JPS63168562A - 細胞固定・保存液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞診検体の固定に適した細胞固定液に関し、
細胞の核と細胞質を良好な形態に固定し、さらにその形
態をかなりの期間保存しうるものである。

〔従来の技術〕

喀痰や子宮肺部から綿棒で採取された粘液性の検体中に
は無数の細胞が含まれており、その中に前癌状態の異型
細胞や癌細胞が含まれていないかどうかを検査するのが
細胞診であり、この細胞診は、現代の癌の早期発見に重
要な役割を担っている。この細胞診には顕微鏡が用いら
れてきたが、近年はそれに加えて、細胞を秒速数百個ま
たはそれ以上のスピードで流して測定するところの自動
細胞分析・分離装置であるフローサイトメトリー（ｆｌ
ｏｗ　ｃｙｔｏｍｅＬｒｙ）を用いて行う自動化細胞診
も適用されようとしている。顕微鏡あるいはフローサイ
トメトリーを用いた細胞診のいずれの場合でも、細胞が
正確に診断されるためには、検体中の細胞が良好な状態
に固定されることが極めて重要で、固定が不良な場合は
、癌細胞が見落とされたり、逆に癌細胞でないものが癌
細胞と見誤られたりする。

細胞診の検体の一般的な固定法は、検体をスライドグラ
スに直接塗抹してそれが乾かぬうちに迅速に固定液に入
れて固定する方法（塗抹標本の湿潤固定法）がとられ、
その固定液としては９５％エタノールが用いられる。し
かし、入院していない患者や集団検診の被検者について
肺癌の喀痰細胞診を行う場合は、病院を受診した際に直
ちに痰が噴出できるとは限らない。むしろ痰は起床時に
出やす（、またこの起床時の痰は、就寝中に肺内から遊
離した細胞を豊かに蓄えているので細胞診に最も適して
いる。この起床時の痰を病院に持参した後に固定を行う
のでは時間が経ち過ぎ、細胞に変性が加わっていて固定
が不良であり、細胞診が不正確となる。このような場合
、適切な喀痰用の細胞固定液があって細胞を直ちに固定
できれば、起床時の喀痰を自宅でその固定液に入れて保
存し、後日病院へ持参出来るので好都合である。しかし
、喀痰を９５％エタノール固定液に入れると、喀痰の粘
液が表層から凝固し、凝固した表層は、固定液が内部へ
浸透するのを妨害して内部の細胞の固定を不良とするば
かりでなく、喀痰をスライドグラスに薄（延ばして塗抹
することをも妨げて更に標本の質を悪くする。また、フ
ローサイトメトリーによる自動化細胞診の場合には、細
胞の固定状態が不均一なために測定誤差が大きくなった
り、凝固した粘液塊が装置のノズルを詰らせて分析不能
となるなどの重大な支障を生ずる。

肺癌検診のために、喀痰用の固定液を最初に導入したの
は米国のサコマノ　（Ｓａｃｃｏｍａｎｎｏ、１９６３
）であり、我が国においても、このサコマノ液がしばし
ば用いられている。このサマコノ液は、５０％エタノー
ル水にカーボワックス（ポリエチレングリコール１５４
０）が２％の割りに添加された簡単な組成のものである
。この液の中に喀痰を吐き出して一定時間固定したあと
、検査室においてブレンダーにかけて強く攪拌して粘液
を機械的に破壊して細胞を遊離させ、遊離した細胞を遠
心沈澱して収集し、これをスライドグラスに塗抹して塗
抹標本を作り、染色を施して顕微鏡診断を行うことにな
る。この液は、エタノール濃度が５０％と少し高い上に
カーボワックスを含むため、固定中に細胞の収縮や核の
濃縮が起り、そのため細胞の詳細な内部構造が読み取り
難く、慣れないと細胞診断に支障を来す欠点がある。ま
た、フローサイトメトリーによる自動化細胞診において
は、この液が粘液溶解剤を含まないために、溶けずに残
っている粘液が装置のノズルを詰らせて測定が不能とな
ったり、また細胞集塊が生じ易いために、細胞−個一個
の測定が不能となるなどの重大な支障をきたす。従って
、このサコマノ液は、フローサイトメトリーによる自動
化細胞診にとっては特に不適切な固定液である。

近年、我が国において、粘液溶解性の喀痰用固定液が開
発されて市販されるようになったが、これらはいずれも
サコマノ液と同様に２％のカーボワックスを含む５０％
エタノール水を基本とし、粘液溶解剤を添加したもので
ある。粘液溶解剤として、東北大学抗酸菌研究所式（サ
ーマル社発売）はＮアセチル−Ｌシスティン（Ｎ−ａｃ
ｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓ−ｔｅｉｎｅ）を用い、大阪府成
人病センタ一式（松浪ガラス社発売）はジチオトレイト
ール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉ−ｔｏｌ）を用い、またＹ
Ｍ式喀痰固定液（武藤純薬社製、特許出願中とのこと）
はジハイドロキジ　ジチオールブタン（ｄｉｈｙｄｒｏ
ｘｙ　ｄｉｔｈｉｏｌｂｕｔｈａｎ）や酵素を加えたも
のとされている。

Ｃ本発明が解決しようとする問題点〕 近年、肺癌患者の急増に関連して喀痰細胞診への需要も
急増し、老人医療法の改正によって昭和６２年度から成
人の肺癌検診が義務付けられることになると、喀痰細胞
診への需要増加にさらに拍車がかかる情勢である。しか
し、肺癌検診のための喀痰細胞診は、子宮癌検診の細胞
診に比べて、正常細胞の数が著しく多くて異常細胞の含
有率は少ない特徴のために、顕微鏡による診断は著しく
労力がかかる作業である上、この技術に習熟した細胞診
士や指導医の数も少ない。そこで労力節減のため、近年
は、フローサイトメトリーを用いた自動化細胞診の開発
が強力に推進されている。これは、バラバラにした細胞
を螢光染色して溶液中に浮遊させておき、この細胞を装
置の中を高速で流しながらレーザー光線を当てて螢光を
発色させ、細胞−個ずつからの螢光量を測定して細胞を
定量するものであるから、喀痰などの粘液性の検体の場
合はその粘液を溶解し、細胞を分散した浮遊状態として
固定（浮遊固定）し得る固定液が不可欠である。また、
集団検診において多数被検者の喀痰をそれぞれ固定液に
入れて回収する場合は、通常は数日間は固定液に入れた
まま保存されることが多いので、この間に細胞の変性が
進行する危険もある。そのような場合に、細胞の固定性
と共に細胞構造の保存性も良好な固定・保存液が望まれ
る。そのような液があれば、肺癌の集団検診にも便利に
利用出来るし、また子宮癌についての集団検診において
も、検診医は、綿棒を一々その場でスライドグラスに塗
抹をせずとも、綿棒を固定液に投入しておけばよいので
手間も省け、かつ塗抹時に起り易い塗抹標本の乾燥とい
う重大な障害からも逃れることが出来て好都合である。

細胞の固定・保存性の良否は細胞の診断精度に重大な影
響を及ぼし、これが不良の検体では診断が不能となった
り、誤診が生じたりするので、細胞診を担当する関係者
には非常に関心が高い。このような細胞の固定・保存液
に関して要求される事項を纏めると以下の通りである。

１、粘液溶解性： 検体中の粘液は、一般に固定液に触れると凝固し、凝固
した粘液は、固定液の粘液境内浸透を阻害して細胞の固
定を不均等として細胞分析上の誤差を生み、また粘液塊
がフローサイトメトリーのノズルを詰らせて分析を不能
とする。従って、粘液性の強い検体の場合、固定中に粘
液が溶解される固定液が望まれる。

２、ＤＮＡと蛋白質の固定： 顕微鏡による診断に際しては、核の大きさやその内部構
造、および核／細胞質比が診断の対象となり、またフロ
ーサイトメトリーによる自動化細胞診に際しては、核の
ＤＮＡ量および細胞のＤＮＡ１ｌ／蛋白量比が定量の対
象となるので、核（ＤＮ＾）と細胞ｔ（蛋白質）との両
者が共に良く固定され、かつ保存されなければならない
。

３、固定による細胞の収縮や凝集の防止：細胞の固定は
確実でなければならないが、固定を強化すると、細胞が
収縮あるいは濃縮して顕微鏡的診断が困難になったり、
また細胞同士が凝集して細胞集塊を作り、これがフロー
サイトメトリーのノズルを詰らせて測定が不能になった
りするので、固定の強度はほどほどでなければならない
。

４、固定液の毒性： 肺癌の集団検診の際は、喀痰の固定液を容器に入れて被
検者に配布することになるが、家庭に配布された固定液
を誤って子供などが飲むという万一の事故も考慮すると
、その固定液の毒性は低くなければならない。

５、固定した細胞の保存性： 集団検診の際は、大量の検体が一時に・集められ、これ
らが順次検査されるので、その間の数日から２週間ぐら
いは固定液の中で細胞構造が保存されねばならない。

近年わが国で市販されている各種の喀痰固定液を検討し
たが、０．２％アセチルシスティンを５０％エタノール
水に添加した東北大学抗酸菌研究所式の固定液は、追試
の結果、粘液溶解性は良好であるが、本出願者がフロー
サイトメトリーによる自動化細胞診用に開発したＤＮΔ
蛋白同時定量用螢光染色液の成分であるヘマトポルフィ
リンとアセチルシスティンとが反応を起して褐色の紫状
沈澱物を生じ、該染色液による染色が障害されることが
欠点であった。次にジハイドロキシ　ジチオールブタン
を用いたＹＭ喀噴液定液（武藤純薬株式会社製、特許出
願中）を検討したが、これは粘液溶解性の点ではＮアセ
チル上システィン使用の固定液と同等と思われたが、独
特の悪臭があり、痰を吐きだそうとして口を容器に近づ
けると、卵が腐ったような悪臭が鼻をつく。ある地域の
集団検診で、これを配られた被検者のうちには、この固
定液の悪臭から固定液が腐っていると思い、固定液を捨
てたものがいたとする報告も伝えられた。またジハイド
ロキシ　ジチオールブタンの毒性が不明な点、酵素を用
いているので約３カ月の有効期間しかなく高価であるな
どの点にも問題がある。

ジチオトレイトールを用いた大阪成人病センタ一式の噴
液固定液については今回は実験していないが、ジチオト
レイトールはＮアセチルムシスティン同様去痰剤として
用いられる薬物であり、使用量も少ないので毒性面では
問題がないものと思われるが、高価である点、価格面で
の問題がある。

本発明は、上述のような欠点がなく、噴液等の細胞診検
体の固定において、細胞の核と細胞質を良好な形態に固
定し、更にその形態をかなりの期間維持しうる固定・保
存液を提供することを目的とし、さらに、フローサイト
メトリーと細胞螢光染色法とを用いた自動化細胞診にも
適した固定・保存液を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、エチルアルコールと食塩と庶糖又はプロピ
レングリコールのいずれか一方とを含有する緩衝液を細
胞の固定及び保存に用いることにより達成される。さら
に、粘液性の細胞診検体の固定・保存には、上記緩衝液
に粘液溶解剤として本発明者が見出した新規な粘液溶解
剤メチルシスティンを加えた固定・保存液を用いれば粘
液が良く溶け、細胞の核及び細胞質が良好に固定され、
しかもフローサイトメトリーと細胞螢光染色法を用いた
自動化細胞診にも適する。

以下に固定・保存液に要求される性質と関連して各成分
の説明を行う。

１）粘液溶解性の問題 本発明者は、フローサイトメトリーと細胞の螢光染色に
よる細胞診の自動化を開発している途上に、当該染色液
と反応しない粘液溶解剤を種々検討した結果、メチルシ
スティンを見出した。メチルシスティン塩酸塩は、化学
的にはｍｅｔｈｙｌβ−ｍｅｒ−ｃａｐｔｏａｌａｎｉ
ｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　Ｈ３ＧＨｚＣ）
Ｉ（ＮＯ３）ＣＯＯ−Ｃ１ｈ　　・ＨＣＩであり、かっ
ては去痰剤として用いられたことがある。多数の患者の
噴液を用いて検討の結果、固定液にメチルシスティンを
０．１〜０．２％添加したものでは、粘液がよく溶け、
細胞固定効果も良好で、固定液に特に悪臭もなく、また
長期の保存にも変質や効力減退を示さなかった。

なお、粘液性の少ない検体の細胞固定には、粘液溶解剤
を用いる必要はなく、以下に述べる各成分を含む緩衝液
を用いれば十分である。

また、フローサイトメトリーによる分析の際には、粘液
溶解と細胞分散の目的で、検体を入れた固定液を高速ブ
レンダーで激しく振盪するが、その際に無数の細かな気
泡が生じ、これが粘液塊を覆ったり粘液塊の中にとじこ
められたりして粘液と粘液溶解剤との接触を妨害するの
で、シリコンレジン製剤であるアンチフオームを消泡剤
として加え、良い結果を得た。シリコンレジンは消泡剤
として、ビール、ブドー酒、しょうゆ、乳製品、果物ジ
ュースなどの各種の食品の濃縮、発酵、および蒸溜工程
などに用いられ、作業の能率化や製品の均一化などに役
立っており、食品中の本島の残留量は５０ｐｐｍ以上と
定められている。実験の結果、シリコンレジンの消泡作
用は１０ｐｐｍで充分に発現し、３０ｐｐｎ＋以上では
シリコンレジンの不溶解分が残るので無駄であった。

２）核（ＤＮＡ）と細胞質（蛋白質）の固定の問題後述
のように、固定液の主剤として適したエタノールは、粘
液を凝固させたり細胞を凝集させたりする点から濃度が
低い方がよい。しかし、固定液のエタノールの濃度を低
くした場合は、エタノールの固定効果が城弱するのでそ
れを補強しなければならない。固定剤としてはゲルター
ルアルデヒドやホルマリンなど種々あるものの、集団検
診用の固定液に課せられる安全性を考慮にいれると、そ
のような毒性の強いものは使用できない。

先ず核の固定であるが、核の主成分はＤＮＡであり、低
濃度エタノールによる固定ではＤＮＡが完全に凝固せず
一部が可溶性となって消失する。一方、ＤＮＡは生理的
濃度の食塩の存在下でその溶解度を最も減するので、こ
の性質を利用して、固定液に食塩を生理的濃度に加える
ことによってＤＮＡ溶解度を最低とし、エタノールによ
るＤＮＡの固定を補強した。食塩の濃度は０．８〜０．
９％が好ましい。

次に細胞質の固定であるが、細胞質の蛋白質を凝固固定
する物質はエタノールの他に数多くあるが、これらの固
定剤は粘液をも凝固するので不向きである。また、細胞
質が完全に凝固固定された細胞は、恰もゆで卵のように
丸く硬化し、スライドグラスの上に貼りつきに＜＜、染
色の操作中にスライドグラスから脱落し易い。もし、癌
細胞が脱落すると、それは癌の偽陰性誤診（ｆａｌｓｅ
　ｎｃ４ａ−ｔｉｖｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）という重
大な失敗をおかすことになる。また、細胞は、めだま焼
き卵のようにスライドグラス上に薄く延ばされた時には
、その核や細胞質の内部構造が顕微鏡で明瞭に観察でき
て診断が容易であるが、蛋白が強く凝固されてゆで卵の
ように丸く硬化した場合は観察しがたく診断も難しくな
る。従って、細胞固定は、細胞がその本来の軟らかさが
成る程度残って固定され、細胞がスライドグラスに塗抹
された際に薄く伸ばし得ることが必要であり、３０−４
０％の低濃度エタノールはそのような軟らかな固定に適
している。しかし、このような低濃度エタノール中では
、水分が細胞内に流入して細胞は膨化する。この水分流
入を防止する最も簡単な方法は細胞から脱水をすること
であり、そのための単純な物質としては庶糖、グリセリ
ン、あるいはプロピレングリコールなどがある。そのう
ち庶糖は、安価で毒性はなく、また寒冷や高温からの細
胞庇護作用や、顕微鏡標本を作る際の乾燥防止の作用も
あるところから推奨される物質である。庶糖を固定液に
添加する場合の適正濃度は、実験の結果は２％であった
。また庶糖をプロピレングリコールで置き換えても効果
は同等であった。プロピレングリコールの濃度は１．５
〜２％が好ましい。

３）細胞の収縮と凝集の防止の問題 細胞固定のための主剤としてのエタノールは、毒性が低
い点からも優れた固定剤であるが、サコマノ液ならびに
我が国で用いられている前記の３種類の粘液溶解性の固
定液はいずれもエタノール濃度が５０％であり、この濃
度では粘液の凝固や細胞の凝集が起きやすい。従って、
噴液の適切な固定のためには、エタノールの濃度をさら
に低くすると共に、固定効果をエタノール以外の物質で
も補強するのが望ましい。適正なエタノール濃度に関し
ては、本発明者らは、エールリッヒ腹水癌細胞を各種の
濃度のエタノール水に入れて放置した後に、顕微鏡で細
胞形態を観察する実験により、エタノール以外度は３０
−４０％が良いと結論した。

４）固定液の毒性の問題 粘液溶解剤のメチルシスティンは、去痰剤としても用い
られる薬物であり、本固定液に用いられる量はごく僅か
なので毒性面からは問題にならない。また、エタノール
の濃度はホワイトリッカーやウィスキーと同等の３０−
４０％であり、その毒性は少なくとも５０％エタノール
によるものよりは軽い。そのほかの成分は燐酸緩衝液、
食塩、庶糖および、食品添加物としての許容濃度内のプ
ロピレングリコールとシリコンレジンであり、いずれも
毒性の心配はない。

５）細胞の保存性 固定した細胞の保存のためには緩衝液とすることが必要
であり、燐酸緩衝液が一般的であるが、これに限定され
ない。

６）本固定液の調合法 上記の検討の結果、必要な諸成分を含む本固定液の調合
法の一例としては、０．８〜０．９％の食塩を含む０．
０１モル燐酸緩衝液（０，０１モル燐酸緩衝生理的食塩
水、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉ
ｎｅ　ｓｏｌｕｔｉ−ｏｎ）　（以下、ＰＢＳと略称）
に、メチルシスティンを０．２％、庶糖もしくはプロピ
レングリコールを２％、水溶性アンチフオームを１０ｐ
ｐｍ　、エタノールを４０％、それぞれ最終濃度になる
ように加えればよい。

７）本固定液の使用法 本発明の固定液の具体的な使用法としては肺癌検診にお
いては、　噴液を吐き出すための専用の容器に本固定液
を入れて噴液用固定液として製品化しておき、これを予
め被検者に１−３本ずつ配布しておいて起床時の痰を噴
出させ、それを容器ごと後日巡回して回収するか、また
は郵送などの方法で回収し、また、子宮癌検診において
は、綿棒がそのまま投入できる専用の容器に本固定液を
入れたものを子宮癌検診用固定液として製品化しておき
、これに検診医が被検者の子宮腔部を擦過した綿棒を投
入させ、回収する。回収した固定液を検査室に運び、そ
こで遠心沈澱して細胞を収集し、それの塗抹標本につき
顕微鏡診断を行うか、あるいは細胞浮遊液を作ってフロ
ーサイトメトリーによる自動化細胞診を行うことになる
。

例えば、噴液の固定の場合は、噴液を本固定液中に吐き
出したあと、手でよく振盪しておく。２日〜１週間の固
定の後、高速ブレンダーで約２分間振盪し、遠心沈澱し
、顕微鏡標本作製の場合は、残渣をピペットでスライド
グラスに移し、−昼夜乾燥した後、９５％エタノールま
たはスプレ一式による再固定を行う。フローサイトメト
リーによる自動化細胞診の場合は、残渣を１回燐酸緩衝
液で洗浄したのち、螢光染色を施して分析に供する。

〔実施例〕

実験例 １）固定液中のエタノールの濃度の低濃度の限界を定め
る実験 エタノールの５０．４０．３０．２０％水溶液、および
対照液としてサコマノ液（エタノール濃度は５０％）を
準備し、各溶液に一定数のエールリッヒ腹水癌細胞を入
れて室温に一昼夜放置し、自動遠沈塗抹装置（オートス
メア）により塗抹標本を作製し、パパニコロー染色を施
して顕微鏡観察を行った。

〔結果〕　エタノール濃度が５０％のものとサコマノ液
に固定したエールリッヒ腹水癌細胞は、エタノール濃度
が５０％と濃いため、細胞凝集や細胞収縮の傾向が見ら
れ（第１図）、２０％のものでは細胞の膨化が見られ、
４０％および３０％のものではそのような現象は見られ
なかった。

２）３０％エタノール水に添加する食塩の濃度の適正値
を定める実験 食塩はＤＮ＾の溶解を抑制するので、その濃度の適正値
を知るため、４０％エタノール水に食塩をそれぞれ、０
．０．２．０．４．０．６．０．８％添加したものを準
備し、これにエールリッヒ腹水癌細胞を室温で一昼夜固
定し、塗抹標本を作製し、ババニコロー染色を施して顕
微鏡で観察するとともに、一部の細胞を電子顕微鏡で観
察した。

〔結果〕　食塩濃度が０，０．２および０．４％のもの
では、０．８％のものに比べて核の染色性がうずく、０
．６％ではその中間であった。また電子顕微鏡（２００
０倍）では核の内部構造が０．８％のものではよく保た
れていた（第２図）。

３）０．８％食塩添加の３０％エタノール水にさらに添
加する庶糖の濃度の適正値を定める実験庶糖は細胞に流
入する水分を制限して蛋白の固定を促進するので、０．
８％食塩を添加した３０％エタノールに、庶糖をそれぞ
れ０，２．４．６．８％添加したものを準備し、これに
エールリッヒ腹水癌細胞を室温で一昼夜固定し、塗抹標
本を作製し、パパニコロー染色を施して顕微鏡で観察し
た。

〔結果〕　庶ｖＭ濃度が０％のものでは細胞質が膨化し
ており、８％のものでは最も収縮しており（第３図）、
６および４％でも多少収縮しており、２％のものが膨化
も収縮も見られず、もっともよい細胞形態を示したく第
４図）。細胞も核もほどよく拡がり、第３図と比較する
と核の内部構造が明瞭に読み取れる。

４）０．８％食塩ならびに２％庶庶糖添加した３０％エ
タノールの溶媒としてのＰＢＳのモル濃度を定める実験 燐酸緩衝生理的食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）液は、蒸溜水より
細胞保存の作用が優れているのでこれを固定液の溶媒と
して用いることとし、固定液にいれた検体を冷蔵庫保存
する際の燐酸塩の結晶析出のない濃度を検討した。

〔結果〕　実験に用いられることが多い０．０６モル濃
度のＰＢＳ溶媒とした場合は、これに噴液を入れた場合
も入れない場合も、冷蔵庫中で冷やすと直ちに板状結晶
が析出し、この結晶は液を常温に戻しても溶解しなかっ
た。しかし、０．旧モル瀾度のＰＢＳを溶媒として用い
た固定液では、数カ月間冷蔵庫中で保存しても結晶の析
出は見られなかった。

５）噴液の粘液溶解剤のメチルシスティンの濃度を定め
る実験 噴液の粘液溶解のために固定液に添加する粘液溶解剤メ
チルシスティンの適正濃度を知るため、３０％エタノー
ル・ＰＢＳに、メチルシスティンを０．０．５．０．１
，０．２．０．５％それぞれ添加したものを準備し、こ
れに患者の噴液を入れ、室温で３日間放置したものを手
で約２０秒間振盪し、粘液の溶解性を目で観察した。

〔結果〕　メチルシスティンの濃度が０および０゜０５
％のものでは粘液の溶解は不」−分で（第５図）、０．
１％以上の濃度で粘液溶解が発現したく第６図）。

第６図の写真はメチルシスティンを添加しない固定液（
３０％エタノール・Ｐ　Ｂ　Ｓ）で固定した噴液の塗抹
染色標本の顕微鏡写真（１００倍）である。

画面の下１／３に横に走る線条は粘液で、これに細胞が
からめられていて、分散していない。

第７図の写真はメチルシスティンを０．２％添加した固
定液（３０％エタノール・ＰＢＳ）で固定した噴液の塗
抹染色標本の顕微鏡写真（１００倍）である。

粘液が溶解して、細胞は良（分散している。ひときわ大
型の細胞は肺癌細胞である。

６）固定液の消泡剤として添加するシリコン製剤の効果
をみる実験 固定液に固定した噴液は、それの粘液溶解と細胞分散の
目的のため、容器ごと高速ブレンダーにかけて毎分約６
０００回の振動を与えるが、この際に固定液が強く泡立
ち、この気泡が噴液の周囲を取り巻き、固定液との接触
を妨害する。そこでシリコン製剤の消泡剤を用いること
とし、その商品であるアンチフオームを食品添加剤とし
て認可されている濃度の１０ｐｐｍ添加した固定液（２
％庶庶糖添加した３０％エタノール・Ｐ　Ｂ　Ｓ）と、
アンチフオームを添加してない固定液とを準備し、これ
らに噴液を入れて高速ブレンダーにより２分間振盪した
ところ、アンチフオームを添加したものが明らかに気泡
の発生が少なく、また消泡も早く、粘液溶解も優れてい
た。

７）細胞の乾燥防止のために添加するプロピレングリコ
ールの実際の効果にみる実験 噴液の固定液による固定後は、これをスライドグラスに
塗抹して、染色に移る前に一晩乾燥するのであるが、そ
の際に細胞が乾燥しすぎると染色性が悪くなるので、そ
れを防止するため、プロピレングリコールの湿潤作用の
効果も調べたところ、プロピレングリコールが添加しで
あるものの染色性のほうが、これを添加してないものよ
り優れていた。尚、プロピレングリコールの濃度は１．
５〜２％が適当であり、この濃度は食品添加物としての
許容濃度である３％以内であるので、固定液の毒性面か
らも問題とならない。

実施例 固定液（０，２％メチルシスティン、０．８％食塩、２
％プロピレングリコールおよびｔｏｐｐｍアンチフオー
ムを添加した４０％エタノール・Ｐ　Ｂ　Ｓ）（固定液
に噴液を吐き出すと、唾液が加わって固定液のエタノー
ル濃度が薄まるので、エタノール濃度は４０％とした）
の噴液の粘液溶解性、細胞凝集性および細胞固定効果を
みる実験： 完成した固定液の総合的な効果をみるため、１２６名の
患者の噴液につき、噴液を入れた直後にこれを手で振盪
した時と３日後に高速ブレンダーで振盪した場合の噴液
溶解性、細胞の分散および固定効果などを検討した。（
表１） 〔結果〕　高速ブレンダーで振動後は、１例の噴液を除
き、粘液溶解が認められた。粘液溶解が不能であった１
例は、高度に血性であったために血液が粘液をまき込ん
で凝固したものであった。

また、顕微鏡所見上、細胞の分散は良好で、細胞質およ
び核の構造は１力月以上保存したものでも優れていた。

第７図〜第１０図の写真は完成した本固定液で固定し、
４０日間冷蔵庫で保存された噴液中の肺癌細胞の顕微鏡
写真（４００倍）である。細胞質も核もその構造が極め
てよく保たれてい′る。第７図と第８］は肺の扁平上皮
癌細胞の写真で、第９図と第１０図は肺の腺癌細胞の写
真である。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の固定・保存液を用いれば
、細胞の収縮や凝集がみられず、細胞の核及び細胞質の
構造を良好な形態に固定でき、また固定された細胞の保
存性にもすぐれているので、噴液等の細胞診検体の固定
に適し、特に肺癌検診の際の噴液の固定・保存液として
利用価値が高い。

さらに、粘液溶解剤としてメチルシスティンを加えれば
粘液を溶解して細胞を分散させ、細胞固定効果も良好で
あり、しかもこれは螢光染色液と反応しないため、フロ
ーサイトメトリーと細胞螢光染色法とを用いた自動化細
胞診にも適する固定・保存液を提供しうる。

【図面の簡単な説明】

第１図はサコマノ液で固定したエールリッヒ腹水癌細胞
の顕微鏡写真。 第２図は０．８％食塩添加の３０％エタノール水で固定
したエールリッヒ腹水癌細胞の核の電子顕微鏡写真（２
，０００倍）。 第３図は０．８％食塩添加の３０％エタノール水に更に
８％の庶糖を添加した液で固定したエールリッヒ腹水癌
細胞の顕微鏡写真。 第４図は０．８％食塩添加の３０％エタノール水に更に
２９／６の庶糖を添加した液で固定したエールリッヒ腹
水癌細胞の顕微鏡写真。 第５図はメチルシスティンを添加しない固定液（３０％
エタノール・ＰＢＳ）で固定した噴液の塗抹染色標本の
顕微鏡写真（１００倍）。 第６図はメチルシスティンを０．２％添加した固定液（
３０％エタノール・ＰＢＳ）で固定した噴液の塗抹染色
標本の顕微鏡写真（１００倍）。 第７図〜第１０図は、本発明固定液で固定し、４０日間
冷蔵庫で保存された噴液中の肺癌細胞の顕微鏡写真（４
００倍）。第７図と第８図は肺の扁平上皮癌細胞の写真
で、第９図と第１０図は肺の腺癌細胞の写真。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、エチルアルコールと食塩と庶糖又はプロピレングリ
   コールのいずれか一方とを含有する緩衝液から成る細胞
   固定・保存液。 ２、緩衝液が燐酸緩衝液であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の細胞固定・保存液。 ３、エチルアルコールの濃度が３０〜４０％、食塩の濃
   度が０．８〜０．９％、庶糖の濃度が２％、プロピレン
   グリコールの濃度が１．５〜２％であり、燐酸緩衝液の
   燐酸塩濃度が０．０１モルであることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項記載の細胞固定・保存液。 ４、エチルアルコールと食塩と庶糖又はプロピレングリ
   コールのいずれか一方と粘液溶解剤としてのメチルシス
   ティンとを含有する緩衝液から成る細胞固定・保存液。 ５、緩衝液が燐酸緩衝液であることを特徴とする特許請
   求の範囲第４項記載の細胞固定・保存液。 ６、エチルアルコールの濃度が３０〜４０％、食塩の濃
   度が０．８〜０．９％、庶糖の濃度が２％、プロピレン
   グリコールの濃度が１．５〜２％、メチルシスティンの
   濃度が０．１〜０．２％であり、燐酸緩衝液の燐酸塩濃
   度が０．０１モルであることを特徴とする特許請求の範
   囲第５項記載の細胞固定・保存液。 ７、さらにシリコン性消泡剤を含有することを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項記載の細胞固定・保存液。 ８、シリコン性消泡剤の含有量が３０〜５０ｐｐｍであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の細胞固
   定・保存液。