JPS631544B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 非常に多様な有機化合物の分析または監視に対
する関心と要求は現在もなお増大しつつある。関
心を集める化合物に、病気および精神異常状態の
治療に使用される医薬、濫用医薬、身体機能に関
連する天然化合物、環境汚染物質、痕跡量の不純
物などが包含される。これらの化合物の大部分の
対象となる濃度は一般に1μｇ／mlのオーダーま
たはそれ以下である。多くの場合、これらの化合
物の周囲環境は、類似構造の化合物をさらに１ま
たは２種以上含有することが認められるので、こ
のような類似化合物を対象となる化合物から区別
しなければならない。 これまでに発展した主要の方法の１つに、競合
的タンパク質結合分析と呼ばれる方法がある。こ
の分析法は受容体（通常は抗体）に、特定の空間
および電荷の構造（コンフオメーシヨン）を識別
する能力があることを利用するものである。受容
体がリガンドに結合すると、結合したリガンドと
結合していないリガンドとの識別が可能となる。
ラベルしたリガンドを使用し、受容体に対してラ
ベルつきリガンドと未知検体中のリガンドとを競
合させると、ラベルしたリガンドとラベルしてい
ないリガンドの間に受容体の分配が得られる。適
当なラベルを使用すると、結合したラベルつきリ
ガンドと結合していないラベルつきリガンドとを
区別することができ、この比を未知試料中のリガ
ンドの量に関係づけて測定ができる。受容体を測
定したい場合には、実質的に同じ方法が用いられ
るが、ただし、受容体の添加は行わず、またラベ
ルしていないリガンドの添加も必要ない。 競合的タンパク質結合分析法の開発においては
多数の因子を考慮しなくてはならない。各種試薬
類の調製が容易であることは重要な要件である。
オペレーターのエラーの機会を少なくするのが望
ましいので、分析に包含される操作工程の数も重
要である。試薬類の安定性ならびに分析方式が現
在利用できる装置に適合するかどうかも考慮すべ
き点である。もちろん、低濃度の物質を測定する
際の精度と信頼性にも関心がもたれよう。 米国特許第3817837は均一酵素免疫分析法を教
示している。一方、米国特許第3654090；
3791932；3850752；および3839153は不均一酵素
免疫分析法を教示している。オークリツジ国立研
究所で1977年３月17・18日に開催された臨床研究
所の最新分析技術についての第９回年次シンポジ
ウムの講演集に、「ホスホリパーゼＣ−ラベルつ
き抗−ヒトIgG；ヒトIgGによる酵素作用の阻害」
と題するR.WeiおよびS.Reibの論文が報告されて
いる。米国特許第3935074および3998943は、異な
るエピトピツク（epitopic）サイトに対する２種
類の異なる受容体の間の立体阻害を包含する免疫
分析法を開示する。Carrico他、Anal.Biochem.
72，271（1976）およびSchroder他、同、72，283
（1976）は、ラベルをハプテンに結合し、このラ
ベルに酵素転移反応を受けさせて、信号を形成す
る競合的タンパク質結合分析法を教示している。
ハプテンに結合した抗体がラベルへの酵素の接近
を阻止する。 本発明により、競合的タンパク質結合分析法と
この方法に用いる試薬の組み合せが、免疫学的一
対（immunological、pair，リガンドと受容体）
の構成要素である被分析物質（アナライト、ana
−lyte）の定量に対して提供される。この方法
は、リガンドまたは受容体のいずれかに結合した
酵素（すなわち、酵素結合リガンドまたは酵素結
合受容体）を包含する、その免疫学的一対の各構
成要素の少なくとも１つ、通常は２以上の間での
複合体（complex）の形成に依存する。複合体の
形成により酵素阻害剤の接近は阻止される。酵素
の結合体（coniugate）が被分析物質である免疫
学的一対の要素と同一のものから形成されるとき
は、免疫学的一対の他方の要素を試薬として添加
することになろう。また、酵素結合体が被分析物
質の免疫学的一対の同族または相手方の要素から
形成されるときは、上記の添加は必要ない。 分析は水性緩衝媒質中で行われ、試薬類を同時
にまたは前後して添加するのにはさまざまの方式
（protocol）を使用しうる。酵素基質を分析媒質
に添加して酵素活性を測定してもよい。未知試料
で測定した酵素活性を、既知量の被分析物質で測
定した結果と対照することにより、未知試料中の
該物質の量を半定量的または定量的に測定するこ
とができる。 本発明の分析法に適した試薬の組み合せも本発
明により提供され、これは、酵素結合体および酵
素阻害剤、ならびに適宜に被分析物質の免疫学的
一対における相手方の要素を含有する。安定剤、
保存料、緩衝剤などの他の材料も包含しうる。 本発明によると、分析媒質中の酵素活性が分析
媒質に存在する被分析物質の量に関係する、高感
度の正確な酵素ラベル（酵素による標識化）を利
用した競合的タンパク質結合分析法が提供され
る。この方法は酵素と免疫学的一対の一方の構成
要素との結合体を使用するもので、その際酵素結
合体は、少なくとも１個の酵素結合体を含む免疫
学的一対の両構成要素を包含する複合体が形成さ
れたときに、その酵素活性の実質的部分、すなわ
ち酵素結合体の活性の100％までをなお保有する。
酵素阻害剤も使用し、これは酵素活性を実質的に
低下させる作用を有する。本発明の方法では、酵
素への酵素阻害剤の接近が複合体によつて阻止さ
れる。酵素結合リガンドによるリガンドの分析で
はこの酵素結合リガンドに結合した抗リガンドの
量が、分析媒質中に存在するリガンドの量に支配
され；一方、酵素結合リガンドによる抗リガンド
の分析では、分析媒質中の抗リガンドの量が未知
試料中のその量と直接関係する。酵素結合抗リガ
ンドによるリガンドの分析では、リガンドに結合
した酵素結合抗リガンドの量が未知試料中のリガ
ンドの量に直接関係し；これによる抗リガンドの
分析では、リガンドに結合した酵素結合抗リガン
ドの量が分析媒質中に存在する抗リガンドの量に
支配される。酵素阻害剤は、酵素に結合したとき
に酵素作用を阻害することのできる酵素の抗体で
あれば好都合である。リガンドまたは酵素結合リ
ガンドは、そのエピトピツクサイトがそれぞれ酵
素結合抗リガンドまたは抗リガンドによつて飽和
されたときに酵素阻害剤の接近を妨げるのに十分
な数のエピトピツクサイトを有する。 本明細書で用いられる用語の定義を次にまとめ
ておく。 「被分析物質」または「アナライト」−測定の
対象となる化合物または組成物。これは受容体の
少なくとも１個の共通エピトピツクサイトに結合
するモノ−もしくはポリ−エピトピツクな１また
は２以上の抗原またはハプテンでもよい。 「リガンド」−相手となる受容体が天然に存在
するか、または合成できる任意の有機化合物。 「リガンド類似物」−受容体に対して類似リガ
ンドと競合できる変性されたリガンド。この変性
はリガンド類似物を酵素または他の分子に結合す
る手段を与える。 「受容体」−分子の特定の空間的および極性の
構成、すなわちエピトピツクサイトを識別でき
る、普通は多価の（＝少なくとも２個の結合サイ
トを用する）任意の化合物または組成物。受容体
の例としては、天然受容体、抗体、酵素、レクチ
ン、Fab破片などがある。特定のリガンドに対す
る場合には、受容体は抗リガンドと呼ばれる。た
とえば、酵素に対する受容体は抗酵素と呼ばれ
る。受容体とその相手方のリガンドとで免疫学的
一対を構成する。 「酵素結合リガンド」少なくとも１個の酵素分
子が少なくとも１個のリガンド類似物に共有結合
した結合体。酵素は、リガンドの有効エピトピツ
クサイトが抗リガンドで飽和され、リガンドエピ
トピツクサイトへの抗リガンドの結合が酵素阻害
剤の結合を阻止したときにも、その酵素活性の実
質的部分をなお保持する。 「酵素結合抗リガンド」−少なくとも１個の酵
素分子が少なくとも１個の受容体に共有結合した
結合体。この結合体がリガンドの有効エピトピツ
クサイトを飽和し、酵素−抗リガンド結合体の結
合が酵素阻害剤の結合を阻止したときに、酵素は
その酵素活性の実質的部分をなお保有している。 「複合体」−免疫学的一対の両構成要素の少な
くとも１個づつの非共有結合生成物。本発明で
は、複合体は免疫学的一対の一方の要素に共有結
合した少なくとも１個の酵素分子を含有するのが
普通である。複合体は相対的に二次元のものと、
三次元のマトリツクスのものとがある。これは、
ポリマーで言えば、非架橋ポリマーと架橋ポリマ
ーに相当する。 「酵素阻害剤」−酵素に結合したときに酵素作
用を実質的に阻害する巨大分子。その阻害作用は
可逆的と非可逆的の両方の場合があり、受容体を
酵素結合リガンドに結合させるか、酵素結合抗リ
ガンドをリガンドに結合させたときには抑制剤の
酵素阻害作用は妨げられる。好都合には、酵素阻
害剤は特定の酵素を識別する抗体であるのがよ
い。抗体は、酵素に結合したときに、酵素または
酵素に結合する基質の酵素活性を実質的に低下さ
せ、酵素活性の測定値を減少させる。 以下に本発明の分析法、使用材料などについて
個別的に詳述する。 分析法 本発明の分析法は、緩和なPHの水性帯域で実施
される。PHは一般にアナライト（被分析物質）の
濃度変化に対する応答が最もよいPHに近いPHであ
る。アナライトの定量用の分析帯域の調製に使用
する材料は、適当に緩衝させた水溶液、未知試料
（これは予備処理したものでもよい）、酵素結合
体、酵素阻害剤、場合によつて免疫学的一対の他
方の要素、ならびに酵素の基質である。分析帯域
は普通には均一系である。 水性媒質は他の極性溶媒、通常は炭素数１〜
６、より普通には炭素数１〜４の酸素含有有機溶
媒（アルコール、エーテルなど）を含有していて
もよい。通常は、このような共溶媒の量は約20重
量％以下、特に約10重量％以下である。 媒質のPHは普通には約５〜10の範囲内、特に約
７〜９の範囲内であり、約７〜8.5のPHが好まし
い。所望のPHを達成し、測定中にこのPHを維持す
るのに各種の緩衝剤が使用できる。緩衝剤の例に
は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス
（tris）、バルビタールなどがある。使用緩衝剤の
選択は本発明にとつて重要ではないが、個々の分
析で或る緩衝剤が他のものより適しているという
ことはあろう。 分析の実施温度も普通は温和な温度であつて、
通常は測定中ずつと一定温度に保つ。具体的には
約10〜50℃、特に約15〜40℃の範囲の温度を使用
するのが普通である。 分析を受けるアナライトの濃度は一般に約10^-4
ないし10^-15Ｍにわたり、より普通にはほゞ10^-6
ないし10^-13Ｍである。分析が定性、半定量およ
び定量のいずれであるか、酵素の種類と酵素活性
の検出法、ならびに対象となるアナライトの濃度
というような要因により、その他の試薬の濃度が
一般に決定される。試薬類が立体的に排斥された
サイトを目ざして競合する競合方式では、物質間
の相対濃度が極めて重要である。これに反して、
酵素阻害剤以外の試薬をまず加えて、平衡に達し
た後で酵素阻害剤を添加する方式では、酵素阻害
剤に対する試薬の相体濃度はあまり意味を持たな
い。 本発明では、免疫学的一対の相互の構成要素間
での複合体の形成を利用して、この要素の一方に
共有結合した酵素に酵素阻害剤が接近するのを阻
害する。酵素は免疫学的一対のどちらの要素に結
合させてもよい。任意の分類であるが、本発明
を、(1)酵素結合リガンドを用いる分析と、(2)酵素
結合受容体を用いる分析の２種類に分類できる。
最初の酵素結合リガンドによる分析についてまず
考察する。 この第１の種類の分析では、普通には抗リガン
ドの量を受容体サイトに基いて算出するのである
が、抗リガンドの量は、酵素結合リガンドの濃
度、この結合体のリガンド／酵素の比およびリガ
ンドに対する受容体の親和力に応じて変動する。
通常、酵素結合リガンド１分子当り少なくとも１
個の活性受容体サイトがあり、また酵素結合リガ
ンドの状態のリガンドのエピトピツクサイト１個
当りの活性サイトの数は約20までであるが、受容
体：リガンドエピトピツクサイトの比は分析の種
類と受容体の親和力によつては100：１程度まで
高くてもよい。好ましくは、受容体結合サイト／
酵素結合リガンドの状態のリガンドのエピトピツ
クサイトの比は少なくとも１、通常は少なくとも
２であり、上限は約５である。 酵素結合リガンドの酵素／リガンドの比率は酵
素、特にその分子量と有効結合サイト、ならびに
リガンドの分子量に応じて広範囲にわたる。分子
量が2000以下、通常は1200以下のハプテン系のリ
ガンドについては、平均して酵素１個につき少な
くとも１個のリガンドという比であるが、通常は
酵素の分子量2000ごとに約１個以下、特に分子量
が50000以下の酵素について酵素の分子量5000に
つき１個以下という比であろう。分子量が一般に
2000、より普通には5000をこえる抗原のリガンド
に対しては、リガンド１個に対して酵素が複数に
なる可能性もある。酵素：リガンドの重量比は約
10^-6〜10²：１、通常は約10^-2〜10²：１の範囲で
あろう。リガンドはウイルスや細胞でもよく、こ
のような大きなリガンドに対する酵素の数は、モ
ル比に関しては大きくなるが、重量比だと非常に
小さくなる。分子量が10000〜600000の範囲内の
リガンドでは、通常は平均でリガンド１個につき
酵素の数は少なくとも１個になり、リガンドの分
子量5000につき１個以下の酵素という割合にな
る。 酵素結合リガンドと受容体の濃度（結合サイト
に基く濃度）も広範囲にわたり、一般に約10^-4〜
10^-14Ｍ、特に10^-6〜10^-12Ｍである。酵素結合リ
ガンド：リガンドの対象となる最高濃度のモル比
は一般に約10^-4〜10：１、より普通には約10^-3〜
１：１であろう。 活性サイトに基く酵素阻害剤／酵素の当量比は
通常少なくとも約0.1、特に少なくとも約１であ
り、100またはそれ以上のモル過剰になることも
ある。 特定の分析系において、試薬をさまざまの割合
で試験して感度が最適となる比率を決定する。こ
の比率は分析の操作法によつて変化するだけでな
く、各リガンド、各酵素、酵素結合リガンドの酵
素／リガンドの比率、対象となる濃度範囲などに
よつても変化する。 本発明の分析のやり方も、各材料の性質、所望
の感度および使用装置の特性に応じて多岐にわた
る。競合方式と平衡方式のいずれも使用できる。
競合方式では、抗リガンドと酵素阻害剤の両方が
酵素結合リガンドに対して競合する。平衡方式で
は、抗リガンドを酵素結合リガンドと平衡に達す
るだけの時間にわたつて相互作用させ、その後で
酵素阻害剤を添加してもよい。こうすれば、酵素
阻害剤は、抗リガンドの存在によつて接近が立体
的に阻止されている酵素を除いた残りの酵素との
み反応することができる。 リガンドに対する競合方式は、抗リガンドと酵
素阻害剤とを同時に、酵素基質を含有する分析媒
質中のリガンドおよび酵素結合リガンド（単一試
薬とするのが好都合）に添加し、試薬の添加時か
ら計時して異なる２時点において酵素活性を測定
することにより実施できる。得られた２つの測定
値の差を、既知量の同じリガンドで得られた値と
比較する。別法として、基質は試薬の添加後に別
に添加し、時間を試薬の添加時から計算する。試
薬の添加から測定までにさまざまのインキユベー
シヨン時間を使用できる。 リガンドに対する平衡方式では、抗リガンドは
リガンドに酵素結合リガンドと同時に添加する
か、または酵素結合リガンドの添加は後で行つて
もよい。最初の添加法では、抗リガンドと酵素結
合リガンドを添加した後で、分析媒質を平衡に達
するまでインキユベーシヨンし、その後で酵素阻
害剤を添加する。媒質をその後さらに一定時間イ
ンキユベーシヨンしてから、酵素活性を測定す
る。別法として、抗リガンドを検体に添加してイ
ンキユベーシヨンした後、酵素結合リガンドを加
えてさらにインキユベーシヨンし、その後で酵素
阻害剤を添加して、任意に３回目のインキユベー
シヨンを行う。１回の測定でもよいが、各分析に
ついて一定間隔で２個の測定値を求め、この２個
の値の差で結果を表わすのが好ましい。情況によ
つては、上記以外の方式も使用できる。 インキユベーシヨン時間も広範囲にわたり、約
0.5分以下の短時間でもよいが、通常は24時間を
こえず、より普通には６時間以下、特に約30分以
下が好ましい。最終結果は、実質的に同様の方
法、可能ならば全く同一の方法で処理した標準試
験で得られた結果に基いて決定されるのであり、
アナライトの濃度を変えると意味のある再現性の
よい差異が得られる限り、方式の種類や時間は重
要ではない。 分析方式の選択、使用器具およびアナライトの
濃度によつては、分析容量は約1μ程度まで小
さくもなるが、通常は少なくとも25μであり、
最大５ml以下、特に約２ml以下のことが多い。 １つの方法として、酵素阻害剤は抗酵素のFab
砕片でよい。この方法では、酵素結合リガンドと
Fab抗酵素砕片とを単一試薬として混合すること
が可能なので、両試薬を一定の比率で調製でき
る。この試薬をまとめて結合させておくと、測定
誤差の機会は少なくなる。 抗リガンドの測定では、酵素結合リガンドをま
ず検体に添加してインキユベーシヨンした後、酵
素阻害剤を添加する点を除けば、やり方は上記と
実質的に同じである。 次に酵素結合抗リガンドを使用した分析につい
て考察する。 一般に、ポリエピトピツクリガンドのアナライ
トに対しては、結合サイトに基く全抗リガンドの
濃度は、エピトピツクサイトに基く最低または最
高対象濃度の約１〜50倍であり、通常は対象とな
る最高濃度の約１〜10倍、特に１〜３倍である。
モノエピトピツクリガンドアナライトと受容体ア
ナライトに対しては、結合サイトに基いて、ポリ
（リガンド類似物）とラベルつき抗リガンドのそ
れぞれの濃度は対象となる最低濃度にほゞ等し
く、普通には対象となる最高濃度をこえない濃度
であつて、一般に対象となる最低濃度の10^-4以
上、より普通には10^-2以上である。分析の対象と
なる濃度範囲は一般に約10^-4ないし10^-15ｇ／ml
に及ぶ。モノエピトピツクのアナライトと受容体
アナライトに対して、アナライト以外の全抗リガ
ンドの濃度は普通にはポリ（リガンド類似物）ま
たはリガンドのの濃度の15倍までであつて、より
普通には10倍まで、特に３倍までである。 酵素阻害剤の濃度は、抑制剤の性質、その酵素
阻害効果などに応じて大幅に変動する。普通、阻
害速度が確実に速くなるように適当に過剰の抑制
剤を使用できるが、抑制剤の濃度に制限はない。
したがつて、酵素阻害剤は、少なくとも約30％の
抑制、好ましくは50％以上の抑制を生ずるだけの
濃度で存在させる。すなわち、アナライトが存在
しない場合には酵素活性に少なくとも30％の低下
が見られよう。 添加の順序もいろいろに変えられる。普通は、
抑制剤の添加の前に、未知試料とラベルつき受容
体を適当な媒質中で混合する。酵素の基質は酵素
阻害剤と共に、または抑制剤の添加の後で添加し
てもよい。未知試料をラベルつき受容体および適
宜にリガンドまたはポリ（リガンド類似物）と混
合した後、分析媒質を複合体の形成に必要な時間
だけインキユベーシヨンしてもよい。 分析各成分の各添加間の時間および免疫反応の
時間は、使用化合物、添加方式、濃度、受容体の
結合定数などに応じて大幅に変動する。普通は、
各添加間の時間の間隔は数秒から数十時間にわた
るが、通常は24時間をこえず、より普通には６時
間以下である。分析混合物に１成分を添加した
後、次の成分の添加または測定値の読みとりまで
に、さまざまのインキユベーシヨン時間をとる。
最終的な結果は、実質的に同様な方法または可能
ならば全く同一の方法で処理した標準試験で得た
結果に基いて定まるのであるから、アナライトの
濃度を変えたときに意味のある再現性のよい差異
が得られる範囲内では分析方式の種類や時間は重
要な因子ではない。 分析方式の選択、使用装置およびアナライトの
濃度によつては、分析容量は1μ程度まで小さ
くともよいが、普通には少なくとも25μであ
り、また通常は５mlをこえず、より普通には約２
ml以下である。 抗リガンドの測定では、操作は同一であるが、
測定結果は各成分の相対比率に依存する信号の増
減とすることもできる。すなわち、抗リガンドは
複合体から酵素−抗リガンド結合体を取り去つ
て、代りに置換することもできるし、または複合
体の形成を増進することもできる。抗リガンドが
酵素−抗リガンド結合体を置換するような方式を
採用するのが好ましい。 材 料 本発明のアナライト分析法の主要成分は、アナ
ライト；酵素結合リガンドまたは酵素結合受容
体；酵素阻害剤；ならびに酵素基質である。 アナライト （被分析物質） 本発明のリガンド型のアナライトはモノエピト
ピツクまたはポリエピトピツクであるという特徴
を有する。ポリエピトピツクリガンドのアナライ
トは普通はポリアミノ酸、すなわちポリペプチド
およびタンパク質、多糖類、核酸およびこれらの
混合物である。このような混合物または集合体と
しては、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミト
コンドリア、細胞核、細胞膜などがある。 本発明で用いるポリエピトピツクリガンドのア
ナライトの大部分は、分子量が少なくとも5000、
より普通には約10000以上である。ポリアミノ酸
類では、対象となるポリアミノ酸は一般に分子量
が約5000〜5000000、通常は約20000〜1000000の
ものであり；対象になるタンパク質は分子量が約
5000〜600000のもので、アルブミンとグロブリン
を包含し；対象となるホルモン類は一般に分子量
が約5000〜60000の範囲内であろう。 広範なタンパク質を、構造的特徴が類似してい
るタンパク質、特定の生物学的機能を有するタン
パク質、特定の微生物、特に疾病誘発微生物に関
係するタンパク質などの観点から分類することが
できる。 次は構造によるタンパク質の種類である。 プロタミン ヒストン アルブミン グロブリン 硬タンパク質 リソタンパク質 ムコタンパク質 色素タンパク質 リポタンパク質 核タンパク質 上記以外のタンパク質（例、ソマトトロピン、
プロラクチン、インシユリン、ペプシン） 人の血シヨウに存在する多数のタンパク質は臨
床的に重要であり、これには次のものがある。 プレアルブミン アルブミン α₁−リポタンパク質 α₁−酸性糖タンパク質 α₁−抗トリプシン α₁−糖タンパク質 トランスコルチン 4.6S−ポストアルブミン 低トリプトフアン−α₁−糖タンパク質 α₁x−糖タンパク質 チロキシン結合グロブリン インター−α−トリプシン抑制剤 Gc−グロブリン（Gc1−１、２−１、２−２） ハプトグロビン（Hp−１−１、２−１、２−
２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α₂−リポタンパク質 α₂−マクログロブリン α₂−HS−糖タンパク質 Zn−α₂−糖タンパク質 α₂−ノイラミノ−糖タンパク質 エリスロポイエチン（赤血球造血ホルモン） β−リポタンパク質 トランスフエリン ヘモペキシン（凝血酵素） フイブリノーゲン プラスミノ−ゲン β₂−糖タンパク質および 免疫グロブリンＧ（IgGまたはγG−グロブリ
ン） 分子式：γ₂k₂またはγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ（IgAまたはγA−グロブリ
ン） 分子式：（α₂k₂）ⁿまたは（α₂λ₂）ⁿ 免疫グロブリンＭ（IgMまたはγM−グロブリ
ン） 分子式：（μ₂k₂）⁵または（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ（IgDまたはγD−グロブリ
ン） 分子式：（δ₂k₂）または（δ₂λ₂） 免疫グロブリンＥ（IgEまたはγE−グロブリン） 分子式：（ε₂k₂）または（ε₂λ₂） 自由Ｋおよびγライトチエイン（light
chains） 補体因子： C′1（C′1g，C′1r，C′1s） C′2 C′3 （β₁A，α₂D） C′4 C′5 C′6 C′7 C′8 C′9 重要な血液凝固因子には次のものがある。 国際表示 名称 フイブリノーゲン プロトロンビン ａ トロンビン 組織トロンボプラスチン および プロアクセレリン，促進剤グロブリ
ン プロコンバーチン 抗血友病グロブリン（AHG） クリストマス因子，血シヨウトロン
ボプラスチン成分（PTC） スチユアート−プロワ−因子，アウ
トプロトロンビン XI 血シヨウトロンボプラスチン前駆
因子（PTA） XII ハーゲマン因子 フイブリン安定化因子 重要なホルモンタンパク質には次のものがあ
る。 ホルモンペプチドおよびタンパク質 上皮小体ホルモン チロカルシトニン（Thyrocalcitonin） インシユリン グルカゴン レラキシン 赤血球造血ホルモン メラノトロピン（黒血球刺激ホルモン；イン
テルメジン） ソマトトロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（副腎皮質刺激ホルモン） 甲状腺刺激ホルモン 卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン） ルテオマンモトロピツクホルモン（ルテオト
ロピン，プロラクチン） 性腺刺激ホルモン（胎盤性性腺刺激ホルモ
ン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン ハイパーテンシンおよび ブラジキニン（カリジン） ヒト胎盤性ラクトゲン（lactogen） 脳下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バソプレツシン 放出因子（RF） CRF，LRF，TRF，ソマトトロピン−
RF，GRF，FSH−RF，PIF，MIF 分析の対象となるその他の重合体材料はムコ多
糖類と多糖類である。 微生物から誘導された抗原性多糖類の例を示に
示す。 【表】 【表】 分析を受ける微生物は無傷のもの、溶解したも
のまたは粉砕その他で細分化したものでよく、た
とえば抽出などで得られた組成物または部分も分
析できる。対象となる微生物としては次のものが
ある。 コリネバクテリウム属（Corynebacteria） ジフテリア菌（C.diphtheriae） 肺炎球菌属（Pneumococci） 肺炎双球菌（Diplococcus pneumonie） 連鎖球菌属（Streptococci） 化膿連鎖球菌（Str.pyogenes） ストレプトコツカス・サリバルス（Str.
salivarus） ブドウ球菌属（Staphylococci） 黄色ブドウ球菌（S.aureus） 白色ブドウ球菌（S.albus） ナイセリア属（Neisseriae） 髄膜炎菌（N.meningitidis） 淋菌（N.gonorrheae） 腸内菌科（Eenterobacteriaciae） 大腸菌群 大腸菌（E.coli） アイロゲネス菌（Aerobacter aerogenes） 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae） サルモネラ属（Salmonellae） 腸チフス菌（S.typhosa） 豚コレラ菌（S.choleraesuis） ネズミチフス菌（S.typhimurium） 赤痢菌属（Shigellae） 赤痢菌（S.dysenteriae） シユミツツ菌（S.schmitzii） シゲラ・アラビノタルダ（S.arabinotarda） フレキシナー菌（S.flexneri） ボイド菌（S.boydii） ゾンネ菌（S.sonnei） その他の腸内桿菌 尋常変形菌（Proteus vulgaris） 奇怪変形菌（P.mirabilis） モルガン変形菌（P.morgani） 以上は変形菌（プロテウス）属 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa） アルカリ大便菌（Alcaligenes faecalis） コレラ菌（Vibrio cholerae） ヘモフイラス−ボルデテラ群 インフルエンザ菌（Hemophilus
influenzae） 軟下疳菌（H.ducreyi） ヘモフイラス・ヘモフイラス（H.
hemophilus） ヘモフイラス・エジプチカス（H.
Aegypticus） パライソフルエンザ菌（H.
parainfluenzae） 百日咳菌（Bordetella pertussis） パスツレラ属（Pasteurellae） ペスト菌（Past.pestis） 野ウサギ病菌（Past・tularensis） ブルセラ属（Brucellae） マルタ熱菌（Br.melitensis） ウシ流産菌（Br.abortus） ブタ流産菌（Br.suis） 好気性胞子形成桿菌 炭疽菌（Bacillus anthracis） 枯草菌（B.subtilis） 巨大菌（B.megaterium） セレウス菌（B.cereus） 嫌気性胞子形成桿菌 ボツリヌス菌（Clostridium botulinum） 破傷風菌（Cl.tetani） ウエルチ菌Ａ型（Cl.perfringens） ノービ菌（Cl.nouyi） セプチツクス菌（Cl.septicum） ヒストリチクス菌（Cl.histolyticum） 第３型ロデラ菌（Cl.tertium） クロストリジウム・ビフエルメンタス（Cl.
bifermentas） スポロゲネス菌（Cl.sporogenes） ミコバクテリウム属（Mycobacteria） 人型結核菌（Myco.tuberculosis hominis） 牛型結核菌（Myco.bovis） 鳥型結核菌（Myco.avium） ライ菌（Myco.leprae） パラ結核性腸炎菌（Myco.
paratuberculosis） 放線菌類（真菌様のバクテリア） 牛放線菌（Actinomyces israelii） 〃 （Actinomyces bovis） アクチノマイセス・ネスルンジ（Ac.
naeslundii） ノカルジア・アステロイデス（Nocardia
asteroides） ノカルジア・ブラジリエンシス（N.
brasiliensis） スピロヘータ類 梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum） フランベジア・トレポネーマ（Trep.
pertenue） ピンタ・トレポネーマ（Trep.carateum） オーベルマイエル回帰熱スピロヘータ
（Borreliarecurrentis） 黄疽出血病レプトスピラ
（Leptospiraicterohemorrhagiae） 犬レプトスピラ（Lept.canicola） 小スピリルム（Spirillum minus） ストレプトバチルス・モニリフオルミス
（Streptobacillus moniliformis） ミコプラズマ 肺炎ミコプラズマ（Mycoplasma
pneumoniae） その他の病原体 単球症リステリア（Listeria
monocytogenes） 豚円毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae） ソケイ肉芽腫菌（Donovania
granulomatis） バチルス形バルトネラ（Bartonella
bacilliformis） リケツチア（細菌様の寄生虫） 発疹熱リケツチア（Rickettsia prowazekii） モーセリ・リケツチア（R.mooseri） 斑点熱リケツチア（R.rickettsii） コノリ・リケツチア（R.conori） オーストラリス・リケツチア（R.australis） シビリクス・リケツチア（R.sibiricus） アカリ・リケツチア（R.akari） つつが虫リケツチア（R.tsutsugamushi） Ｑ熱リケツチア（R.burnetii） ざんごう熱リケツチア（R.quintana） クラミジア（分類不可の寄生虫，細菌性／ウイル
ス性） クラミジア剤（Chlamydia agent）（命名未
確定） 真菌類 クリプトコツカス・ネオフオルマンス
（Cryptococcus neoformans） ブラストマイセス・デルマチジス
（Blastomycesdermatidis） ヒストプラズマ・カプスラツム
（Histoplasmacapsulatum） コクシジオイデス・イミチス
（Coccidioidesimmitis） ブラジル・パラコクシジオイデス
（Paracoccidio−ides brasiliensis） ガコウソウ・カンジダ（Candida albicans） アスペルギラス・フミガツス
（Aspergillusfumigatus） カサ状ケカビ（Mucor corymbifer） （Absidia corymbifera） リゾパス・オリザエ（Rhizopus oryzae） リゾパス・アルリズス（Rhizopus arrhizus） クモノスカビ（Rhizopus nigricans） 上の３例は藻菌類 スポロトリカム・シエンキ
（Sporotrichumschenkii） ホンセカエア・ペドロソイ（Fonsecaea
pedrosoi） ホンセカエア・コンパクタ（Fonsecaea
compacta） ホンセカエア・デルマチチジス
（Fonsecaeadermatitidis） クラドスポリウム・カルリオニ
（Cladosporiumcarrionii） フイアロフオラ・ベルルコサ
（Phialophoraverrucosa） アスペルギルス・ニドランス
（Aspergillusnidulans） マズラ足放線菌（Madurella mycetomi） マドレラ・グリセア（Madurella grisea） アレシエリア・ボイジ（Allescheria boydii） フイアロスフオラ・ジーンセルメイ
（Phialosphorajeanselmei） 石コウ状小胞子菌（Microsporum gypseum） 毛ソウ白セン菌（Trichophyton
mentagrophytes） ケラチノマイセス・アジエロイ
（Keratinomycesajelloi） 犬小胞子菌（Microsporum canis） シヨウ紅色白セン菌（Trichophyton rubrum） オーズアン小胞子菌（Microsporum
andouini） ウイルス アデノウイルス 疱疹ウイルス 単純疱疹 水痘 帯状疱疹 Ｂウイルス 痘疹ウイルス 天然痘 種痘 中痘 変態痘 伝染性軟属腫 ピコルナウイルス（Picornaviruses） ポリオウイルス コツクスサツキーウイルス エコウイルス（Echoviruses） 鼻ウイルス（Rhinoviruses） 混合ウイルス インフルエンザ（Ａ，ＢおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） 流行性耳下腺炎ウイルス ニユーカツスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫病ウイルス 犬ジステンパーウイルス 呼吸シンシチウムウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス（Arboviruses） 東部馬脳炎ウイルス 西部馬脳炎ウイルス シンドビス（Sindbis）ウイルス チクグンヤ（Chikugunya）ウイルス セムリキ森林ウイルス マヨラ（Mayora）ウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフオルニア脳炎ウイルス コロラド・ダニ熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス（Reoviruses） １〜３型レオウイルス 肝炎ウイルス Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 腫瘍ウイルス ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルス グロス（Gross）ウイルス マロニー（Maloney）白血病ウイルス モノエピトピツクリガンドのアナライトは一般
に分子量が約100〜2000、より普通には125〜1000
であろう。対象となるアナライトには、医薬、代
謝生成物、殺虫剤、環境汚染物質などがある。分
析できる医薬としてアルカロイドがある。アルカ
ロイドの例には、モルフインアルカロイド、たと
えば、モルフイン、コデイン、ヘロイン、デキス
トロメトルフアンならびにこれらの誘導体および
代謝生成物；コカインアルカロイド、たとえば、
コカイン、ベンゾイルエクゴニン、これらの誘導
体および代謝生成物；麦角アルカロイド、たとえ
ばリゼルグ酸のジエチルアミド；ステロイドアル
カロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリ
ンアルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キ
ノリンアルカロイド、たとえばキニンおよびキニ
ジン；ジテルペンアルカロイド、これらの誘導体
ならびに代謝生成物がある。 別の群の薬品としてステロイドがあり、これに
はエストロゲン、ゲストロゲン、アンドロゲン、
アンドレノコルチカルステロイド、胆汁酸、強心
性グリコシドおよびアグリコン（ジゴキシンとジ
ゴキシゲニン、サポニンとサポゲニンなどこれら
の誘導体および代謝生成物などが包含される。ま
た、ジエチルスチルベストロールなどの擬ステロ
イド物質もこれに包含される。 その次の薬品群として、５または６員環の環式
ラクタムがある。これにはバルビツール酸塩、ジ
フエニルヒダントインおよびこれらの代謝生成物
が包含される。 別の薬品群はアルキル部位の炭素数が２〜３の
アミノアルキルベンゼンである。これにはアンフ
エタミンとカテコラミンの類が含まれ、具体例と
してはエフエドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリ
ン、ナルセイン、パパベリン、これらの誘導体お
よび代謝生成物がある。 別の薬品群は、複素環がアゼピン、ジアゼピン
およびフエノチアジンからなるベンゾ複素環化合
物で、具体的にはオキサゼパム、クロルプロマジ
ン、テグレトール、イミプラミン、これらの誘導
体および代謝生成物が包含される。 別の薬品群はプリンであつて、これにはテオフ
イリン、カフエイン、これらの誘導体および代謝
生成物が包含される。 別の薬品群はマリフアナから誘導されるもの
で、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビ
ノールが含まれる。 別の薬品群として、ビタミンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，
ＥおよびＫなどのビタミン類がある。 別の薬品群はプロスタグランジン類で、これは
ヒドロキシル化と不飽和結合の程度および位置に
よつて変化する。 次の薬品群として抗生物質があり、これにはペ
ニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチ
ン、テトラサイクリン、テラマイシン、これらの
代謝生成物および誘導体がある。 次の薬品群として、ヌクレオシドとヌクレオチ
ドがあり、この群には適当な糖およびリン酸置換
基を有するATP、NAD、FMN、アデノシン、
グアノシン、チミジンおよびシチジンが包含され
る。 別の薬品群は雑多なその他の薬剤であつて、た
とえばメタドン、メプロバメート、セロトニン、
メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、ライドカイン、プロカインアミド、アセチル
プロカインアミド、プロパノロール、グリセオフ
ルビン、ブチロフエノン、抗ヒスタミン剤、抗コ
リン作動薬（例、アトロピン）、これらの代謝生
成物および誘導体が包含される。 別の化合物群として、アミノ酸および小ペプチ
ドがあり、これにはチロキシン、トリヨードチロ
ニン、オキシトシン、ACTH、アンギオテンシ
ン、ゲンタマイシン、メタおよびロイ−エンケフ
アリン、これらの代謝生成物および誘導体が包含
される。 病気状態に関係する代謝生成物に、スペルミ
ン、ガラクトース、フエニルピルビン酸および１
型ポルフイリンがある。 対象となる殺虫剤の例には、ポリハロゲン化ビ
フエニル、リン酸エステル、チオリン酸エステ
ル、カルバメート、ポリハロゲン化スルフエンド
アミド、これらの代謝生成物および誘導体があ
る。 受容体のアナライトは、分子量が一般に10000
ないし２×10⁶、より普通には10000ないし10⁶の
範囲内であろう。免疫グロブリンIgA，IgG，
IgEおよびIgMは、分子量が一般に約160000ない
し約10⁶であろう。酵素の分子量は普通約10000〜
600000である。天然の受容体の分子量も広範囲に
わたり、一般に少なくとも約25000で、10⁶または
それ以上に達するものもある。これには、アビジ
ン、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合
ブレアルブミン、トランスコルチンなどがある。 酵素結合リガンドまたは受容体 酵素結合体は酵素を免疫学的一対の一方と結合
させて調製する。それには２官能性の試薬を利用
するか、またはその免疫学的一対成分もしくは酵
素にもともと存在したか、またはこれらの変性に
よつて導入した官能基の間に共有結合を形成させ
る。 免疫学的一対成分１分子当りの酵素の数は、そ
の免疫学的一対成分の大きと性質によつて大幅に
変動する。ハプテンを包含する酵素結合リガンド
は、一般に酵素１個当り少なくとも１個、より普
通には少なくとも２個のハプテンを含有し、酵素
の分子量を1500で割つた値に等しい数のハプテン
を含有することもあろう。酵素結合リガンドが抗
原（分子量5000以上）を含有する場合、酵素：リ
ガンドのモル比は広範囲にわたり、一般に約0.01
〜100：１の範囲内である。酵素が受容体に結合
される場合、モル比は通常約0.1〜10：１の範囲
内であろう。 多種多様な物質、たとえばタンパク質（例、抗
体）、多糖類、核酸などへの、酵素を含むタンパ
ク質の結合については文献にも非常に多くの実例
が載せられている。多様な結合基および結合官能
基が使用しうる。非オキソカルボニル、オキソカ
ルボニル、ジアゾ、スルホニル、オキソイミノ、
イミド、およびチオノ官能基を利用するのが好都
合である。オキソカルボニルでは還元アルキル化
を用いるのが有利であろう。 官能基間の結合基は、直接結合であつてもよい
が、より普通には少なくとも１個、特に少なくと
も２個の炭素原子を有する。結合基の炭素数の上
限は一般に約20、より普通には約12以下であろ
う。タンパク質への酵素の結合法は米国特許第
3791932および3839153に示されている。 モノエピトピツクリガンドの結合法は米国特許
第3817837、特にその31〜34欄および実施例に示
されている。 本発明の酵素結合体の製造において、結合サイ
ト数に基く比較でリガンドに対して受容体が過剰
に存在していても、酵素結合体の活性の実質的部
分がなお保たれていることが望ましい。その場
合、複合体の一方の構成要素に結合した複合体中
の酵素がその活性の実質的部分を保有する。通
常、酵素結合体のもとの活性の少なくとも約20
％、好ましくは30％以上、さらに好ましくは50％
以上が残留するのがよい。したがつて、抗リガン
ドとリガンドとの結合によつて起る酵素の不活性
化を少なくするようような方法で酵素を使用し、
酵素結合体を調製するのが望ましい。酵素はどれ
でも使用できるが、たいていの場合は或る種の酵
素が有利である。酵素の選択に当つては、酵素が
結合後も高い代謝回転率を有し；活性を著しく低
下させずに保存でき；分光光度法による測定がで
きる好都合な酵素の分析法が存在し；最適回転率
のPHが、抗リガンドとリガンドの結合に最適のPH
に適当に近いことが望ましい。もちろん、本発明
にとつて、抗リガンドとリガンドの結合により酵
素への接近が阻まれる巨大分子の酵素阻害剤が入
手できるということも必要である。また、酵素の
利用可能な基質は、その酵素活性サイトへの接近
が、酵素阻害剤の酵素への接近に比較して妨げら
れていないようなものが望ましい。通常、基質の
分子量は5000以下、より普通には約2000以下、好
ましくは約1000以下である。 各種の酵素の中で、特に有利に利用できる酵素
をIUB分類にしたがつて下記に列挙する。 １ 酸化還元酵素 1.1 供与体のCH−OH基に作用 1.1.1 受容体がNADまたはNADP １ アルコール脱水素酵素 ６ グリセリン脱水素酵素 26 グリオキシレート還元酵素 27 Ｌ−乳酸脱水素酵素 37 リンゴ酸脱水素酵素 49 グルコース−６−リン酸脱水素酵素 17 マンニツト１−リン酸脱水素酵素 1.1.2 受容体がチトクローム ３ Ｌ−乳酸脱水素酵素 1.1.3 受容体がO₂ ４ グルコース酸化酵素 ９ ガラクトース酸化酵素 1.2 供与体のCH−NH₂基に作用 1.4.3 受容体がO₂ ２ Ｌ−アミノ酸酸化酵素 ３ Ｄ−アミノ酸酸化酵素 1.6 還元NADまたはNADPからなる供与体に
作用 1.6.99 他の受容体 ジアフオラーゼ 1.10 ジフエノールおよび関連物質からなる供
与体に作用 1.10.3 受容体がO₂ １ ポリフエノール酸化酵素 ３ アスコルビン酸酸化酵素 1.11 H₂O₂受容体に作用 1.11.1 ６ カタラーゼ ７ ペルオキシダーゼ ３ 加水分解酵素 3.1 エステル結合に作用 3.1.1 カルボン酸エステル加水分解酵素 ７ コリンエステラーゼ 3.1.3 リン酸モノエステル加水分解酵素 １ アルカリ性ホスフアターゼ 3.1.4 リン酸ジエステル加水分解酵素 ３ ホスホリパーゼＣ 3.2 グリコシル化合物に作用 3.2.1 グリコシド加水分解酵素 １ α−アミラーゼ ４ セルラーゼ 17 リゾチーム 23 β−ガラクトシダーゼ 27 アミログルコシダーゼ 31 β−グルクロニダーゼ 3.4 ペプチド結合に作用 3.4.2 ペプチジル−アミノ酸加水分解酵素 １ カルボキシペプチダーゼＡ 3.4.4 ペプチジル−ペプチド加水分解酵素 ５ α−キモトリプシン 10 パパイン 3.5 ペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用 3.5.1 線状アミドのＣ−Ｎ結合 ５ ウレアーゼ 3.6 酸無水物結合に作用 3.6.1 ホスホリル含有無水物中の無水物結
合 １ 無機ピロホスフアターゼ ４ リアーゼ 4.1 Ｃ−Ｃリアーゼ 4.1.2 アルデヒドリアーゼ ７ アルドラーゼ 4.2 Ｃ−Ｏリアーゼ 4.2.1 加水分解酵素 １ 炭酸脱水酵素 4.3 Ｃ−Ｎリアーゼ 4.3.1 アンモニアリアーゼ ３ ヒスチーゼ 酵素阻害剤 酵素阻害剤は、酵素と相互作用または反応し
て、酵素の代謝回転率を実質的に低下させて好ま
しくは０にすることができる巨大分子である。酵
素阻害剤はその阻害作用を物理的または化学的に
果すことができる。 物理的阻害は２種類の起り方で起りうる。１つ
は、抑制剤の物理的な量が酵素基質の接近を妨げ
る。他の１つは、酵素阻害剤が酵素に結合した結
果としてコンフオメーシヨンの変化が起り、これ
が酵素活性に影響する。場合によつては、この両
方の作用が併発する。たいていは、物理的抑制剤
は、その酵素に結合する抗体（抗酵素）であろ
う。全抗体またはFab砕片のいずれも使用でき
る。酵素を阻害する抗体は多数のものが市販され
ており、また個々の酵素を抗原として使用して阻
害性の抗酵素を製造することもできる。 酵素阻害の別の方法は、抑制剤と酵素との化学
反応による。特に、酵素と反応して酵素活性を低
下または壊滅させる抑制剤が使用できる。特定の
酵素に特異的に反応する多様な不可逆抑制剤（不
活性化剤）が知られており、または巨大分子量の
中心（hub）分子に誘導したものであつて、その
阻害作用をなお保有するものも使用することがで
きる。 下記に、酵素と、これを阻害する既知の抑制剤
の例を列挙する。 【表】 【表】 トラン
拮抗的可逆抑制剤も使用できるが、これは酵素
の基質と拮抗して、結合していない酵素ラベルつ
き受容体中に存在する酵素の酵素代謝回転率を低
下させる抑制剤の効果に変動が生ずるので、あま
り好ましくはない。 上に列挙した特定の酵素以外にも、同じ不可逆
抑制剤で不活性化させうる関連酵素は多数存在す
る。また、この非拮抗的抑制剤の誘導体も、分子
の活性部分を残すことによつてその阻害作用をな
お保有しているものが多数調製できる。 抑制剤が巨大分子（すなわち分子量が少なくと
も2000、普通は5000以上の分子）ではない場合に
は、この抑制剤を中心核となる別の化合物に結合
させて、複合体への抑制剤の接近を阻止するのに
必要な寸法まで巨大化させる。中心核に抑制剤を
結合させる場合、結合サイトは抑制剤の阻害作用
に必要な部分から離れた部位となるように選択す
る。したがつて、阻害作用にとつて重要ではない
結合サイトを有する抑制剤を使用し、これを作用
させる酵素として基質に対する構造特異性の要求
があまりきびしくない酵素を選択するのが一般に
好ましい。下記にタンパク質分子に結合できる抑
制剤と、それによつて阻害される酵素の例を列挙
する。 巨大分子量物質への抑制剤の結合に慣用の結合
様式も使用できる。結合様式はその抑制剤の種類
と中心核となる物質の性質によつて変るだろう。
場合によつては、抑制をなお可能にするような中
心核への強力な特異的または非特異的結合が存在
する場合に、巨大分子への抑制剤の結合を非共有
結合とすることも可能である。 以下の実施例は例示のために挙げるのであつ
て、限定の意図はない。なお実施例において、部
および％は特に指定のない限り重量によるが、た
だしリガンド混合物に関しては容量による。特に
記載がなければ、各種反応で使用した材料は市販
されている。実施例では下記の略号を使用した。 DMF：ジメチルホルムアミド THF：テトラヒドロフラン Ｇ−６−PDH：グルコース−６−リン酸脱水素
酵素 BSA：牛血清アルブミン RSA：ラビツト血清アルブミン HRP：ホースラデイツシユ（西洋わさび）ペル
オキシダーゼ Ｔ−３：トリヨードチロニン 実施例 １ Ｎ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルアミ
ン無水物でアミド化したトリヨードチロニンの
G6PDH（ロイコノストク・メセンテロイデス）
との結合 Ａ 反応は、磁気撹拌機を備えた25mlの丸底フラ
スコを箔でおおい、アルゴン雰囲気に置いたも
ので行つた。T3メチルエステル塩酸塩0.591ｇ
の溶液を、２mlのDMFと２mlのTHFからなる
溶媒系で形成した。この溶液に146μのトリ
エチルアミン（1.25当量）を添加し、溶液を15
分間撹拌した。次にＮ−メチルイミノ二酢酸無
水物（MEMIDA）0.130ｇ（1.20当量）を１度
に加えた。SiO₂でのTLCが完全な反応を示し
たら（TLC分析の溶媒系はAcOH／MeOH／
CHCL₃＝５：10：85）、溶媒を最初は水流ポン
プ、最後は機械的真空ポンプによる減圧下で
Biichi回転蒸発器により除去した。この時の水
浴温度は30℃をこえないようにした。残渣を
8.5mlの乾燥THFにとかし、この溶液に酢酸エ
チル76mlを添加して、混合物を激しく振りまぜ
た。得られた懸濁液を重力過し、液を分液
ロトに入れて、まず水10ml、次に水20ml、さら
に飽和食塩水２×15mlで洗浄し、溶液を乾燥し
た。MgSO₄を加えてさらに乾燥を行い、この
MgSO₄を重力過により取り除いた。溶媒を
蒸発器で除去し、生成物残渣をCHCl₃に懸濁さ
せた。次に石油エーテルをこの懸濁液の共溶媒
として添加した。その後、溶媒を去し、固体
生成物を真空下デシケータ中で乾燥した。デシ
ケータでの乾燥後に、Ｔ−３−MEMIDAの白
色粉末0.346ｇが得られた。 Ｂ １mlのTHFに2.21×10^-2ｇのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド（NHS）を溶解し、別の
乾燥THF1mlに3.61×10^-2ｇのジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）を溶解した。
反応フラスコにＡで調整したT3−
MEMIDA7mgと乾燥THF344μを入れ、こ
れを氷浴温度に冷却した後、上のNHS溶液
46μとDCC溶液55μを添加した。反応混
合物を光線からさえぎつて、低温室（２℃）
で約27時間撹拌した。この溶液をグラスウー
ル栓を通して過した後、真空下で蒸発乾固
し、得られた白色固体をCH₂Cl₂中の20％ｎ
−ヘキサン約１mlに溶解し、0.6×4.5cmのセ
ルロース粉末カラムで同じ溶媒によりクロマ
トグラフ処理し、重力流れを使用して同じ溶
媒で溶離した。ほゞ２カラム分の量の展開溶
媒を使用し、約0.25mlに分けたフラクシヨン
を採取した。フラクシヨン２〜５を集めて、
減圧下で蒸発乾固し、残渣を乾燥ジグリム
（diglyme）に溶解した。 Ｃ 冷0.05M炭酸塩緩衝液（PH９）２mlに凍結乾
燥したＧ−６−PDH（ロイコノストク・メセン
テロイデス，L.mesenteroides）12.1mgを溶解
し、この溶液を同じ緩衝液１×350mlで１晩透
析した。透析袋の残留液を透析物で３mlに調整
した。 この溶液を同じ緩衝液で2.16mg／mlの酵素濃
度に調整し、この溶液３mlを撹拌機を備えた反
応フラスコに入れた。これを氷浴で冷却しなが
ら、１mlのDMFを150μ／分の速度で加え、
次に１mlを取り出した。残りの３mlに、0.385
当量／μの濃度のT3−MEMIDA・NHSエ
ステルを次のスケジユールで添加した。まず
10μを２回添加、次に20μを１回添加、そ
の後30μを２回添加、以上の添加を各添加の
間に20分の間隔をあけて行なつた。各添加後
に、抗−Ｔ−３の存在下および不存在下での酵
素活性を分析した。反応混合物を23mmの（分子
量25000カツトオフ）Spectrapor透析袋に入れ
て、低温室で２×0.5の0.05Mトリス（tris）
−HCl，0.1M KClおよび1mM NaN₃（PH８）
に対して透析した。透析をくり返した。透析残
留液を２℃において15，000rpmで10分間遠心
分離した後、上澄み液を、0.05Mトリス−
HCl，0.1MKClおよび1mMNaN₃（PH8.0）中の
0.9×98.5cmＧ−50Mカラムでクロマトグラフ
処理し、同じ緩衝液で４滴／分の流速で溶離
し、20滴づつのフラクシヨンを採取した。フラ
クシヨン29〜33を集め、１℃において17，
000rpmで10分間遠心分離した。 撹拌棒を備えた冷ピアース・レアクテイビア
ル（Pierce Reactivial）に上記溶液３mlを入
れ、4M中和ヒドロキシルアミン冷水溶液１ml
を撹拌しながら５分間かけて徐々に添加した。
氷浴温度で10分後、反応混合物を室温まで昇温
させ、さらに90分間反応を続けた。反応混合物
をSephadexG−50Mカラムで前出のトリス緩
衝液を用いてクロマトグラフ処理し、同じ緩衝
液で室温で溶離した。カラムは0.9×98cmで、
流速は４滴／分で、あり、20滴づつのフラクシ
ヨンを採取した。フラクシヨン29〜34を集め、
25000の分子量をカツトオフするコロジオン袋
装置を用いて低温室で濃縮した。残留液を前出
のトリス緩衝液で２mlに調整した後、その１ml
を２×250mlの冷50mM炭酸塩緩衝液（PH9.05）
に対して透析した。 酵素１分子当りのT₃基の数をローリー
（Lowry）蛋白質の定量及び放射能の計数
（MEMIDAは¹⁴Cを含有していた）結果に基い
て計算したところ、約16であつた。 実施例 ２ ジゴキシンとＧ−６−PDHの結合体の調製 Ａ メタノール（18ml、モレキユラーシーブ3A
上で乾燥したもの）にとかした３−ケトジゴキ
キシゲニン（228mg、0.59ミリモル）、カルボキ
シメトキシルアミン塩酸塩（140mg、0.64ミリ
モル）および酢酸ナトリウム（294mg、3.6ミリ
モル）の透明溶液を、室温で窒素下に３時間撹
拌した。その試料をtlcで分析するとオキシム
誘導体の完全な生成を示した（R0.33；0.5：
１：10／HOAc−MeOH−CHCl₃，シリカゲ
ルプレート）。得られた反応生成物を蒸発乾固
し、残渣を５〜10℃で32mlの５％NaHCO₃に
溶解し、３×20mlのクロロホルムで抽出した。
重炭酸ナトリウム層を５〜10℃において28mlの
1N塩酸によりPH２〜３まで酸性化した後、10
×25mlの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽
出液を飽和食塩水で洗浄し、無水流酸ナトリウ
ム上で乾燥した。溶媒を蒸発させて残つた固体
を、メタノール／酢酸エチル／ヘキサンの混合
物から再結晶させると、白色の固体（188mg、
mp.202〜220℃（分解））が得られた。 Ｂ シヨウ液（serum）栓と乾燥管を備えた乾燥
したフラスコに、上記オキシム23.05mg（0.05
ミリモル）とDMF250μ（4゜A型モレキユラ
ーシーブ上で乾燥したもの）を入れ、室温で撹
拌しながら乾燥トリエチルアミン7.1μ
（0.052ミリモル）をシヨウ液栓から注射器で添
加した。この混合物を−14℃に冷却した後、カ
ルビトールクロロホルメート9.34μ（0.05ミ
リモル）を溶液の表面下に添加し、混合物を30
分間撹拌した。 別のフラスコで、0.055Mトリス緩衝液（PH
8.1）に約１〜２mg／mlの濃度でとかしたグル
コース−６−ホスフエート脱水素酵素
（G6PDH）の溶液２mlに、撹拌しながら、グ
ルコース−６−リン酸二ナトリウム塩20mgと
NADH40mgを加えた。（この反応中に、液の一
部を何回か採取して希釈し、希釈した酵素溶液
の5μを１mlの緩衝液と50μの基質でさらに
希釈してから、この溶液を1.5mlの試料カツプ
に入れ、流動セル（flowcell）を使用してギル
フオード分光光度計で60秒間にわたつて酵素活
性を読み取ることにより、酵素活性の測定を行
つた。）混合物を０℃に冷却し、撹拌下にカル
ビトール1.08mlを溶液の表面下に注射器で徐々
に添加した。30分間放置後、ブリンクマン遠心
分離機で４分間遠心分離して析出物を除去し、
上澄み液を単離した。この上澄み液を1N
NaOHで約9.0のPHに調整した。この時点でも
酵素活性をチエツクした。 この酵素溶液を撹拌しながら、ここに上で調
製した混合無水物を1μづつに分けて約1μ
／分の速度で添加した。混合無水物を10μ
だけ添加した後、抑制率と不活性化率を測定し
た。抑制率の測定は、上記の分析法で完全強度
の抗ジゴキシン約5μを使用して行なつた。
混合無水物約35〜45μを添加して、約50％の
抑制率と約36％の不活性化率が得られた。所望
の抑制率と不活化率が得られたら、この酵素結
合体を、0.05％のNaN₃と0.005％のチメロサル
を含有する0.055Mトリス−HCl緩衝液（PH8.1）
に対して透析することにより精製した。 上述した方法によつて、１回目の反応では各酵
素に５個のジゴキシンが結合した酵素結合体が得
られ、これは36％不活性化され、50％抑制されて
いた。別に行なつた第２回の反応では9.2個のジ
ゴキシンを含有する酵素結合体が得られ、これは
不活性化率が48％で抑制率が62％であつた。 実施例 ３ ヒトγ′−グロブリン（hIgG）のHRPへの結合 Ａ 凍結乾燥したHRP（10.95ｇ）を0.5mlの0.3M
NaHCO₃緩衝液（PH8.6）に溶解し、この溶液
を透析袋を入れて、低温室で氷冷緩衝液（上記
参照）１×500mlに対して３時間透析した。PH
を8.1に調整し、この溶液をさらに４時間透析
した。HRP溶液の量を透析物で２mlに調整し、
分光光度計で分析すると、3.46mg／mlの濃度を
示した。 Ｂ 上記溶液1.5mlに、室温で撹拌下において、
95％エタノール中のフルオルジニトロベンゼン
の１％溶液100μを添加し、混合物を直射光
線からさえぎつて１時間撹拌下に放置した。過
ヨウ素酸ナトリウム（１ml、40mM（ミリモ
ル））を添加し、この混合物を前と同じ条件下
で0.5時間撹拌した後、0.34Mエチレングリコ
ール水溶液0.5mlを加えた。同じ条件下でさら
に１時間撹拌した後、反応混合物を透析袋に移
し、低温室で３×900mlの10mM NaHCO₃緩
衝液（PH9.5）に対して透析した。 Ｃ 凍結乾燥したhIgG（9.7mg、マイルス・ラボ
ラトリー、凍結乾燥およびDEAE−セルロース
処理をしたもの、ロツト番号24）を、0.5mlの
10mM NaHCO₃緩衝液（PH9.5）に溶解し、２
×500mlの氷冷緩衝液（上記参照）に対して透
析した。この溶液の量を透析物で1.2mlに調整
してから、２〜４℃でブリンクマン微量遠心分
離機に４分間かけ、その後分光光度計で分析す
ると、5.28mg／mlの濃度を示した。 Ｄ HRP透析物の透析残渣（5.2mgHRP、1.3×
10^-1μM）に２〜４℃で撹拌しながら、hIgG透
析残渣0.95ml（５mg、3.1×10^-2μM）を添加し、
混合物を45分間撹拌した。この混合物に次に
NaBH₄ ５mg（1.32×10^-4Ｍ）を添加し、混合
物を２〜４℃で約4.5時間撹拌してから、、低温
室で２×300mlのPBS緩衝液（10mM
Na₂HPO₄，0.15M NaCl，PH7.0）に対して透
析した。透析残渣を低温室でコロジオン袋装置
（分子量25000以上を遮断）により約１mlまでさ
らに濃縮し、低温室でブリンクマン微量遠心分
離機に２分間かけてから、上澄み液を1.5×89
cmのSephadexG−200カラム（PBS中のゲル）
でクロマトグラフし、同じPBS緩衝液で溶離
した。流速は30秒ごとに１滴の割合で、20滴づ
つフラクシヨンを取つた。操作圧力は15cmで、
クロマトグラフイーは室温で行なつた。 各フラクシヨンについて分光光度計による分
析と酵素活性の分析の両方を行なつた。フラク
シヨン48は1.65×10^-6ＭのHRPと1.32×10^-6Ｍ
のhIgGを示し、hIgG／HRPのモル比は0.80と
なつた。酵素の分析については後で説明する。 実施例 ４ hIgGとG6PDHの結合 Ａ 氷冷した反応フラスコにまず0.5M NaHCO₃
緩衝液（PH10）中の〔¹⁴C〕−hIgG0.42μMを入
れ、次に水酸化ナトリウムでPH10に調整した脱
イオン水３ml中のアセトイミド酸エチル0.52ｇ
（4.2×10^-3Ｍ）を加えた。約４℃で５分間撹拌
した後、混合物を室温で25分間撹拌した。同量
のアセトイミド酸エチルの２回目の添加を１回
目の添加と同じ条件で行ない、反応溶液を透析
袋に移して、２℃で３×1400mlの
0.5MK₂HPO₄に対して透析した。PHを濃塩酸
で7.8に調整した後、袋の中の溶液を二分し、
Solval遠心分離機で２℃において12Kで30分間
遠心分離した。この溶液を次にコロジオン袋装
置でPBS（PH7.8）に対して濃縮処理した。 Sephadex Ｇ−200をPBS（PH6.7）中で膨潤
させ、この混合物を沸騰湯浴上で９時間加熱す
ることによりSephadexG−200のカラムを調製
した。２×89cmのカラムを作り、上記溶液の一
部をこのカラムに適用した。各フラクシヨンは
0.02％のNaN₃を含有するPBS（PH7.0）で溶離
した。フラクシヨン・コレクターは一定しなか
つたが、フラクシヨン113〜145を一緒にして、
100mMリン酸ナトリウム（PH8.0）１×1200
ml，２×1000mlに対して透析すると、38mlの最
初の容積が最終容積は35mlになつた。この溶液
をコロジオン袋装置で6.2mlに濃縮して、2.36
mg／mlのhIgG溶液を得た。 Ｂ 上記溶液（1.48×10^-8Ｍ hIgG）１mlにPH
8.1の水中の0.06M過ヨウ素酸ナトリウム１ml
（６×10^-5Ｍ）を加え、混合物を室温で3.5時間
撹拌した。この混合物に次に0.16Mエチレング
リコール水溶液１mlを添加し、混合物を室温で
1.5時間撹拌した。その後、反応混合物を透析
袋に移し、まず３×500mlの50mM NaHCO₃
緩衝液（PH９）に対して、次に１×500mlの
200mM NaHCO₃緩衝液（PH8.8）に対して透
析した。 Ｃ ほゞ3.5mlのＧ−６−PDH（L.mesentero−
ides，ロツト番号6A053−42）を200mlの
200mM NaHCO₃緩衝液（PH8.8）で充分に透
析した。 上のhIgG（2.27mg，1.42×10^-8Ｍ）とＧ−６−
PDH（8.82mg，8.48×10^-8Ｍ）の各溶液を合わせ
ると、最終的な量は6.6mlとなり、これを氷浴で
冷却しながら撹拌した。この混合物をその後室温
まで昇温させて、撹拌を４時間続けた。混合物を
氷水浴で冷却した後、５mgのNaBH₄を添加し、
混合物を氷浴に3.5時間保持した。この溶液を次
に透析袋に移し、0.15MのNaClを含有する
10mM K₂HPO₄緩衝液（PH９）に対して２〜４
℃で充分に透析した。反応混合物をその後コロジ
オン袋装置でPBS（PH7.0）に対して2.4mlの量ま
で濃縮した。 PBS（PH7.0）中のSephadexG−200から２×84
cmのクロマトグラフイーカラムを調製した。反応
混合物をこのカラムに適用し、室温でPH7.0の
PBSにより溶離して、40滴づつフラクシヨンを
取つた。カラムの流速は５滴／分で、約18cmの圧
力ヘツドを用いた。各フラクシヨンを酵素活性な
らびに放射能について分析した。酵素分析法につ
いては後述する。 実施例 ５ ｏ−ジアニシジンのデキストラン10への結合 0.5ｇのデキストラン（Dextran）10を２mlの
水に溶かして４℃に冷却した溶液に、４℃の100
mg／mlCNBγ水溶液250μを加え、PHを
1NNaOHの連続添加により11に維持した。５分
後200μだけを取り分けて、２mlのアセトンを
加えて、この溶液を４℃で10Kにして５分間遠心
分離すると、ペレツトが単離された。このペレツ
トをDMF／0.1M重炭酸塩緩衝液（PH９）の混合
物中に溶解し、同じ混合物にとかしたｏ−ジアニ
シジンの20mg／mlの溶液をデキストラン10：ｏ−
ジアニシジンのモル比が１：10となる量だけ添加
した。PHを９に調整し、低速で撹拌しながら反応
を暗所で１晩進行させた。 この混合物にその後1M1−アミノ−２−プロパ
ノール100μを添加し、PHを1N HClで９に調整
し、混合物を暗所で室温に３時間放置した。次に
PHを７に調整し、10Kで４℃において５分間遠心
分離し、上澄み液を単離した。 0.01M PO₄，0.2M NaClのPH７の緩衝液中の
SephadexG−25の２×40cmのカラムに上記の上
澄み液を加え、生成物を35ml／hrの流速で同じ緩
衝液により溶離して、80滴づつのフラクシヨンを
集めた。この操作の間、カラムは暗所に保持し
た。フラクシヨン21〜25を取り出して、いつしよ
にした。 実施例 ６ ホースラデイツシユ・ペルオキシダーゼ
（HRP）の抗−ヒトIgG（抗−hIgG）への結合 透析袋に４mlの8.5mg／ml抗−hIgG（Fc特異性）
（Dakoロツト番号015、力価600μｇ／ml）を入
れ、低温室（２〜４℃）で３×350mlの0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（PH7.5）に対して透析した。
残留液を5.1mlの透析物で希釈し、２〜４℃で15，
000rpmで10分間遠心分離した。 10mlのRBフラスコに上で調整した6.45mg／ml
の抗−hIgG溶液５ml（32.3mg）を入れ、氷浴で
冷却し、1.5×10^-2Ｍ〔¹⁴C〕無水酢酸−ベンゼン
溶液15μを撹拌下に添加した。2.75時間後、2M
ヒドロキシルアミンと2M NaClの水溶液を添加
して反応を抑え、氷浴を取りはずして、混合物を
室温で１時間撹拌した。１×350mlの0.1Mリン酸
ナトリウム−0.1M硫酸ナトリウム（PH7.1）に対
して透析した後、残留液を上記の透析用緩衝液で
膨潤させた２×44cmのＧ−25Mゲル上でクロマト
グラフ処理し、同じ緩衝液で溶離した。流速は10
滴／分（36ml／hr）で、2.4mlづつのフラクシヨ
ンを取つた。放射能を有するフラクシヨンをいつ
しよにすると、全量が23mlとなり、31.5mgの抗−
hIgGを含有していた。この抗−hIgG溶液の22.5
ml（30.8mg）を透析袋に移して、低温室で３×１
の氷冷した50％飽和硫酸アンモニウムに対して
透析した。 ホースラデイツシユ・ペルオキシダーゼ
（Sigma，ロツト番号65C−9530）を6.5mg／ml
の濃度の溶液となるように飽和硫酸アンモニウム
に溶解し、そのうちの１mlを低温室で４分間遠心
分離した。上澄み液を捨て、ペレツトを５mlの氷
冷した0.3M NaHCO₃（PH8.5）に再溶解し、３×
400mlの0.3M NaHCO₃緩衝液（PH8.5）に対して
低温室で透析した。 透析した抗−hlgGを透析物で17mlに希釈して
1.81ｇ／mlの濃度にした。50％飽和硫酸アンモニ
ウム中のこの溶液の３ml（5.4mg）を２〜４℃に
おいて10，000rpmで５分間遠心分離し、上澄み
液を捨て、沈澱を0.5mlの10mM NaHCO₃−
Na₂CO₃緩衝液（PH9.5）に溶かし、３×350mlの
同じ緩衝液で透析した。ホースラデイシユ・ペル
オキシダーゼ（HRP）の残留液を透析物で1.1ml
に希釈した。その一部のUV分析によると6.31
mg／mlの濃度であつた。 上記HRP溶液0.8mlにNaHCO₃緩衝液0.2mlを加
えて全量を１mlにし、次に95％エタノール中の１
％２，４−ジニトロフルオルベンゼン100μを
撹拌しながら添加し、混合物を光線からさえぎり
ながら室温で１時間撹拌した。この混合物に次に
30.2mM過ヨウ素酸ナトリウム水溶液１mlを滴下
し、混合物を光線からさえぎつて0.5時間撹拌し
た後、0.34Mエチレングリコール水溶液１mlを添
加した。混合物をさらに0.75時間撹拌してから、
２×350mlの氷冷した10mM NaHCO₃−Na₂CO₃
緩衝液（PH9.5）で透析した。 反応フラスコに、まずNaHCO₃−Na₂CO₃緩衝
液中の4.5mg／ml抗−hlgG溶液１mlを入れ、次に
HRP−過ヨウ素酸ナトリウム反応生成物の溶液
を加えた。HRP／抗−hlgGのモル比は4.2であつ
た。0.5時間撹拌した後、NaBH₄5.05mgを加え、
混合物を氷浴温度で5.5時間撹拌してから、１×
350mlの0.1Mリン酸ナトリウム−0.1M硫酸ナト
リウム（PH7.1）で透析し、次に飽和硫酸アンモ
ニウム水溶液に対して透析した。残留液を２〜４
℃で４分間遠心分離した後、上澄み液を捨て、沈
澱を0.4mlのリン酸塩−硫酸塩緩衝液に再溶解し
た。この溶液を1.5×88cmのＧ−200カラム（同じ
緩衝液で膨潤させたゲル）でクロマトグラフ処理
し、同じ緩衝液で溶離した。流速は２滴／分で、
20滴づつフラクシヨンを取つた。403nmと280nm
のUVを吸収することを示したフラクシヨンをい
つしよにして、この溶離液を飽和硫酸アンモニウ
ムに対して透析し、残留液を２〜４℃で５分間
15，000rpmの遠心分離機にかけた。上澄み液を
捨て、沈澱を上記リン酸塩−硫酸塩緩衝溶液0.4
mlに溶解した。この溶液を、やはり同じ緩衝液で
膨潤させた1.5×88cmのＧ−200のカラムでクロマ
トグラフ処理し、同じ緩衝液で２滴／分の流速で
溶離して、20滴づつのフラクシヨンを集めた。
UV吸収で目的とする結合体の存在を示すフラク
シヨンを３個のフラクシヨンにまとめ、HRPに
ついて分析した。各フラクシヨンを該タンパク質
の安定化のために卵アルブミン中で１％にした。
フラクシヨンは、抗−hIgGが4.18×10^-7Ｍ，
HRPが5.25×10^-7Ｍ，比活性度が119IU／mgであ
り；フラクシヨンは抗−hIgGが1.08×10^-6Ｍ，
HRPが4.6×10^-7Ｍ，比活性度が309IU／mgであ
り；フラクシヨンは抗−hIgGが5.1×10^-7Ｍ，
HRPが7.56×10^-7Ｍ，比活性度が684IU／mgであ
つた。 本発明の有用性を実証するために、多くの分析
を行なつた。多くの例では、使用材料が分析感度
を最適にするのに適したものではなかつたことを
付記する。合成の都合、入手性および初期段階の
処理が分析の特性と結果を支配する結果となつ
た。 実施した第１の分析は、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素へのＴ−３結合体を使用する。
50mMトリス−HClプラス0.1％RSA（PH7.9）中の
実施例１の生成物の１：10希釈度の溶液5μに、
50mMトリス−HClおよび0.1％RSAの水溶液
（PH7.9）1.8ml、0.1M β−NAD（PH5.0）50μお
よび抗−T3血清25μを加えた。この溶液を30℃
で20分間培養し、RSAを含有しない分析緩衝液
中の0.066M Ｇ−６−P100μと25μの緩衝液
中の抗−Ｇ−６−PDH2μとをこの順序で加え
て、30℃で340nmにおいて分析した。変化を４分
間追跡した。25μの抗−T3の代りに25μの緩
衝液を用いて分析をくり返した。４分間後に、抗
−T3の不存在下での340nmの吸光度は0.012であ
るのに対し、抗−T3の存在下では0.020であつ
た。この結果は、本発明の方法にしたがつて抗リ
ガンド（この場合は抗−T3）を定量できること
を示している。また、酵素結合体はもとの酵素活
性度のわずか5.7％の活性しか有しておらず、ハ
プテン数は約16であつた。このように酵素１分子
当りの多数のハプテンの存在と、低い酵素活性度
は分析感度を実質的に低下させる効果を有する。 実施した次の分析は実施例２の生成物を使用し
たジゴキシンの分析に関する。分析の実施にあた
つて、5.57×10^-3ｇ（7.13×10^-6Ｍ）のジゴキシ
ンを10mlの乾燥DMFにとかし、このDMF溶液か
ら一連の異なる希釈度の溶液（標準溶液）を調製
した。分析の実施のために、まず実施例２のジゴ
キシン−Ｇ−６−PDH結合体25μを１mlの緩衝
液で希釈した。（緩衝液は、0.25ｇの卵アルブミ
ンを50mMトリス−HClと1mM NaN₃の水溶液
（PH7.8）250mlにとかして、PH7.8の0.1％の卵アル
ブミン溶液とすることによつて調製したものであ
る。）上記の酵素結合体溶液に、抗ジゴキシン
（1μの抗ジゴキシンを緩衝液で希釈したもの）
25μ、分析緩衝液１mlおよび上で調製したジゴ
キシン溶液2μからなるプレインキユベーシヨ
ンした混合物を加えた。30℃で10分間インキユベ
ーシヨンした後、30℃の80mMβ−NAD（PH5.1）
50μを加えた。この混合物を30℃で340nmにお
いて0.5分間分析した後、抗−Ｇ−６−PDH5μ
を加え、30℃で340nmにおける分析を５分間行な
つた。次の表に結果を示す。 【表】 上の結果は２回の測定値で平均であり、バツク
グラウンドを補正した後の値である。 この結果から、V²の測定値を利用すれば、ジ
ゴキシンの濃度を10^-8ないし10^-9Ｍというような
低濃度でも10⁴の範囲にわたつて測定できること
が実証される。 次の分析は、上のハプテンに比較して抗原の測
定における本発明の有用性を実証するものであ
る。この分析の実験操作は次の通りである。 まず、実施例３のHRP−hIgG結合体2μを
200μの緩衝液で希釈し、これにhIgG20μと抗
−hIgG2μとを加える。この混合物を30℃で0.5
時間インキユベーシヨンした後、抗−HRP4μ
を加えてさらに0.5時間インキユベーシヨンする。
この混合物に0.22mMのｏ−ジアニシジンを含有
する緩衝液1.8mlと22mM過酸化水素10mlとを加
え、30℃で460nmの吸光度変化を反応開始から１
分間にわたつて測定した。最終濃度はHRP−
hIgG結合体が1.3×10^-9Ｍ，抗−hIgGが3.7×10^-8
Ｍ，抗−HRPが4.6×10^-8Ｍであつた。使用した
緩衝液は0.01Mリン酸ナトリウム、0.05M硫酸ナ
トリウム、0.1％卵アルブミンおよび4.0％ポリエ
チレングリコール6000、PH7.0である。 各種hIgG濃度における結果を次の表にまとめ
る。 【表】 上の結果から、10^-10Ｍというような低濃度も
検出できるヒト・ガンマグロブリンの高感度分析
法が本発明により提供されることは明らかであ
る。また、いくつかの簡単な添加と、約0.5時間
程度の短時間のインキユベーシヨンの後で、測定
自体も短時間に行うことができる。使用する分光
光度計も単純なものでよく、測定は可視領域で行
える。 次の分析もhIgGであるが、Ｇ−６−PDH酵素
を使用した実施例４の結合体を用いて分析を行
う。結合体としては上記調製のフラクシヨン42を
利用する。分析は次のようにして行う。0.2mlの
フラクシヨン42を緩衝液中の3.68×10^-5Ｍ抗−
hIgG溶液0.2mlと混合する。緩衝液は10mMリン
酸ナトリウムと50mM硫酸ナトリウム、PH7.48で
あり；フラクシヨン42はhIgGの濃度が2.54×10^-2
mg／mlで、Ｇ−６−PDHの濃度が1.58×10^-2mg／
mlである。この混合物を30℃で30分間インキユベ
ーシヨンした。別に緩衝液1.6ml、Ｇ−６−P0.05
mlおよびNAD0.05mlから溶液を調製し、クベツ
ト（吸収セル）に入れて30℃で３分間インキユベ
ーシヨンした。緩衝液は0.1％RSAと1mM
NaN₃を含有する50mMトリス−HCl，PH7.8であ
る。上記のＧ−６−Ｐ溶液はRSAを含有しない
緩衝液中の140mMであり；NAD溶液はPH５の脱
イオン水中の80mMである。クベツトには次にプ
レインキユベーシヨンした結合体と抗−hIgGの
混合物0.05mlを加え、この溶液を反転させて混合
し、340nmで2.5分間測定した。読み取りを中断
し、抗−Ｇ−６−PDH 1μを添加して分析系に
過剰の抗−Ｇ−６−PDHを存在させ、溶液を反
転混合してから５分間340nmで測定を続けた。 抗−hIgG0.2mlをPBS（PH７）0.2mlに代えて上
記の操作をくり返す。 抗−hIgGが存在している場合、最初の１分か
ら２分までの間（すなわち、抗−Ｇ−６−PDH
は添加前で、まだ存在しない）で測定したミリ吸
光度／分の変化率は51.8であり、抗−Ｇ−６−
PDHを存在させた２回目の５分の測定中の４分
から５分までの間の変化率は22.2であつた。抗−
hIgGが存在しない場合には、結果はそれぞれ
52.4と2.3であつた。 上の結果から、極めて低濃度の抗−hIgGの存
在を測定できることは明らかである。また、この
結果からhIgGを測定することもできよう。すな
わち、分析媒質中にhIgGが存在すると、hIgG−
G6PDH結合体への結合に利用できる抗−hIgGの
量を低下させる結果を生ずるからである。 次に述べる最後の分析も抗原の例としてhIgG
を使用し、添加した抗体および抗体と抗原の組み
合せの効果を示すものである。この分析はまた、
酵素を不活性化させる酵素阻害剤として基質を使
用すると、全試薬の添加後短時間で安定な測定値
が得られるようになることも例示する。 分析操作は次のとおりである。実施例５で調製
したデキストラン10−ｏ−ジアニシジン（0.5ml）
を、上でHRPに対して用いたのと同じ緩衝液で
１：１に希釈し、HRP−hIgG結合体を最終濃度
が1.4×10^-8Ｍとなる量で添加する。次に、場合
に応じて、抗−hIgG（マイルス・ラボラトリー、
ロツド20、9.6mg／ml）とhIgG（最終濃度10^-6）の
水溶液20μを添加し、その後室温で20分間イン
キユベーシヨンする。この混合物に22mM過酸化
水素5μを添加し、30℃で460nmの吸光度変化を
１分間測定した。２回目の測定は10分で行なつた
が、吸光度の著しい変化は認められなかつた。結
果を次の表に示す。 【表】 抗−hIgGの添加は、一定時間内におけるｏ−
ジアニシジンの転化量を実質的に減少させる。抗
−hIgGとhIgGの両方の添加は、酵素結合体への
結合に利用できる抗−hIgGの量を低下させ、有
効な酵素が実質的に失活するまでにより大きな転
化率を与える。この後者の方法を利用すると、数
分経過後も測定値は比較的長時間かなり一定の値
を保つているので、吸収光の測定時間に神経を使
う必要がなくなる。 以上の結果から、ハプテンおよび抗原の両方を
包含するリガンドを極めて低濃度でも測定できる
高感度かつ正確な方法が提供されることは明らか
である。また、本発明の方法は、結合後および抗
リガンドを結合体に結合させた後のいずれにおい
ても、酵素をそのもとの活性の実質的部分をなお
保有するように軽くラベルできるという有利な特
徴を有している。さらに、天然の酵素の偶発的な
存在が阻止されるので、検体中の酵素活性度の測
定は必要なくなる。本発明の分析法の操作は単純
で、汎用の分光光度計を利用できる。また、測定
も、要するに大部分の当業者が一般に熟知してい
る酵素測定である。 以上に、理解をより明確にするために本発明を
例を挙げて詳細に説明したが、これらは例示にす
ぎず、本発明はその範囲内で変更・修正が可能で
あることは当然である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 相反的要員であるリガンドとリガンド受容体
   とからなる免疫学的一対の一員である被分析物質
   の検体中における存在を測定する方法であつて： (i) 水性媒質中において下記(A)〜(D)をあわせ、 (A) 該検体； (B) 該免疫学的一対の要員のいずれか一方に酵
   素を結合させている酵素結合体、ただし該酵
   素は該酵素結合体を該免疫学的一対の残りの
   要員と結合して複合体を形成したときにもそ
   の活性の実質的部分をなお保有するものであ
   る； (C) 酵素阻害剤、ただしこの阻害剤は該酵素が
   該複合体中に存在するときには酵素への阻害
   作用が阻止されるものである； および (D) 該酵素結合体と該被分析物質とが該免疫学
   的一対の同一要員である場合には、該免疫学
   的一対の残りの要員； ただし、該リガンドがモノエピトピツクで
   あり、該酵素が抗リガンドに結合される場合
   には、ポリ（リガンド類似物）を該被分析媒
   質中に存在させ； (ii) 該媒質における酵素活性を既知量の被分析物
   質を含有する媒質における酵素活性と比較して
   測定する、 ことからなる上記測定法。 ２ 該水性媒質のPHが５〜10の範囲であり、温度
   が10〜50℃の範囲であつて、該酵素阻害剤の添加
   を試薬(A)，(B)および(D)の混合後に行う特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３ 該酵素阻害剤が抗酵素である特許請求の範囲
   第１項または第２項記載の方法。 ４ 該酵素阻害剤が不可逆的阻害剤である特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ５ 該酵素阻害剤が可逆的阻害剤である特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 ６ (i)，(B)は受容体に結合したときもその酵素活
   性の実質的部分をなお保持している酵素結合リガ
   ンドであり； (C)は酵素阻害剤、ただし、この阻害剤は受容体
   が酵素結合リガンドに結合したときには酵素結合
   リガンドへの阻害作用が阻止されるものであり；
   そして (D)は該リガンドおよび該酵素結合リガンドに特
   異的に結合することのできるリガンド受容体（た
   だし、リガンドが被分析物質である場合のみ）で
   ある ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ７ 該酵素阻害剤が可逆的阻害剤である特許請求
   の範囲第６項記載の方法。 ８ 該可逆的阻害剤が抗酵素である特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 ９ 該酵素阻害剤が不可逆的阻害剤である特許請
   求の範囲第６項記載の方法。 １０ 該不可逆的阻害剤が該酵素結合リガンドの
   酵素の基質である特許請求の範囲第９項記載の方
   法。 １１ 被分析物質がリガンドであり； (i)，(B)は、リガンド受容体に結合してもその酵
   素活性の実質的部分をなお保持している酵素結合
   リガンドであり； (C)は、該酵素と反応してこれを阻害し、またリ
   ガンド受容体が該酵素結合リガンドに結合したと
   きには該酵素との反応が阻害される酵素基質であ
   る不可逆的酵素阻害剤であり；そして (D)は、該リガンドおよび該酵素結合リガンドに
   特異的に結合することができるリガンド受容体で
   ある ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １２ 相反的要員であるリガンドとリガンド受容
   体とからなる免疫学的一対の一員である被分析物
   質の検体中における存在の測定用キツトであつ
   て、 (A) 該免疫学的一対の要員のいずれか一方に酵素
   を結合させている、酵素結合体、ただし該酵素
   は該酵素結合体を該免疫学的一対の残りの要員
   と結合して複合体を形成したときにもその活性
   の実質的部分をなお保有するものである； (B) 該免疫学的一対の相反的要員（被分析物質と
   該酵素結合体が共に該免疫学的一対の同一要員
   であるときのみ）；および (C) 酵素阻害剤 が、該測定を少なくとも実質的に最適化する相
   対割合で備つている、前記キツト。