JPS631347B2

JPS631347B2 -

Info

Publication number: JPS631347B2
Application number: JP54076378A
Authority: JP
Inventors: Berugaa Deiitaa; Buraun Furantsu; Furai Gyuntaa; Gyuutorain Uerunaa; Uerunaa Uorufugangu
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1978-06-20
Filing date: 1979-06-19
Publication date: 1988-01-12
Also published as: DE2826965A1; CS220789B2; US4331760A; CA1129848A; HU179435B; EP0007407B1; DE2960421D1; EP0007407A1; JPS552992A; ZA793037B; ATE90T1; YU142679A

Description

【発明の詳細な説明】体液、特に尿中の白血球の検出は腎及び泌尿生
殖器系の疾患の診断に極めて優れている。

従来、この検出は遠心分離されていない尿又は
尿沈渣中の白血球を苦労にも数えることにより行
なわれた。明らかに両方法とも完全な白血球だけ
を把握するに過ぎない。他方、白血球溶解速度は
尿環境により著しく変動することは知られてお
り、それ故例えば強アルカリ性尿中では僅か60分
間の白血球半減期が計算される。非常に低い白血
球数もしくは長時間の尿放置で偽陰性所見が得ら
れる。

溶解誤差を除いて、計算盤において遠沈されて
おらずにホモゲナイズした尿中の白血球の顕微鏡
による定量的測定により信用できる数値が得られ
る。しかし実際にはこの方法は余り利用されてい
ない。それというのもそれは煩雑でありかつ時間
をロスし、訓練された者だけが使用することがで
きるからである。

医療実地において、殆んどの尿中白血球測定は
所謂尿沈渣の視野法により実施される。この際
に、初めに被検体（沈渣）を遠心分離により取得
しなければならない。しかしその際に尿の他の成
分もまた富化され、例えば上皮細胞及び塩のよう
なそれらが白血球の顕微鏡計測を著しく妨害しう
る。変動する沈渣含量、沈渣の不均一性並びに場
合により異なる顕微鏡による拡大又は異なる顕微
鏡の光学的装置により、顕微鏡視野当りの白血球
数に関する“定量”という表現は数百％の誤差を
包含し得る。

それ故、本発明の課題は、体液中の白血球を容
易に取り扱える簡便な方法で並びに可能な限り迅
速かつ完全に検出することができる診断剤を開示
することであつた。

そのような白血球試験の検出原理としては、白
血球が広範囲の酵素スペクトルを有しているので
酵素反応が使われる。

既に、米国特許第3087794号明細書に白血球検
出が記載されかつ特許請求されており、その検出
は顆粒性白血球中に存在するペルオキシダーゼ活
性を介して行なわれる。過酸化水素と有機指示
薬、例えばｏ−トリジンを含浸させた吸収性担体
は有色の酸化生成物の形成により白血球の存在を
示す。しかしそのような試験は決定的な欠点を有
している。１つは全く一般的にペルオキシダーゼ
反応は例えばアスコルビル酸のような尿中の還元
物質により著しく妨害され易い。更に、いくつか
の文献［例えばL.Mettler著、“Med.Welt”、23
巻、399頁（1972年）参照］に、偽陰性所見の原
因となる、尿中の白血球ペルオキシダーゼの不安
定性が言及されている。

数年来、組織−及び細胞化学的酵素学におい
て、測定すべき組織中に存在する酵素のエステル
分解活性に基づいている比色定量検出法が確立し
ている［例えばA.G.E.Pearse、組織化学、理論
及び応用（Histochemistry、Theoretical and
Applied）参照］。その場合、原理的には無色又
は薄色のエステルを使用し、これは酵素分解によ
りたいていの場合無色の酸成分及び同様に無色の
アルコール−（フエノール）−成分に分解される。
後者が酵素けん化に引続く反応で着色生成物に変
換される（例えばジアゾニウム塩とのカツプリン
グ又は酸化反応）。

例えば、F.シユマルツル（Schmalzl）及びH.
ブラウンシユタイナー（Braunsteiner）は
“Klin.Wschr.”、46巻、642頁（1968年）に基質と
してのナフトール−ASD−クロル−アセテート
と着色アゾ化合物を形成するためのジアゾニウム
塩とを用いる特異性細胞化学的白血球エステラー
ゼ検出を記載している。

例えば尿のような体液中の白血球を迅速かつ簡
便に検出するための診断剤にはこの種の２成分系
は適当ではないことが明らかである。それという
のも周知のように尿中に現出する多くの化合物、
例えばウロビリノーゲン、ステルコビリノーゲ
ン、ビリルビン等がジアゾニウム塩と反応するか
らである。しかもこの検出法は鈍感過ぎる。例え
ば白血球数5000／μの試料は反応を呈しない。

ところで、驚異的にも中性好性顆粒性白血球中
に現出するエステラーゼを検出する基質としてス
ルホンフタレインエステルを使用する場合に、体
液中の白血球を良好に検出する安定かつ迅速に呈
示する診断剤が判明した。

それ故、本発明の目的は、白血球中に存在する
エステラーゼを検出する基質として一般式：［式中R₁は場合によりハロゲン又は低級アル
コキシ基により置換されているカルボン酸基を表
わすか又はペプチド化学で常用の窒素保護基を有
するアミノ酸基又は天然Ｌ−α−アミノ酸２〜４
個から成るペプチド基を表わし、 R₂はハロゲン原子又は低級アルキル基を表わ
し、 R₃及びR₄は同じか又は異なつていてよく、
各々水素原子又はハロゲン原子を表わす］のスル
ホンフタレインエステルを使用する、色原体及び
常用の添加物が含浸されている吸収性担体より成
る、体液中の白血球を検出するための診断剤であ
る。但し、一般式のスルホンフタレインエステ
ルは大部分が新規化合物であるが、既に、ジ−ア
セチル−3′，5′，3″，5″−テトラブロム−フエノ
ールスルホンフタレイン（＝ブロムフエノールブ
ル−ジ−アセテート）及びジ−ベンゾイル−3′，
5′，3″，5″−テトラブロム−フエノールスルホン
フタレイン（＝ブロムフエノールブル−ジ−ベン
ゾエート）は文献により公知である［W.R.
Orndorff、F.W.Sherwood共著、“J.Amer.Chem.
Soc.”、45巻、486頁（1923年）］ので、これらを
本発明から除く。

それ故、更に本発明の目的は一般式′：［式中R₂，R₃及びR₄は前記のものを表わしか
つR₁′はR₁と同じものを表わすが、但しR₂及びR₃
が臭素原子を表わしかつR₄が水素原子を表わす
場合にはアセチル基又はベンゾイル基ではない］
の新規スルホンフタレインエステル並びにその製
法である。

一般式′の新規スルホンフタレインエステル
の製造は公知方法で行なうことができる。有利に
は、公知方法で一般式：［式中R₂，R₃及びR₄は前記のものを表わす］
を有する相応する公知のスルホンフタレインを一
般式： HO−R₁′ （）［式中R₁′は前記のものを表わす］の酸もしく
はその適当な反応性誘導体と反応させる。

カルボン酸エステルを製造する際に、反応性誘
導体としては、特に相応するカルボン酸アンヒド
リド又はカルボン酸クロリドを場合により第三ア
ミンの添加下に使用する。アミノ酸エステル及び
ペプチドエステルを製造するために、ペプチド化
学で常用の合成法、例えば混合−アンヒドリド−
及び酸クロリド−法を適用する。

置換基R₁′，R₂，R₃及びR₄の定義中のハロゲン
とは弗素、塩素及び臭素、殊に塩素及び臭素であ
る。

置換基R₁′の定義中の“低級アルコキシ基”並
びに置換基R₂の“低級アルキル基”は炭素原子
１〜５個、殊に１〜３個を含有し、メトキシ基或
いはメチル基が特に優れている。

置換基R₁′のカルボン酸基としては炭素原子１
〜７個、殊に１〜４個の脂肪族カルボン酸或いは
例えば安息香酸又はナフトエ酸のような芳香族カ
ルボン酸の基が該当する。アセチル基、プロピオ
ニル基及びベンゾイル基が特に優れている。

置換基R₁′のアミノ酸基としては、ニトロ基に
より置換されていてよくかつ場合により存在する
ヒドロキシ基が場合により常用の酸素保護基、例
えばアセチル基を有する天然Ｌ−α−アミノ酸、
特にＬ−アラニン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−
リシン、Ｌ−チロシン及びＬ−アルギニンの基が
優れている。

ペプチド化学において常用の窒素保護基として
は例えばアシル基、オキシカルボニル基、チオカ
ルボニル基、スルホニル基、ビニル基、シクロヘ
キセニル基、ホスホリル基又はカルバモイル基が
挙げられる。

置換基R₁′の定義中のペプチド基とは前記の天
然Ｌ−α−アミノ酸２〜４個から成るものであ
る。

本発明で色原体として使われる一般式′のス
ルホンフタレインエステルは含浸溶液１当り濃
度10^-4〜10^-1モル、殊に10^-3〜10^-2モルで使用す
る。

白血球検出用の診断剤の他の成分は好適な緩衝
液系である。これには例えばリン酸塩−、バルビ
ツル酸塩−、硼酸塩−、トリス−（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン−（トリス−）、２−アミノ
−２−メチル−プロパンジオール−１，３−（ア
メジオール−）又はアミノ酸緩衝液が該当し、そ
の際にPH値及び緩衝能は、試験片を体液中に浸漬
した後でこの片上でPH値が６〜10、殊に７〜９に
なるように選択すべきである。

更に、本発明による体液中の白血球を検出する
ための診断剤を製造する際に、一層短い反応時間
が達成されるので付加的に表面活性剤を使用する
と有利である。

有利にはカチオン活性湿潤剤、例えば第四ピリ
ジニウム塩を濃度0.05〜２％、殊に0.1〜0.5％で
使用する。

本発明による診断剤を製造するために、有利に
は吸収性の担体、例えば紙、セルロース又はプ
ラスチツク繊維フリースに易揮発性溶剤、例えば
水、メタノール、エタノール又はアセトン中の、
試験片の製造に常用の必要反応成分（基質、緩衝
液、場合により表面活性剤或いは増粘剤、例えば
ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ
ース及び澱粉、安定化剤、例えばアミノ酸、色
素、例えばタートラジン等）の溶液を含浸させ
る。これを２つの別の工程で行なうと有利であ
る：初めに緩衝液を含有する水溶液で含浸させ、
その後で一般式のエステラーゼ基質の溶液で含
浸させる。特別な場合には、逆の含浸順序を適用
することもできる。製造した試験紙をそのままで
使用することができるし或いは公知方法でグリツ
プに接着するか又は有利に西ドイツ国特許第
2118455号明細書によりプラスチツクと微細なメ
ツシユのネツト材との間に封入することができ
る。

被検体液中に浸漬後、迅速にかつ操作し易い方
法で白血球の存在を呈色反応により示す診断剤が
得られる。中性好性顆粒白血球中に現出するエス
テラーゼの活性は白血球の溶解後でも完全に得ら
れるので、本発明による診断剤を用いて完全なか
つまた溶解した白血球が確認される。従つて、溶
解誤差は起らない。

例１紙（例えばSchleicher＋Schull23SL）を順序
に次の溶液で含浸し、その後で60℃で乾燥させ
る：溶液１トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
0.61ｇ塩酸、0.1N 約５ml 水、蒸留合計100ml この溶液を0.1N−塩酸でPH値9.0に調節する。

溶液２ジ−アセチル−４，５，６，７，3′，5′，3″，
5″−オクダブロム−フエノールスホンフタレイ
ン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−アセ
テート） 0.107ｇアセトン合計100ml 白色の試験紙が得られ、これは白血球含有尿中
に浸漬すると青色に変色する。次のものが検出さ
れる：白血球数5000／μ（尿）、約２分間で白血球数2000／μ（尿）、約５分間で白血球数1000／μ（尿）、約10分間で白血球数500／μ（尿）、約15分間で該試験の感度は白血球数約500／μである。

ジ−アセチル−４，５，６，７，3′，5′，3″，
5″−オクタブロム−フエノールスルホンフタレイ
ン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−アセテ
ーセ）の代りに次の基質を使用する場合に、同じ
特性（感度：白血球数300〜1000／μ）を有す
る試験紙が得られる： (a) ジ−アセチル−3′，3″−ジクロル−フエノー
ルスルホンフタレイン（＝クロルフエノールレツド−ジ−アセテー
ト）は白血球含有尿中に浸漬する際に赤色の反応
生成物が生じる。

(b) ジ−アセチル−5′，5″−ジブロム−ｏ−クレ
ゾールスルホンフタレイン（＝ブロムクレゾールパープル−ジ−アセテー
ト）では紫色の反応生成物が生じる。

(c) ジ−アセチル−3′，5′，3″，5″−テトラブロ
ム−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムフエノールブル−ジ−アセテート）
（参考例）により青色の反応生成物が生じる。

(d) ジ−アセチル−3′，3″−ジブロム−5′，5″−
ジクロル−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムクロルフエノールブル−ジ−アセテ
ート）により青色の反応生成物が生じる。

(e) ジ−アセチル−４，５，６，７−テトラブロ
ム−3′，5′，3″，5″−テトラクロル−フエノー
ルスルホンフタレイン（＝テトラブロム−テトラクロルフエノールブ
ル−ジ−アセテート）で青色の反応生成物が生じ
る。

(f) ジ−クロルアセチル−3′，3″−ジブロム−5′，
5″−ジクロル−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムクロルフエノールブル−ジ−クロル
アセテート）で青色の反応生成物が生じる。

(g) ジ−クロルアセチル−3′，5′，3″，5″−テト
ラブロム−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムフエノールブル−ジ−クロルアセテ
ート）で青色の反応生成物が生じる。

(h) ジ−クロルアセチル−４，５，６，７，3′，
5′，3″，5″−オクタブロム−フエノールスルホ
ンフタレイン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−クロル
アセテート）で青色の反応生成物が生じる。

(i) ジ−（２−メトキシ−プロピオニル）−４，
５，６，７，3′，5′，3″，5″−オクタブロム−
フエノールスルホンフタレイン［＝テトラブロムフエノールブル−ジ−（２−
メトキシ−プロピオネート）］で青色の反応生成
物が生じる。

(j) ジ−ベンゾイル−４，５，６，７，3′，5′，
3″，5″−オクタブロム−フエノールスルホンフ
タレイン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−ベンゾ
エート）で青色の反応生成物が生じる。

例２紙（例えばSchleicher＋Schu¨ll23SL）に順序
に次の溶液を含浸させ、その後60℃で乾燥させ
る：溶液１ジ−ナトリウム−テトラボレート−デカヒドレ
ート 1.91ｇ塩酸、0.1N 約20ml 水、蒸留、合計100ml 溶液を0.1N−塩酸によりPH値9.0に調節する。

溶液２ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フ
エニルアラニル）−3′，5′−3″−5″−テトラブロ
ム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−
（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フエニ
ルアラニル）−ブロムフエノールブル−］
0.123ｇアセトン合計100ml 白血球含有尿中に浸漬する際に約10分後に青色
に変る白色試験紙が得られる。この試験の感度は
白血球数約1000／μである。

ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フ
エニルアラニル）−3′，5′，3″，5″−テトラブロム
−フエノールスルホンフタレインの代りに次の基
質を使う際に同じ特性（感度：白血球数800〜
3000／μ）を有する試験紙が得られ、その際に
すべての場合に白血球含有尿中へ浸漬する際に青
色の反応生成物が生じる： (a) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル）−3′，5′，3″，5″−テトラブロム−フ
エノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニル）−ブロムフエノールブル−］ (b) ジ−（N〓，N〓−ジ−ベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リシル）−3′，5′，3″，5″−テトラブ
ロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（N〓，N〓−ジ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−リシル）−ブロムフエノールブル−］ (c) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−
アセチル−Ｌ−チロシル）−3′，5′，3″，5″−テ
トラブロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ
−アセチル−Ｌ−チロシル）−ブロムフエノール
ブル−］ (d) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−
エトキシカルボニル−Ｏ−アセチル−Ｌ−チロ
シル）−3′，5′，3″，5″−テトラブロム−フエノ
ールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ
−エトキシカルボニル−Ｏ−アセチル−Ｌ−チロ
シル）−ブロムフエノールブル−］ (e) ジ−（N〓−ベンジルオキシカルボニル−N〓
−ニトロ−Ｌ−アルギニル）−3′，5′，3″，5″−
テトラブロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（N〓−ベンジルオキシカルボニル−
N〓−ニトロ−Ｌ−アルギニル）−ブロムフエノー
ルブル−］ (f) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アラニル）−3′，5′，3″，5″−テ
トラブロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニル−Ｌ−アラニル）−ブロムフエノール
ブル−］ (g) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル）−４，５，６，７，3′，5′，3″，5″−
オクタブロムフエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニル）−テトラブロムフエノールブル−］例３紙（例えばSchleicher＋Schull23SL）を次の
溶液で順序に含浸させかつその後60℃で乾燥させ
る：溶液１トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
0.61ｇ塩酸、0.1N 約５ml ラウリルピリジニウムクロリド 0.2ｇ水、蒸留合計100ml この溶液を0.1N−塩酸でPH9.0に調節する。

溶液２ジ−アセチル−４，５，６，７，3′，5′，3″，
5″−オクタブロムフエノールスルホンフタレイ
ン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−アセ
テート） 0.107ｇアセトン合計100ml 白色の試験紙が得られ、これは白血球含有尿中
に浸漬する際に約１分後に青色に変色する。該試
験の感度は白血球数約500／μである。

例１及び２による他の基質を用いても、例えば
前記のラウリルピリジニウムクロリドのような湿
潤剤を使つて、湿潤剤を含有しない同じ試験紙に
比べて1/2に短縮した反応時間を有する試験紙が
得られる。

例４ジ−アセチル−４，５，６，７，3′，5′，3″，
5″−オクタブロム−フエノールスルホンフタレ
イン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−ア
セテート）テトラブロムフエノールブル−5.0ｇ（５ミリ
モル）を新しく蒸留した無水酢酸54ｇ＝50ml
（0.45モル）中で加温下に溶解しかつ３時間還流
加熱する。溶液を真空中で濃縮後、油状残渣を少
量のイソプロパノールと共に撹拌しかつトルエン
から再結晶させる。このようにして得られたジ−
アセテートは166〜167℃で溶融しかつ五酸化二リ
ン上で60℃で乾燥させる際に生じる結晶酢酸２モ
ルを含有する。テトラブロム−フエノールブル−
ジ−アセテート4.2ｇ（＝77.4％）が得られる；
無色結晶、融点174℃（分解）。

同じ方法で相応して置換されているフエノール
スルホンフタレインから次の化合物が得られる： (a) ジ−アセチル−3′，3″−ジクロル−フエノー
ルスルホンフタレイン（＝クロルフエノールレツド−ジ−アセテー
ト）、無色、結晶、融点132℃（分解） (b) ジ−アセチル−5′，5″−ジブロム−Ｏ−クレ
ゾールスルホンフタレイン（＝ブロムクレゾールパープル−ジ−アセテー
ト）、無色結晶、融点117℃（分解） (c) ジ−アセチル−3′，3″−ジブロム−5′，5″−
ジクロル−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムクロルフエノールブル−ジ−アセテ
ート）、無色結晶、融点217℃（分解） (d) ジ−アセチル−４，５，６，７−テトラブロ
ム−3′，5′，3″，5″−テトラクロル−フエノー
ルスルホンフタレイン（＝テトラブロム−テトラクロルフエノールブ
ル−ジ−アセテート）、無色結晶、融点253〜254
℃（分解）例５ジ−クロルアセチル−４，５，６，７，3′，
5′，3″，5″−オクタブロム−フエノールスルホ
ンフタレイン（＝テトラブロムフエノールブル
−ジ−クロルアセテート）無水テトラヒドロフラン100ml中のテトラブロ
ムフエノールブル−5.0ｇ（50ミリモル）の溶液
に無水ピリジン0.81ml（10ミリモル）を撹拌下に
加えかつ無水テトラヒドロフラン３ml中の新しく
蒸留したクロルアセチルクロリド1.18ｇ＝0.79ml
（10.5ミリモル）の溶液を10℃で冷却下に滴加す
る。室温で２時間撹拌した後、形成したピリジン
ヒドロクロリドを吸引別しかつ液を真空中で
50℃で濃縮する。油状残渣6.1ｇが得られ、これ
をイソプロパノール50mlと沸騰加熱し、不溶分を
分離する。氷浴中で冷却後、テトラブロムフエノ
ールブル−ジ−クロルアセテート3.9ｇ（＝68.7
％）を単離する；弱帯黄色結晶、融点226〜227℃
（分解）。

同じ方法で相応して置換されているフエノール
スルホンフタレインと相応する酸塩化物から次の
化合物が得られる： (a) ジ−クロルアセチル−3′，5′，3″，5″−テト
ラブロム−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムフエノールブル−ジ−クロルアセテ
ート）、無色結晶、融点206〜207℃（分解） (b) ジ−クロルアセチル−3′，3″−ジブロム−5′，
5″−ジクロル−フエノールスルホンフタレイン（＝ブロムクロルフエノールブル−ジ−クロル
アセテート）、無色結晶、融点172℃（分解） (c) ジ−（２−メトキシ−プロピオニル）−４，
５，６，７，3′，5′，3″，5″−オクタブロム−
フエノールスルホンフタレイン［＝テトラブロムフエノールブル−ジ−（２−
メトキシ−プロピオネート）］、無色結晶、融点
214〜216℃（分解） (d) ジ−ベンゾイル−４，５，６，７，3′，5′，
3″，5″−オクタブロム−フエノールスルホンフ
タレイン（＝テトラブロムフエノールブル−ジ−ベンゾ
エート）、無色結晶、融点196〜197℃（分解）例６ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル）−3′，5′，3″，5″−テトラブロム−フ
エノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル）−ブ
ロムフエノールブル−］溶液１混合アンヒドリドを製造するために、Ｎ−ベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン3.13ｇ（14
ミリモル）を無水テトラヒドロフラン50ml中に溶
かし、トリエチルアミン1.93ml（14ミリモル）を
加えかつ−15〜−20℃に冷却する。その後、クロ
ル蟻酸エチルエステル1.34ml（14ミリモル）を撹
拌下にピペツト添加しかつ反応混合物を水遮断下
に20〜30分間冷浴中に放置する。

溶液２ブロムフエノールブル−4.69ｇ（７ミリモル）
を無水テトラヒドロフラン45ml中に溶解しかつ−
10〜−15℃に冷却する。

反応混合アレヒドヒドを形成する際に溶液１から析
出するトリエチルアミンヒドロクロリドを迅速に
吸引別しかつ液を溶液２に加える。これにピ
リジン２mlを添加しかつ湿分排除下に−15℃で撹
拌する。その際に徐々に二酸化炭素が発生する。

約２時間後に２度目に、約16時間後に３度目に
等量の改めて調製し、吸引取した混合アンヒド
リド（溶液１）をこれに加えかつその後約５時間
−15℃で更に撹拌する。後処理するために、反応
混合物に数滴の水を加え（過剰のアンヒドリドを
分解するために）かつ溶剤を真空中で留去させ
る。残渣を酢酸エステル100ml中に採りかつ順次
に1N−クエン酸30ml、水20ml、７％−炭酸水素
ナトリウム溶液70ml及び２回水25mlで洗浄する。
硫酸ナトリウム上で乾燥後、酢酸エステル相を真
空中で蒸発濃縮する。帯黄色の粘性粗製物11.3ｇ
が得られ、これをトルエン／ジオキサン／酢酸エ
ステル−混合物（９：２：１）を用いて珪酸ゲル
でカラムクロマトグラフイー処理により精製す
る。

このようにしてジ−（Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アラニル）−3′，5′，3″，5″−テトラ
ブロム−フエノールスルホンフタレイン5.5ｇ
（68％）が無色の無定形粉末として得られる；α²⁰ _D
＝−33.6゜（Ｃ＝１％、メタノール）。分析により、
化合物は水0.39モル、ジオキサン0.19モル、トル
エン0.60モルを含有する。

同じ方法で、相応して置換されているフエノー
ルスルホンフタレインを種々のアミノ酸と反応さ
せることにより次の化合物が得られる： (a) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
フエニルアラニル）−3′，5′，3″，5″−テトラブ
ロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−フエニルアラニル）−ブロムフエノールブル−］
無色、無定形粉末、α²⁰ _D＝−33.5゜（Ｃ＝１％、酢酸
エステル） (b) ジ−（N〓，N〓−ジ−ベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リシル）−3′，5′，3″，5″−テトラブ
ロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（N〓，N〓−ジ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−リシル）−ブロムフエノールブル−］
無色、無定形粉末、α²⁰ _D＝−15.0゜（Ｃ＝１％、酢酸
エステル） (c) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−
アセチル−Ｌ−チロシル）−3′，5′，3″，5″−テ
トラブロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−アセ
チル−Ｌ−チロシル）−ブロムフエノールブル−］
無色、無定形粉末、酢酸エステル0.6モル含有、
α²⁰ _D＝−35.3゜（Ｃ＝１％、酢酸エステル）この際に合成の副生成物として次のものが生じ
る：ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−
エトキシカルボニル−Ｏ−アセチル−Ｌ−チロ
シル）−3′，5′，3″，5″−テトラブロム−フエノ
ールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ
−エトキシカルボニル−Ｏ−アセチル−Ｌ−チロ
シル）−ブロムフエノールブル−］、無色、無定形
粉末、α²⁰ _D＝−19.5゜（Ｃ＝１％、酢酸エステル） (d) ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル）−４，５，６，７，3′，5′，3″，5″−
オクタブロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニル）−テトラブロムフエノールブル−］
無色、無定形粉末、α²⁰ _D＝−28.7゜（Ｃ＝１％、メタ
ノール）例７ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アラニル）−3′，5′，3″，5″−テ
トラブロム−フエノールスルホンフタレイン
［＝ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アラニル）−ブロムフエノール
ブル−］溶液１単一工程法により酸塩化物を製造するためにＮ
−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン−Ｌ
−アラニン1.18ｇ（４ミリモル）を無水ジメチル
ホルムアミド10ml中に溶解しかつ−30℃に冷却す
る。その後、撹拌及び冷却下に塩化チオニル0.32
ml（4.4ミリモル）をピペツトで測量添加しかつ
反応混合物を水の遮断下に冷浴（−30℃）中に30
分間放置する。

溶液２ブロムフエノールブル−1.34ｇ（２ミリモル）
を無水ジメチルホルムアミド10ml中に溶かしかつ
−10〜−20℃に冷却する。

反応溶液２を溶液１に加え、ピリジン１mlを加えか
つ−10〜−20℃で２時間撹拌し、次に室温で２時
間撹拌する。同量の改に製造した酸塩化物（溶液
１）並びにピリジンを合計してなお３回加える
が、その際にその都度前記の反応条件を保持す
る。

後処理するため、反応混合物を真空中で乾燥さ
せ、その後例６に記載したように更に処理する。

無定形粗製物2.67ｇが得られ、これをヘプタ
ン／酢酸エチルエステル−混合物（１：２）を用
いて珪酸ゲルでカラムクロマトグラフイー処理す
ることにより精製する。

ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−アラニル）−3′，5′，3″，5″−テトラ
ブロム−フエノールスルホンフタレイン1.4ｇ
（57％）が酢酸エチルエステル0.6モルを含有する
無色の無定形粉末として得られる；α²⁰ _D＝5.9゜（Ｃ
＝１％、酢酸エステル）。

同じ方法で次の化合物が得られる： (a) ジ−（N〓−ベンジルオキシカルボニル−N〓
−ニトロ−Ｌ−アルギニル）−3′，5′，3″，5″−
テトラブロム−フエノールスルホンフタレイン［＝ジ−（N〓−ベンジルオキシカルボニル−
N〓−ニトロ−Ｌ−アルギニル）−ブロムフエノー
ルブル−］無色、無定形粉末、クロロホルム0.6
モルを含有、α²⁰ _D＝−12.0゜（Ｃ＝１％、氷酢酸）

Claims

【特許請求の範囲】１一般式′：［式中R′₁はハロゲン又は低級アルコキシ基に
より置換されていてよいカルボン酸基を表わすか
又はペプチド化学で常用の窒素保護基を有するア
ミノ酸基又は天然Ｌ−α−アミノ酸２〜４個から
成るペプチド基を表わし、 R₂はハロゲン原子又は低級アルキル基を表わ
し、 R₃及びR₄は同じか又は異なつていてよく、
各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、その際に、R₂及びR₃が臭素原子を表わしかつ
R₄が水素原子を表わす場合にはR′₁はアセチル基
又はベンゾイル基ではない］の新規スルホンフタ
レインエステル。２一般式′：［式中R′₁はハロゲン又は低級アルコキシ基に
より置換されていてよいカルボン酸基を表わすか
又はペプチド化学で常用の窒素保護基を有するア
ミノ酸基又は天然Ｌ−α−アミノ酸２〜４個から
成るペプチド基を表わし、 R₂はハロゲン原子又は低級アルキル基を表わ
し、 R₃及びR₄は同じか又は異なつていてよく、
各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、その際に、R₂及びR₃が臭素原子を表わしかつ
R₄が水素原子を表わす場合にはR′₁はアセチル基
又はベンゾイル基ではない］のスルホンフタレイ
ンエステルを製造する方法において、公知方法で
一般式：［式中R₂，R₃及びR₄は前記のものを表わす］
の化合物を一般式： HO−R′₁ （）［式中R′₁は前記のものを表わす］の酸もしく
はその適当な反応性誘導体と反応させることを特
徴とする、新規スルホンフタレインエステルの製
法。３色原体及び適当な緩衝物質が含浸されている
吸収性担体より成る、体液中の白血球を検出する
ための診断剤において、色原体として一般式
′：［式中R′₁はハロゲン又は低級アルコキシ基に
より置換されていてよいカルボン酸基を表わすか
又はペプチド化学で常用の窒素保護基を有するア
ミノ酸基又は天然Ｌ−α−アミノ酸２〜４個から
成るペプチド基を表わし、 R₂はハロゲン原子又は低級アルキル基を表わ
し、 R₃及びR₄は同じか又は異なつていてよく、
各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、その際に、R₂及びR₃が臭素原子を表わしかつ
R₄が水素原子を表わす場合にはR′₁はアセチル基
又はベンゾイル基ではない］の新規スルホンフタ
レインエステルを使用することを特徴とする、該
エステルを含有する体液中の白血球を検出するた
めの診断剤。４担体が付加的な通常使われる助剤を含有す
る、特許請求の範囲第３項記載の診断剤。５担体が付加的な助剤として湿潤剤を含有す
る、特許請求の範囲第４項記載の診断剤。