JPS63145237A - 耐ウィルス性、貯蔵安定性、静脈内適合性の免疫グロブリンｇ製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、耐ウィルス性、貯蔵安定性、静脈内適合性の
免疫グロブリンＧ製剤の製造方法に関する。

（従来の技術並びに発明が解決しようとする問題点） 先天性または後天性の免疫欠損状態の治療のために、ヒ
ト血漿から分画化によって得られた免疫グロブリン製剤
がすでに３０年間以上用いられている。しかし、冷エタ
ノールによる分画化［コーン（ｃｏｈｎ）の分画化コに
よって得られた１ｇＧは静脈内投与では非常に重篤な副
反応が観察されるので、筋肉内にのみ使用可能である。

静脈内に使用可能な免疫グロブリン製剤は改良された効
果を示すので、アルコール分画化免疫グロブリンから静
脈内適合性の製剤を製造する方法がすでに発表されてい
る。クランケンハウスフアルマライ（Ｋｒａｎｋｅｎｈ
ａｕｓｐｈａｒｍａｚｌｅ）　６巻、５号（１９８５年
）　、２２８〜２３１頁の綜説に述べられているこれら
の方法では、１ｇ０分子を例えばプラスミンにより酵素
分解し、または例えばβ−プロピオラクトンにより化学
的に修飾し、または抗補体性凝集体の形成を特殊な沈降
方法、吸収方法、クロマトグラフィ方法、および安定剤
の添加によって阻止し、もしくは凝集体を除去して、非
修飾１ｇＧを製造することが試みられている。

酵素分解免疫グロブリン（Ｉｇ　Ｇ）と化学修飾１ｇＧ
はくこれらの対応方法が例えば半減期および効力の低下
または作用開始の遅延のような蛋白質性質の変化をもた
らすので、生の免疫グロブリンの全ての機能を満たすこ
とができない。

これらの欠点があるために、これらの方法に代りうる免
疫グロブリン分画化方法が開発されている。ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）／ヒドロキシエチル澱粉のようなコロイドに
よる沈降によっては、除去されないコロイドの注入が生
ずる。他方では、ウィルス濃縮方法としてのＰＥＧ沈降
方法が知られている。これらの分画化方法によっても、
高い抗補体活性は除去されていない。

ヒト血漿からの免疫グロブリンＧの単離に関して、バウ
ムスターク（ＢａｕｍＳｔａｒｋ）等はアーカイヴスオ
ブバイオケミストリイアンドバイオフイジツクス（Ａｒ
ｃｈｉｖｅｓ　ｏｌ’　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　ａ
ｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）１０８巻（１９８４年）、
５１４〜５２２頁に、イオン交換体、特にＤＥＡＥ−セ
ファデックスのような陰イオン交換体をこの分離に非連
続法で用いる方法を述べている。

スオメラ（ＳｕｏＩＩｌｅｌａ）等は「血漿蛋白質の分
離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ’　Ｐｌａｓｍａ　Ｐ
ｒｏｔｅｌｎｓ）　Ｊ　、カーリング（ｃｕｒｌｉｎｇ
）編集、ファーマシアファインケミカルス（Ｐｈａｒｏ
＋ａｃｉａ　Ｆｌｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１９８３
，１２７〜１３０頁に、血漿からの免疫グロブリンＧの
単離に特にゲル濾過、陰イオン交換体でのクロマトグラ
フィおよび陽イオン交換体でのクロマトグラフィを用い
る方法を述べている。

フリートリ（Ｆｒｉｅｄｌｌ）とキストラ−（Ｋｉｓｔ
ｌｅｒ）は、「血漿蛋白質の分画化方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｏｆ’ＰｌａｓＩＩｌａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒａ
ｃｔｌｏｎａｔｌｏｎ）　Ｊカーリング編集、アカデミ
ツクプレス（ＡｃａｄｅＩＩｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）１９
８０．２０３〜２１０頁に、ゲル濾過によってアルブミ
ン溶液からエタノールと塩を除去することを述べている
。マルチナッハ（Ｍａｒｔｉｎａｃｈｅ）とヘノン（Ｉ
ｌｅｎｏｎ）は同じ刊行物の２２３〜２３５頁に、エタ
ノールと塩の除去によるＩｇＧ溶液の精製への５ゲル濾
過の使用を述べている。

スオメラは同じ刊行物の１０７〜１１６頁において、市
販のＩｇＧ製剤は１ｇ０分子の分解をもたらす蛋白質分
離酵素、例えばプラスミノゲンを含んでいるので、通常
貯蔵安定性ではないことを警告している。スオメラは、
イオン交換体クロマトグラフィを用いて得たＩｇＧ製剤
からリシン−アガロースを用いるクロマトグラフィによ
ってプラスミノゲンを除去することを試みている。

しかし、これらの方法は蛋白質分解酵素を完全に除去す
るためには充分ではないことが確認されている。鈴木と
高橋は、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｅｏｌｏｇｙ）Ｊ　３４巻（１９７４）の４３２
〜４３５頁に偽グロブリン分画からアルギニン−アガロ
ースへの吸着によって純粋なプレカリクレインを得るこ
とを述べている。

免疫グロブリン分画は出発物質に依存して変動する量で
、プレカリクレイン、カリクレイン、プラスミノゲン、
プラスミン、トロンビンまたは第℃因子のような種々な
酵素を含有しうるので、これらの分画の特異性吸着剤に
よる処置は全ブロテイナーゼ活性を除去するために充分
ではない。

この他に、血液、ヒト血漿または血漿分画の適用によっ
て一般に、病原体ウィルスが伝達されうる。この場合、
生命を危険にさらす疾患を生ずるようなり型肝炎ウィル
ス、非Ａ／非Ｂ型肝炎ウィルスならびにエイズウィルス
が特に強調される。

従って、充分なウィルス不活化を生ずるような滅菌処置
の実施が血漿蛋白質の精製にとって不可欠である。この
ことは特に、１０００Å以上の給血者からのプールから
血漿分画を製造する場合にいえることである。

例えば第■因子、第■因子およびフィブリノゲンのよう
な凝固因子製剤に対してと同様に、血漿および幾つかの
血漿蛋白質分画に対する滅菌処理方法が公知である。こ
の場合に、例えば溶液中での熱処理、凍結乾燥状態での
加熱、蒸気圧下での加熱ならびに洗剤による滅菌処理が
あり、特に凝固因子製剤の製造の出発物質としての血漿
の滅菌処理に関しては西ドイツ特許第３０３３’９３２
号にβ−プロピオラクトンと紫外線照射とによる複合処
理方法が述べられている。

コーン分画化によって製造された免疫グロブリンは今ま
で耐ウィルス性と見なされていたので、免疫グロブリン
製剤の製造にとって滅菌処理は不必要であると今まで考
えられていた。しかし、ザランセット（Ｔｈｅ　Ｌａｎ
ｃｅｔ）１９８６年、３２２頁および５８１〜５８２頁
には、ＩｇＧ製剤によるＢ型肝炎、非Ａ／非Ｂ型肝炎、
Ａ型肝炎の伝染ならびに場合によってはエイズの伝染も
生ずることが述べられている。クロマトグラフィ精製し
た免疫グロブリンの使用に伴って、場合によっては非Ａ
／非Ｂ型肝炎の伝染も生ずる。従って、免疫グロブリン
に対して滅菌処理を行なうことが緊急に必要であるよう
に思われる。

クロマトグラフィ処理によって製造した免疫グロブリン
は液体状態では安定ではなく、ウィルス伝染の危険性を
伴っている。この製剤の加熱滅菌処理は凝集体の形成を
生じ、抗補体活性を高めるので、不可能である。ソルビ
マクロゴールオレエート（ＳＯｒｂｌｍａｅｒＯｇＯＩ
ＯＩｅａｔ）のような洗剤による処理は製剤から洗剤を
除去するために多額の費用を必要とする。β−プロピオ
ラクトンとの反応は、ステファン（ＳｔｅｐｈＢｎ）と
ディヒテルミュラ−（ＤＩｃｈｔｅｌｔｏｌ　１ｅｒ）
がアルツナイミッテルフォルシュング／ドラッグリサー
チ（Ａｒｚｎｃｉｎ＋、Ｐｏｒｓｃｈ、Ｄｒｕｇ　Ｒｅ
ｓ、）３３巻（１１）、９号、１２３０〜１２３１頁（
１９８０年）に示しているように、周知の条件下で確か
に耐ウィルス性の製剤を生ずるが、蛋白質の化学的修飾
をも生ずる。

本発明の目的は、抗補体活性を含まずそのために静脈内
適合性を有し、修飾されない完全で高純度の耐ウィルス
性、貯蔵安定性の免疫グロブリンＯ製剤を、凝固因子を
含まない血漿またはＩｇＧ含有血漿もしくはＩｇＧ含有
血清分画のイオン交換体による処理および限外濾過を伴
う、濃縮および多段階精製によって調製する工業的規模
で経済的に実施可能な製造方法を提供することである。

（問題点を解決するための手段） この目的は本発明によると、 （ａ）　　凝固因子を含まない血漿またはＩｇＧ含有血
漿分画から、透析濾過もしくはゲル濾過によって沈澱剤
を除去し、好ましいイオン組成に調節し、 （ｂ）　　得られた蛋白質溶液に対して、ＩｇＧを他の
蛋白質から分離するために、イオン交換体による分画化
を行ない、 （ｃ）　　得られたＩｇＧ溶゛液中の蛋白質分解酵素を
色素結合吸着剤を用いるアフィニティクロマトグラフィ
によって除去および／またはアンチトロンビンＩＩＩの
添加によって阻害し、（ｄ）　　このように安定化した
ＩｇＧ溶液を蛋白質濃度２０〜６０ｇ　／　ｌ　−ｐｉ
（値Ｂ、Ｏ〜６．０において０．０３〜０．０７％β−
プロピオラクトンによって処理し、蛋白質濃度５〜２０
ｔｒ／１まで稀釈した後に紫外線を照射し、 （ｅ）　　無菌化し稀釈したＩｇＧ溶液から低分子物質
を除去するために、この溶液をさらに透析濾過またはゲ
ル濾過し、 （ｆ）　　このように安定化し無菌化した溶液を好まし
い蛋白質濃度２〜１６％に調節し、無菌沢過する ことによって達成される。

本発明による方法は、ヒトからの出発物質によっても、
動物からの出発物質によっても実施することができる。

出発物質としては、凝固因子を含まない血漿、血清、ヒ
トアルブミンの工業的規模の製造の際に多量に発生し、
コーン分画化によって単離されたγグロブリン分画（コ
ーンペースト（ｃｏｈｎ−Ｐａｓｔ）　ＩＩまたはＩＩ
／ＩＩＩ）　、または塩沈澱によって（例えば、硫酸ア
ンモニウムによって）単離された粗γグロブリン分画が
用いられる。これらの出発物質は正常な給血者プールか
らも、またウィルス抗原と細菌抗原とに対して高い抗体
力価を有する特定の給血者からも得られる。

本発明による方法の出発物質として、凝固因子を含まな
い血漿またはコーンペースト■またはＵ／ｍを用いるの
が好ましい。

しかし、それ自体が治療的に非常に有効な、凝固因子の
血漿からの分離が、他方では、血漿のより以上の分画化
を妨げることが知られている。従って、例えば解凍プロ
セスから得られた寒冷沈降物を第■因子濃縮物の製造の
出発物質として用い、第■因子、第■因子１．第■因子
および第Ｘ因子（ＰＰＳＢ複合体）を陰イオン交換体へ
の吸着によって単離し、精製形で同様に治療的に用いる
ことができる。

それ故、本発明による方法の好ましい出発物質を得るた
めには、給血制度の基準に従って血漿搬出法によって得
られた血漿を＋４℃において解凍し、寒冷沈降物を遠心
分離によって除去する。ＰＰＳＢｆ！合体から凝固因子
を例えばジエチルアミノエチル基によって置換した架橋
デキストランのような陰イオン交換体への吸着によって
分離する。このようにして処理した血漿に対して、残留
フィブリノゲンを除去するために、エタノールによる沈
澱を行なう。この段階は必ずしも必要ではないが、この
段階を経ることによって次のクロマトグラフィ段階にお
けるカラム材料の汚染が避けられる。この方法段階の条
件すなわち８〜１１％のエタノール濃度と４，５〜６．
５のｐＨ値は、免疫グロブリン分画中で凝集体が形成さ
れないように選択する。

このように処理した血漿は次の組成を示す：蛋白質含量
　　　　４０　〜５５ｇ／ｌＩｇＧ含量　　　　　　５
．０〜７．５ｇ　／　１アルコ一ル濃度　　８〜１１　
　％ α１−グロブリン　２．５〜３．５％ α２−グロブリン　７．０〜９．５％ β　−グロブリン　７．０〜９，０％ γ　−グロブリン　１１　〜１５　　％アルブミン　　
　　６２　〜６８　　％（セルロースアセテート膜によ
る電気泳動） この凝固因子除去血漿または濃縮免疫グロブリン分画も
、その前処理のために、かなりの量でアルコール（エタ
ノール）または他の沈澱剤を含んでいる。さらに、血漿
の自然の組成によってまたは前処理によってイオン性環
境が与えられる。

さらに加工するためには、アルコールまたは沈澱剤を除
去して、定義されたイオン性環境を設定することが必要
である。それ故、次の方法段階ではアルコールまたは沈
澱剤の分離と、好ましいイオン組成の調節とを行なう。

これは５〜ｌＯ倍の交換量による透析濾過によって行な
うことができる。このためには、平たい膜としてもまた
中空繊維としても配置することのできる、排除限界ｌＯ
〜１００，０００ダルトンの限界濾過膜を用いる。この
プロセスの終了時には、好ましい蛋白質濃度（２０〜３
０ｇ／ｌ）に調節される。この方法段階のためにはゲル
濾過を行なうのが好ましい。ゲル濾過の原理はアルコー
ルや塩のような低分子物質の通過は妨げるが、血漿蛋白
質のような高分子物質はゲルマトリックスと相互作用す
ることなく通過させるような多孔質ゲル材料を用いるこ
とに基づいている。この原理を利用して低分子物質を分
離し、同時に移動相の組成に応じて好ましいイオン組成
に調節する。

ゲル濾過のためには、２〜１０．０００ダルトンの排除
限界を有する、例えば架橋デキストラン、Ｎ−アクリロ
イル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プ
ロパンジオールのコポリマー、またはセファデックスＧ
２５、トリスアクリルＧＦＯ５もしくはセルファインＧ
Ｈ２５のようなセルロースを主成分とするようなゲル材
料が適している。

蛋白質溶液を塗布する前に、クロマトグラフィカラム中
に依存するゲルを好ましい緩衝系と平衡化させる。陰イ
オン交換体または陽イオン交換体で新たな処理を行なう
かどうかに応じて、モル濃度０．０１〜０．０５とｐＨ
値４．５〜６．５を有する緩衝系が適している。

このように処理した蛋白質溶液はアルコールと妨害性塩
とを含まず、次のような組成を有する。

蛋白質含量　　　　２０　〜３０ｇ／ｕＩｇＧ含量　　
　　　　２．５〜３．７ｇ／　１α１−グロブリン　２
．５〜３．５％ α°２−グロブリン　７．０〜９，０％β　−グロブリ
ン　７，０〜９．０％ アルブミン　　　　６２　〜６８？６ γ　−グロブリン　１１　〜１５　　％（セルロースア
セテート膜による電気泳動） これらの蛋白質溶液に対して、ＩｇＧを他の蛋白質から
分離するために、イオン交換体での分画化を行なう。陽
イオン交換体（例えば、スルホプロピル基またはカルボ
キシメチル基によって置換したアガロース、またはＳ−
セファロース、ｓｐ−トリスアクリル、ＣＭ−セファロ
ースのような、Ｎ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒ
ドロキシメチル−１，３−プロパンジオールのコポリマ
ー）を用いた場合には、免疫グロブリンＧ分画が交換体
マトリックスに結合するが、他の全ての血漿蛋白質は移
動相によって、阻止されることなく、マトリックスを通
過しうるように、条件を選択する（緩衝液０．０１〜０
．０５モル、ｐｉ１４．５〜６．５）。続いて、結合し
た免疫グロブリンＧを高い塩濃度０．５〜［，５モルの
溶離用緩衝液によって溶離する。

免疫グロブリンＧの収率はこの方法によると約８０９６
であり、免疫グロブリンＧ分画は少量のＩｇＡとＩｇＭ
とを含有する。

それ故、陰イオン交換体（例えば、ジエチルアミノエチ
ル基によって置換したアガロース、Ｎ−アクリロイル−
２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパン
ジオールのコポリマー、セルロースまたはケイ酸、また
はメタクリルアミドもしくはＮ−メチレンビスメタクリ
ルアミド含有上ツマ−のアミノエチル基によって置換し
た第４級ポリマー、例えばＤＥＡＥ−セファロース、［
）ＥＡＥ−）リスアクリル、Ｄ　Ｅ　Ａ　ＩＥ−セルロ
ース、ＤＥＡＥ−スフエロシル、ＱＡＥ−アクセル、Ｑ
ＡＭ−オイベルギット）において免疫グロブリンＧ分画
を得るための血漿分画化を実施するのが好ましい。この
場合に、全ての血漿蛋白質が陰イオン交換体マトリック
スに結合するが、ＩｇＧ分画はゲル床と相互作用するこ
とな（、純粋な分画として回収されるように、緩衝液環
流を選択する（０．０Ｌ〜０．０５モル、ｐＨ６，５〜
６．５）。

この方法によると、ＩｇＡ、　ＩｇＭおよび他の血漿蛋
白質などの不純物を含まず、１００％までγグロブリン
から成る免疫グロブリンＧ分画が、約９０％収率で得ら
れる（セルロースアセテート膜による電気泳動）。この
高度に純粋な稀釈免疫グロブリンＧ分画を緩衝剤の除去
のために、生理学的に適合しうる塩溶液に対して透析濾
過し、好ましい蛋白質濃度に調節するために限外濾過に
よって濃縮する。

このためには、排除限界１０〜１００．０００ダルトン
の平面モジュールまたは中空繊維モジュールとしての限
外ｐ過膜が適している。

しかし、このようにして得られたまたは他の公知の方法
によって、例えば沈澱、凍結乾燥または噴霧乾燥と次の
可溶化とによって、または陽イオン交換体への吸着と次
の溶離とによって濃縮された、蛋白質含量約５０〜＋ｔ
ｏｇ／ｌの免疫グロブリンＧ溶液はまだ貯蔵安定性をも
たず、数時間後には分解酸物が生ずる。酵素基質８２２
８８［カビ（Ｋａｂｉ）Ｊを用いて、免疫グロブリンＧ
分画中に１０．ＯＯＯ’￥　／　１までのかなりの蛋白
質分角ｑ活性が含まれることを示すことができた。特異
性酵素基質を用いて、すなわちプラスミン基質、プラス
ミノゲン基質、トロンビン基質およびプレカリクレイン
基質を用いて、痕跡量の酵素を検出することができた。

これらの酵素を除去するための慣用的方法、例えば硫酸
バリウム、白色粘土、寒天、コロイドケイ酸、活性炭、
アフィニティ交換体、陽イオン交換体または陰イオン交
換体への吸着ならびにアプロチニン、アミノ酸およびフ
ッ素化合物のような酵素阻害剤の添加は充分な分離また
は阻害をもたらす二とができない。

本発明によると、色素結合吸着剤、例えばクロムブルー
［チバ（ｃｉｂａ）］が結合したアガロース、セルロー
スまたは例えばセファロース、セルロースまたはトリス
アクリルのような、Ｎ−アクリロイル−２−アミノ−２
−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールのコポ
リマーを用いるアフィニティクコマトグラフィによって
、蛋白質分解酵素を分離するかまたはアンチトロンビン
ＩＩＩの添加によって阻害する。

本発明によるアフィニテイクロマトグラフイの効果は第
１表から明らかである。ここで検討した製剤１〜５は下
記の実施例２の方法によって得られたものである。

第１表 ３７℃において４週間貯蔵した後のＩｇＧ製剤の蛋白質
分解活性 製剤　蛋白質分解活性Ｕ／１　　分解生成物（＋１　Ｐ
　Ｌ　Ｃ）Ｌ　　　　　　１３　　　　　　　　＜１％
２　　　　７　　　　　　く１％ ３　　　　　１７　　　　　　　　＜１％４　　　　１
１　　　　　　　　＜１％５　　　　　１０　　　　　
　　　＜１％蛋白質分解酵素を抑制するために本発明に
よって添加した精製アンチトロンビンＩＩＩの効果は第
■表から明らかである。ここで検討した製剤１〜４は、
下記の実施例１の方法によって得たものである。

第■表 ３７℃において４週間貯蔵した後のＩｇＧ製剤の蛋白質
分解酵素 製剤　蛋白質分解活性Ｕ／１　　分解生成物（ｌ（ＰＬ
Ｃ）１　　　　７　　　　　　く１％ ２　　　　１１　　　　　　　＜１％ ３　　　　４　　　　　　　く１％ ４　　　　１０　　　　　　　＜１％ 貯蔵安定性のＩｇＧ溶液を得るためには、アンチトロン
ビン■０．５〜３Ｅ／ｍｌの添加が必要である。

このようにして精製、安定化した免疫グロブリンＧ分画
は、例えばＢ型肝炎、非Ａ／非Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎およ
びＩＩＴＬＶ−ＩＩＩ　／ＬＡＢのような病原体ウィル
スによって汚染されている可能性がある。

それ故、本発明によると耐ウィルス性免疫グロブリンＧ
製剤を得るために、滅菌処理を行なう。、ヨーロッパ特
許公開節［１１０２，１３２号では、イオン交換体を用
いてｌｌＢｓ　Ａｇの減少が可能であることが確かに述
べられているが、本発明者らの実験は耐ウィルス性製剤
を得るためにはこの減少では不充分であることを示して
いる。

本発明によって調製した血漿にイオン交換体での分画化
の前に、Ｂ型肝炎ウィルスを代表するカッパモデルウィ
ルス（バクテリオファージ）またはＨＢｓ　Ａｇ　４．
６Ｘ　１０”を加えると、単離したＩｇＧ分画中にウィ
ルス６．３Ｘ　１０３／　ｍｌが残留する。対応する実
験結果を第■表に要約する。

第■表 ＩｇＧのクロマトグラフィ精製におけるウィルス分布（
ＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム）この減少は耐ウィル
ス性免疫グロブリンＧ製剤には不充分である。それ故、
本発明による方法は付加的な滅菌段階を含む。このため
には、β−プロピオラクトンと紫外線照射の組合せが用
いられる。

精製免疫グロブリンＧ分画を蛋白質濃度２０〜ＢＯｇ／
ｌにおいてβ−プロピオラクトン（βＰＬ）０．０３〜
０．０７％、特に０．０５％、ｐＨ６，０〜６．０、特
にｐＨ７，２によって処理する。３〜２４時間の反応時
間後に、免疫グロブリン溶液を５〜２０ｇ／ｆＬの蛋白
質含量に稀釈し、回転貫流装置において紫外線照射する
。このように滅菌した溶液は続いて公知の方法を用いて
蛋白質４〜１２％に調節する。第■表から明らかなよう
に、本発明による方法によってモデルウィルスが充分に
確実に不活化される。

第■表 クロマトグラフィ精製ＩｇＧにおけるβＰＬ／　ＵＶに
よる細菌ウィルスの不活化 この場合に検出された少なくとも７．５１０ｇ＋ｏのウ
ィルス不活化（力価低下）はＢ型肝炎、非Ａ／非Ｂ型肝
炎およびエイズに対する耐ウィルス性に相当する。

β−プロピオラクトンの公知のウィルス不活化作用は免
疫グロブリンの検出可能な化学的修飾を生ずるが、本発
明による方法では公知の方法に比べて明らかに低いβ−
プロピオラクトン、１度をＵＶ照射と併用することによ
って画期的に効果的なウィルス不活化が達成され、これ
によって免疫グロブリンが検出可能に変化したり、その
活性が影響をうけることはない。このことは第７表に説
明する。

第７表 βＰＬ／ＵＶ滅菌処置のクロマトグラフィ精製１ｇＧに
対する影響（実施例） 本発明を次の実施例によって説明する。

実施例Ｉ Ａ、新鮮な凍結ヒト血漿５（ＩＱのプールを＋４℃にお
いて解凍し、この際に残留する沈澱（寒冷沈降物）を遠
心分離によって分離した。ＰＰＳＢｍ合体の因子を分離
するために、透明な上清に予め膨潤させ平衡化したイオ
ン交換体（ＤＥＡＥセファデックス）を混合し、室温に
おいて１時間撹拌した。ゲルをフィルターによって戸別
し、上清にｐｌ　５．３において容量％のエタノールを
混合した。−３℃において３時間静置させた後、大部分
がフィブリノゲンから成る沈澱を遠心分離によって除去
し、無菌濾過を実施した。

Ｂ、前記で生成した、凝固因子を含まない血漿からアル
コールを除去し、イオン環境を０゜０２２Ｍトリスヒド
ロキシメチル−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）／　ＨＣＩ　
（ｐＨ７，５）に調節するために、セファデックスＧ　
２５を２２Ｊ２満たし、０．０２２Ｍ　Ｔｒｉｓ／　Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）で平衡化させたカラムを用いてゲル
濾過した。血漿を完全に緩衝化させるために、１２回の
ゲル濾過サイクルが必要であった。蛋白質含量２２　ｇ
　／　ｌを有する回収分画を無菌濾過した。

Ｃ１このようにして得られた緩衝化血漿から、ＩｇＧを
陰イオン交換体クロマトグラフィによって分離した。こ
のためには、ＤＥＡＥトリスアクリルＬＳを満たし、０
．０２２Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ７、，５）で平衡
化させた１０１カラムを用いた。緩衝化した血漿を陰イ
オン交換体において１２１部ずつ分画化し、これによっ
てＩｇＧ以外の全ての血漿蛋白質は交換体に結合した。

全血漿量を処理するために６サイクルが必要であった。

結合した血漿蛋白質をその都度、０．０２２ＭＴｒｉｓ
／ＨＣＩ、０．６Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５＞によって
溶離し、用途別に集めた。

Ｄ、蛋白質含量１．５ｇ／ｌと容積１２０１とを有する
全１ｇＧ分画を限外２過装置（排除限界１０．０００ダ
ルトン）を用いて、蛋白賃金ｆｆ１４０ｇ／ｌに濃縮し
た。ｐ１１値７．２においてこの溶液を固体食塩によっ
て生理学的環境に調節し、存在する蛋白質分解酵素をほ
ぼ抑制するために、アンチトロンビンＩ［１１，５Ｕ／
ｍｌを混合した。

Ｅ２段階りにおいて得られたＩｇＧ溶液に滅菌のために
ｐＨ７，２においてβ−プロピオラクトン（０，５ｍｌ
　／　Ｉｔ溶液）を加え、１２時間の反応期間中ｐＨ値
を一定に維持した。

次に生理学的食塩水によって蛋白質含量ｌ口ｇ／ｕにな
るまで稀釈し、Ｕｖ回転貫流装置内でこの溶液に２０１
部時の貫流速度と１ｍＷ／ｃｄ　Ｘ分の強度とによって
照射した。

Ｆ、このようにして得られた無菌１ｇＧ溶液からＴｒｉ
ｓ／１ｌｃｌ緩衝剤を除去するために、セファデックス
Ｇ　２５を２２１充填し、半生理学的食塩溶液で平衡化
させたカラムを用いてこのＩｇＧ溶液をゲル濾過した。

限外濾過装置（排除限界１０，０００ダルトン）を用い
て５０ｇ／ｌの蛋白質含量に濃縮した後、１ｆｔにつき
０．１５０モルのグリシンを加え、無菌濾過を実施した
。

このようにして得られたこの免疫グロブリンＧ溶液は次
の性質を有した： 収　　率：　　　　７２　　　％ 蛋白質：　　　５６．８ｇ／ｌ ＩｇＧ：　　　５３．５ｇ／ｌ γ−グロブリン：１００％（セルロースアセテート膜に
よる電気法 動） 補体結合反応：１１μｍ／蛋白質ｍｇ 蛋白質分離活性ニアＵ／１ ゲル２過＝　９５％モノマー （ＩＩＰＬｃ） ５％ダイマー −％ポリマー −％分解生成物 修飾：　　　検出不能 実施例２ 実施例１、段階Ａ−Ｃの操作をくり返した。

Ｄ、蛋白賃金ｆｍ１．５ｇ／Ａを仔するＩｇＧ分画を固
体食塩によって、生理学的塩７農度に１凋節した。

チバークロムブルートリスアクリルＬＳＩＱを充填した
クロマトグラフィカラムを０．０２２ＭＴｒｌｓ／ｌｌ
Ｃｌ、　０．１５Ｍ食塩（ｐＨ７，５）で平衡化した。

精製し稀釈した等張性１ｇＧ溶液２０１を流速６之／時
でゲル床上にポンプ供給した。蛋白質分解酵素を除去し
たＩｇＧ溶液を限外濾過装置によって４０ｔｒ／１に濃
縮した。

実施例１、段階ＥとＦの操作をくり返した。

収　　率　：　　　　６２　　　　％ 蛋白質：　　　５３．５ｇ／Ｉ ＩｇＧ：　　　５１．５ｇ／ｌ γ−グロブリン：９９．１％（セルロースアセテート膜
による電気法 動） 補体結合反応：１５μｇ　／　ｍｇ蛋白質修　飾：　　
　検出不能 ゲル濾過：９３．４％モノマー （ＩＩＰＬＣ） ５．８９％ダイマー ０．６６％ポリマー −％分解生成物 蛋白質分解活性：　１８ｔｌ／ｕ 実施例３ ヒト血漿５０１の他のプールを用いて実施例１の方法を
くり返したが、この場合にはエタノールによる処理は省
略した。凝固因子を含まない血漿を、イオン交換体ゲル
のＰ別後、直接段階Ｂ（ゲル濾過）に導き、イオン環境
をＱ、０２２ＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ７，５）に調節
した。次に実施例１または２の段階Ｂ−Ｆの操作をくり
返した。

収　　率　：　　　　７０　　　　％ 蛋白質：　　　５２．４ｇ／ｉ ＩｇＧ：　　　５１．８ｇ／ｌ γ−グロブリン：〜１００％（セルロースアセテート膜
による電気泳動） 補体結合反応；１２μｌ／蛋白質ｆｆ１ｇ修　飾：　　
、　検出不能 ゲル濾過：８５．９％モノマー （ＩＩＰＬＣ’） １４．１％ダイマー −％ポリマー −％分解生成物 実施例４ Ａ、コーンの方法に従ってヒト血漿からアルコール分画
化によって得られる粗γ−グロブリンペースト（ペース
トｎ／ｍ）１ｋｇを、０．１５Ｍリン酸水素ナトリウム
緩衝剤（ｐｌ＋５．２）１１　ｆｌ中に溶解した。不溶
成分を除去するために、遠心分離し、次に濾過した。

Ｂ、得られた溶液を実施例１、段階Ｂの操作に従って濾
過して、アルコールを除去し、イオン環境を０．０２２
Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ７，５）に調節した。

段階Ｂで得られた蛋白賃金ｆｆ１１５ｇ／Ｑの溶液を実
施例１または２の段階Ｃ−Ｆの操作に従ってさらに処理
した。

収　　率　：　　　　５６　　　　％ 蛋白質：　　　５１．２ｒ／Ａ ＩｇＧ：　　　　　４９．７ｇ／ｌ γ−グロブリン：９８％（セルロースアセテート膜によ
る電気泳動） 補体結合反応＝２０μＩ／蛋白質ｍｇ 修　飾：　　　検出不能 ゲル濾過：　　　９３．１％モノマー （ＨＰＬＣ） ６．９％ダイマー −％ポリマー −％分解生成物 実施例５ 実施例１、段階Ａ−Ｆの操作をくり返したが、この場合
には段階ＣにおいてＤＥＡＥ　）リスアクリルＬＳの代
りにセファロースＱを用いた。

収　　率：　　　　　５６．５％ 蛋白質：　　　４６．７ｇ／ｌ ＩｇＧ：　　　４６．２ｇ／ｌ γ−グロブリン：９６．９％（セルロースアセテート膜
による電気泳動） ゲル濾過：　　　９３．５％モノマー （ＩＩＰＬｃ） ６．５％ダイマー −％ポリマー −％分解生成物 蛋白質分解活性：１７Ｕ／ｉ 実施例６ 実施例１、段階Ａ−Ｆの操作をくり返したが、この場合
には段階ＣにおいてＤＥＡＥ　）リスアクリルＬＳの代
りにＤＥＡＥスフエロシルを用いた。

収　　率　：　　　　７０　　　％ 蛋白質：　　　４９．５ｇ／ｉ ＩｇＧ：　　　５３．５ｆｔ／１ γ−グロブリン：１００％（セルロースアセテート膜に
よる電気泳動） 補体結合反応：１５μｍ／蛋白質ｌｌ１ｇ修　飾：　　
　検出不能 ゲル沢過：　　　９４．５％モノマー （ｌ（ＰＬＯ） ５．５％ダイマー −％ポリマー −％分解生成物 蛋白質分解活性：　　９Ｕ／１ 実施例７ 実施例１、段階Ａ−Ｆの操作をくり返したが、この場合
には段階Ｂにおいてアルコール除去と緩衝化とのために
セファデックスＧ　２５の代りにトリスアクリルＧＰ０
．５を用いた。

収　　率：　　　　７０　　　％ 蛋白質：　　　５１．５ｇ／ｊｌ ＩｇＧ：　　　５０．２　ｇ　／　１ γ−グロブリン二〜１００％（セルロースアセテート膜
による電気泳動） 補体結合反応＝１３μｉ／蛋白質ｌ１１ｇ修　飾：　　
　検出不能 ゲル沖過＝　　９５％モノマー （ＨＰＬＣ） ５％ダイマー −％ポリマー −％分解生成物 蛋白質分解活性：１８Ｕ／１ 実施例８ Ａ、実施例１、段階Ａの操作をくり返した。

Ｂ１段段階において得られた溶液をアルコール除去とイ
オン環境調節のために、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ５，８）によって平衡化したセファデックスＧ　２
５においてゲル濾過した。蛋白賃金ｆｉ１２２ｇ／ｌの
回収分画を無菌沖過した。

ｃ、ｓｐトリスアクリルＬＳＩ！充填クロマトグラフィ
カラムを、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐｔ！
５．８）で平衡化し、段階Ｂで得られた緩衝化血漿を１
９１ずつ９５サイクルでクロマトグラフィ精製した。陽
イオン交換体に結合したＩｇＧ分画をその都度、０．０
２５Ｍ酢酸ナトリウム、０．６Ｍ食塩（ｐＨ１７，５）
によって溶離した。

Ｄ、回収したＩｇＧ分画を限外濾過装置（排除限界ｔｏ
、ｏｏｏダルトン）を用いて、蛋白賃金ｆｆ１４０ｇ　
／　ｌに濃縮し、等損性食塩溶液に対して透析濾過した
。

このようにして得られた溶液に対して実施例１と同様に
アンチトロンビン■を加えるか、または実施例２と同様
にチバークロムブルーートリアクリルＬＳでのアフィニ
ティクロマトグラフィを行なった。

実施例１、段階ＥとＦの操作に従って、さらに処理した
。

収　　率　：　　　　５５　　　　％ 蛋白質：　　　５２．３ｇ／ｆｌ ＩｇＧ：　　　　５０．３ｇ／ｌ ＩｇＡ：　　　　　０．８ｇ／Ｉ ＩｇＭ：　　　　　０．６ｇ／ｌ γ−グロブリン：９７％（セルロースアセテート膜によ
る電気泳動） 補体結合反応：１２μｌ／蛋白質ｆｆ１ｇ修　飾：　　
　検出不能 ゲル濾過：　　　９１．５％七フッマ ー　ＨＰＬＣ） ７　　％ダイマー １．５％ポリマー −％分解生成物 （発明の効果） 本発明の製造方法によれば、画期的に次の性質を備えた
免疫グロブリンＧ製剤が得られる。

・純度はγ−グロブリン約１００％である（セルロース
アセテート膜による電気泳動）。

・製剤はＩｇＡとＩ　ｇＰｖｌを含まない。

・収率はＩｇＧ　　９０％までになる。

・全てのＩｇＧサブクラスが製剤中に含まれる。

・製剤は高分子凝集体を含まないので、低い非特異的抗
補体活性を有し、この理由から静脈内投与に適する。

・免疫グロブリン溶液は耐ウィルス的に無菌化され、生
であり、修飾されていない。

・製剤は分解生成物が検出不能であるほど微量に、有効
プロテアーゼを含むにすぎず、貯蔵安定性を有する。

これらの性質は免疫グロブリン製剤に課せられる要求を
全て満たす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、凝固因子を含まない血漿またはＩｇＧ含有血漿分画
   もしくはＩｇＧ含有血清分画の、イオン交換体による処
   理および限外濾過を伴う、濃縮および多段階精製による
   、耐ウィルス性、貯蔵安定性、静脈内適合性の免疫グロ
   ブリンＧ製剤の製造方法において、 （ａ）凝固因子を含まない血漿またはＩｇＧ含有血漿分
   画から、透析濾過もしくはゲル濾過によって沈澱剤を除
   去し、好ましいイオン組成に調節し、 （ｂ）得られた蛋白質溶液に対して、ＩｇＧを他の蛋白
   質から分離するために、イオン交換体による分画化を行
   ない、 （ｃ）得られたＩｇＧ溶液中の蛋白質分解酵素を色素結
   合吸着剤を用いるアフィニティクロマトグラフィによっ
   て除去および／またはアンチトロンビンIIIの添加によ
   って阻害し、 （ｄ）このように安定化したＩｇＧ溶液を蛋白質濃度２
   ０〜６０ｇ／ｌ、ｐＨ値６．０〜８．０において０．０
   ３〜０．０７％β−プロピオラクトンによって処理し、
   蛋白質濃度５〜２０ｇ／ｌまで稀釈した後に紫外線を照
   射し、 （ｅ）無菌化し稀釈したＩｇＧ溶液から低分子物質を除
   去するために、この溶液をさらに透析濾過またはゲル濾
   過し、 （ｆ）このように安定化し無菌化した溶液を好ましい蛋
   白質濃度２〜１６％に調節し、無菌濾過することを特徴
   とする耐ウィルス性、貯蔵安定性、静脈内適合性の免疫
   グロブリンＧ製剤の製造方法。 ２、段階（ａ）を排除限界１０〜１００，０００ダルト
   ンの膜における５〜１０倍交換量による透析濾過として
   、または排除限界２〜１０，０００ダルトンのゲル濾過
   材におけるゲル濾過として実施し、この際にモル濃度０
   ．０１〜０．０５、ｐＨ値４．５〜８．５の緩衝系を交
   換媒質として、または平衡化のために用いることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ゲル濾過材として、架橋したデキストランゲル、Ｎ
   −アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−
   １，３−プロパンジオールベースゲルまたはセルロース
   ゲルを用いることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ４、ゲル濾過材として、セファデックスＧ−２５、トリ
   スアクリルＧＦ−０５またはセルファインＧＨ−２５を
   用いることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方
   法。 ５、段階（ａ）において、ゲルをｐＨ値６．５〜８．５
   の緩衝系と平衡化させ、段階（ｂ）においてモル濃度０
   ．０１〜０．０５、ｐＨ値６．５〜８．５を有する緩衝
   系と同様に平衡化させた陰イオン交換体によって分画化
   を実施することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至
   第４項のいずれか１項記載の方法。 ６、陰イオン交換体として、ＤＥＡＥ−セファロース、
   ＤＥＡＥ−トリスアクリル、ＤＥＡＥ−セルロース、Ｑ
   ＡＭ−オイペルギットまたはＱＡＥ−アクセルを用いる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、段階（ｃ）においてアンチトロンビンIII０．１〜
   ５単位／ｍｌを用いることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項乃至第６項のいずれか１項記載の方法。 ８、段階（ｃ）において、クロムブルーに結合した吸着
   剤を用いるアフィニティクロマトグラフィを実施するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第６項のいず
   れか１項記載の方法。 ９、クロムブルーに結合したトリスアクリルを用いるア
   フィニティクロマトグラフィを実施することを特徴とす
   る特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、段階（ｄ）において、紫外線照射を１ｍＷ／ｃｍ
   ＾２×分の強度において実施することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項乃至第９項のいずれか１項記載の方法
   。 １１、出発物質として血漿を用い、血漿から寒冷沈降物
   を除去した後に、ＰＰＳＢ複合体から凝固因子を陰イオ
   ン交換体への吸着によって分離することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれか１項記載の
   方法。 １２、出発物質として凝固因子を除去され且つエタノー
   ルによる沈降によって残留フィブリノゲンを除去された
   血漿を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１１項
   記載の方法。