JPH0732705B2

JPH0732705B2 - 動物細胞増殖用組成物およびそれを用いる動物細胞の増殖方法

Info

Publication number: JPH0732705B2
Application number: JP61279774A
Authority: JP
Inventors: 一昭北野; 靖新谷
Original assignee: 工業技術院長
Priority date: 1986-11-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1995-04-12
Anticipated expiration: 2010-04-12
Also published as: JPS63133982A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、動物細胞を増殖するための組成物，動物細胞
の増殖方法および生理活性物質の製造法に関する。

従来の技術動物細胞を大量に効率よく培養する技術は、新しい有用
な生理活性物質の探索や生産に、さらに遺伝子操作技術
を施した細胞を用いる生理活性物質生産に必須の技術と
して、種々の方向からの研究が進められている。従来動
物細胞の培養には、血清を約10％程度添加した培地が主
として用いられ、とりわけ牛胎児血清（FCS）含有培地
が賞用されて来た。

発明が解決しようとする問題点しかしながら、血清は非常に高価であり、かつ原因不明
のロット差があるため、細胞を大量に培養するには問題
が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれる
ため、生産される有用物質を培養液から回収精製する際
にも不都合が生ずる。これらの不都合を解消しようとし
て、血清を含まない培地（無血清培地）が種々開発され
て来たが、一般に汎用性が低く、増殖性および生理活性
物質生産性の面でも血清含有培地に比べると必ずしも十
分なものとはいえない。

いずれにしても従来知られている培地は、細胞培養によ
って有用物質を大量に効率よく得るためには必ずしも十
分満足できるものではなかった。

そこで、本発明者らは、ポリエチレングリコールを添加
した動物細胞増殖用組成物により動物細胞を培養する
と、動物細胞が著しく増殖され、またこれにより、産生
される生理活性物質の量が増大される旨の発明を行なっ
た（特願昭61−128112号）。

また、ポリビニールアルコールまたはこれとポリエチレ
ングリコールとを添加した動物細胞増殖組成物により動
物細胞を培養すると、動物細胞が著しく増殖され、また
これにより、産生される生理活性物質の量が増大する旨
の発明を行なった（特願昭61−227190号）。

問題点を解決するための手段本発明者らは、さらに種々研究を重ねたところ、ポリエ
チレングリコールまたは／およびポリビニールアルコー
ルにさらに低密度リポ蛋白質を添加すると、血清無添加
の状態でも動物細胞の増殖が著しく促進され、またこれ
により、産生される生理活性物質の量が増大され、しか
も動物細胞に対する汎用性が高まることを見い出し、こ
れに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）ポリエチレングリコールまたは／およびポリビニ
ールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有してなる動
物細胞増殖用組成物、および、（２）ポリエチレングリ
コールまたは／およびポリビニールアルコールと低密度
リポ蛋白質とを含有してなる動物細胞増殖用培地で動物
細胞を培養することを特徴とする動物細胞の増殖方法で
ある。

本明細書においては、ポリエチレングリコール，ポリビ
ニールアルコールおよび低密度リポ蛋白質をそれぞれPE
G,PVAおよびLDLと略記することもある。

本発明の組成物は、基礎培地，ポリエチレングリコール
または／およびポリビニールアルコールと低密度リポ蛋
白質とからなる。

該基礎培地としては、動物細胞の培養に用いることので
きるものであればいずれのものでもよい。

本発明に用いられる基礎培地としては、たとえば市販さ
れている各種基礎培地［たとえば、イーグルの最小必須
培地（MEM）（サイエンス（Science）130巻 432頁 19
59年），イーグルの基礎培地（BME）（プロシーデイン
グス・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・エキスペリメ
ンタル・バイオロジー・アンド・メディスン（Proceedi
ngs of the Society for Experimental Biology and Me
dicine）89巻 362頁 1965年），ダルベッコ改変イー
グル培地（DME）（バイロロジー（Virology）８巻 396
頁 1959年），イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）
（ザ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディ
スン（The Journal of Experimental Medicine）147巻
923頁 1978年）,L−15培地（アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ハイジーン（American Journal of Hygien
e）78巻 173頁 1963年），マッコイ5a培地（プロシー
デイングス・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・エキス
ペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディスン100
巻 115頁 1959年），ハムF12培地（プロシーデイング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユー・エス・エー（Proceedings of National Academ
y of Science,USA）53巻 288頁 1965年）,RPMI 1640
培地（ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル
・アソシエーション（Journal of the American Medica
l Association）199巻 519頁 1967年）など］あるい
はこれらを混合した培地が挙げられる。さらに該基礎培
地にそれぞれの細胞の増殖に必須な因子（補助増殖因
子）たとえばホルモン類（たとえばインスリン，トラン
スフェリン，ステロイドホルモンなど），蛋白性増殖因
子［たとえば上皮細胞増殖因子（EGF），血小板由来増
殖因子（PDGF），繊維芽細胞増殖因子（FGF）など］，
重金属類（たとえば亜セレン酸ナトリウムなど）やリン
脂質（たとえばエタノールアミン，ホスファチジルエタ
ノールアミンなど）を必要により添加した無血清培地が
挙げられる。

さらに、これらに通常の使用量またはそれ以下の血清代
替物質［たとえばGFS（第２回次世代産業基盤技術シン
ポジウム−バイオテクノロジー予講集161頁,1984年）,N
U−シーラム（コラボレーテイブリサーチ社製），シー
ラムプラス（KCバイオロジカルズ社製）など］が添加さ
れた培地や、通常の使用量以下の血清［たとえば牛胎児
血清（FCS），新生子牛血清，仔牛血清，ブタ血清，ヤ
ギ血清，ニワトリ血清など］を添加した培地でもよい。
また市販の無血清培地［たとえばハイブリティー１（日
本薬品開発製）,HB−102（ハナ・メディア社製）,HL−
１（ベントレット社製）など］を基礎培地として用いて
もよく、市販の基礎培地に準じてアミノ酸などの濃度を
最適化した培地を作成して用いてもよい。

本発明で用いられるポリエチレングリコールは、〔−CH
₂CH₂O−〕ｎ（ｎは重合度を表す。）の構造を持つ高重
合体であり、重合分子量が約1000以上のものが好まし
く、なかでも約2,000ないし20,000のものが好ましく、
さらに約4,000,約6,000,約20,000のものが好ましい。

本発明で用いられるポリエチレングリコールの量は、使
用時の濃度が約10％（W/V）以下となる量が好ましい。
なおここにおいて、「以下」は「０」を含まないことを
示す。また、ポリエチレングリコールの量としては、使
用時の濃度が、より好ましくは約0.001ないし10％（W/
V）、さらに好ましくは約0.01ないし２％（W/V）となる
量である。

また、本発明で用いられるポリビニールアルコールは、
〔−CH₂CH（OH）−〕ｎ′（ｎ′は重合度を表す。）の
構造を持つ高重合体であり、平均重合度が約500ないし
2,000のものが好ましく、なかでも約500のもの,1,500〜
1,800のものが好ましい。

本発明で用いられるポリビニールアルコールの量は、使
用時において約0.001ないし10％（W/V）が好ましく、な
かでも約0.01ないし３％（W/V）となる量がより好まし
い。

ポリエチレングリコールとポリビニールアルコールは単
独で使用しても良いし、両者を同時に使用しても良い。
両者を同時に使用する場合、その混合比は、PEGを１と
した場合、PVAは約0.01〜100（重量比）となるのが好ま
しく、なかでも約0.1〜10（重量比）となるように混合
するのがより好ましい。

本発明で用いられる低密度リポ蛋白質は、動物の血しょ
うから分離される比重1.019ないし1.063、分子量（2.2
ないし2.3）×10⁶、直径19〜25nmの粒子を形成するリポ
蛋白質で、脂質，糖および蛋白質からなり、生体内では
細胞ヘコレステロールを供給する役割を荷っている。

本発明においては、市販のLDL（例、ヒトLDL,ウシLDL
等）を用いてもよいし、例えばセル・カルチュアー・メ
ソッド・フォー・モルキュラー・アンド・セル・バイオ
ロジー（Cell Culture Methods for Molecular and Cel
l Biology,Alan R.Liss,Inc.,New York）１巻69頁1984
年に記載の方法，以下の参考例に示す方法などにより、
動物（例、ウシ，ブタ等）の血清から調整したLDLを用
いてもよいが、参考例に示す方法により調整したLDLが
とりわけ好都合に用いられる。

本発明で用いられるLDLの量としては、使用時の濃度
が、約0.01ないし1000μg/mlとなるのが好ましく、なか
でも約0.05ないし500μg/mlとなるのがより好ましく、
さらに好ましくは約0.5ないし100μg/mlとなる量であ
る。なお本明細書において、LDLの量はLDLが含有する蛋
白質量として表す。

PEGまたは／およびPVAとLDLとは、あらかじめ組成物中
に混合されていても良いし、培地として使用する際に混
入しても良い。

本発明の動物細胞増殖用組成物は、固体状態のものおよ
び水溶液であるもののいずれでもよい。固体状態のもの
は、それをたとえば水に溶解あるいは懸濁して用いられ
る。

また、該組成物を動物細胞増殖用の培地として用いるこ
とができるが、培地として用いる場合には、血清を含ま
ない培地としても良く、さらに、通常の使用量以下の血
清を含む培地としても良い。ここで、通常の使用量とし
ては、たとえば約10％（V/V）が挙げられる。

本発明の組成物を培地として用いる場合には、通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物を含む培地としてもよ
い。ここで、通常の使用量としては、たとえば、GFSの
場合は約３〜4g/（蛋白質として）であり、NU−シー
ラムの場合は約10％（V/V）であり、シーラムプラスの
場合は約10％（V/V）である。

本発明方法によって培養される動物細胞としては、特に
限定されない。その例としては、たとえばヒト，マウ
ス，ラット，ウシ，ハムスターなどの哺乳動物由来のリ
ンパ系細胞（例、正常リンパ球，ミエローマ細胞,B−リ
ンパ芽球様細胞,Tリンパ性白血病細胞など），各種ハイ
ブリドーマ（例、マウスハイブリドーマ，マウス・ヒト
ヘテロハイブリドーマ，ヒトバイブリドーマなど），正
常２倍体細胞（例、繊維芽細胞など），その他の種々の
接着依存性細胞などを挙げることが出来る。

より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、Namalva
（ATCC CRL1432）（インターナショナル・ジャーナル
・オブ・キャンサー（International Journal of cance
r）12巻 396頁 1973年）,Raji（ATCC CCL86）（ラン
セット（Lancet）１巻 238頁 1964年）,EB−３（ATCC
CCL85）（ランセット１巻 252頁 1964年）,WI−L2
（キャンサー（Cancer）22巻 517頁 1968年）,Daudi
（ATCC CCL213）（キャンサー・リサーチ（Cancer Res
earch）28巻 1300頁 1968年）,RPMI 8226（ATCC CC
L155）（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド
・メディスン 125巻 1246頁 1967年）,CCRF−CEM（A
TCC CCL119）（キャンサー 18巻 522頁 1965年）,R
PMI 1788（ATCC CCL156）ジャーナル・オブ・ザ・ナ
ショナル・キャンサー・インスティチュート（ユナイテ
ィド・ステーツ）（Journal of the National Cancer I
nstitute（United States）43巻 1119頁 1969年）,CR
CF−SB（ATCC CCLI20）（キャンサー・リサーチ 27巻
2479頁 1967年）,Jurkat（イムノジェネティクス（I
mmunogenetics）10巻 247頁 1980年）などが、マウス
リンパ系細胞としては、たとえば、MPC−11（ATCC CCL
167）（ザ・ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・
メディスン131巻 515頁 1970年）,NS−１（ATCC TIB
18）（ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（European Journal of Immunology）６巻 511頁 197
6年）,P3X63Ag8U・１（P3U1）（ATCC CRL1597）（カレ
ント・トピックス・オブ・マイクロバイオロジー・アン
ド・イムノロジー（Current Topics of Microbiology a
nd Immunology）81巻１頁 1978年）などが、ハイブ
リドーマとしては、たとえばマウスハイブリドーマCEA
（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテク
ノロジー予稿集 175頁昭和59年）,HS−II（同
上）,E235I63（ハイブリドーマ（Hybridoma）４巻 47
頁 1985年），マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドー
マN12−16・63（第２回次世第産業基盤技術シンポジウ
ム−バイオテクノロジー予稿集 175頁昭和59
年），およびN12−16・63から誘導された高産生（N12−
16・63・49・19,N12−16・63・49・19・69など）（第３
回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジ
ー予稿集 155頁昭和60年）,I12−22・25（バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミ
ュニケーション（Biochemical and Biophysical Resear
ch Communication）129巻 26頁 1985年）,HB III−43
・１（同上）ヒトＢハイブリドーマW471−7.24（IFO 5
0094）などが、接着依存性細胞としては、たとえばFL
（ATCC CCL62）（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイロオジ
ー・アンド・メディスン 94巻532頁 1957年）,HeLa
（ATCC COL2）（キャンサー・リサーチ 12巻 264頁
1952年）,Wish（ATCC CCL25）エキスペリメンタル・
スル・リサーチ（Experimental Call Research）23巻
14頁 1961年）,CHO−K1（ATCC CCL61）（ザ・ジャー
ナル・オブ・エキスペリメンタル・メディスン 108巻
945頁 1958年）,L細胞（ATCC CCL1）（ジャーナル
・オブ・ナショナル・キャンサー・インスチチュート・
ユー・エス・エー９巻 229頁 1948年）などがそれ
ぞれ挙げられる。

上記ヒトＢハイブリドーマW471−7.24は日本特願昭61−
227191号に記載の方法で得られ、昭和61年８月20日から
財団法人発酵研究所（IFO）にIFO 50094として寄託さ
れている。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられる生理
活性物質を生産する動物細胞としては、たとえば、マウ
スモノクローナル抗体を産生するCEA,HS−II,E235163な
ど、ヒトモノクローナル抗体を産生するN12−16・63お
よびその変異株,I12−22・25,HB III−43・1,W471−7.2
4などが、白血球インターフェロンを産生するNamalva細
胞、インターロイキン−２を産生するJurkat細胞，遺伝
子組換え細胞（マウスＬ−IL−213−３細胞，ヒトFL−I
L385−６細胞，ハムスターＣ−IL485−14細胞（特開昭6
1−63282号公報参照）など）などが挙げられる。

本発明方法の培養には通常培養に用いられる容器または
装置が用いられる。たとえば浮遊細胞の場合には、マル
チウエルプレート，培養フラスコ，スピナーフラスコ，
ジャーファーメンター，ファーメンターなどが用いら
れ、さらにホローファイバー培養装置，セラミックマト
リックスを用いた培養装置さらにマイクロカプセル培養
法などが適宜採用される。培養依存性細胞の場合には、
マルチウエルプレート，培養フラスコ，ローラーボト
ル，マイクロキャリアー培養法，ホローファイバー培養
法，セラミックマトリックス培養法などが用いられる。

本発明の培養は、用いられる動物細胞の培養に適した条
件が採用される。一般的には、培養温度約37℃前後で、
pH約6.5ないし7.5で、数日ないし３か月培養される。た
とえば、本発明の培地に通常0.1ないし５×10⁵個/mlの
細胞を播種し、マルチウエルプレートやフラスコの場合
には約37℃,5％炭酸ガス培養器（炭酸ガス濃度５％の培
養器）中でpH約6.5ないし7.5で約１ないし20日間培養さ
れる。ジャーファーメンターやメンターなどでは通気撹
拌培養が行われる。またこれの培養槽やホローファイバ
ー，セラミックマトリックス，マイクロカプセルなどを
用いた培養においては培地を回分的，または連続的に交
換することにより生理活性物質の生産性を向上させるこ
とができる。連続潅流培養の場合には１ないし数ケ月
（約３か月）も続ける場合がある。また、必要により通
気される。

培養液から細胞を採取するには、たとえば、浮遊細胞の
場合は、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集め
る。接着依存性細胞の場合にはたとえば、0.1mg/mlのED
TAおよび1.25mg/mlのトリプシンを添加して、37℃,1な
いし２分反応させて細胞を分散させたのち、遠心分離ま
たはろ過によって集める。

細胞培養によって生産される生理活性物質は、その物質
が培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠心分離によ
って上澄液を得、これから採取される。また細胞内に蓄
積される物質の場合には、ろ過または遠心分離によって
得た細胞を物理的方法（例、超音波，フレンチプレス，
ダイノミルなど）または化学的方法（例、塩酸グアニジ
ン等）にて処理し、生産物を抽出したのち、上澄液を得
る。

上記上澄液から生理活性物質を分離，精製するには自体
公知の分離，精製法を適宜組み合わせて行うことができ
る。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチドの場
合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法,SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法，イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法，アフィニティクロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法，逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法，等電
点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが適用
される。

本発明の方法に従って増殖させた動物細胞は、たとえば
これにウイルスを感染させてワクチンの製造に利用した
り、各種リンフォカイン類（例、インターフェロン類，
イターロイキン−２など），各種増殖因子類（例、上皮
細胞増殖因子，繊維芽細胞増殖因子など），各種ホルモ
ン類（例、ヒト成長ホルモン，インスリンなど），各種
酵素類（例、ウロキナーゼ，組織プラスミノーゲン活性
化因子など）や各種モノクローナル抗体（例、マウスモ
ノクローナル抗体，ヒトモノクローナル抗体など）など
の生理活性物質の生産に利用される。また遺伝子操作に
よって特定の遺伝子を導入した細胞を用いることにより
該物質を効率よく生産させることができる。また本発明
の方法に従って増殖し、集めた細胞を直接に、人工皮膚
や人工器官（例、膵臓ベータ島細胞や、肝細胞など）と
して利用することもできる。

本発明方法により、動物細胞を効率良く増殖させること
ができるので、動物細胞を工業的に大量に増殖させる方
法として有利に用いることができる。

本発明方法において、生理活性物質を生産する動物細胞
を培養した場合には、該細胞が効率良く増殖されるの
で、生産活性物質を効率良く生産することができ、工業
生産上有利である。

実施例以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。PEGおよびPVAの添加％はW/V％を表す。ま
た、LDLの添加量はLDLが含有する蛋白質量として表して
いる。なお、実施例で用いたヒトLDLは、シグマ社製の
市販のLDLであり、ブタLDLは参考例１に示す方法で製造
されたものである。

参考例１ブタ血清１を5mMEDTAと1MNaClを添加した10mMトリス
・塩酸緩衝液（pH7.2）に対して透析したのち、同じ緩
衝液で平衡化したシバクロン・ブルーF3G−Ａ（バイオ
ラッド社製）カラム（2.5cmφ×18cm）へ通液した。同
じ緩衝液で十分洗滌したのち、この緩衝液に0.5MNaSCN
を添加した溶出液300mlで溶出した。活性画分を集め、
低比重液（0.15MNaCl,d＝1.006）を添加して比重をｄ＝
1.019に調整したのち、35000rpmで30時間遠心分離し
た。底部層約100mlを集めて、これに高比重液（ｄ＝1.3
46,NaCl 153.0gとKBr35 4.0gとを水に溶かして１と
したもの）を添加して比重をｄ＝1.069に調整したの
ち、超遠心分離機（35000rpm,30分,4℃）にかけて、LDL
層（最上層）約10ml（蛋白質として約10.6mgのLDLを含
む）を得た。

実施例１ IMDM,ハムF12およびＬ−15培地を1:1:2の比率で混合し
た培地に、2mg/インスリン,2mg/トランスフェリン,
2×10^-6Mエタノールアミン,2.5×10^-8M亜セレン酸ナト
リウム（４つを合せてITESと称する。）を添加し、これ
にPEG20,000（平均分子量20,000）を0.1％添加した培地
と、無添加の培地とを用意し、それぞれ24穴マルチウエ
ルプレートへ1ml宛分注した。この各穴へ、第１図に示
す各種濃度のヒトLDL（シグマ社製）を添加したのち、
マウス・ヒト−ヒトヘテロハイブリドーマN12−16・63
・49・19株の細胞を１×10⁵個/mlになるように播種し、
５％炭酸ガス培養器中で37℃,3日間培養後、コールター
カウンターにて細胞数を測定した。結果を第１図に示
す。第１図において、−○−はヒトLDLのみを添加した
場合、−●−はヒトLDLと0.1％PEG20,000とを同時に添
加した場合の細胞数を示す。

第１図から明らかなように、0.1％PEGと至適濃度（3.12
ないし25μg/ml）のヒトLDLとを添加すると、0.1％PEG
のみあるいは至適濃度のヒトLDLのみを添加した場合に
比べて、細胞増殖は著しく促進された。

実施例２実施例１におけるヒトLDLの代りに、参考例に従って調
整したブタLDLを各種濃度添加し、実施例１と同一条件
下で実施して細胞数を測定した。結果は第２図に示す。
第２図において、−○−はブタLDLのみを添加した場
合、−●−はブタLDLと0.1％PEG20,000とを同時に添加
した場合の細胞数を示す。

第２図から明らかなように、0.1％PEGと至適濃度（0.36
ないし200μg/ml）のブタLDLとを添加すると、0.1％PEG
のみあるいは至適濃度のブタLDLのみを添加した場合に
比べて、細胞増殖は著しく促進された。

第１図，第２図は比較すると、参考例１に示す方法によ
り調整したブタLDLは、市販のヒトLDL（シグマ社製）に
比べて、PEGとの相乗効果が大きく、かつ広い濃度域で
安定した増殖を示すことが明らかである。

実施例３実施例１と同じ基礎培地にITESを添加した培地（１）、
更にこれに0.1％PEG20,000を添加した培地（２）、培地
（１）に0.1％PVA（平均重合度500）を添加した培地
（３）、培地（１）に0.05％PEG20,000と0.05％PVA（平
均重合度500）とを添加した培地（４）、およびその各
々に参考例に従って調製したブタLDL10μg/mlを添加し
た培地（５）ないし（８）を用意し、これらを24穴マル
チウエルプレートへ1mg宛分注した。これに表１に示す
各種細胞を１×10⁵個/mlの割合で播種し、37℃,5％炭酸
ガス培養器中で３日間培養したのち、コールターカウン
ターで細胞数を計数し、表１の結果を得た。

表１の結果から、PEGまたは／およびPVAとLDLとを添加
すると、各種細胞に対して幅広く細胞増殖を示すことが
明らかである。

実施例４実施例１と同じ基礎培地にITESを添加した培地（１）、
更にこれに0.1％PEG20,000を添加した培地（２）、培地
（１）に0.1％PVA（平均重合度500）を添加した培地
（３）、培地（１）に0.05％PEG20,000と0.05％PVA（平
均重合度500）とを添加した培地（４）、およびその各
々に参考例に従って調製したヒトLDL10μg/mlを添加し
た培地（５）ないし（８）を用意し、これらを24穴マル
チウエルプレートへ1ml宛分注した。これに表２に示す
各種細胞を１×10⁵個/mlの割合で播種し、37℃,5％炭酸
ガス培養器中で３日間培養したのち、コールターカウン
ターで細胞数を計数し、表２の結果を得た。

表２の結果から、PEGまたは／およびPVAとLDLとを添加
すると、各種細胞に対して幅広く細胞増殖を示すことが
明らかである。

参考例２実施例１と同じ基礎培地にITESを添加し、更にこれに0.
1％PEG20,000を添加した培地（１）、10μg/mlヒトLDL
を添加した培地（２）、0.1％PEG20,000と10μg/mlヒト
LDLとを添加した培地（３）を用意し、これらをそれぞ
れ100mlスピナーフラスコへ仕込み、これにマウス・ヒ
ト−ヒトヘテロハイブリドーマN12−16・63・49・19・6
9株を１×10⁵個/mlになるように添加し、回転数25rpm,3
7℃にて６日間培養し、細胞数および抗体産生量を測定
した。結果を表３に示す。

上記培地（３）の培養液上清１に硫酸アンモニウムを
添加して０〜45％飽和で沈澱する画分を集め、5mMEDTA
を含む5mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透析
し、生じる沈澱を集め、5mMEDTAと0.5MNaClとを添加し
た50mMトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）3.2mlに溶解させた
のち、同じ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−300ゲ
ルカラム（約100ml）にかけ、活性画分を集めたとこ
ろ、約13mgの抗破傷風トキソイドヒトIgMが得られた。

参考例３実施例１と同じ基礎培地にITESを添加した培地，さらに
これに0.25％PEG20,000を添加した培地を用意し、これ
を24穴マルチウエルプレートへ1ml宛それぞれ分注し
た。これらに、それぞれW471−7.24細胞（IFO 50094）
を１×10⁵個/mlの割合で播種し、37℃,5％炭酸ガス培養
器中で５日間培養したのちコールターカウンターで細胞
数を計数し、表４の結果を得た。

発明の効果本発明の動物細胞増殖用組成物は、血清無添加の状態で
も、広範囲の動物細胞に対して細胞増殖作用を示すもの
で、該組成物による培地を用いると動物細胞を大量に効
率良く増殖させることができる。また、生理活性物質を
生産する動物細胞を培養すると、該細胞が大量に効率良
く増殖されるので、生理活性物質を効率よく生産させる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた各種濃度ヒトLDLの添加
効果を示す。第２図は、実施例２で得られた各種濃度ブタLDLの添加
効果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリエチレングリコールまたは／およびポ
リビニールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有して
なる動物細胞増殖用組成物。
【請求項２】固体状態にある特許請求の範囲第１項記載
の組成物。
【請求項３】水溶液である特許請求の範囲第１項記載の
組成物。
【請求項４】血清を含まない特許請求の範囲第３項記載
の組成物。
【請求項５】ポリエチレングリコールまたは／およびポ
リビニールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有して
なる動物細胞増殖用培地で動物細胞を培養することを特
徴とする動物細胞の増殖方法。
【請求項６】動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地
である特許請求の範囲第５項記載の増殖方法。