JPH0517835B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化酵素の製造方法に関し、さら
に詳しくは酵素活性を有する粒状、繊維状あるい
はフイルム状などのキチン成形体を提供する固定
化酵素の製造方法に関するものである。

近年、酵素利用工業において水溶性の酵素を水
不溶性の高分子担体などに固定化することによ
り、酵素反応工程を連続化し、酵素を繰り返して
使用する研究が進展し、すでに実用化されている
ものもある。この不溶性酵素の製造法として、酵
素を水不溶性の担体に結合される担体結合法、酵
素を官能性試薬と反応させて不溶化する架橋法及
び酵素をゲルの格子内に包み込むかポリマーの皮
膜で被覆する包括法などが知られている。

工業的規模で酵素を固定化する場合には固定化
操作が簡便であり、固定化された酵素が長時間安
定に保たれる必要があり、用いる担体は多孔性で
堅牢で安価である必要がある。

キチンは豊富に存在する未利用天然資源であ
り、酵素の固定化用担体としての利用が提案され
ている。例えば、特公昭56−35号公報にはキチン
にジエチルアミノエチル基を導入し、そのイオン
交換基を介した酵素の固定化方法が、特公昭53−
10150号公報にはキチンから得られれるキトサン
に酵素を吸着又はペプチド結合により固定化する
方法が、また特開昭52−3892号公報には脱アセチ
ル化キチンへの架橋法並びにジアゾ法による酵素
の固定化方法が提案されている。しかしながら、
これらの方法により得られる固定化酵素の形態
は、粉末状もしくは薄片状であるため、固定化酵
素をカラムに充填し酵素反応工程を連続化する
際、流体抵抗が大きいため十分な流速が得られ
ず、またカラムが目詰まりするなどの実用上大き
な欠点を有していた。すなわち、キチンを担体と
した固定化酵素を実用化するにあたつて、キチン
の形態に大きな問題があつたわけであり、したが
つて操業条件を規制しない形態の固定化酵素の開
発が望まれていた。

本発明者らか、上記のごとき欠点の改良された
固定化酵素を提供すべく鋭意努力を重ねた結果、
キチンを固定化酵素として好ましい形態にあらか
じめ成形した後、この成形体に酵素を固定すると
いう方法の開発に成功し、本発明に到達した。

すなわち本発明は、あらかじめ成形されたキチ
ンをアルカリ処理して膨潤キチン成形体を得、得
られた膨潤キチン成形体を酵素溶液に浸漬したの
ちグルタルアルデヒド処理を行うことを特徴とす
る固定化酵素の製造方法である。

本発明にいうキチンとは、ポリ（Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン）そのもの及びその誘導体の
ことをいう。かかるキチンは、例えば甲穀類、昆
虫類の外骨格などを塩酸処理並びにカ性ソーダ処
理してタン白質及びカルシウム分を分離精製する
ことによりあるいはそれらを例えばエーテル化、
エステル化などすることにより調製することがで
きる。本発明に好ましく用いられるキチン誘導体
としては、例えばカルボキシメチル化キチン、ヒ
ドロキシエチル化キチンなどのエーテル化キチ
ン、アセチル化キチン、スルホン化キチンなどの
エステル化キチンがあげられる。エステル化物と
しては、例えばギ酸、酢酸、酪酸、吉草酸、イソ
酪酸、イソ吉草酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチ
ル酸、アントラニル酸、フタル酸などのカルボン
酸類、硫酸、トルエンスルホン酸、スルホフアニ
ル酸などのスルホン酸類、炭酸類あるいはそれら
の無水物のエステル化物があげられる。

本発明における成形とは、キチン又はその誘導
体を適当な溶媒、例えばトリクロル酢酸を含む塩
化メチレン、塩化リチウムを含むＮ−メチルピロ
リドン、塩化リチウムを含むジメチルアセトアミ
ド、トリフルオロアセトン又はヘキサフルオロイ
ソプロピルアルコールなどに溶解したのち、成形
し凝固させることをいう。キチン溶液を凝固させ
るには、キチン溶液と凝固液とを接触させればよ
く、凝固液としてはキチン又はその誘導体が溶解
しない液体であればよく、例えばメタノール、エ
タノール、イソプロピルアルコール、イソブタノ
ール、アセトン、水などが使用できる。成形体の
形態は、固定化酵素としての用途に適したもので
あればよく、例えば粒状、繊維状、フイルム状、
チユーブ状、スポンジ状などがあげられる。

本発明におけるアルカリ処理とは、あらかじめ
成形されたキチンとアルカリ溶液とが接触するよ
うないかなる方法をも含む。アルカリ溶液として
は水酸化ナトリウム水溶液が実用的であり、その
濃度は好ましくは0.1w／ｖ％以上、さらに好ま
しく10w／ｖ％以上、最適には30〜60w／ｖ％の
範囲であり、好ましい処理温度は10℃以上、さら
に好ましくは40℃以上、最適には60〜120℃の範
囲であればよい。処理時間はアルカリ濃度と処理
温度とにより異なるが、好ましくは１分〜24時
間、さらに好ましくは15分〜12時間、最適には１
〜６時間程度であればよい。また、浴比はキチン
成形体１重量部に対してアルカリ溶液を好ましし
くは25重量部以上、さらに好ましくは50重量部以
上、最適には100重量部以上であればよい。アル
カリ溶液は必要に応じて撹拌してもよく、処理
後、アルカリを除去する場合には中和、水洗など
の操作を行えばよい。

アルカリ処理を施し、水洗したキチン成形体は
水によつて膨潤しており、このようにして得られ
た膨潤キチン成形体をそのまま酵素溶液中に浸漬
してもよいが、その前に緩衝液に浸漬して十分に
平衡化しておくことが望ましく、用いる緩衝液の
種類、濃度、PHなどは酵素溶液と同一のものが好
ましい。

本発明に用いられる酵素溶液とは、酵素活性を
もつ液体であり、酵素の種類、純度、濃度及び起
原などはいかなるものでもよく、複数の酵素を含
有している液体であつてもよい。

本発明において、例えば次にあげるような種類
の酵素が使用できる。

酸化還元酵素：アスコルビン酸オキシダーゼ、
アラニンデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシター
ゼ、ウリカーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシ
ダーゼ、クルコースオキシダーゼ、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロームＣオ
キシダーゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、ペルオキシダーゼ、６−ホスホグルコン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、
NADHオキシダーゼなど。

転移酵素：アスパラギン酸アセチルトランスフ
エラーゼ、アミノ酸トランスフエラーゼ、酢酸キ
ナーゼ、アデニレートキナーゼ、クレアチンホス
ホキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、
ホスホアセチルキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、
フルクトキナーゼなど。

加水分解酵素：アミラーゼ、アスパラギナー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノアシラ
ーゼ、アルギナーゼ、インベルターゼ、ウレアー
ゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、
カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、ト
ロンビン、ナリンジナーゼ、ヌクレオチターゼ、
パパイン、ヒアウロニダーゼ、プラスミン、ペク
チナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシン、ペニシ
リナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパー
ゼ、ホスフアクターゼ、ラクターゼ、リパーゼ、
リボヌクレアーゼ、レンニン、ケラチナーゼ、デ
ハロゲナーゼなど。

リアーゼ：アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、スレオニンアルドラ
ーゼ、ヒスチジンアンモニナリアーゼ、フエニル
アラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマ
ール酸ヒドラーゼ、リンゴ酸シンテターゼ、メチ
オニナーゼなど。

異性化酵素：アラニンラセマーゼ、グルコース
イソメラーゼ、グルコースホスフエイトイソメラ
ーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマー
ゼ、スーパーオキシドデイスムターゼなど。

リガーゼ：アミノ酸活性化酵素、アスパラギン
シンテターゼ、グルタチオンシンテターゼ、グル
タミンシンテターゼ、ピルビン酸シンテターゼな
ど。

上記の酵素を溶解する溶剤としては、緩衝液が
適しており、その種類、濃度、PHは使用する酵素
の安定性とキチン成形体への酵素の固定化率とか
ら決定されるため一律には規定し得ないが、概ね
好ましい濃度は１ｍＭ〜0.5Mであり、さらに好
ましくは５ｍＭ〜0.2Mであり、最適には10ｍＭ
〜0.1Mの範囲である。好ましいPH或は、PH２〜
11であり、さらに好ましくはPH４〜９の範囲であ
る。

本発明の方法を実施するにあたつて、膨潤キチ
ン成形体を酵素溶液に浸漬するが、その条件は特
に限定されない。しかしながら、酵素の安定性及
び固定化収率向上の観点から、好ましい温度は０
〜30℃、さらに好ましくは０〜20℃、最適には０
〜10℃であり、浸漬時間は好ましくは10分以上、
さらに好ましくは１時間以上、最適には２〜12時
間であればよい。

以上のようにして膨潤キチン成形体を酵素溶液
に浸漬した後、グルタルアルデヒド処理を行う
が、実施に際しては、膨潤キチン成形体が浸漬さ
れている酵素溶液にグルタルアルデヒドを添加し
てもよく、又は酵素溶液から取り出した膨潤キチ
ン成形体をグルタルアルデヒドを含む緩衝液に浸
漬してもよい。いずれの場合においても、グルタ
ルアルデヒドの濃度は、好ましくは0.01〜20w／
ｖ％、さらに好ましくは0.02〜10w／ｖ％、最適
には0.05〜5w／ｖ％であればよい。また、グル
タルアルデヒド処理する際の温度と時間とは、一
概には規定し得ないが、例えば４℃で処理する場
合には約10時間、20℃の場合では２〜５時間であ
ればよい。

グルタルアルデヒド処理により得られた固定化
酵素は、水又は緩衝液を用いて十分に洗浄し、過
剰のグルタルアルデヒドや遊離の酵素などを除去
することが望ましい。

以上述べた本発明の方法により得られる固定化
酵素の特長は、形態が粒状あるいは繊維状に成形
されているため、実際に使用する場合の操作性が
非常に良好なことであり、また本発明の方法によ
れば特に粒状キチンは多孔性であるため、担体重
量当りの酵素活性の高い固定化酵素が容易に得ら
れる。その他、キチンは生体適合性に優れている
ため、本発明の方法により得られる固定化酵素
は、化粧品や医薬品などの人体に直接触れるよう
な用途にも適用できる。

以下に実施例をあげ、本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例 １ キチン粉末５ｇを8w／ｖ％LiClを含むジメチ
ルアセトアミド995ｇに溶解しキチン溶液を得た。
この溶液を直径0.2mmのノズルからメタノールに
滴下し粒状に凝固せしめた後、水で洗浄して直径
約0.8mmのキチンビーズ350mlを得た。400ｇの水
酸化ナトリウムにこのキチンビーズと水を加えて
1000mlとし、85℃に30分間保つた後、冷却し、水
洗を繰り返した。得られた膨潤キチンビーズ10ml
を25ｍＭリン酸緩衝液（PH7.2）に浸漬して平衡
化した後、同緩衝液１mlあたり130ユニツトのグ
ルコキナーゼを含む酵素液15mlに浸漬した。４℃
にて５時間ゆるやかに撹拌した後、25％グルタル
アルデヒド溶液の0.1mlを添加し、４℃で８時間
ゆるやかに撹拌し、次いで50ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（PH8.5）にて洗浄した。

このようにして得たグルコキナーゼ固定化キチ
ンビーズの活性を、グルコースをATPとから生
成したグルコース−６−リン酸量をグルコース−
６−リン酸脱水素酵素を用いて測定した結果、ビ
ーズ１mlあたり70ユニツトであり、固定化率は約
36％であつた。

実施例 ２ キチン粉末30ｇを8w／Ｗ％のLiClを含むジメ
チルアセトアミド970ｇに溶解しキチン溶液を得
た。この溶液を加圧下でギヤーポンプにて輸送
し、直径0.07mm、150ホールのノズルより水中に
押し出して繊維化し、水中で巻き取つた。得られ
た繊維を80℃に加温した40w／Ｖ％NaOH水溶液
中に２時間浸漬した後、よく水洗し、20ｍＭリン
酸緩衝液（PH5.5）に浸漬した。このようにして
得られた繊維状膨潤キチン５ｇを、260ユニツト
のプロテアーゼを含む同緩衝液20mlに浸漬し、４
℃に６時間放置した後、0.2％のグルタルアルデ
ヒドを含む同緩衝液50mlに室温で２時間浸漬し
た。0.5M NaCl水溶液でよく洗浄したのちに測
定したプロテアーゼ活性は、キチン繊維50mgあた
り1.8ユニツトであり固定化率は69％であつた。

参考例 １ キチン粉末と膨潤キチン成形体のそれぞれに固
定化される酵素量を比較するため以下の実験を行
つた。

キチン粉末（100メツシユ）200mgと、乾燥重量
が200mgに担当する水膨潤キチンビーズ（15ml）
を、80℃の40w／ｖ％NaOH水溶液に30分間浸漬
した後、よく水洗して、200ｍＭリン酸緩衝液
（PH６）にて平衡化した。250ユニツトのグルコー
スオキシダーゼを含む30mlの同緩衝液に、それぞ
れのキチンを浸漬して４℃で３時間経過後、0.2
mlの25％グルタルアルデヒド溶液を添加し冷蔵庫
に一夜放置した。50ｍＭリン酸緩衝液（PH5.6）
にて洗浄後、それぞれのキチンに固定化された酵
素活性を30℃における酸素吸収速度から求めたと
ころ、キチン粉末では95ユニツト、キチンビーズ
では170ユニツトであつた。

以上の結果より膨潤キチン成形体の方が、キチ
ン粉末よりも、酵素固定化用担体としてはるかに
優れていることがわかる。

参考例 ２ 固定化酵素をカラムに詰め、連続反応を行う場
合の成形化キチン固定化酵素の操作性を検討し
た。

実施例１で得たグルコキナーゼを固定化したビ
ーズを、径10mm、長さ５cmのカラムに詰め、50ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（PH8.5）を通液した。通
液速度を徐々に上げ、SV＝30で６時間経過後も
ビーズ層の圧縮は起こらなかつた。

以上の結果より、ビーズ状キチン固定化酵素
は、巾広い操作条件で使えることがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ あらかじめ成形されたキチンをアルカリ処理
   して膨潤キチン成形体を得、得られた膨潤キチン
   成形体を酵素溶液に浸漬したのちグルタルアルデ
   ヒド処理を行うことを特徴とする固定化酵素の製
   造方法。