JPH0260318B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は特定微生物の菌体を酵素源として用い
るアデノシンとホモシステインからＳ−アデノシ
ル−Ｌ−ホモシステインを効率良く酵素合成して
採取する方法に関する。 Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（以下、
SAHと略称する）は、生体内においてＳ−アデ
ノシルメチオニン（以下、SAMと略称する）が
関与するメチル基供与反応で生じる重要な生理活
性物質である。而して、近時かかるSAHに鎮静
剤、睡眠誘発剤などとしての効果が見い出されて
おり、その大量生産が期待されている。 従来、SAHの製造方法としてはサツカロマイ
セス属またはキヤンデイダ属の酵母から抽出する
方法〔例えばアーカイブズ・オブ・バイオケミス
トリー・アンド・バイオフイジツクス（Arch.
Biochem.Biophys）69、575（1962）〕、SAMから
の酵素的脱メチル法〔例えばジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem）
240、2512（1965）〕、SAMからの化学的脱メチル
法（例えば特公昭45−37536号）などが知られて
いる。しかしながら、これらほ方法はいずれも非
常に経費がかかり、工業的製造法とは言い難い。 一方、アデノシンとホモシステインをサツカロ
マイセス属またはキヤンデイダ属酵母の菌体抽出
物の存在下に酵素合成する方法〔例えばアーカイ
ブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフイジツクス（Arch・Biochem・Biophys）
69、575（1962）〕も知られている。しかし、この
方法は菌体からの抽出物を用いる点で操作性に難
があり、必ずしも実用的とは言い難い。 本発明者らは以上のように実状に鑑み、SAH
の酵素的合成法に関して種々検討を加えた結果、
サツカロマイセス属またはキヤンデイダ属に属す
る菌体を酵素源として用いた時に、アデノシンと
ホモシステインから簡単に、しかも効率良く
SAHが構成できることを見い出し本発明を完成
した。 かくして本発明によれば、サツカロマイセス属
またはキヤンデイダ属に属しアデノシンとホモシ
ステインよりSAHを合成する能力を有する微生
物の菌体の存在下にアデノシンとホモシステイン
を水性媒体中で接触させて反応せしめ、SAHを
合成して採取することを特徴とするSAHの製造
法が提供される。 本発明において酵素源として用いられる微生物
は上記の属に属し、生菌体または乾燥菌体の形態
でアデノシンとホモシステインからSAHを合成
できる能力を有するものであればいずれでも良
く、その具体例としてはサツカロマイセス・セレ
ビジエ（Saccharomyces cerevisiae）IFO
1805、サツカロマイセス・セレビジエIAM
4175、サツカロマイセス・シエバリエリ
（Saccharomyces chevalieri）IFO 1727、サツ
カロマイセス・エキシグース（Saccharomyces
exiguus）IFO 0215、サツカロマイセス・ウバル
ム（Saccharomyces uvarum）IFO 0565、サツ
カロマイセス・フアーメンタチ
（Saccharomyces fermentati）IFO 0422、サツ
カロマイセス・ロウキシー（Saccharomyces
rouxii）IFO 0487、サツカロマイセス・バヤヌ
ス（Saccharomyces bayanus）IFO 0206、サツ
カロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）
IFO 1172、サツカロマイセス・デルプリユツキ
ー（Saccharomyces delburueckii）IFO 0955、
キヤンデイダ・ウチリス（Candida utilis）IFO
0396、キヤンデイダ・ギリエルモンデイー
（Candida guilliermondii）IFO 0566、キヤンデ
イダ・サケ（Candida sake）IFO 1633、キヤン
デイダ・トロピカリス（Candida tropicalis）
IFO 0587、キヤンデイダ・クルセイ（Candida
krusei）IFO 0013、キヤンデイダ・マセイドニ
エンシス（Candida macedoniensis）IFO 0706、
キヤンデイダ・シユードトロピカリス（Candida
pseudotropicalis）IFO 1065、キヤンデイダ・マ
ルトーサ（Candida maltosa）ATCC 38042、キ
ヤンデイダ・インターメデイア（Candida
intermedia）IFO 0761、キヤンデイダ・アルビ
カンス（Candida albicans）IFO 1594などが挙
げられる。また市販パン酵母、清酒酵母なども前
記の属に属するかぎり使用することができる。さ
らにこれらの菌の天然及び人工変異菌であつても
SAH合成能を有するかぎり同様に使用すること
ができる。 本発明におけるSAHの合成方法は微生物の生
菌体又は乾燥菌体の形態で菌体内酵素の作用を利
用するものであるが、この酵素は微生物を通常の
方法で培養する事により調整する事ができる。 微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無
機塩、有機微量栄養源を含有する通常の培地でよ
く、微生物の種類に応じて適宜選択して使用すれ
ばよい。また培養方法は通常液体培地で行なわれ
るが、固体表面培養によつても行うことができ
る。培養条件は微生物の種類に応じて適宜選択す
れば良く、温度10〜60℃、PH３〜10の範囲が用い
られるが、一般的には温度20〜40℃、PH４〜９の
範囲で10〜120時間培養すれば良い。培養中には
通気・撹拌を行つて微生物の生育を促進されるこ
ともできる。 本発明におけるSAHの合成反応には、前記の
ようにして培養した微生物が生菌体または乾燥菌
体の形態で使用される。例えば、微生物の培養液
中の菌体をそのまま使用してもSAHの合成反応
は進行するが、培養液中の成分が障害になる場合
や菌体量を多く使用したい場合には培養液から分
離した菌体を用いることが好ましい。菌体は生菌
体のままで充分に使用目的を達するが、貯蔵ある
いは取扱いの便宜から風乾菌体、凍結乾燥菌体、
アセトン菌体などのような乾燥菌体として用いる
こともできる。また、菌体を常法に従つて固定化
して使用することもできる。 本発明におけるSAH合成反応は酵素反応基質
であるアデノシンとホモシステインとを微生物菌
体の存在下に水性媒体中で接触させることによつ
て行なわれる。反応に供されるホモシステインは
Ｌ体、DL体のいずれであつても使用することが
できる。また反応の条件は適宜選択すればよく、
基質濃度としてアデノシンを１ｍＭ以上、好まし
くは２〜20ｍＭ、ホモシステイン濃度を１ｍＭ以
上、好ましくは２〜200ｍＭとすればよい。 なお、本発明におけるホモシステインなる用語
は反応系内においてホモシステインを供給する物
質（例えばホモシスチン、ホモシステインチオラ
クトンなど）をも含むものとして理解されるべき
である。 反応における系のPHは４〜12、好ましくは６〜
10に保てばよく、PHの調整は通常の方法、たとえ
ばリン酸カリウムバツフアー、リン酸ナトリウム
バツフアー、トリスバツフアー、塩化アンモニウ
ムバツフアー、グリシンバツフアーなどによつて
調整すればよい。 反応温度は、反応がよく進行し酵素活性、基質
および生成物に影響のない温度であればよく、通
常は15〜60℃、好ましくは20〜50℃である。反応
時間は基質のSAHへの転化率が増大するように
設定すればよく、バツチ式の場合、通常0.1〜48
時間好ましくは0.5〜36時間である。その他目的
に応じて水性媒体中にアセトン、エタノールの如
き有機溶媒や各種の界面活性剤を添加して反応を
行わせることもできる。 かくしてSAHを含有する反応液が得られるが、
該反応液からSAHを採取する方法は公知方法に
よればよい。その分離法としては、例えばSAH
含有液を強酸性カチオン交換樹脂に接触させて
SAHを吸着させた後、硫酸で溶出させ、溶出液
にリンタングステン酸を加えてSAHを沈殿させ
る方法、SAH含有液を活性炭に接触させてSAH
を吸着させた後、エタノール／水／濃アンモニア
水（５：50：１）で溶出させ、溶出液を減圧下濃
縮して濃縮物のPHを酢酸で７に調節した後、
SAHを０℃で晶出させる方法などが例示される。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。ただし本発明はこれらの例のみに限定
されるものではない。 なお、実施例におけるSAHの定量は次のよう
にして行つた。すなわち、反応終了後、反応液を
直ちに０〜５℃に冷却し過塩素酸を添加して反応
を停止した。次いで遠心分離にて不溶物を除去し
たのち、得られた上澄液にリン酸カリウムバツフ
アー（PH7.0）を添加して、生成した過塩素酸カ
リウムを遠心分離により除去した。かくして得ら
れた上澄液の所定量を採取して高速液体クロマト
グラフイー（日立製作所製、638−30型、カラ
ム：Cosmocil 5C₁₈、Detecter：UV260nｍ）を
用いることによりSAHの定量を実施した。 実施例 １ グルコース５ｇ／dl、ペプトン0.5ｇ／dl、酵
母エキス0.1ｇ／dl、KH₂PO₄0.2ｇ／dl、
K₂HPO₄0.1ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.02ｇ／dl、
寒天２ｇ／dlからなる寒天斜面培地（PH6.0）で
28℃、48時間培養した第１表記載の菌株１白金耳
を、グルコース５ｇ／dl、ペプトン0.5ｇ／dl、
酵母エキス0.1ｇ／dl、KH₂PO₄0.2ｇ／dl、
K₂HPO₄0.1ｇ／dl、Mg SO₄・7H₂O0.02ｇ／dl
からなりPH6.5に調整、加熱滅菌した液体培地10
mlに植菌し、28℃で40時間振盪培養を行なつた。 遠心分離にて集菌し、0.1Mリン酸ナトリウム
バツフアー（PH8.5）で洗浄した後、菌体をアデ
ノシン２ｍＭ、DLホモシステイン４ｍＭ、リン
酸ナトリウムバツフアー（PH8.5）100ｍＭからな
る基質溶液１mlに懸濁し、30℃で４時間振盪して
反応させた。SAHの収量を測定し、その結果を
第１表に示した。

【表】

【表】 実施例 ２ 液体培地量が５mlであること以外は実施例１と
同様に培養したキヤンデイダ・ウチリスIFO
0396の培養液５mlをIN NaOHでPH8.5に調整し
た後、アデノシン5μmol、DE−ホモシステイン
5μmolを添加し、30℃で４時間振盪して反応させ
た。SAHの収量は0.24μmol／mlであつた。 実施例 ３ 液体培地量が500mlであること以外は実施例１
と同様に培養したサツカロマイセス・セレビジエ
IFO 1805の培養液より菌体を遠心分離にて集菌
し、生理食塩水で一回洗浄した後、再び遠心分離
にて集菌した。次にこの洗浄菌体を用いて下記の
手順に従い風乾菌体、凍結乾燥菌体及びアセトン
乾燥菌体はそれぞれ調整した。 すなわち洗浄菌体を通風下に約15時間室温にて
乾燥した後、更に五酸化リンを入れた減圧デシケ
ーター中５℃で１日乾燥した。次にこの乾燥菌体
を乳鉢で粉末状にすりつぶし、再び減圧デシケー
ター中で乾燥することにより風乾菌体を調整し
た。凍結乾燥菌体は、洗浄菌体をそのまま真空凍
結乾燥を行うことにより調整した。またアセトン
乾燥菌体は、洗浄菌体を５℃に冷却した500倍容
量のアセトン中に添加し、５分間撹拌した後、
過にて菌体を集め脱水アセトンで洗浄した後、減
圧でアセトンを留去することにより調整した。次
いでこれら３種類の乾燥菌体それぞれ50mgをアデ
ノシン２ｍＭ、DL−ホモシステイン４ｍＭ、リ
ン酸カリウムバツフアー（PH6.5）100ｍＭからな
る基質溶液１mlに懸濁し、37℃で４時間振盪して
反応させた。それぞれのSAH合成量を第２表に
示した。

【表】 実施例 ４ 実施例３と同じ培養方法及び乾燥方法で調整し
た第３表に示す各菌株の風乾菌体50mgを使用し、
実施例３と同様に反応させた。SAHの収量を第
３表に示した。

【表】 実施例 ５ 実施例３と同じ培養方法及び乾燥方法で調整し
たサツカロマイセス・セレビジエIFO 1805の風
乾菌体50mgをアデノシン10ｍＭ、Ｌ−ホモシスチ
ン10ｍＭ、リン酸カリウムバツフアー（PH8.0）
100ｍＭからなる基質溶液１mlに懸濁し、37℃で
４時間反応させた。SAHの収量は3.96μmo／ml
であつた。 実施例 ６ 実施例３と同じ方法で調整したサツカロマイセ
ス・セレビジエIFO 1805の風乾菌体200mgを10ｍ
Ｍリン酸カリウムバツフアー（PH7.0）２mlに加
えて懸濁し、氷冷したのちアクリルアミド375mg、
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド20mg、５
％のＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチレンジアミン
水溶液0.25mlを加えて溶解させ、減圧にして脱気
した後、2.5％の過硫酸アンモニウム水溶液0.25
mlを加えて氷冷下に静置した。１時間後生成した
菌体含有ゲルを細かく粉砕し、10ｍＭリン酸カリ
ウムバツフアー（PH7.0）で洗浄し菌体固定化物
を調整した。この固定化物1.9ｇをアデノシン10
ｍＭ、DL−ホモシステインｍＭ、リン酸ナナト
リウムバツフアー（PH9.0）100ｍＭからなる基質
溶液２mlに加え、30℃で８時間反応させた。
SAHの収量は1.10μmol／mlであつた。 実施例 ７ 実施例３と同じ方法で調整したサツカロマイセ
ス・セレビジエIFO 1805の風乾菌体2.5ｇをアデ
ノシン10ｍＭ、DL−ホモシステイン10ｍＭ、リ
ン酸ナトリウムバツフアー（PH9.5）100ｍＭから
なる基質溶液50mlに懸濁し、37℃で６時間反応さ
せたところ、反応液中に238μmol（90mg）のSAH
が合成された。その後、氷冷下30％過塩素酸水溶
液５mlを添加して反応を停止した後、遠心分離に
より菌体残渣などの不溶物を除去した。次いで、
得られた上清液にIMKHCO₃水溶液を添加しPH
6.0に調整し、生成した過塩素酸カリウムの沈殿
を遠心分離にて除去した。かくして得られた上清
液を強酸性陽イオン交換樹脂ダウエツクス50×８
（H⁺型）カラムに、通液したのちカラムを0.025
％チオジグリコール水溶液および0.025％チオジ
グリコール含有2N硫酸で洗浄したのち、0.025％
チオジグリコール含有6N硫酸で溶出される部分
を集めて、これに20％リンタングステン酸水溶液
を添加し、生成した沈殿物を遠心分離にて集めて
冷水で洗浄したのち、５倍容量のアセトン／水
（50／50・Ｖ／Ｖ）に溶解し、イソアミルアルコ
ール／エーテル（１／１・Ｖ／Ｖ）で抽出した
後、得られた水層にBaCO₃を加えてPHを3.9に調
整し、生成したBaSO₄をロカにて除去した上清
液を凍結乾燥したところ、白色固体物が53mg得ら
れた。シリカゲル薄層クロマトグラフイー、高速
液体クロマトグラフイー、ペーパークロマトグラ
フイー、赤外吸収スペクトル、比旋光度を測定し
たところ、この白色固体物はSAHであることが
確認された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サツカロマイセス属またはキヤンデイダ属に
   属しアデノシンとホモシステインよりＳ−アデノ
   シル−Ｌ−ホモシステインを合成する能力を有す
   る微生物の菌体の存在下にアデノシンとホモシス
   テインを水性媒体中で接触させて反応せしめ、Ｓ
   −アデノシル−Ｌ−ホモシステインを合成して採
   取することを特徴とするＳ−アデノシル−Ｌ−ホ
   モシステインの製造法。 ２ 微生物の菌体が生菌体または乾燥菌体である
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。