JPS62920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はタンパク固定プラスチツクの製法に関
するものである。 生物学的に活性なタンパク、例えば酵素，抗
体，ホルモンなどを不溶性の担体に固定させたも
のは、その酵素的活性、免疫反応的活性等を利用
するために有用であり、そのためタンパク固定担
体の製造のための種々の方法が公表されている。
例えばハロゲン化シアンで活性化した不溶性多糖
類の担体に共有結合によりタンパクを固定する方
法、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド類を架
橋剤としてタンパクを固定する方法、担体の表面
にタンパクを単に物理的に吸着させる方法などが
ある。これらの方法のうち化学的反応によるもの
はCNBrのような危険な試薬を用いる必要があつ
たり、反応操作が複雑で手数がかかる欠点があ
る。また、吸着による方法は操作は簡単である
が、固定されるタンパクの量が充分でなかつた
り、均一に固定できない欠点があり、できたもの
の活性を利用する際バラツキが大きく信頼性が低
く実用的ではなかつた（特公昭45―38543号，特
公昭49―28031号，特公昭51―12712号、特開昭53
―29923号，USP3553310号，USP3646346号各公
報参照）。そこで本発明者は、種々研究の結果、
簡単な操作で均一かつ安定なタンパク固定プラス
チツクを製造する方法を開発した。 本発明は、操作的にはラウリル硫酸塩の存在下
でタンパクとプラスチツク類を接触させるという
吸着法と同程度の簡単なものでよい。 プラスチツク類としては試験管などの材料に用
いられているような合成高分子化合物のものを意
味し、例えばポリエチレン，ポリスチレン，ポリ
プロピレン，シリコンゴム等及びそれらとアクリ
ル酸との共重合体などが適しており、その他にも
前記特開昭53―29923号公報の第５頁にも多くの
例示があるが、ナイロン，ポリカーボネート，ガ
ラスは適さない。この不溶性担体の形状はチユー
ブ状，ビーズ状、シート状またはフイルム状，繊
維状等目的に応じて適宜選ぶことができる。なか
でも試験管の先端を着脱できるようにしたもの
（特開昭53―29923号図面参照）は使用に便利であ
る。 タンパクとしては種々の酵素，抗体，ホルモン
等を挙げることができ、未精製状態または精製し
たものを用いる。タンパクの種類は本発明の性質
上特別な限定が必要ではなくそれぞれ目的に応じ
て選択使用すればよく、分子の大きさがあまり小
さなものは適さないこともあり、一般的には数万
以上の分子量のものが適すと考えられるが、通常
の技術者であれば簡単な予備実験で適否を決定で
きるであろう。この例としては前記特公昭51―
12712号公報第５欄にも記載のあるような蛋白質
分解酵素，脂肪分解酵素，澱粉分解酵素等の消化
系の加水分解酵素その他の分解酵素のような酵素
類があり、一方特開昭53―29923号公報第６頁に
記載のあるような抗体、すなわち各種ステロイド
ホルモン，ペプチドホルモンに対する抗体等各種
の抗体が使用可能である。抗体は抗原を動物に感
作して採血する常法によつて得た抗血清のままで
もよく、硫安による塩析またはアフイニテイクロ
マトグラフイなど常法により精製したものを用い
てもよい。 固定化に際してはラウリル硫酸塩、例えばラウ
リル硫酸ナトリウムおよびタンパクを適当な緩衝
液に溶かしてプラスチツク類と接触させればよ
い。ラウリル硫酸ナトリウムの適当な濃度はタン
パクの種類、精製度合および希釈程度により差が
あるが、一般的には0.001〜0.05％（W/V）好ま
しくは0.003〜0.01％ということができる。接触
させる時の温度は、タンパクを扱うことから加熱
することは好ましくない通常の室温で行なうのが
便利でもあり、良い結果が得られ、その際数時間
乃至10数時間を要するのが普通である。なお、ラ
ウリル硫酸ナトリウムの存在下にタンパクとプラ
スチツクを接触させるとは、三者を同時に加える
ことは勿論、予めプラスチツクをラウリル硫酸ナ
トリウムで処理し、洗浄しまたは洗浄なしに次い
でタンパクと接触させることも含めており、いず
れでも目的は達成できるが、後の実験例では明ら
かとなるように、予めプラスチツクを処理した後
タンパクを接触させるよりも、三者を同時（ラウ
リル硫酸ナトリウムとタンパクの混合液をプラス
チツクに加える）に接触させる方が良い結果が得
られる。予めプラスチツクをラウリル硫酸ナトリ
ウムで処理するときは、このものの濃度はかなり
広い範囲で使用できるがむしろやや濃い方がよ
く、0.01％（W/V）以上0.1％程度が適当であ
り、1.0％でも可能である。タンパク固定プラス
チツクは必要があればポリビニルアルコール溶液
等の安定化剤に浸して被膜を形成させるか或は形
成させることなしに減圧乾燥して保存してもよ
い。 次に抗体をタンパクの例にしてタンパク固定プ
ラスチツクの製造法を示し、その固定化状態をラ
ジオイムノアツセイにより検討した結果を示す
が、本発明はこれらの例によつて限定されるもの
ではない。 ポリエチレンチユーブはエチレン90％とアクリ
ル酸10％の共重合体からなる容量1.1mlの先端部
分を用い、タンパク固定後は筒型の部分と結合し
て使用した。 タンパク固定プラスチツク製造の操作は次のＡ
法またはＢ法により、ラジオイムノアツセイ
（RIA）は法，法または法により行なつ
た。 Ａ法 ａ プラスチツクチユーブを蒸留水で洗浄（30分
間） ｂ 抗体及びラウリル硫酸ナトリウム溶液に接触
（対照は抗体のみ） ｃ 蒸留水で洗浄（５分間×４回） ｄ １％ポリビニルアルコール溶液に接触（30
分） ｅ 減圧下乾燥 Ｂ法 ａ プラスチツクチユーブを蒸留水で洗浄（30分
間） ｂ ラウリル硫酸ナトリウム溶液に接触（30分
間） ｃ 蒸留水で洗浄（５分間×４回） ｄ 抗体溶液に接触（２時間） ｅ 蒸留水で洗浄（５分間×４回） ｆ １％ポリビニルアルコール溶液に接触（30分
間） ｇ 減圧下乾燥 法（RIA） ａ 抗体固定プラスチツクチユーブに標準物質
（緩衝液に溶解）を加える（５μｌ）。 ｂ 標識抗原（緩衝液に溶解）を加える（1000μ
ｌ）。 ｃ 放置して反応（室温2.5時間） ｄ 内容液を除去 ｅ 生理食塩水でチユーブ内を洗浄（1.5ml×１
回） ｆ チユーブの放射能量をガンマ・カウンターで
測定 法（RIA）（サンドイツチ法） ａ 抗体固定プラスチツクチユーブに標準物質
0.05Mリン酸緩衝液に溶解）を加える（100μ
ｌ）。 ｂ 0.05Mリン酸緩衝液（0.5％BSA含有）を加
える（400μｌ）。 ｃ 振盪反応（室温，４時間） ｄ 内容液を除去 ｅ 生理食塩水でチユーブ内を洗浄（1.5ml×１
回） ｆ 標識抗体（0.05Mリン酸緩衝液（0.5％BSA
含有）に溶解）を加える（500μｌ）。 ｇ 振盪反応（室温，24時間） ｈ 内容液を除去 ｉ 生理食塩水でチユーブ内を洗浄（1.5ml×１
回） ｊ チユーブの放射能量をガンマ・カウンターで
測定 法（RIA） ａ 抗体固定プラスチツクチユーブに標識抗原溶
液を加える（１ml）。 ｂ 放置して反応（室温，１日） ｃ 内容液を除去 ｄ 生理食塩水でチユーブ内を洗浄（１ml×１
回） ｅ チユーブの放射能量をガンマ・カウンターで
測定 例 １ Ａ法によりポリエチレンチユーブにコルチゾー
ル抗体を固定し、このときの0.003％ラウリル硫
酸ナトリウムの存在による効果を検討した。抗体
はコルチゾール―６α―ヘキサクシネート・
BSAに対する家兎抗血清を硫安で塩析したγＧ
分画を0.001Mリン酸緩衝液（PH6.4）に溶解して
用いた。RIAは法により行ない標準物質を加え
ないときのカウント（Bo）と総カウント（Ｔ）
の比を求めた。標識抗原は６α―カルボキシメチ
ルチオコルチゾール・ヒスタミン−¹²⁵I（約３万
dpm）を用いた。

【表】 この表に見られるように、ラウリル硫酸ナトリ
ウムの存在下抗体とチユーブを接触させた方に標
識抗原が多く結合しており、このことはチユーブ
に抗体も多く固定していることを意味する。ま
た、バラツキも小さく本発明の効果が明らかであ
る。 例 ２ Ａ法によりポリエチレンチユーブにTSH抗体
を固定し、ラウリル硫酸ナトリウムの効果を法
のRIAで検討した。抗体は家兎抗ヒトTSH血清を
用い、固定に要した接触時間は２時間である。 結果は図面に示す通りであるが、B₃₂₀は標準ヒ
トTSH（Carbio Chem.製）を320μＵ／ml0.1ml
加えたときの測定カウントでありBoは標準物質
なしのときのカウント（非特異的結合量）であ
り、Ｔは各チユーブに加えた¹²⁵I―ヒトTSH抗体
（家兎抗ヒトTSH血清をCNBr活性化セフアロー
ス4Bを用いたアフイニテイクロマトグラフイに
より精製し、これをクロラミンＴ法で¹²⁵I標識し
たもの）のカウントである。 この図にみられるように、抗血清の希釈程度に
よりラウリル硫酸ナトリウムの最適濃度には幾分
の差がある。ただし、その濃度も0.1％になると
効果がみられなくなる。 例 ３ 例２と同じ条件でラウリル硫酸ナトリウムと抗
血清を別にして加え、その順序による効果の差を
検討した。

【表】 これらの間には顕著な差は認められないが、抗
血清を最後に加える例ではややバラツキが大き
い。 例 ４ プラスチツクをラウリル硫酸ソーダ溶液で前処
理し、洗浄した後抗血清を接触させる方法（Ｂ
法）とＡ法を比較した。チユーブはポリエチレン
製で、抗体はTSH抗血清の0.001Mリン酸緩衝液
溶液を用い、RIAは法により行い、標識抗原は
¹²⁵I標識ヒトTSHを用いた（各群５例）

【表】 この結果から、前処理によるＢ法はＡ法より劣
るが効果が認められる。 例 ６ 抗体として家兎抗ヒトTSH血清を用い、これ
をポリエチレンチユーブにＡ法により固定し法
によりRIAを行ないラウリル硫酸ナトリウムの効
果を検討した。各群５例。

【表】 ラウリル硫酸ナトリウムの存在によりバウンド
の％は高く、バラツキは小さい。 例 ７ Ａ法によりポリスチレンチユーブ，ポリプロピ
レンチユーブ及びシリコーン片にTSH抗体を固
定して法によりその効果を検討した（条件等は
例２と同じ）。いずれも数倍の抗体が固定したこ
とが認められバラツキも約１／３になつた。これらの チユーブは、内面を吸着に適すように加工するこ
とにより多くのタンパクを固定できると考えられ
る。 例 ８ 例７と同様にＡ法でTSH抗体を固定し、法
で効果を確認することにより、次の界面活性剤
（濃度0.01％）について検討したが、いずれにも
効果が認められなかつた。 ソジウム・オレエート（陰イオン性） ドテシル・トリメチル・アンモニウム・クロリ
ド（陽イオン性） ジメチルアルキルベタイン（アノンBF）（両性
イオン性） ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエー
ト（Tween80）（非イオン性）

【図面の簡単な説明】

図面はラウリル硫酸ナトリウムの濃度とB/Tの
関係を図示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ラウリル硫酸塩の存在下でタンパクとプラス
   チツク類を接触させることを特徴とするタンパク
   固定プラスチツクの製法。