JPH02142478A - Ｆｏｋ１制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、遺伝子工学試薬として有用な制限酵素及び修
飾酵素に関し、更に詳細にはＦＯｋ　ｌ制限酵素及びｐ
ｏｋ　ｌ修飾酵素の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

Ｆｏｋ　ｌ制限・修飾＃、素は、１９８１年に発見され
生化学的研究がなされてきた。Ｆｏｋ　ｌ制限・修飾酵
素は、ＤＮＡを切断する活性を有するＦｏｋ　ｌ制限酵
素とＦＯｋ　ｌ制限酵素による切断よりＤＮＡｔ−保護
する修飾＃素により構成される。

Ｆｏｋ　ｌ制限酵素は、…型制限酵素としてＦｉ特異な
性質を有し、ＤＮＡ塩基配列中二回転対称構５′ 造を有しない５塩基からなる配列（ＧＧＡＴＧ　”　）
を認識し、その認識配列の３′側９塩基離れた位置を、
４塩基からなる５゛突出末端を生成するように切断する
酵素である。認識配列から離れた特定の位置を切断する
性質を利用して、−本領ＤＮＡの特異的切断への応用も
試みられ、その有用性が高まっている。

一方、Ｆｏｋ　ｌ修飾酵素は、Ｆｏｋ　ｌ制限酵素の上
記認識配列をメチル化することにより、ｐＯｋｌ制限酵
素による切断を保護する機能を有する酵素であるが、今
までＫその酵素化学的な性質は明らかにされていない。

ＦＯｋ　ｌ修飾酵素と種々の制限＃索を用いた遺伝子解
析法が可能であり、その有用性が高まっている。これら
Ｆｏｋ　ｌ制限酵素及び修飾酵素の有用性が確認される
に至り、その有用な製造方法の開発が望まれていた。

従来から知られているＦｏｋ　ｌ制限酵素の製造方法と
しては、椙崎らの方法がある。福崎らは、７ラボバクテ
リウム　オケアノコイテス（Ｆｌａ−ｖｏｂａｃｔｅｒ
ｌｕｍ　０ｋ８ａｎＯｋＯ１ｔ８８　）　　［以下Ｆｏ
ｋ菌と略記する〕より回収する製造方法を確立している
。当該方法はジーン（Ｇｅｎθ）第１６巻、第７５頁（
１９８１年）に記載されている。Ｆｏｋｌ修＃酵素の製
造方法については、いまだ詳細な確立した方法の報告は
ない。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、Ｆｏｋ菌から得られるＦｏｋ　ｌ制限酵
素、修飾酵素の宮ｉ′は少なく、また操作も煩雑でろり
、両酵素を大量に得ることは困難であつ九。一方、これ
ら遺伝子の単離及び該遺伝子１８々のベクターに結合し
てクローニングする方法についてはいまだ明らかにされ
ていない。

本発明の目的は、Ｆｏｋ　ｌ制限酵素及び修飾酵素の工
業的製造に適したＦｏｋ　ｌ制限・修飾系遺伝子を含む
プラスミドを導入した新規微生物、特に大腸菌の創製及
びそれを用いたＦｏｋ　ｌ制限酵素及び修飾酵素の製造
方法を提供することＫろる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＦｏｋ　ｌ
制限・修飾系Ｉ！＃素遺伝子に関する。ＦｏｋＩ制限・
修飾酵素遺伝子にはＤＮＡを切断する活性を有するＦｏ
ｋ　ｌ制限＃素をコードする遺伝子と、Ｆｏｋ　ｌ制限
酵素による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素をコード
する遺伝子を含んでいる。

なお、本明細書において、制限・修飾系酵素遺伝子とは
、制限及び修飾の両酵素遺伝子を持つ遺伝子と、その各
個別の遺伝子との両者を統合した意味の用語である。換
言すれば、制限及び／又は修飾酵素遺伝子を意味する。

これら遺伝子は、単独あるいは複合体の形で利用できる
。

また本発明の第２の発明は、Ｆｏｋ　ｌ制限酵素及び修
飾酵素の製造方法に関する発明でろって、Ｆｏｋ　ｌ制
限酵素遺伝子及び修飾酵素遺伝子が組込まれたプラスミ
ドを保有する大腸菌を培養し、培養物よシＦｏｋ　ｌ制
限酵素及び修飾酵素を採取することを特徴とする。

更に、本発明の第３の発明は、Ｆｏｋｌ修飾酵素の製造
方法に関する発明であって、ＦＯｋｌ修飾酵素遺伝子が
組込まれたプラスミドを保有する大腸菌を培養し、培養
物よりＦｏｋ　ｌ修飾酵素を採取することを特徴とする
。

本発明者らは、Ｆｏｋ菌よりＦｏｋ　ｌ制限・修飾酵素
遺伝子全領域を含む４．５ｋｂ　ＤＮＡ全クローニング
することに成功し、更にこのＤＮＡ断片全体ろるいは一
部全含むプラスミドｔ−導入した微生物、特に大腸菌を
培養することにより菌体中に著量のＦｏｋ　ｌ制限酵素
及び／あるいは修飾酵素が高濃度で蓄積することを見出
し、本発明を完成した。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明に係る新規微生物、例えば大腸菌に次に例示する
工程によシ得ることができる。

１）ＤＮＡ供与体であるＦｏｋ　閑から染色体ＤＮＡを
抽出し、制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片を回収する。

２）コスミドベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部
位に１）で得られたＤＮＡ断片を結合させる。

３）２）で得たＤＮＡをラムダファージにパッケージン
グし、得られたファージ粒子を大腸菌に感染させ形質導
入体を得、目的のＤＮＡを含有するライブラリーを形成
し、対応する修飾酵素遺伝子を含有するクローンを単離
する。

リ　制限酵素遺伝子は細胞染色体内のその対応する修飾
メチラーゼ遺伝子の近傍に存在し、２つの遺伝子は、ク
ローニング実験中は一緒に結合して残っていることが推
定される。コスミドベクターは５０〜５０　ｋｌ）にも
わたる大きなりＮＡ断片を組込むことが可能であるので
、５）で得られたクローンのＤＮＡ断片上に制限酵素遺
伝子が同時に存在することは十分可能性がある。そこで
、３）で得られたクローンの制限酵素活性を解析し、制
限・修飾酵素遺伝子が同時に組込まれたクローンを選択
する。

５）４）で得た組換え体プラスミドＤＮＡを取出し、目
的の断片を切出し、これを発現ベクタープラスミドに結
合させる。

６）５）で得たＦｏｋ　ｌ制限・修飾酵素遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を結合させた発現ベクタープラスミドを宿主
に導入し、形質転換体を得る。

上記ＤＮＡ供与体であるＦＯｋ菌ＤＮＡは培養液よシ菌
体を回収し、それよシ抽出する。抽出、精製、制限酵素
による切断等は、公知の方法を用いることができ、当該
の詳細は、トーツス（Ｔｈｏｍａｓ　）　　ほか著プロ
セデュアス　インヌクレイツク　アシツズ　リサーチ（
Ｐｒｏｃｅａｕτｅ８ｉｎ　Ｎｕａｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）第５５５頁、ノ１−パー　ア
ンド　ｏ　−（Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ　）　　
出版（１９６６年）に記載されている。

−万、コスミドベクターの開裂も同様の方法で行うこと
ができる。

コスミドベクターとしては公知のものが使用できるが、
例えばｐＨＣ７９などが挙げられる。

次にＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用いてベクターＤＮＡの
開裂部位に上述のＤＮＡ断片ｆｔｉ込ませる力５、その
手段自体は公知の方法によるものでｌ）、ベクターＤＮ
Ａのａ類及び制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が
選択される。

次いで、染色体ＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを′イ
ン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）　　でラムダファー
ジにパッケージングし、ファージ粒子を調製する。当該
方法の詳細はマニアテイス（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ　）　
　ほか編、モレキュラー　クローニングア　ラボラトリ
−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｔｏｎｉｎｇ　ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）第２９５〜
５０７頁、コールドスプリング／Ｓ−ノ（−ラボラトリ
−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂａｒｂ（＋ｒ　ｌ４ｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　）出版（１９８２年）に記載されてい
る。

次いで、７ア一ジ粒子を宿主大腸菌に感染させ導入させ
るが、宿主大腸菌としては野生株、変異株のいずれも使
用できる。

この様にして、目的のＤＮＡＭ片を宿主に導入させ、コ
スミドベクターの特性、例えばｐＨＣ７９のＢａｍＨ１
部位にクローニングする場合にはアンピシリン耐性、テ
トラサイクリン感受性コロニーを選択することによりコ
スミドライブラリーを作製することができる。

こうして得られたＦＯｋ菌染色体ＤＮＡのライブラリー
から、目的とする制限・修飾系酵素遺伝子ｔ−組込んだ
クローンの選択は以下のように公知の方法を用いて行う
。すなわち修飾酵素遺伝子に対応する制限酵素遺伝子の
認識配列中の（もしそのような配列がクローン中に存在
するとすれば）それら自身のＤＮＡをメチル化するであ
ろう修飾遺伝子をクローンが含有している事実を利用す
る。そのようなりローンは、それ故対応する制限酵素に
よるイン　ビトロでの消化に抵抗するであろう。それ故
、これらクローンの制限酵素消化によりメチラーゼをコ
ードしたクローンが選択的に残存するでろろう。染色体
ＤＮＡのライブラリーよりプラスミドを調製し、Ｆｏｋ
　ｌ制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡで大腸菌を形
質転換し、抗生物質プレートでの培養により再び形質転
換コロニーを得る。これらのコロニーのいくつかを選び
とり、そのＤＮＡを修飾及び／又は制限酵素遺伝子の存
在について分析する。この様にして解析した結果、制限
・修飾酵素両遺伝子を同時に組込んだプラスミド（ｐＦ
ｏｋｃｏｓ　１６　）　ｆｃ得た。このプラスミドをＨ
ｌｎａＨｌで消化しプラスミドベクターに組込み、大腸
菌を形質転換し、制限・修飾酵素両遺伝子を同時に組込
んだ最小の長さを有するプラスミド（ｐＦｏｋＭＲ５，
２ａ　）を得た。更に解析した結果、このプラスミド上
の４．５１ｉｔ）の領域に両遺伝子がコードされること
を明らかにした。

この４．５　ｋｌ）の全塩基配列を解析し念結果第１図
に示すような塩基配列が明らかになった。

Ｆｏｋ　ｌ修飾酵素は第１図に示す塩基番号６２〜２０
０１にコードされており、またＦｏｋ　ｌ制限酵素は、
同じ（２０７０〜３８１８にコードされている。

プラスミドに組込まれｆｃＦｏｋｌ制限酵素遺伝子を導
入した大腸菌がＦｏｋ　ｌ制限酵素蛋白を生産している
か否かを調べる手段としては、次のようなイン　ビボ（
ｉｎ　ｖｌｖｏ　）及び／又はインビトロの方法により
調べることができる。インビボでの制限酵素活性は、組
換え体大腸菌にピルレフトファージを感染させ、その感
染効率を調べる。対照として組換え体プラスミドを保持
しない宿主大腸菌を用いれば、制限酵素遺伝子を組込ん
だプラスミドを保持する菌ではファージＤＮＡがイン　
ビボで切断され、その感染効率は低下する。ピルレフト
ファージとしては例えばラムダ　ジ−ティー　ラムダ　
シー（λｇｔ。

λＣ）を用いることができる。一方、イン　ビトロでの
制限＃素活性は試験するクローンを培養し、その培養物
を破砕し超遠心分離を行い残渣を除去した上清を用い、
緩衝液［１０ｍＭ）リスＨＣ１（ｐＨ−７，５）−７ｍ
Ｍ　Ｍｇ、Ｃ１２−６０ｍＭＮａＣｌ　−７ｍＭ　２−
メルカプトエタノール−１０ｔチウシ血清アルブミン］
中、５７℃で反応を行いアガロースゲル電気泳動によｐ
解析することができる。

また、メチラーゼを生産しているか否かを調べる手段と
しては、組換え体大腸菌より調製した染色体ＤＮＡある
いは組換え体ＤＮＡがＦｏｋＩ制限酵素により切断され
るか否かを検定することにより解析できる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。

実施例１ ｆＩＩ　　Ｆｏｋ菌染色体ＤＮＡの調製フラボバクテリ
ウム　オケアノコイテスＩＦｏ１２５５６株をＬ培地（
バクトドリプトン１ｏｙ／ｌ、酵母エキス５　ｆ　／　
ｔ　、　ＮａＣ１５ｔ７ｔ、グルコース１り７１％ｐＨ
７，４）　５００−中、５７ｃで培養し遠心して集菌す
る。１０縦の２５％　シヨ糖−α０５Ｍ　　トリスＨＣ
１（ｐＨａＯ）液に菌体を懸濁し、リゾチーム１０■を
２−〇ＣＬ２５Ｍ　　）リスＨＣ１（ｐＨａＯ）液に溶
かしたものと、５−の（Ｌ２ＭＥＤＴＡ浴液を加えかく
はんし、２０℃で１時間静置する。８０−のα１５　Ｍ
　ＮａＣ１−α０２Ｍ　トリスＨＣｊ　（ｐＨａ　Ｏ）
　−１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶ａｔ加えかくはんし、次に１０
ｍの５％ＳＤＳ溶液を加えてかくはんする。２０■／ｆ
ｎｔのプロテイネース（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　）　Ｋ
　溶ＷをＱ、５ｔＲｔ刀口えてかくはんし、５７℃で１
時間静置する。等容量のフェノール・クロロホルム（ｊ
　：　１　）混液を加え、３０分分間中かにかくはんを
続けた後、　　３，０００　ｒｐｍで遠心し５．水層と
フェノール層を分ｍする。以下、この操作を７エノール
処理という。水層を透析チューブにとジ、０、＋５ＭＮ
ａＣ１−０、０２Ｍ　　ト　リ　ス　ＨＣＬ　　（ｐＨ
ａ　Ｏ）　−１ｍＭ　ＥＤＴ、Ａに対して透析した後、
９０℃１５分間加熱しＤＮａｓｅ活性を不活化させた１
％ＲＮａ日θ浴ｇをａｌ−カロえかくはんし、５７℃で
２時間静置する。フェノール処理を行い水層を回収する
。これ全透析チューブにとり、ＴＥ溶ｆｆ［ＣＬＯＩＭ
　　）！Ｊス）（Ｃ２（ｐＨａ０）−Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　〕に対して透析し、次の工程に用いた。

＋２１　　コスミドライブラリーの作製上記ｆｉｌで得
られたＦｏｋ菌染色体ＤＮＡ１００μＶ　を檀々の酵素
量の制限酵素５ａｕ５Ａ１で最適条件（ｊＯｍＭ　　ト
リスＨＣ１（ｐＨ７，５）−７ｍＭ　ＭｇＣｌ２−　＋
　００　ｍＭ　ＮａＣ１〕で３７℃１時間反応させ、５
−２５％のショ糖密度勾配遠心にて分画し、６５〜５０
　ｋｂの長さを含む画分を分取し、エタノール沈殿によ
シ回収した。

コスミドベクターとしてはｐＨ０７９’ｉ用いた。ｐＨ
０７９５／Ｊりを制限酵素ＢａｍＨ１ｉＯＵで緩衝液［
ｊＯｍＭ）リスＨＣｔ（ｐＨ＆ｏ）、７　ｍＭ　ＭｇＣ
４、Ｉ　００　ｆｆｌＬＭＮａＣｌ　、　　２　ｍＭ　
　２−メルカプトエタノール、α０１チ　ウシ血清アル
ブミン〕中、３０℃で１時間反応させた。

フェノール処理を行い、制限酵素を失活させた後、エタ
ノール沈殿しＤＮＡを回収した。

このＤＮＡをＢＡＰ緩衝液〔ｃＬＩＭ　トリス塩ｒＲ（
ｐＨ＆０））に溶解し、１Ｕのアルカリホスファターゼ
を加え、５５℃　５０分間反応サセ、フェノール処理、
エタノール沈殿を行いベクターＤＮＡを回収した。染色
体ＤＮＡ−５ａｕ５Ａ１断片１．７　ｌｉｔとＢａｍＨ
ｌで切断したｐａｃ　７９　ＤＮＡ　１．４μｆをＴ４
　ＤＮＡリガーゼ７００Ｕｔ−用い、リガーゼ緩衝数（
６６ｍＭトリスＨＣ１（ｐＨ７，６）　−＆　６　ｍＭ
ＭｇＣ！４−１０戚ＤＴ’Ｉ’−１１ｍＭＡＴＰＪ中、
１６℃　１６時間反応させ結合させた。

結合したＤＮＡ　　α４５μｆをグロス７エルド（Ｇｒ
ｏａｖｅｌ＋ａ　）らの方法〔文献　ジーン（Ｇｏｎｅ
　）、第１５巻、第２２７頁（１９８１年）〕に従い調
製したパッケージングエキストラクトを用いて、ラムダ
ファージ粒子にパッケージングした。

大腸菌ＨＢＩＯＩ株を５−のマルトースを含むＬ培地〔
バクトドリプトン１０　ｆ　／　１％酵母エキス５　ｆ
　／　ｔ　、食塩１０　ｆ　／　Ｌ、マルトース（Ｌ４
チ、ｐＨ７，４〕で５７℃、１６時間培養したものとラ
ムダ７アージ粒子を５７℃で４０分間吸着させ、Ｌ培地
を加え更に５７℃で１時間静置したものをアンピシリン
５０μｆ／ｄを含むＬ寒天培地に塗布した。５７℃で生
育したコロニーをかきとシ、アンピシリン１００μｆ／
−を含むＬ培地で対数増殖期まで生育させプラスミドＤ
ＮＡを調製し、これをコスミドライブラリーＤＮＡとし
た。

（３）　ＦＯｋ　ｌ修飾酵素遺伝子を含有する大腸菌の
選択 上記（２）のコスミドライブラリーＤＮＡ　１０μｔを
制限酵素ＦＯｋｌｌＯＯＵで緩衝液〔１０蜆トリスＨＣ
２（ｐＨ７，５）　−７ｍ）１１ＭｇＣ１２−６０ｍＭ
　ＮａＣ２−７ｍＭ　２−メルカプトエタノール−α０
１チウシ血清アルブミン〕中、３７℃で１時間反応させ
た。フェノール処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを
回収し、アルカリホスファターゼ処理を行い、５′末端
を脱リン酸化した。こうして得られたＤＮＡを大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に形質転換し、アンピシリン５０μｆ／ｄを
宮むＬ寒天培地に塗布した。３７℃で生育したコロニー
を分離し、テトラサイクリン１２．５μ２／−を含むＬ
寒天培地で生育できないコロニーを分離した後、プラス
ミドの解析を行った。

アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性味を１００
　Ａｔ／１ｔｒｔのアンピシリンを含む２−のＬ培地で
５７℃　１６時間培養した後、集菌した。これに１１−
の溶液１（５０ｍＭグルコース−１０ｍＭ　）リスＨＣ
２（ｐＨａｏ　）−５ｍＭ　ＥＤＴＡ　−４１ｎ９　／
　ｔｄリソザイＡ　（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ））を加え、室
温で５分間保持した後、（１２−の浴ｇｌｌ（α２　Ｎ
　ＮａＯＨ−１％　ＳＤＳ　）　′ｆｔ加えた。

０℃で５分間保持後、α１５−の溶液１［［ｃ５Ｍ　酢
酸カリウムｐＨ４，８］を加え、０℃　５分間保持した
後、遠心分離し、上溝を回収した。フェノール処理後、
エタノール沈殿し、α０５−の浴液１％＋　（１０ｍＭ
　）リスＨＣ２（ｐＨ＆　０　）　−１ｍＭ　ＥＤＴＡ
−α２１１１５ｉ’　／　ｗｔ　ＲＮａｅｅＡ　）に溶
解し、５７℃で１時間反応させた。これにα０３−の溶
ｆｆＶ［２０％ポリエチレングリコールφ６０００−２
　Ｍ　ＮａＣｔ］　ｆｔ加え、混合後、０℃　６０分間
保持した。遠心分離で沈殿を回収後、ＴＢ浴液に溶解し
た。このＤＮＡ溶液にＦｏｋ　ｌ制限酵素を作用させ、
アガロース電気泳動を行い、プラスミドＤＮＡがＦｏｋ
　ｌで切断されるかどうかを調べた。その結果、約５８
　ｋｌ）のＤＮＡを含み、Ｆｏｋ　１で切断されないプ
ラスミドが得られ、これをｐＦＯｋｃＯｓｌ　１６　　
と命名した。

＋４１　　ＦＯｋ　ｌ制限・修飾酵素遺伝子をコードす
る最小領域を決定するためにプラスミドベクターｐＵＣ
１８へのサブクローニングを行った。

ｐＦｏｋｃｏａ　１６　ＤＮＡ　’に適当量の制限酵素
Ｈ１ｎｄｌｌで消化して得られたＤＮＡ断片１．０μ２
とＢｉｎｄｌｌｌで開裂し、脱リン酸化したプラスミド
ベクターｐＵ０１８の１．０μｆを’Ｉ’４　ＤＮＡリ
ガーゼ５５０Ｕを用い結合させた。こうして得られたＤ
ＮＡを大ＭｉＷ、ＴＭｉ９株に形質転換し、アンピシリ
ン５０μ２／−を含むＬ寒天培地に塗布した。５７℃で
生育したコロニーをかきとり１００μｆ／Ｗ１ｔのアン
ピシリンを含むＬ培地で対数増殖期まで生育させ、プラ
スミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡｊＯμｆＶＣ制限
酵素Ｆｏｋｌ＋ＯＯＵを加え、５７ｃ　１時間反応させ
た。フェノール処理、エタノール沈殿を行いＤ　Ｎ　Ａ
を回収し大腸菌ＪＭ！０９株に形質転換した。アンピシ
リン５０μｆ／ｍ１．、工ＰＴＧ（イソプロピル−１−
チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）とＸ−ｇａｌ　（
５−プロモー４−クロロ−５−インドリル−β−カラク
トシド）１含む、Ｌ寒天培地に塗布し、５７℃で生育さ
せ、白色を呈するコロニーを分離し、プラスミドの解析
及び制限酵素活性の解析を行った。

まず、プラスミドの解析は次のように行った。１００μ
ｆ　／ａｔのアンピシリンを含む２ｄのＬ培地で５７℃
、１６時間培養し７を後集菌し、（３）で述べたと同じ
方法でプラスミドＤＮＡ’ｅ＃Ａ袈した。このＤＮＡ溶
液にＦｏｋ　ｌ制限酵素を作用させ、アガロース電気泳
動を行い、グラスミドＤＮＡがＦｏｋＪで切断されるか
どうかを調べた。

Ｆｏｋ　ｌで切断されなかったプラスミドＤＮＡをもつ
組換え体大腸閑の制限酵素活性を７７−ジ感染に対する
耐性の獲得の有無で試験した。すなわち、組換え体をア
ンピシリン１００μｆ　／ｍｌ　ｓマルトースα４チを
含む２−のＬ培地で５７℃、１６時間培養し、これに適
当に希釈したピルトントラムダ７アージを加え、５７℃
、２０分間保持し吸着させた後、５０℃に保温しておい
たα６％寒天を含むＬ軟窪天培地を加え、アンピシリン
５０　Ａｙ／ｒｔ　ｋ含むＬ寒天培地上に流し、寒天を
固化させた。

対照として、プラスミドを保持しない大腸菌ＪＭＴＯＰ
株を、［１４チマルトースを含むＬ培地で培養したもの
を用い、同様にピルトントラムダ７アージを感染させた
ものを用意する。

試験Ｍ、対照菌共に３７℃で一晩保持した後、プレート
上のプラーク数を測定した。

このようにして調べた結果、制限・修飾酵素遺伝子をコ
ードする最小のＤＮＡ断片、５．２ｋｂ　Ｈｌ　ｎａ　
Ｉ［［断片をもつ組換え体グラスミドｐＦｏｋＭＲ５，
２ａが得うレタ。

このプラスミドｐＦｏ　ｋＭＢ　５．２　ａを導入した
大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭＩ
　０９／ｐＦｏｋＭＲ５，２ａ　と我示し、微工研菌寄
第１　Ｄ３５８号（ＦＥＢＭ　　Ｐ−１０５５８）とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
。

（５１ａ　２　ｋｂ断片上の両遺伝子の構成は、５．２
ｋｂＤＮＡ断片の両側からの欠損変異株を解析すること
で決定した。約１０μ２のｐＦｏ　ｋＭＲ５，２ａをベ
クター上のマルチクローニングサイトに存在するＫｐｎ
　（、Ｓａｌ　１両制限＃素部位で開裂する。開裂した
ＤＮＡにエキソヌクレアーゼＩｌｌ　＋８００を加え、
１００μｔの緩衝液（５０ｍＭ　　）　　リ　ス　ＨＣ
ｔ　（ｐＨ＆０）　　−１００ｍλ４ＮａＣ１−５ｍＢ
Ｊ　ＭｇＣ４−１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール
〕中、３７℃で反応を行う。反応！１０μｔを１分おき
に分取し、１００μｔのマングビーンヌクレアーゼ緩衝
液１：　４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）　−＋
　００　ｍＭＮａｃｔ−２ｍＭ　ＺｎＣ４−１０％グリ
セロール〕に力ｎえる。６５℃、５分間加熱しエキソヌ
クレアーゼ■を失活させた後、マングビーンヌクレアー
ゼ５０Ｕを加え、５７℃で１時間反応を行う。こうして
得られた８ａ１１部位から削られた釉々の長さ全もつＤ
ＮＡ断片をＴ４　　ＤＮＡリガーゼを用いて再度環状化
させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。アンピシリ
ン５０μ？／１ｒｔｔを含むＬ寒天培地に塗布し、３７
℃で生育したコロニーを分離し、得られた欠損変異株の
プラスミドの解析及び制限酵素活性及び修飾酵素活性の
解析を行った。

一万、ｓ、２　ｋｂ　Ｈｌｎａｌｌ［断片ｆ　ｐＵＣ１
８Ｈ１ｎｄ■部位にｐＦｏｋＭＲ５，２ａ　　とは逆方
向にもつプラスミドｐＦｏｋＭＲ５−２ｂについても上
記と同様の方法で欠損変異株を調製し、解析を行った。

その結果、！ａ　２　ｋｂＨｌｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片上
の第１図に示すＨｌｎｄ［・Ｐｓｔｌ　　Ｄ　Ｎ　Ａ断
片上に修飾酵素遺伝子、制限酵素遺伝子の順に並んでい
ることが明らかとなった。

（６）　（５）で得られた４、　５　ｋｂ　Ｈｌｎｄｌ
ｌｌＰａｔｌ　　ＤＮＡ断片ｔ−檎々の制限酵素で切断
し、メツシングらのＭ１５ジデオキシ　シーフェンス （ｄｉｄｅｏｘｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）法〔メンツズ
　インエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１０１巻、第２０頁（１９８５年
）に従いシーフェンス解析を行った。すなわち、４．５
ｋｂ　Ｈｌｎｄｌｌ−Ｐａｔｌ　ＤＮＡ断片を種々の制
限酵素で切断して得られた断片を、マルチクローニング
サイト中の適当な制限酵素で開裂したＭ１５ｍｐ１８及
びＭ１３ｍｐ１９に結合し大腸菌ＪＭ１０９株に形質感
染させる。得られた７アージプラークをＬ５ＴＲｔの２
Ｙ’Ｉ’（バクトドリプトン１６　ｆ／ｌ、酵母エキス
８　ｆ　／　ｔ、食塩５１７１％ｐＨ７，２）　　で培
養し、１本鎖ＤＮＡを回収し、シーフェンス解析を行っ
た。

このようにして第１図に示すようなＦＯｋｌ制限・修飾
酵素遺伝子をコードする４、　５　ｋｌ）Ｈｌｎｄ［［
−Ｐａｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の全塩基配列を明らかにし
た。

（７）　　プラスミドｐＦｏｋＭＲ５，２ａを導入した
大腸菌（ニジエリア・コーリーＪＭ１０９／ｐＦｏｋＭ
Ｒ５，２ａ）によるＦｏｋ　ｌ制限酵素及び修飾酵素の
生産上記大腸菌をアンピシリン１００μｆ／−を含む１
０−のＬ培地に接種し、３７℃で１６時間前培養した。

これをアンピシリン１００μｆ　／ｄを含む５００＋ｄ
ＯＬ培地を含む２を容フラスコに移し、５時間（１２０
ｒｐｍ　）培養した後、ＩＰＴＧ　５００　ｌｉｔ／−
を加えた後、更に３時間培養した。集菌後、緩衝液［１
０ｍＭ　）　ＩＪスＨＣｔ（ｐＨＩＩＬＯ）　−１０ｍ
Ｍ　　２−メルカプトエタノール−１ｍＭ　ｇＤＴＡ　
）　５−に懸濁する。これに１５ｍｆ／−のリゾチーム
を加え氷中１時間保持する。超音波処理で菌を破砕し、
１００，０００Ｘｆ　　１時間超遠心し上澄を回収する
。この分画で活性を測定したところ、ＦＯｋｌ制限酵素
が＋、０ＯＯＵ、修飾酵素が４，０ＯＯＵ生産されてい
た。

また、両酵素は、ホスホセルロース、　ＤＥＡＥ−セル
ロース、ヒドロキシルアパタイト、ヘパリンセファロー
ス、セファデックスＧ−１００等のクロマトグラフィー
で分離でき、それぞれ単一な酵素として精製可能である
。

実施例２ ＦＯｋ　ｌ修飾酵素遺伝子が組込まれたプラスミドを導
入した大腸菌によるＦＯｋ　ｌ修飾酵素の生産 Ｆｏｋ　ｌ修飾酵素遺伝子を組込んだプラスミドは、以
下のようにして作成した。プラスミドｐＦｏｋＭＲ５，
２ａを制限酵素ＢａｍＨ３、Ｐｓｔｌで切断し、生成し
た２、４ｋｌ）のＤＮＡ断片を、グラスミドＭ１５ｍｐ
１８のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨｌ　−Ａ
ｃｅ　１部位に’ｒ４　　ＤＮＡ　リガーゼを用いて挿
入した。こうして得られたプラスミドを制限酵素Ｐｓｔ
ｌで切断し、生成した２、　４　ｋｂＤＮＡ断片を発現
ベクターｐｘｘ　２２５−５のＰａｔ　１部位にＴ４　
　ＤＮＡリガーゼを用いて挿入しＦｏｋ■修飾酵素遺伝
子を組込んだプラスミドｐＫｓ　５７を作成した。

このプラスミドｐＫ８５７を導入した大腸菌（ニジエリ
ア・コーリーＪＭ１０９／ｐＫ８５７　）によるＦｏｋ
　ｌ修飾酵素の生産方法を以下に示す。前記大腸菌をア
ンピシリン５０　ｔｉｔ／ｌｄ、グリセロールα５％、
チアミンα００１％、カザミノ酸ａ４％を含むＭ９培地
（α６％　リン酸二ナトリウム、（１３％リン酸−カリ
ウム、（Ｌ１％塩化アンモニウム、ａ０５％塩化ナトリ
ウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、（１１ｍＭ塩化カルシ
ウム）中、５７℃でＡｓ＠ｏ　＝１２５に達するまで培
養し、ＩＰＴＧ　５００　Ａｆ／−を加えた後、更に５
時間培養した。集菌後、緩衝液〔５０ｍＭトリスＨＣ２
（ｐＨ７，５）、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　１　ｍＭジ
チオスレイトール、α１　ｍＭ　　フェニルメチルスル
ホニル７ルオライド〕 ５ｔＩＬｔに懸濁する。

これにα る。

ｒｎｙ／−のり ゾチームを加え、 水中 ０分間保持 する。

×　１、 超音波処理で菌を破砕し、 ０．０ 時間超遠心し上面を回収する。

この分 画で活性を測定したところ、 Ｆｏｋｌ 修飾酵素が ０．０ Ｕ生産されていた。

本酵素はホスホ セルロース、 ＥＡＥ −セルロース、 ヒドロキシ ルアパタイ ト、 セファデックスＧ− ０のク ロマトグラフィーで単一酵素と して精製可能で ある。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明し九通り、 本発明によ ｏｋ ■制限・修飾系酵素遺伝子が単離てれた。

該遺 伝子を含有するプラスミ ドで形質転侠した大腸 菌によシ、 遺伝子工学において有用なＦｏｋｌ制 限酵素及び／又は修飾酵素を効率よ ことが可能となった。

【図面の簡単な説明】

く製造する 第　１ 図は本発明のＦｏｋｌ 制限・修飾酵素遺伝

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｆｏｋ１制限・修飾系酵素遺伝子。 ２、Ｆｏｋ１限酵素遺伝子及び修飾酵素遺伝子が組込ま
   れたプラスミドを保有する大腸菌を培養し、培養物より
   Ｆｏｋ１制限酵素及び修飾酵素を採取することを特徴と
   するＦｏｋ１制限酵素及び修飾酵素の製造方法。 ３、Ｆｏｋ１修飾酵素遺伝子が組込まれたプラスミドを
   保有する大腸菌を培養し、培養物よりＦｏｋ１修飾酵素
   を採取することを特徴とするＦｏｋ１修飾酵素の製造方
   法。