JPS63160585A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体反応の触媒等として用いられる固定化酵
素の製造方法に関するものである。

〔従来の技術〕

近年、生体反応は化学工業、医薬品工業、食品工業等、
各種分野での利用が進みつつある。特に酵素を用いた生
体反応は常温、常圧という緩やかな条件下で迅速に進行
し、しかも従来の化学反応に比べて高い安全性を有し、
公害の発生する心配もない。したがって資源、エネルギ
ー、生産設備等の面で大変有利である。さらに酵素は基
質ゼｉ異性が優れているため、目的とする生成物を高収
率で得ることができ１反応生成物の処理等をＷＡ端に軽
減させるという長所も併せ持っている。

ところで酵素は水溶性であり、これを水に溶解して酵素
反応を行い１反応終了後に酵素のみを分離回収して再利
用することは困難であるため、酵素を固定化することが
提案されている。酵素を固定化することにより、酵素反
応を連続法で行うことが可能になるとともに、酵素の回
収も容易になり、また酵素の基質選択性を利用して、溶
液中の特定物質を検出するための酵素センサをつくるこ
とも可能になる。

従来の固定化酵素の製造方法としては、酵素を溶解した
多糖類、タンパク質等の水溶性高分子ゾルを担体に含浸
させた後、カルシウム塩等のゲル化剤でゲル化して担体
上に酵素を固定化する方法（例えば特開昭５９−１０９
１７３号）、あるいは必要によリアミノ化した担体表面
に酵素およびゲルタールアルデヒド混合溶液を供給して
酵素をゲル化させ。

さらに表面に高分子薄膜を形成する方法（例えば特開昭
６１−５７８２号）などが提案されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、このような従来の固定化酵素の製造方法
においては、ゲル化剤などの比較的機しい固定化反応試
薬を用い、また反応時間が長いため、固定化時に酵素の
変性、失活等が起り呂＜。

このため酵素の固定化率、酵素活性および得られる固定
化酵素の活性保持率が低いものとなるという問題点があ
った。

本発明は以上のような問題点を解決するためのものであ
り、酵素の固定化率、酵素活性および活性保持率が高く
、しかも酵素の脱落するおそれの少ない固定化酵素の製
造方法を提供することを目的としている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、酵素を含む水溶性高分子物質水溶液を担体に
含浸させ、水分を除去したのち、担体表面に高分子薄膜
を形成することを特徴とする固定化酵素の製造方法であ
る。

本発明において担体としては、微細孔を有する物質など
、比表面積の大きい物質が使用でき１例えば活性炭、セ
ライト、多孔性ガラス、天然繊維等があげられる。これ
らの種類は特に限定されず。

１種以上のものが使用可能である。水溶性高分子物質と
しては水に溶解して粘性を付与できるものであればよく
、例えばアルギン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）、に
−カラギーナン、デンプン等の多糖類、コラーゲン等の
タンパク質、その他が用いられ、これらも１種以上のも
のが使用可能である。

酵素としては、生体反応その他に用いられる酵素があり
、例えばインベルターゼ、トリプシン。

アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアー
ゼ、リパーゼ等の加水分解酵素；アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダー
ゼ等の酸化還元酵素；メチルトランスフェラーゼ、グリ
コジルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ等の転
移酵素；アミノ酸デカルボキシラーゼ、グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ等の脱離酵素（リアーゼ）；異性化酵
素（インメラーゼ）；合成酵素（リガーゼ）等があり。

これらも１ｇ１以上のものが用いられる。

担体表面に形成する高分子薄膜としては、酵素を含む水
溶性高分子物質水溶液を含浸させた担体表面に薄膜を形
成できるものであればよく１例えばポリ酢酸ビニル、酢
酸セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル
等の数平均分子量１００　、０００以下で、有機溶剤に
可溶性の樹脂があり、これらも１種以上のものが使用可
能である。また有機溶剤としては上記樹脂を溶解できる
ものであればよく１例えば芳香族類、ケトン類、アルコ
ール類等が好ましく、これらも１種以上のものが使用で
きる。

固定化酵素の製造方法は、まず水溶性高分子物質および
酵素を水に溶解して、酵素を含む水溶性高分子物質水溶
液を調製する。このとき水溶性高分子物質の添加量は０
．１〜５重景％程度、酵素の添加量は１〜１０ａ＋ｇ／
Ｑ程度が好ましい。一方、予め洗浄、乾燥させた担体に
上記酵素を含む水溶性高分子物質水溶液を含浸させ、水
分を除去する。水分の除去方法としては凍結乾燥、真空
乾燥、通風乾燥、自然乾燥等の通常の乾燥方法を採用で
きる。

そして被膜形成樹脂を有機溶剤に溶解した溶液に。

上記水分を除去した担体を接触させ、その後溶剤を揮発
させて、担体表面に薄膜を形成し、酵素を担体上に固定
化する。

このようにして得られる固定化酵素は１反応性の激しい
試薬を用いないので、固定化時の酵素の変性、失活が少
なくなる。

〔発明の効果〕

以上の通り本発明によれば、酵素を含む水溶性高分子物
質水溶液を担体に含浸させ、水分を除去した後、担体表
面に直接高分子薄膜を形成するようにしたため、従来法
および水分を除去しない場合よりも酵素の固定化率、酵
素活性および活性保持率が高く、安定性の高い固定化酵
素を容易に得ることができる。

〔実施例〕

次に実施例および比較例について説明する。実施例中％
は特に言及しない限り重量％である。

実施例１ 顆粒状の活性炭を７０％ＨＮＯ，に浸して１時間５０℃
に保った後、活性炭を充分洗浄した。一方、５．０１１
１ｇ／ｓｏΩの濃度でアミラーゼを含む１％に一カラギ
ーナン水溶液１０ｍ１ｌｌを調製した。この溶液中に前
記処理を行った活性炭５ｇ（乾燥重量）を分散させ。

活性炭中に酵素含有に一カラギーナン水溶液を含浸させ
た後、凍結乾燥により水分の除去を行った。

次に活性炭を１％ポリスチレンのベンゼン溶液に５秒間
浸漬して直ちに引き上げ、ベンゼンを揮発させて固定化
酵素を得た。

比較例１ 実施例１と同様にして硝酸処理した活性炭に酵素を吸着
させたあと、グルタルアルデヒド処理を行って固定化酵
素を得た。

実施例１および比較例１で得られた固定化酵素の酵素固
定化率、酵素活性および活性保持率を第１表に示す。

表中、酵素固定化率は固定化前および固定化後の水溶液
の酵素濃度をＬｏｔ＋＋ｒｙ法により測定し、下記式に
より算出した値である。

酵素活性はオリーブ油を基質とした加水分解反応（山田
ら、農芸化学会誌、並、８６０　（１９６２）　）を行
い、生成する遊離脂肪酸を１／ｌ０Ｎ−ＫＯＨで滴定す
ることによりＷ出した値である。また活性保持率は固定
化された酵素活性の固定化前の酵素活性に対する割合（
％）である。

第１表 第１表より、実施例１は比較例１に比べ、酵素固定化率
、酵素活性および活性保持率が高くなっていることがわ
かる。

実施例２ 多孔性ガラス（２０〜５０ｍｅｓｈ、平均孔径５００人
）を減圧・に燥させ、リパーゼを５．０ｍｇ／ｍＱの濃
度で含む１％に一カラギーナン水溶液にこの乾燥多孔性
ガラスを分散させ、１時間攪拌して多孔性ガラスに酵素
含有に一カラギーナン水溶液を含浸させた。

多孔性ガラスを洗浄後、４０℃で真空乾燥を行い、水分
を除去した。そして０．５％ポリ酢酸ビニルのメタノー
ル溶液に浸し、直ちに引き上げてメタノールを揮発させ
固定化酵素を得た。

比較例２ 実施例２で用いたのと同じ多孔性ガラスとγ−アミノプ
ロピルエトキシランとを反応させた後。

多孔性ガラスとリパーゼとをグルタルアルデヒドを用い
て結合させ固定化酵素を得た。

実施例２および比較例２で得られた固定化酵素の酵素固
定化率、酵素活性および活性保持率を第２表に示す。

第２表 第２表より、実施例２で得ら、れた固定化酵素は比較例
２で得られたものに比べ、酵素固定化率。

酵素活性および活性保持率が高くなっていることがわか
る。

実施例３ ５ｍＨ／ｍ１２の濃度でリパーゼを含む１％アルギン酸
ナトリウム水溶液Ｉｏｎρを調製した。この溶液に担体
としてのガーゼを浸漬した後取り出し、自然乾燥により
水分を除去した。そしてガーゼを１％酢酸セルロースの
アセ１−ン溶液に浸漬し、アセトンを揮発させて固定化
酵素を得た。

比較例３ リパーゼをポリアクリルアミドゲルで包括固定して固定
化酵素を得た。

実施例３および比較例３で得られた固定化酵素の酵素固
定化率、酵素活性および活性保持率を第３表に示す。

第３表 第３表より、実施例３で得られた固定化酵素は比較例３
で得られたものよりも酵素固定化率、酵素活性および活
性保持率が高いことがわかる。

次に上記固定化酵素を触媒として酵素反応を行い、使用
時間経過に伴う酵素活性の減少度を測定した結果を第１
１表に示す。

第４表 第４表より、実施例３で得られた固定化酵素は比較例３
で得られたものに比べ、使用安定性が優れていることが
わかる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素を含む水溶性高分子物質水溶液を担体に含浸
   させ、水分を除去したのち、担体表面に高分子薄膜を形
   成することを特徴とする固定化酵素の製造方法。
2. （２）担体が活性炭、セライト、多孔性ガラスおよび天
   然繊維から選ばれる１種以上のものである特許請求の範
   囲第１項記載の固定化酵素の製造方法。
3. （３）水溶性高分子物質が多糖類およびタンパク質から
   選ばれる１種以上のものである特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の固定化酵素の製造方法。
4. （４）高分子薄膜が数平均分子量１００，０００以下で
   、有機溶剤に可溶性の樹脂から選ばれる１種以上のもの
   である特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに
   記載の固定化酵素の製造方法。
5. （５）酵素が酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、
   異性化酵素、脱離酵素および合成酵素から選ばれる１種
   以上のものである特許請求の範囲第１項ないし第４項の
   いずれかに記載の固定化酵素の製造方法。