酵素の蛋白分子が
   通過可能な分画分子量を有する保持膜に担持させてなる
   ものを用いたことを特徴とする酵素電極。 ２、微粉末担体が微粉末多孔性ガラスである特許請求の
   範囲第１項記載の酵素電極。