JPH0359069B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、チオール基の検出・定量に有用な新
規な化合物又はその塩および該化合物又はその塩
を構成成分とするところのチオール基定量用組成
物、さらには該化合物又はその塩を用いることか
らなるチオール基の定量方法に関する。チオール
基を検出・定量する際の発蛍光試薬としては、従
来よりＮ置換マレイミド（町田等Chem.Pharm.
Bull.（Tokyo）25．1678（1977）、や奈良等Agric.
Biol、Chem.42、793（1978）、ダンシルアジリジ
ン（Fahey R.C.等Anal.Biochem.107、１
（1980）、ビメイン（Lankmyr E.P.等J.
Chromatogr.222、249（1981）およびアンモニウ
ム７−クロロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジア
ゾール−４−スルフオエート（以下「SBD−Cl
アンモニウム塩」と略す）（Andrews.J.L.等
Arch.Biochem.Biophys.214、386（1982））などが
知られている。 これ等のうち、SBD−Clは水に対する溶解性
が優れていること、チオール基との複合体の安定
性が良好であること、等の点で他の発蛍光試薬に
比べ、タンパク質中のチオール基の検出・定量な
ど生物学的な応用性が広い旨述べられている。
（Andaews J.L.等Arch.Biochem.Biophys.214、
386（1982）） しかしながら、SBD−Clのチオール基に対す
る反応性は低く、本発明者が検討したところによ
ると、アルカリ性水溶液（PH10）中、40℃で１時
間、さらに室温で24時間反応させてもチオール基
との反応率はわずかに数％でしかなく、従つて低
濃度のチオール基の定量に用いることができなか
つた。 このような現状の中で本発明者は驚くべきこと
に、SBD−Clの７位のクロル基をフルオロ基に
置換した新規化合物がチオール基に対し、著しく
高い反応性を有し、従つて極微量のチオール基が
定量できることを見出し、かかる知見から本発明
を完成した。 すなわち本発明は下記の構造式 で表わされる７−フルオロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾール−４−スルホン酸（以下
「SBD−Ｆ」と略す）又はその塩および該SBD−
Ｆ又はその塩を発蛍光剤として含有するチオール
基定量用組成物、さらには、該SBD−Ｆ又はそ
の塩を試料検体に加えて反応させ、生じた蛍光誘
導体の蛍光強度を測定することからなるチオール
基の定量方法である。 本発明化合物であるSBD−Ｆは文献未載の新
規化合物であり、例えば下記の反応図の如く７−
フルオロ−２−オキサベンゾ−１，３−ジアゾー
ルをスルホン化して得ることができる。 該スルホン化剤としては硫酸、発煙硫酸、三酸
化イオウまたピリジンやジオキサンなどとの付加
物、クロル硫酸、塩化スルフリルなどが挙げられ
るが、好ましくは発煙硫酸である。 反応に使用し得る溶媒は、アセトン、テトラヒ
ドロフラン、ベンゼン、ジエチルエーテル、ジメ
チルホルムアミド、ピリジン、アセトニトリル、
ジオキサン、クロロホルム、ジクロルメタン、ジ
クロルエタン、酢酸エチルの如き不活性有機溶媒
が用いられる。これらのうち親水性溶媒は水と混
合して使用することも可能である。 反応は通常、加温下で行なわれる。すなわち通
常は50〜150℃の範囲から選ばれるが好ましくは
100〜140℃である。 反応時間は、反応温度、反応に供せられる化合
物、溶媒等によつて異なるが通常0.5〜48時間、
好ましくは１〜24時間の範囲で適宜選択される。 反応混合物からの目的物の単離・精製は常法に
従つて容易に行なうことができる。例えば、ジク
ロルメタン、クロロホルム、酢酸エチルのごとき
有機溶媒による抽出、或は活性炭素、シリカゲ
ル、イオン交換樹脂、デキストラン架橋重合体、
スチレン若しくはアクリル酸エステルの多孔質重
合体等を用いた各種のクロマトグラフイーを適用
して行なうことができる。 出発物質の７−フルオロ−２−オキサベンゾ−
１，３−ジアゾールは既知化合物であり、例えば
Nunno等の方法（J.Chem.Soc(c)1433、1970）に
従つて製造することができる。 こうして得られたSBD−Ｆは通常油状物であ
るので常法により、すなわち該スルホン酸基を当
モル量の塩基で処理することによつて結晶性の
SBD−Ｆの塩として得ることができる。 該塩基は測定系に影響を与えなければ、SBD
−Ｆ中のスルホン酸基とイオン的に結合して塩を
形成する基をすべて含み、その塩としてはナトリ
ウム、カリウムの如きアルカリ金属との塩、カル
シウム、マグネシウムの如きアルカリ土類金属と
の塩、アンモニウム塩、エタノールアミン、トリ
エチルアミン、ジシクロヘキシルアミンの如き有
機アミン塩等の無機塩基若しくは有機塩基との塩
を挙げることができる。 本発明化合物のSBD−Ｆは、それ自身では蛍
光を示さず、チオール基と選択的に反応結合した
のち顕著な蛍光を示すことから、その蛍光強度を
測定すれば検体試料中のチオール基を検出・定量
することができる。本発明化合物のSBD−Ｆ又
はその塩それ自体、或いはSBD−Ｆ又はその塩
を発蛍光剤として含有する組成物を用いてチオー
ル基を定量する際、良好な反応性を期待するため
の好ましい条件は、試料に対し添加するSBD−
Ｆの量は、チオール基１モルに対し、10モル以
上、特に10²〜10⁴モルが好ましく、PHはアルカリ
性であること好ましくは９〜11、反応温度は20℃
以上好ましくは30〜70℃、反応時間は１分〜４時
間好ましくは30〜60分である。反応中のPHを維持
するためには緩衝液を用いることが望ましく、該
緩衝液としてはホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、
トリス塩酸緩衝液などが挙げられるが、ホウ酸緩
衝液が望ましい。チオール基と結合して得られた
蛍光誘導体を励起させ、生じた蛍光強度を測定す
るための励起波長および蛍光波長として、励起強
度は370〜390nｍ、好ましくは380nｍ、蛍光波長
は490〜530nｍ、好ましくは515nｍを選ぶことが
できる。 本発明化合物のSBD−Ｆは多くの特徴を有す
るが、列記すると次の如くである。 (1) チオール基との反応性が高いために、検出限
界を大幅に低下させることができる。 (2) 盲検値が低いので測定感度が良好である。 (3) 水または生物学的緩衝液に対する溶解性が高
い。 (4) 溶液状態での安定性が高い。水溶液状態では
室温中１週間以上も安定である。 (5) チオール基との誘導体の安定性が高い。PH
9.5の条件下では冷蔵庫中で１週間以上も安定
である。 本発明化合物のSBD−Ｆは、前述の特性から
10^-10乃至10^-8Mの微量のチオール化合物の蛍光
定量分析に応用できるばかりでなく、ひろく生体
組織試料を対象とし顕微鏡の視野内でチオール基
を検出するような組織学的検査、チオール基を含
有する蛋白質、ペプチドの定量、酵素中のチオー
ル基の機能の研究、膜、細胞、組織等の生体中の
チオール基の検出とこれら生体構成部分の構造と
機能の関係についての検討、種々の分泌液その他
の臨床試料中のチオール基の定量を基礎とした代
謝、臨床分析それらの自動化の基礎等、生化学、
生理学および基礎、臨床にわたる医学的研究に非
常に広範囲の応用が可能である。 チオール基の検出・定量に本発明の化合物を用
いる時は塩の状態が好ましく、而して該塩は常温
において固体であるので加工された固型物、例え
ば錠剤、凍結乾燥品等として他の必要成分例えば
キレート剤とともに使用に供することができる。 次に実施例をあげてさらに具体的に本発明を説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下
の実施例に制約されるのではない。 実施例 １ SBD−Ｆの合成 ７−フルオロ−２−オキサベンゾ−１，３−ジ
アゾール0.5ｇに発煙性の60％硫酸２mlを加え、
130〜140℃で４時間加熱還流させる。反応終了
後、反応液を氷浴中で冷却する。4N水酸化ナト
リウム溶液を加えてPH３〜４としベンゼン500ml
を加えて抽出する。有機層を硫酸ナトリウム上で
乾燥させて過し、液を減圧下に濃縮すると油
状物（0.4ｇ）を得た。 Ｉ Rν^KBr _nax（cm^-1）：1235、1190 実施例 ２ SBD−アンモニウム塩の製造 実施例１で得られた７−フルオロ−２−オキサ
ベンゾ１，３−ジアゾール−４−スルホン酸0.4
ｇを水に溶解させた後、氷冷中冷却しながら28％
アンモニア水を加えてPH８とする。 該溶液にエタノール１を加えて過し、沈澱
物を少量のエタノールで洗滌後、洗液と液を集
めてポリスチレン樹脂LS−110 P40（東洋曹達社
製、商品名）を用いたカラムクロマトグラフイー
（1.5cm×50cm）に付し、水で溶出させる。 溶出液に当量のエタノールを加えて100〜110℃
で共沸させた後、残渣をアセトニトリルとエタノ
ール（９：１）の混合液に溶解させ過する。
液を減圧下に濃縮すると白色の針状結晶物0.4ｇ
を得た。 分解点 290〜300℃ 元素分析 C₆H₆N₃O₄SFとして 計算値（％）Ｃ、30.64；Ｈ、2.57；Ｎ、17.87 実測値（％）Ｃ、30.80；Ｈ、2.52；Ｎ、18.14 NMR（DMSO−D₆、100MHz）δ（ppm）：7.816
（Ｓ、CH）、7.767（Ｓ、CH）、7.74（Ｓ、CH）、
7.691（Ｓ、CH）、7.505（Ｓ、CH）、7.429（Ｓ、
CH）、7.400（Ｓ、CH）、7.324（Ｓ、CH）、7.108
（Ｓ、NH₄） Ｕ Ｖ λ^H2O _naxｎｍ（ε）：261（2.43×10³）、272
（3.13×10³）、2.83（3.17×10³）、313（4.15×10³） 実施例 ３ EDTA 2Na（２ｍＭ）、グルタチオン（10μM）
を含む0.1Mホウ酸緩衝液（PH9.5）２mlとSBD−
Ｆアンモニウム塩またはSBD−Clアンモニウム
塩1.0ｍＭを各々含む0.1Mホウ酸緩衝液（PH9.5）
２mlとを混合した２群の検体試料を用意する。こ
れらの２群の検体試料を60±１℃に調整した恒温
槽中で種々の一定時間反応させ、反応終了後各検
体試料を氷水にて冷却した後、日立けい光光度計
650−10Sを用いて励起波長380nｍ、蛍光波長
515nｍで蛍光強度を測定した。結果を第１図に
示す。 実施例 ４ 次の６種類の物質について、その検出限界を求
めた。 ●グルタチオン ●コエンザイムＡ ●システアミン ●ホモシステイン ●アセチルシステイン ●システイン 上記物質を各々5μM含むEDTA 2Na（１ｍＭ）
含有0.1Mホウ酸緩衝液（PH9.5）を準備する。同
一の緩衝液で適当な濃度に希釈された各検体試料
２mlにSBD−Ｆアンモニウム塩（１ｍＭ）を含
む0.1Mホウ酸緩衝液（PH9.5）２mlを加え、この
混合液を60±１℃に調整した恒温槽中で１時間反
応させる。 反応終了後、各検体試料を氷水にて冷却した
後、実施例２と同様に蛍光光度計を用いて励起波
長380nｍ、蛍光波長515nｍで蛍光強度を測定し
た。 なお、検出限界は盲検査の２倍に設定した。さ
らに上記実験と平行して5μMのアラニンおよび
ブロリンを用いた対照実験を行つた。結果を表
に示す。

【表】 ＊：検出されなかつた
実施例 ５ 検量線の作成 ２ｍＭのSBD−Ｆアンモニウム塩を含むPH9.5
のEDTA 2Na（１ｍＭ）含有0.1Mホウ酸緩衝液
（以下の試料と略す）を準備する。 次に各種濃度のグルタチオンを含むPH9.5の
EDTA 2Na（１ｍＭ）含有0.1Mホウ酸緩衝液を
準備し、各濃度の試料１mlにそれぞれの試料１
mlを加え、以下実施例３と同様な方法でその蛍光
強度を測定した。 なお、上記実験と平行してグルタチオンを含ま
ないPHのEDTA 2Na（１ｍＭ）含有0.1Mホウ酸
緩衝液だけの盲検を行つた。結果を表に、また
そのプロツト図（検量線）を第２図に示す。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図はグルタチオンとの反応性を示す。図中
−○−はSBD−Ｆ、−●−はSBD−Ｆ−Clにおけ
る結果を示す。第２図は実施例５の検量線を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の構造式 で表わされる７−フルオロベンゾ−２−オキサ−
   １，３−ジアゾール−４−スルホン酸又はその
   塩。 ２ 下記の構造式 で表わされる７−フルオロベンゾ−２−オキサ−
   １，３−ジアゾール−４−スルホン酸又はその塩
   を発蛍光剤として含有するチオール基定量用組成
   物。 ３ 下記の構造式 で表わされる７−フルオロベンゾ−２−オキサ−
   １，３−ジアゾール−４−スルホン酸又はその塩
   を試料検体に加えて反応させ、生じた蛍光誘導体
   の蛍光強度を測定することからなるチオール基の
   定量方法。