JPS63129997A

JPS63129997A - α−アミラ−ゼ活性測定用基質及び測定方法

Info

Publication number: JPS63129997A
Application number: JP27770286A
Authority: JP
Inventors: Yoshisuke Ogawa; 小川　善資
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1986-11-20
Publication date: 1988-06-02
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: JPH0650996B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれ
を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関するものであ
る。

［従来の技術］急性すい炎、耳下腺炎等の診断のために、血清や尿中の
α−アミラーゼ活性を測定する手法がある。

Ｑ−アミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷん
が用いられてきたが、精度の点で難点があった。このた
め、でんぷんに代って、近年、マルトペンタオース（Ｇ
５）に代表されるマルトオリゴ環がアミラーゼ活性測定
用基質として採用されつつある。即ち、α−アミラーゼ
の共役酵素として、α−グルコシダーゼを用いると、次
の方法によってα−アミラーゼの活性を測定することが
できる。

マルトース（Ｇ２）＋マルトリオース（Ｇ３）α−グル
コシダーゼＧ　２　＋　０３　　　　　　　　　　５　Ｇ　＋ここ
で生成したグルコース（Ｇ１）は、例えばグルコースオ
キシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系又はヘキソキナ
ーゼ／ホスホグルコムターゼ／グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ＋等により定量され
、α−アミラーゼ活性が測定される。

また、最近になって、還元末端のグルコースにアブリボ
ンとしてバラニトロフェノール等のフェノール系化合物
を導入し、アブリボンを遊離させてそのスペクトル吸収
を測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定する
方法も提案されている（特公昭５７−５３０７９）。

［発明が解決しようとする問題点］しかしながら、前述のマルトオリゴ糖をアミラーゼ活性
測定基質として用いる場合には、試料である血清や尿中
に内因性のグルコースやマルトースが存在するため、そ
の影響を受け、測定誤差が生じることになる。このため
、マルトオリゴ糖を基質として用いる場合には、試料中
のグルコース等を予めヘキソナーゼ等を用いて処理する
必要があった。

一方、特公昭５７−５３０７９の方法において、アブリ
ボンとしてフェノール系化合物を用いた場合には、遊離
した発色基は試料中に共存する種々の物質によって作用
を受け、吸光度が変動しやすくなり、その結果、測定精
度が劣る場合があった。

このように、従来のα−アミラーゼ活性測定方法は、い
ずれも操作性や測定精度等に問題を有するものであった
。

［問題点を解決するための手段］本発明者は、これら従来技術の問題点を解決するべく、
鋭意研究を行なった結果、内因性のグルコースやマルト
ースの影響を受けず、かつ、精度の高い吸光度の測定が
可能なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれを用いた
α−アミラーゼ活性測定方法を見出し、本発明を完成さ
せた。

即ち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖を含むこ
とを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用基質Ａ−Ｇｎ−Ｂ　　・・・・・・　（Ｉ）（式中、Ａは、又はを、Ｂはグルコース以外の！＃糖類又はその誘導体を、
Ｇはグルコースを、ｎは４〜１５の整数をそれぞれ表わ
す。ただし、（ＩＩ　）式又は（ＩＩＩ　’）式におい
て、ＲＩ−Ｒ４は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ
２）　ｙ　ＣＯＯＭ　（Ｖは０，１又は２、Ｍは水素原
子又はアルカリ金属を表わす、）を、ｘＩ〜ｘ４は酸素
原子又はイオウ原子をそれぞれ表わす、）及び上記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖と試料と
をグルコシダーゼの共存下に接触させ、遊離する単糖類
又はその誘導体を測定することにより、試料中のα−ア
ミラーゼ活性を測定することを特徴とするα−アミラー
ゼ活性測定方法、を要旨とするものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のα−アミラーゼ活性測定用基質において、前記
一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ環の、非還元末
端であるＡは、未置換グルコースでも良いし、グルコー
スの４位及び／又は６位を置換したものでも良い（即ち
、前記一般式（ＩＩ））。更にグルコースの４位と６位
が一緒になってアルキレン橋を形成しているものでも良
い（即ち、前記一般式（Ｉｌｌ））。

このように、一般式（Ｉ）において、Ａは無修飾（未置
換）及び修飾（置換）されたグルコースを含むものであ
る。Ａが無修飾のグルコースの場合でも、本発明の基質
は従来の基質に比べて、はるかに精度よくα−アミラー
ゼ活性を測定し得るものであるが、下記の理由により修
伽グルコースであることが好ましい。

即ち、マルトオリゴ環からなる基質において、非還元末
端がグルコースそのものであると、α−アミラーゼ活性
測定時に使用する共役酵素であるグルコシダーゼが一部
の非還元末端のグルコースを切断し、α−アミラーゼ活
性測定に誤差を与えてしまう場合があるのである。

修飾された非還元末端としては、前記一般式（１１）又
は（ＩＩＩ　）において、下記第１表（ａ）、（ｂ）に
示すような置換基を導入したものが例示される。

第　　１　　表（ａ）　　一般式（！■）（ｂ）　　一般式（ＩＩＩ　）一般式（１）において、還元末端となるＢはグルコース
以外のｓｍ類又はその誘導体を表わす。

Ｂがグルコースを含まないのは前述の通り内因性のグル
コースと区別するためである。Ｂの具体例としてはフル
クトース、マンノース、ガラクトース、ソルボース、タ
ガトース等が例示され、その誘導体としては、リン酸基
を導入したものが挙げられる。これらのうち、フルクト
ースが入手容易性や反応性等から最も好ましい。

また、一般式（Ｉ）において、Ｇｎは具体的にはマルト
ペンタオース（Ｇ５）、マルトオクタツース（Ｇδ）、
マルトデカオース（Ｇ１０）、マルトヘキサデカオース
（ＧＩＧ）等が挙げられる。

これらのうち、０５〜Ｇδは水溶性に優れるうえに２種
のアイソエンザイムの作用を均等に受ける可能性が高い
ため、基質として好ましい。

本発明のα−アミラーゼ活性測定用基質としては、一般
式（１）で表わされる化合物が、次の一般式（ＩＶ）で
表わされる化合物であることが最も好ましい。

（式中、Ｚｌ、Ｚ２は水素原子又はリン酸基を表わす。

）以下において、上記一般式（ＩＶ）の化合物を、ＭｅＧ
５Ｆと略すことがある。

次に一般式（１）のマルトオリゴ環の製造方法の一例を
述べる。

まず、サイクロデキストリン（α、β、γのいずれでも
良い、）と、グルコースを除く！＃糖類、例えばしよｇ
Ｉ（Ｇ＋Ｆ）とをサイクロデキストリングルカノトラン
スフェラーゼの共存下に反応させる。その結果、サイク
ロデキストリンが開環し、その還元末端にしよ糖が転穆
し、新たに還元末端がフルクトースとなる。もっとも、
この際、デキストリンの分断も行なわれるので、得られ
るデキストリンは原料のサイクロデキストリンのグルコ
ース数のものに限られず、それ以下のグルコース数のも
のも生成する。マルトオリゴ環のグルコース数が、この
操作で所望のものよりも少なければ、マルトース以上の
オリゴ糖と、得られた転位デキストリンとを再度サイク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼの共存下に
反応させれば良い。

なお、非還元末端のグルコースＡは、前述の通り、その
４位及び／又は６位が修飾されている方が、測定誤差が
少なくなるので好ましいものである。非還元末端の４位
及び／又は６位を修飾する場合には、上述の方法で得ら
れた！＃糖類転移マルトオリゴ糖を、酸触媒の存在下に
ジメトキシトルエンやジメトキシプロパンと反応させる
。その結果、一般式（ＩＩＩ　）で示される非還元末端
が得られる。

一方、一般式Ｎｌ）で示される非還元末端を導入する場
合には、上記一般式（Ｉｌｌ　）の化合物の６位及び／
又は４位を触媒存在下にＯＨ基とし、次いで、ハロゲン
化アルキルを反応させ、接触ｙ元すればよい。また、Ｘ
　Ｉ−Ｘ　４のいずれかをＳにしたい場合には、（ｎ）
式又は（Ｉｌｌ　）式の化合物をスルホン酸エステル化
し、メルカプタン類を反応させれば良い。

なお、前述の例で、非還元末端にフルクトースを導入す
る場合の原料としてしょ糖を用いる例を示したが、マル
トシルシュクロースを原料としても良い。また、サイク
ロデキストリンのかわりに市販のマルトオリゴ糖を用い
ても良い。サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼとしては、バチルズ・マセランス、バチルス・メ
ガテリウム、バチルス・サーキュランス及びバチルス・
オーベンシス等を起源とするものを使用できる。

このようにして得られた反応生成液から、所望のマルト
オリゴ糖を分ｍｍ製する手段としては、ＧＰＣ、イオン
交換クロマトグラフィー、合成吸着剤による方法等が挙
げられる。

次に、一般式（１）で示されるマルトオリゴ糖を用いて
、本発明の方法により試料中のα−アミラーゼ活性を測
定する方法について説明する。

体液等の試料に、基質及び共役酵素としてグルコシダー
ゼを加えると、下記のように反応が進む（なお、以下に
おいては一般式（Ｉ）の具体例として一般弐′ｒＶ）で
示されるＭｅＧｓＦを用いる）。

α−アミラーゼｅＧ５ＦＭｅ　　Ｇ３　　　＋　　Ｇ２　　　Ｆα−グルコシダ
ーゼＧ２−Ｆ　　　　　　　　　　　　　２ＧＩ＋Ｆここで
遊離したフルクトースを例えばマンニトールデヒドロゲ
ナーゼ（ＭＤＨ）やソルビトールデヒドロゲナーゼ（Ｓ
ＤＨ）と、ＮＡＤＨ共存下に反応させることによりＮＡ
Ｄを生成させ、その吸光度の変化によりフルクトース量
が測定できる。

ＮＡＤＨＮＡＤＮＡＤＨＮＡＤ［作用コ一般式（１）で表わされるマルトオリゴ糖は試料中のα
−アミラーゼ及び共役酵素のグルコシダーゼにより切断
されてフルクトース等の単糖類を生じる。この単糖類を
例えばＭＤＨやＳＤＲ等で定量することにより、試料中
のα−アミラーゼ活性を測定できる。

［実施例］以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１竺ｊ」１旦１」１遺市販のＧ５２９．５ｇにピリジン１４０ｍｆｔと無水酢
酸１４０ｍＪ：Ｌを加え、室温で４８時間反応させるこ
とにより、パーアセテート化Ｇ５５１．８ｇを得た。得
られたパーアセテート化Ｇ５２５．０ｇをクロロホルム
１６５ｍｆｌに溶かし、１０℃以下で３０％ＨＢｒ−酢
酸と２時間反応させることにより、パーアセテート化Ｇ
５ブロマイド２４．５ｇを得た。このパーアセテート化
Ｇ５ブロマイドをベンゼン中、Ｈｇ（ｃＮ）２６．７ｇ
、ベンジルアルコール３３ｍ１と２時間還元反応させる
ことにより、パーアセテート化Ｇ５ベンジルグリコシド
を得た。次いで、パーアセテート化Ｇ５ベンジルグリコ
シドをメタノール中、ナトリウムメトキシドで室温加水
分解することにより、ベンジルグリコシド化Ｇ５１９．
９ｇを得た。

ベンジルグリコシド化Ｇ５１９．９ｇをＤＭＦ中、ベン
ズアルデヒドジメチルアセタール１４，８ｇと、Ｐ−）
−ルエンスルホン酸触媒下８５〜９０℃で４時間反応を
行なうことにより、非還元末端４．６−０−ベンジリデ
ン、ベンジルグリコシド化Ｇ５を得た。

非還元末端４．６−０−ベンジリデン、ベンジルグリコ
シド化Ｇ５を、ピリジン１００ｍＪ２．無水酢酸１００
ｍｊ２と室温で４８時間反応させ、非還元末端４．６−
０−ベンジリデン、ベンジルグリコシド化Ｇ５パーアセ
テート２６．２ｇを得た。非還元末端４．６−０−ベン
ジリデン、ベンジルグリコシド化Ｇ５パーアセテート２
６．２ｇを、ジオキサン３７０ｍＩＬ中で、ＫＯＨ１８
０ｇとともに塩化ベンジル１８０ｍＪ２と１０５〜１１
０℃で６時間反応させることにより、非還元末端４．６
−０−ベンジリデンバーベルジル化Ｇ５を得た。更に、
非還元末端４．６−０−ベンジリデンバーペンジル化Ｇ
５を、アセトン７５０ｍＪ２、ＩＮ−ＨＣｕ１６０ｍｊ
２中、湯浴上で環流させ、ベンジリデンをはずすことに
より、非還元末端４．６−ＯＨバーベンジル化Ｇ５７．
６ｇを得た。

この非還元末端４．６−ＯＨバーベンジル化Ｇ５７．６
ｇにＢａ０２３．１　ｇ、Ｂａ　（ＯＨ）２・８Ｈ２０
９，４ｇとともヨウ化メチル８４ｍ１をＤＭＦ２４０ｍ
Ｊ２中で光遮断下、４８時間室温にて反応させ、非還元
束ｉ４，６−〇−メチルパーベンジル化Ｇ５を得、非還
元束Ｊ４．６−ジー０−メチルバーベンジル化Ｇ５を、
メタノール／酢酸エチル中でＰｄによる室温、常圧接触
還元を行なうことにより、非還元末端４．６−ジーＯ−
メチル化Ｇ５１．２ｇを得た。

次に、この非還元束＠４．６−ジー０−メチル化Ｇ５を
１０％Ｗ　／　Ｖのｍン夜とし、これにしよ糖液４％ｗ
　／　ｖを等量混合し、バチルス・オーベンシス起源の
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを添
加し、３７℃、ｐＨ６，０の条件下で１６時間静置し、
反応させた。１６時間後、この反応液をカラムクロマト
グラフィー法で精製したところ、ＭＧ５Ｆ（ただし、Ｚ
Ｉ及びＺ２は水素原子）０．１２ｇが得られた。

実施例２ α−アミラーゼ活性測定例下記配合にて試薬Ｉを調製した。

試薬Ｉ上記で得られた基質１ｍｍｏｆｔ／ｎ（最終濃度） α−グルコシダーゼ２５Ｕ／ｍｆＬ（〃　　）マンニトールデヒドロゲナーゼ４００／ｍｊ２（／／　　　）ＮＡＤＨＯ，１６ｍｍｏｕ／Ｉｌ（／／　　）ＰＩＰＥ
Ｓバッファー（ｐＨ７，０）１００ｍｍｏ℃／ｆｌａｉｌ　　　）上記試薬■８００μｋに、α−アミラーゼ活性が９０　
ｍ　Ｕ　／　ｍ　ｆｌ　、及び２７０　ｍ　Ｕ　／　ｍ
　Ａをそれぞれ含む検体血清１００μｍを加えて、３７
℃で１０分間インキュベーションしながら、３４０ｎｍ
で吸光度変化を測定した。

結果を第１図に示す。

第１図から、本発明の方法によれば、６分以降において
、いずれの濃度でも良好な直線関係が得られていること
から、本発明によれば、α−アミラーゼ活性の安定かつ
高精度な測定が可能であることがわかる。

実施例３実施例２において、各検体血清に更に、グルコースを１
００ｍｇ／ｍＩｌ添加したこと以外は、同様の手順で測
定を行なった。

その結果、第１図と殆ど同一の結果が得られた。

このことから、本発明は内因性のグルコース等によって
は全く影響を受けないことがわかる。

［発明の効果］以上詳述した通り、本発明のα−アミラーゼ測定用基質
は、一般式（Ｉ）に示すマルトオリゴ糖を含むものであ
って、このマルトオリゴ糖は、試料中のα−アミラーゼ
及び共役酵素のグルコシダーゼにより切断されてフルク
トース等の単糖類を生じ、これにより定量が可能となる
が、その際、糖の還元末端にグルコースを除く単糖類を
転位させであるので、試料中に含まれる内因性グルコー
スやマルトース等の影響を受けることがない。従って、
本発明のα−アミラーゼ測定用基質によれば、正確にか
つ効率良くα−アミラーゼ活性を測定することが可能と
される。更に、一般式（Ｉ）の非還元末端に修飾したグ
ルコースを導入すると、より測定精度を上げることがで
きる。

また、本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、一般式
（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖と試料とをグルコシ
ダーゼの共存下に接触させ、遊離する単糖類又はその話
導体を測定することにより、試料中のα−アミラーゼ活
性を測定するものであって、α−アミラーゼ活性の安定
かつ高精度な測定を容易に行なうことができる。特に遊
離したＩＬ１！類をＮＡＤ又はＮＡＤＨ共存下酵素処理
するとことによりＮＡＤ又はＮＡＤＨが得られるが、こ
の際の吸光度測定は、試料中の他の夾雑物により影響を
受けず、安定して測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２で得られた吸光度変化の測定結果を示
すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記一般式（ I ）で表わされるマルトオリゴ糖
を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用基質
。Ａ−Ｇ＿ｎ−Ｂ・・・・・・（ I ）（式中、Ａは、 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（II）又は ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（III）を、Ｂはグルコース以外の単糖類又はその誘導体を、Ｇ
はグルコースを、ｎは４〜１５の整数をそれぞれ表わす
。ただし、（II）式又は（III）式において、Ｒ＿１〜
Ｒ＿４は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ＿２）＿
ｙＣＯＯＭ（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子又はアル
カリ金属を表わす。）を、Ｘ＿１〜Ｘ＿４は酸素原子又
はイオウ原子をそれぞれ表わす。）
（２）前記（ I ）式中、Ｂがフルクトースであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の基質。
（３）マルトオリゴ糖は下記一般式（IV）で表わされる
ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
第２項に記載の基質。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（IV）（式中、Ｚ＿１、Ｚ＿２は水素原子又はリン酸基を表わ
す。）
（４）下記一般式（ I ）で表わされるマルトオリゴ糖
と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触させ、遊離す
る単糖類又はその誘導体を測定することにより、試料中
のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴とするα−
アミラーゼ活性測定方法。Ａ−Ｇ＿ｎ−Ｂ・・・・・・（ I ）（式中、Ａは、 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（II）又は ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（III）を、Ｂはグルコース以外の単糖類又はその誘導体を、Ｇ
はグルコースを、ｎは４〜１５の整数をそれぞれ表わす
。ただし、（II）式又は（III）式において、Ｒ＿１〜
Ｒ＿４は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ＿２）＿
３ＣＯＯＭ（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子又はアル
カリ金属を表わす。）を、Ｘ＿１〜Ｘ＿４は酸素原子又
はイオウ原子をそれぞれ表わす。）
（５）前記（ I ）式中、Ｂがフルクトースであること
を特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の測定方法。
（６）マルトオリゴ糖は下記一般式（IV）で表わされる
ものであることを特徴とする特許請求の範囲第４項又は
第５項に記載の測定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（IV）（式中、Ｚ＿１、Ｚ＿２は水素原子又はリン酸基を表わ
す。）