JPS63160600A - ピルビン酸定量用試薬 - Google Patents
ピルビン酸定量用試薬Info
- Publication number
- JPS63160600A JPS63160600A JP30657386A JP30657386A JPS63160600A JP S63160600 A JPS63160600 A JP S63160600A JP 30657386 A JP30657386 A JP 30657386A JP 30657386 A JP30657386 A JP 30657386A JP S63160600 A JPS63160600 A JP S63160600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amount
- pyruvic acid
- present
- reagent
- pyruvate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は、ピルビン酸測定用試薬に関する。更に詳しく
は、本発明は、乳酸脱水素酵素、乳酸酸化酵素及びニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型からなるピル
ビン酸定量用試薬に関する。
は、本発明は、乳酸脱水素酵素、乳酸酸化酵素及びニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型からなるピル
ビン酸定量用試薬に関する。
動物は、炎症を起すと血中のシアル酸濃度が増加するこ
とが知られている。シアル酸をノイラミニダーゼとＮＡ
ＮＡ−アルＰラーゼで分解するとピルビン酸が生成する
ので、ピルビン酸量を定量することができれば血中のシ
アル酸量を知ることができるので、炎症の度合いを診断
することができる。
とが知られている。シアル酸をノイラミニダーゼとＮＡ
ＮＡ−アルＰラーゼで分解するとピルビン酸が生成する
ので、ピルビン酸量を定量することができれば血中のシ
アル酸量を知ることができるので、炎症の度合いを診断
することができる。
従来、ピルビン酸を定量する手段としては、（イ）ピル
ビン酸オキシダーゼを用いる方法及び（ロ）乳酸脱水素
酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（
ＮＡＤＨ）を用いる方法が知られている。
ビン酸オキシダーゼを用いる方法及び（ロ）乳酸脱水素
酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（
ＮＡＤＨ）を用いる方法が知られている。
しかしながら、（イ）及び（ロ）の方法は、共に極微量
のピルビン酸を定量することは困難である。即ち。
のピルビン酸を定量することは困難である。即ち。
（イ）の方法によυ極微量のピルビン酸をピルビン酸オ
キシダーゼによシ分解したとき生成する過酸化水素の微
量測定は極めて困難であり、実用的方法は知られていな
い。又、（ロ）の方法はＮＡ［）Ｈの減少を紫外分光計
によって測定するものであるが、ＮＡＤＨの分子吸光係
数（６，３Ｘ １０’ｃｒｎ５／ｍｏｌ ）に依存する
ため、高感度化は望めない。
キシダーゼによシ分解したとき生成する過酸化水素の微
量測定は極めて困難であり、実用的方法は知られていな
い。又、（ロ）の方法はＮＡ［）Ｈの減少を紫外分光計
によって測定するものであるが、ＮＡＤＨの分子吸光係
数（６，３Ｘ １０’ｃｒｎ５／ｍｏｌ ）に依存する
ため、高感度化は望めない。
本発明者等は、ピルビン酸の定量、殊に、血中に存在す
るシアル酸を分解して得られるピルビン酸の如く極微量
のピルビン酸の定量を容易々らしめるため鋭意検討した
結果、本発明を完成した。
るシアル酸を分解して得られるピルビン酸の如く極微量
のピルビン酸の定量を容易々らしめるため鋭意検討した
結果、本発明を完成した。
本発明の試薬をピルビン酸の存在する系中に加えると以
下の反応が進行する。
下の反応が進行する。
つ１シ、ＮＡＤＨを大量に存在させ、酸素を供給しつつ
反応させれば、当初系中に存在したピルビン酸量が極微
量であっても、過酸化水素量は時間の経過とともに増加
する。一定量の酵素（一定力価の酵素）の存在下、一定
時間における一定ピルピン酸からの過酸化水素生成量を
検量し、標準曲線を作成しておくことＫより未知試料中
のピルビン酸量は生成した過酸化水素量を測定すること
により容易に定量することができる。
反応させれば、当初系中に存在したピルビン酸量が極微
量であっても、過酸化水素量は時間の経過とともに増加
する。一定量の酵素（一定力価の酵素）の存在下、一定
時間における一定ピルピン酸からの過酸化水素生成量を
検量し、標準曲線を作成しておくことＫより未知試料中
のピルビン酸量は生成した過酸化水素量を測定すること
により容易に定量することができる。
よって極めて微量のピルビン酸であっても、上記反応系
を使用しである時間反応させ、測定可能な量の過酸化水
素が生成した時点で過酸化水素量を測定することにより
、ピルビン酸を定量することができる。
を使用しである時間反応させ、測定可能な量の過酸化水
素が生成した時点で過酸化水素量を測定することにより
、ピルビン酸を定量することができる。
本発明の特徴は、上述したように極微量のピルビン酸の
定量ができる様になったこと、極めて容易に前記反応系
か組めるので定量にあたっての操作に煩雑さが伴なわな
いなどである。
定量ができる様になったこと、極めて容易に前記反応系
か組めるので定量にあたっての操作に煩雑さが伴なわな
いなどである。
尚、本発明における「極微量」とはおおよそＩＱ−６％
に／ １３〜１０−９モル／ｌ程度の量を指している。
に／ １３〜１０−９モル／ｌ程度の量を指している。
本発明は、乳酸脱水素酵素、乳酸酸化酵素及びＮＡＤＨ
力島らなるピルビン酸定量用試薬である。
力島らなるピルビン酸定量用試薬である。
本発明はピルビン酸の存在する系中に添加すると前記反
応式に示した如く、サイクリック反応系が形成される。
応式に示した如く、サイクリック反応系が形成される。
乳酸脱水素酵素はビッツビン酸とＮＡＤＨとの反応の触
媒として存在させることＫよ、９ ＮＡＤと乳酸を与え
るために使用され、乳酸酸化酵素は乳酸と酸素との反応
の触媒として存在させることによジビルビン酸と過酸化
水素を与えるために使用される。
媒として存在させることＫよ、９ ＮＡＤと乳酸を与え
るために使用され、乳酸酸化酵素は乳酸と酸素との反応
の触媒として存在させることによジビルビン酸と過酸化
水素を与えるために使用される。
ピルビン酸はサイクリック反応系を循環して繰返し反応
に供せられ、それに伴って過酸化水素が逐次蓄積される
ので過酸化水素量と、時間との関係カラヒルビン酸量を
知ることができる。
に供せられ、それに伴って過酸化水素が逐次蓄積される
ので過酸化水素量と、時間との関係カラヒルビン酸量を
知ることができる。
本発明を構成する乳酸脱水素酵素及び乳酸酸化酵素の量
は適宜決めることができるが、通常は所謂触媒量でよい
。又ＮＡＤＨは、前記両酵素に対して過剰量存在させる
ことが好ましい。
は適宜決めることができるが、通常は所謂触媒量でよい
。又ＮＡＤＨは、前記両酵素に対して過剰量存在させる
ことが好ましい。
本発明試薬によるピルビン酸の定量は、上ｅ反応式中に
示された如く生成する過酸化水素量を測定することによ
り行われる。
示された如く生成する過酸化水素量を測定することによ
り行われる。
例えば、血中ピルビン酸を比色法で定量する場合、被検
血液量は通常０．０１ｍＡ！（らいが使用される。この
血中のピルビン酸量はおおよそ０．３〜０．９Ｉｎ９と
予想されるので、使用する乳酸脱水素酵素及び乳酸酸化
酵素は１００〜１０．０００Ｕ／ｌ、又、ＮＡＤＨは０
．１〜０．５ ｍＭ程度を用いればよい。
血液量は通常０．０１ｍＡ！（らいが使用される。この
血中のピルビン酸量はおおよそ０．３〜０．９Ｉｎ９と
予想されるので、使用する乳酸脱水素酵素及び乳酸酸化
酵素は１００〜１０．０００Ｕ／ｌ、又、ＮＡＤＨは０
．１〜０．５ ｍＭ程度を用いればよい。
生成・蓄積した過酸化水素の測定法は常法を適宜選択す
ることができ、例えば、Ｈ２Ｏ２電唖法と、０□の消費
を成極で測定することも可能だが、より好ましくは、比
色定量法、例えば被ルオキシダーゼ及び発色剤を組合わ
せて使用するととにより、簡便に測定することができる
。発色剤としては、４−アミノアンチピリン−フェノー
ル、４−アミノアンチピリン−ジメチルアニリン、４−
アミノ−アンチピリン−ジエチルｍ−トルイジン、トリ
フェニルメタンロイコ体などの酸化することＫよって色
素を生成することが出来る物質であればよい。
ることができ、例えば、Ｈ２Ｏ２電唖法と、０□の消費
を成極で測定することも可能だが、より好ましくは、比
色定量法、例えば被ルオキシダーゼ及び発色剤を組合わ
せて使用するととにより、簡便に測定することができる
。発色剤としては、４−アミノアンチピリン−フェノー
ル、４−アミノアンチピリン−ジメチルアニリン、４−
アミノ−アンチピリン−ジエチルｍ−トルイジン、トリ
フェニルメタンロイコ体などの酸化することＫよって色
素を生成することが出来る物質であればよい。
ペルオキシダーゼの使用量は、通常、１００〜１０００
Ｕ／ｌ存在させることが望ましく１発色剤の使用量は約
０．１〜２ ｍＭ程度である。
Ｕ／ｌ存在させることが望ましく１発色剤の使用量は約
０．１〜２ ｍＭ程度である。
本発明の試薬を用いて前記サイクリック反応系の反応を
進行させるためには、酸素の存在が必要なので、測定に
あたっては、酸素を充分供給することが必要である。
進行させるためには、酸素の存在が必要なので、測定に
あたっては、酸素を充分供給することが必要である。
本発明によシ、今まで定量することができなかった極微
量のピルビン酸を測定することができ、また煩雑な操作
や高価な装置を用いることなく極微量のピルビン酸を定
量できる様になった。
量のピルビン酸を測定することができ、また煩雑な操作
や高価な装置を用いることなく極微量のピルビン酸を定
量できる様になった。
以下実施例により本発明を用いたピルビン酸定量方法に
ついて説明する。
ついて説明する。
検量線の作成
ピルビン酸を１ｍＭ含む水溶液を作成して、これを適当
な濃度まで蒸留水で希釈した。検量線を画く場合は０−
５０μＭまで希釈して調製した。ＵＶ法の場合は０−１
ｍＭまでの濃度の水溶液を作成した。この標＄液１０μ
ｌを試験管に採り、このなかに本発明の試薬（乳酸脱水
素酵素１００００［Ｊ／ｌ、乳酸酸化酵素１００Ｕ、＃
、・９−オキシダーゼ１０００Ｕ／１．ＮＡＤＨＯ，５
ｍＭ、４−アミノアンチピリン２． ＯｍＭ 、フェノ
ール１ ｍＭを含むトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，６５０
ｍＭ） ３ ｒｒｄｌを加え３７℃で２０分間反応させ
た。２０分後、分光光度計を用いてて従来法のＵＶ法で
も測定した。方法は標準液１００Ａ／に試薬（乳酸脱水
素酵素１０００Ｕ／／、ＮＡＤＨ０，２４ｍＭを含むリ
ン酸緩衝液ｐＨ７，２５０ｍＭ ） ３ ｍｌを加え、
３７℃で１０分間反応させ、反応後波長３４０ｎｍで比
色した。この値をもとに検量線（ムで示す）を作成した
。
な濃度まで蒸留水で希釈した。検量線を画く場合は０−
５０μＭまで希釈して調製した。ＵＶ法の場合は０−１
ｍＭまでの濃度の水溶液を作成した。この標＄液１０μ
ｌを試験管に採り、このなかに本発明の試薬（乳酸脱水
素酵素１００００［Ｊ／ｌ、乳酸酸化酵素１００Ｕ、＃
、・９−オキシダーゼ１０００Ｕ／１．ＮＡＤＨＯ，５
ｍＭ、４−アミノアンチピリン２． ＯｍＭ 、フェノ
ール１ ｍＭを含むトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，６５０
ｍＭ） ３ ｒｒｄｌを加え３７℃で２０分間反応させ
た。２０分後、分光光度計を用いてて従来法のＵＶ法で
も測定した。方法は標準液１００Ａ／に試薬（乳酸脱水
素酵素１０００Ｕ／／、ＮＡＤＨ０，２４ｍＭを含むリ
ン酸緩衝液ｐＨ７，２５０ｍＭ ） ３ ｍｌを加え、
３７℃で１０分間反応させ、反応後波長３４０ｎｍで比
色した。この値をもとに検量線（ムで示す）を作成した
。
未知量の定量（血中ピルビン酸の定量）新鮮血液Ｉ Ｉ
ｎｔに過塩素酸１ ＃Ｉｔを加え３０００ ｒ、ｐ、ｍ
で遠心分離した。得られた検体より１０μ１分取し小試
験管に入れ、この中に検量線作成で使用した本発明の試
薬３ｄ１ｊｒ：加えて３７℃で２０分間反応させた。２
０分後分光光度計で波長５０５ ｎｍにて測定した。得
られた値をもとに、検量線から検体のプルビン酸を読み
取り検体中のピルビン酸量を知ることか出来た。なお、
この時のピルビン酸量は過塩素酸で１／２に希釈しであ
るため２倍にする必要がある。このようにして測定した
検体３例の結果を下記に示す。
ｎｔに過塩素酸１ ＃Ｉｔを加え３０００ ｒ、ｐ、ｍ
で遠心分離した。得られた検体より１０μ１分取し小試
験管に入れ、この中に検量線作成で使用した本発明の試
薬３ｄ１ｊｒ：加えて３７℃で２０分間反応させた。２
０分後分光光度計で波長５０５ ｎｍにて測定した。得
られた値をもとに、検量線から検体のプルビン酸を読み
取り検体中のピルビン酸量を知ることか出来た。なお、
この時のピルビン酸量は過塩素酸で１／２に希釈しであ
るため２倍にする必要がある。このようにして測定した
検体３例の結果を下記に示す。
血液を用いた測定例
本発明の試薬を使用 従来Ｕｖ法（Ｌｉ）Ｈ−ＮＡＤ
Ｉ（）検体Ａ Ｏ，３２ｍＱ／ｄｔ Ｏ
，３ｍ１ｌｄｉＢ Ｏ，１２０，０９ ＣＯ，０６０
Ｉ（）検体Ａ Ｏ，３２ｍＱ／ｄｔ Ｏ
，３ｍ１ｌｄｉＢ Ｏ，１２０，０９ ＣＯ，０６０
第１図は、ピルビン酸の濃度測定のための検量線である
。・は本発明による検量線であシ、ムは従来法による検
量線である。
。・は本発明による検量線であシ、ムは従来法による検
量線である。
Claims (2)
- （１）乳酸脱水素酵素、乳酸酸化酵素及びニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド還元型からなる、ピルビン酸
定量用試薬。 - （２）ペルオキシダーゼ及び発色剤を含む特許請求の範
囲第（１）項に記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30657386A JPS63160600A (ja) | 1986-12-24 | 1986-12-24 | ピルビン酸定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30657386A JPS63160600A (ja) | 1986-12-24 | 1986-12-24 | ピルビン酸定量用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63160600A true JPS63160600A (ja) | 1988-07-04 |
Family
ID=17958682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30657386A Pending JPS63160600A (ja) | 1986-12-24 | 1986-12-24 | ピルビン酸定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63160600A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866153A (zh) * | 2017-05-11 | 2018-11-23 | 广州市伊川生物科技有限公司 | 一种唾液酸测定试剂盒及其测定方法 |
| CN109097434A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-28 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种唾液酸检测试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59213399A (ja) * | 1983-05-18 | 1984-12-03 | Toyo Jozo Co Ltd | Ｎｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
-
1986
- 1986-12-24 JP JP30657386A patent/JPS63160600A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59213399A (ja) * | 1983-05-18 | 1984-12-03 | Toyo Jozo Co Ltd | Ｎｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866153A (zh) * | 2017-05-11 | 2018-11-23 | 广州市伊川生物科技有限公司 | 一种唾液酸测定试剂盒及其测定方法 |
| CN109097434A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-28 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种唾液酸检测试剂盒 |
| CN109097434B (zh) * | 2018-08-15 | 2021-08-27 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种唾液酸检测试剂盒 |
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