JPS63196300A

JPS63196300A - α−アミラ−ゼ活性測定方法

Info

Publication number: JPS63196300A
Application number: JP2894387A
Authority: JP
Inventors: Yoshisuke Ogawa; 小川　善資
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-02-10
Filing date: 1987-02-10
Publication date: 1988-08-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発面唸α−アミラーゼ活性測定方法に関するものであ
る。

〔従来の技術〕

急性すい炎、耳下腺炎等の診断のために血清や尿中のα
−アミラーゼ活性を測定する手法がある。

アミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷんが用
いられてきたが、精度の点で難点があった。

近年、でんぷんにかわって、マルトペンタオース（Ｇ５
）を代表とするマルトオリゴ塘がアミラーゼ活性測定用
基質として採用されつつある。

α−アミラーゼの共役酵素としてα−グルコシダーゼを
用いると、次の方法によりてα−アミラーゼの活性を測
定することができる。

ｃ　５　　ｄ−ＺコＥ？−−ｔｚ→マルトース（Ｇ２）
＋ツル上トリオース（Ｇ３）ｃｚ＋０３！！上ニア４２
己？望ｔ＝ｊ（−５ａ　１ここに生成したグルコース（
Ｇｌ　）は、例えばグルコースオキシダーゼ／パーオキ
シダーゼ／色素系又はヘキソキナーゼ／水人ホグルコム
ターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ／ＮＡＤＨ系等により定量される。

更に最近、還元末端のグルコースにアグリゴントシてパ
ラニトロフェノール等のフェノール系化合物を導入し、
アブリボンを遊離させてそのスペクトル吸収を測定する
ことによりα−アミラーゼ活性を測定する方法も提案さ
れている（ｆＦ公昭５７−５３０７９）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前述のマルトオリゴ糖をアミラーゼ活性
測定用基質として用いる場合には、試料である血清や尿
中に内因性のグルコースやマルトースが存在するため、
その影響を受け、測定誤差が生じることになる。従って
、マルトオリゴ糖を基質として用いる場合には試料中の
グルコース等を予めヘキソキナーゼ等を用いて処理する
必要がありた。

一方、アブリボンとしてフェノール系化合物を用いた場
合には、遊離した発色基は試料中の共存物質により作用
を受け、吸光度が変動しやすくなり、その結果、測定精
度が劣る場合があった。

本発明者は、これら従来技術の問題点を解決するために
研究を行ない、その結果、先にフルクトース等の単種類
を還元末端に転位させたマルトオリゴ糖を用いたα−ア
ミラーゼ活性測定方法を完成し、出願したｌ願昭６ｌ−
２７７７０２）。

しかし、この方法ではＮＡＤＨ−＋ＮＡＤの退色反応を
利用するものであり、発色反応と比べると感度や精度の
点で若干劣る場合がありた。

本発明は、先願発明を更に改良すべく、研究を継続した
結果、完成されたもので、下記の一般式（Ｈで表わされ
るマルトオリゴ糖を含む基質と試料とをグルコシダーゼ
の共存下に接触させ、遊離するイノシトール又はその誘
導体をＮＡＤの存在下、イノシトール脱水素酵素と接触
させることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定方法であ
る。

ｋ−Ｇｎ−１ｔＩ）〔ここでＡはＣ）Ｉｓ−Ｘｓ−鳥を、■はイノシトール又はその誘導体を、Ｇはグルコー
スを、ｎは３〜１５の整数をそれぞれ表わす。

（「１式又は［相］式において、Ｒ１〜Ｒ４は水素原子
、低級アルキル基、又は（ＣＨｚ　）　ｙ　ＣＯＯＭ　
（７はＯ〜ｚ　ｔ　Ｍは水素原子又はアルカリ金属を表
わす。〕を、Ｘ、〜Ｘ４は酸素原子又はイオウ原子をそ
れぞれ表わす。〕本発明会提供されるα−アミラーゼ活性測定用基質であ
る一般式中で表わされるマルトオリゴ糖において、非還
元末端であるＡは未置換グルコースでもよいし、グルコ
ースの４位及び／又は６位を置換したものでよい（前記
「式）。さらにグルコースの４位と６位が−緒になりて
アルキレン橋を形成していてもよい（前記■式）。

一般式（１１において、還元末端となる■はイノシトー
ル又はその誘導体である。■がイノシトールであること
によって前述の通り内因性のグルコースと区別すること
ができる。

一般式（Ｉ）において、Ａ−Ｇｎは具体的にはマルトペ
ンタオース（Ｇ５）％マルトオクタツース（Ｇ８）、マ
ルトデカオース（ＧＩＯ）、マルトヘキサデカオース（
Ｇｌ　６　）等が例示される。このうち、０５〜Ｇ８は
水溶性に優れｌるうえに、２種のアイ妙エンザイムの作用を均等に受け
る可能性が高いため、基質として好ましい。

一般式＋１３において、Ａは前述のとおり、未修飾され
たグルコースを含むものである。無修飾の場合でも本−
発明の基質は従来の基質に比べて、はるかに精度よくα
−アミラーゼ活性を測定し得るものであるが、下記の理
由により修飾グルコースが好ましい。

即ち、マルトオリゴ糖から成る基質において、非還元末
端がグルコースそのものであると、α−アミラーゼ活性
測定時に使用する共役酵素であるグルコシダーゼが一部
の非還元末端のグルコースを切断し、α−アミラーゼ活
性測定に誤差を与えてしまうのである。

修飾された非還元末端としては第１表に示したような置
換基を導入したものが例示される。

第１表一般式（Ｉｌで表わされる化合物のうち、α−アミラー
ゼ活性測定用基質としてもっとも好ましいのは次の■］
式で表わされる化合物である。

（Ｚｌ−Ｚ、は水素原子又はリン酸基を表わす。）Ｎ式
の化合物を以下ＭｅＧｓｉと略すことがある。

一般式（Ｉ）のマルトオリゴ糖の製造方法の一例を述べ
る。

先ず、サイクロデキストリン（α、β、γのいずれでも
よい。）とイノジ−トールとをサイクロデキストリング
ルカノトランスフェラーゼの共存下に反応させる。その
結果、サイクロデキストリンが開環し、その還元末端に
イノシトールが転移し、新たな還元末端がイノシトール
となる。もつとも、この際デキストリンの分断も行なわ
れるので得られるデキストリンは原料のサイクロデキス
トリンのグルコース数のものに限られず、それ以下のグ
ルコース数のものも生成する。マルトオリゴ糖のグルコ
ース数が、この操作で所望のものよりも少なければ、マ
ルトース以上のオリゴ糖と、得られた転位デキストリン
とを再度サイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼの共存下に反応させればよい。

なお、非還元末端のグルコースは、前述の通り、その４
位及び／又は６位が修飾されている方が測定誤差が少な
くなるので好ましいものであるが、非還元末端の４位及
び／又は６位を修飾する場合には、上述の方法で得られ
たイノシトール転移マルトオリゴ塘を酸触媒の存在下に
ジメトキシトルエンやジメトキシプロパンと反応させる
。その結果、■式で示される非還元末端が得られる。

一方、■式で示される非還元末端を導入する場合には、
■式の化合物の６位及び／又は４位を触媒存在下にＯＨ
とし、次いで、ハロゲン化アルキルを反応させ、接触還
元すればよい。

また、Ｘ１〜Ｘ４のいずれかをイオウ原子にしたい場合
には■弐又は１■式の化合物をスルホン酸エステル化し
、メルカプタン類を反応させればよい。なお、サイクロ
デキストリンのかわりに市販のマルトオリゴ糖を用いて
もよい。

前述の反応で用い北サイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼはバチルス・マセランス、バチルス・メ
ガテリウム、バチルス・サーキュランス及ヒバチルス・
オーペンシス等を起源とするものを使用できる。

反応液から所望のマルトオリゴ糖を分離精製する手段と
してはＧＰＣ，イオン交換クロマトグラフィー、合成吸
着剤による方法等が挙げられる。

次に、（ＩＪ式で示される基質を用いて試料中のα−ア
ミラーゼ活性を測定する方法を述べる。

体液等の試料に基質及び共役酵素として、グルコシダー
ゼを加えると下記のように反応が進む。

ＭｅＧ、　ｌ　”　”−”　　ＭｅＧ１＋Ｇ、　■ｃ、
　Ｉ　　ａゴ竺で１−２Ｇ、＋１ここで遊離したイノシトール又はその誘導体はイノシト
ール脱水素酵素（ＩＤＨ）と、ＮＡＬ）共存下に反応さ
せることによりＮＡＤＨを生成させ、その吸光度の変化
によりイノシトール量が測定できる。

〔作　　用〕

一般式ＩＩ）で表わされる本発明で用いる基質は試料中
のα−アミラーゼ及び共役酵素のグルコシダーゼにより
切断されてイノシトール又はその誘導体を生じる。この
イノシトール類を例えばＩＤＨ等で脱水素することによ
り、ＮＡＤ−＋ＮＡＤＩ（の発色反応を起こさせ、生成
し九ＮＡＤＨ量を測定することによりα−アミラーゼ活
性を測定することができる。

以下に実施例ｔ−揚げて本発明を更に説明する。

〔実　施　例〕

実施例１ａ、　Ｉの製造 β−サイクロデキストリン２０９−とイノシトール２０
５Ｆ−を溶解した液中に、バチルス・オーペンシスを起
源とするサイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼｆｔ２００１Ｌ／／　を基質添加後、６０ＣｐＨ６
，ｏの条件下で２５時間反応させた。

次いで、この反応液をシリカ充填カラムによりクロマト
分離し、Ｇ、Ｉを８．８ｙ−得た。

次に、このＧ、１８５４と市販のＧ４オリゴ糖１２５Ｌ
とを４ｏｏｍｌのバッファ液（ｐＨ６，０）に溶解させ
、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ２
ｏｏｍ／Ｐ基質を添加し、３７Ｃで２０分間反応させた
。次いで再度クロマト分離したところＧ、Ｉが１．８）
得られ友。

α−アミラーゼ活性測定例試薬Ｉ上記で得られた基質　　　１　ｍ　ｏ　ｌ／Ｉ３（最終
濃度）α−グルコシダーゼ　　　　２５ＵＡｎｌ（〃）
イノシト−欠デ？ト５クシーービ　　　　　４０ＵＡｌ
（ｔｔ　　　　）ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　
　　４，０’ｍｍａＶ１３ｃ　　　　”　　　　）ＰＩ
ＰＥＣ−（ｙ）７−（ｐＩ（７，０）　１ｏｏｍｍｏｌ
／＃（〃　　　）上記試薬８００μｌに、α−アミラー
ゼ活性が５５　ｍＴＪ／ｍｌ及び２２０　ｍＵ／ｎｔｌ
である検体血清１００μｍを加えて３７Ｃで１０分間イ
ンキュベーションしなから３４ｏ」で吸光度変化を測定
した。

結果を図に示す。

図から本発明においては４分以降において、いずれの濃度でも良好な直線関係が得られている
ことがわかる。

実施例２実施例２において、各検体血清にさらにグルコースを１００　ｍ９７ｍ１添加した他は同様の
手順で測定を行なった。

その結果、図とほとんど同一の結果が得られた。

従って、本発明は内因性のグルコース等によりては全く影響を受けないことがわかる。

〔効　果〕

本発明のマルトオリゴ糖を含む基質は還元末端にイノシ
トール類を転位させたので、試料中に含まれる内因性グ
ルコースやマルトース等の影響を受けることなく正確に
効率よ〈α−アミラーゼ活性を測定することができる。

さらに、非遺元末端に６飾したグルコースを導入すると
、さらに精度が上がる。また、イノシトールをＮＡＤ共
存下酵素処理することによりＮＡＤＨが得られるが、こ
の際の吸光度測定は、試料中の他の夾雑物により影響を
受けず、安定して測定することができる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例の結果を示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１）下記の一般式（ I ）で表わされるマルトオリゴ糖
を含む基質と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触さ
せ、遊離するイノシトール又はその誘導体をＮＡＤ（ニ
コチン酸アミドアデニンジヌクレオチド）の存在下、イ
ノシトール脱水素酵素と接触させることにより、試料中
のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴とするα−
アミラーゼ活性測定方法。Ａ−Ｇｎ−Ｉ（ I ）〔ここでＡは ▲数式、化学式、表等があります▼（II）又は▲数式、
化学式、表等があります▼（III）を、Ｉはイノシトー
ル又はその誘導体を、Ｇはグルコースを、ｎは３〜１５
の整数をそれぞれ表わす。（II）式又は（III）式において、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は水
素原子、低級アルキル基、又は（ＣＨ＿２）ｙＣＯＯＭ
〔ｙは０〜２、Ｍは水素原子又はアルカリ金属を表わす
〕を、Ｘ＿１〜Ｘ＿４は酸素原子又はイオウ原子をそれ
ぞれ表わす。〕２）（ I ）式が下式で表わされる特許請求の範囲第１
項記載の測定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｚ＿１〜Ｚ＿５はそれぞれ水素原子又はリン酸基を表
わす。）