JPS6318465B2 - - Google Patents
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- JPS6318465B2 JPS6318465B2 JP8160081A JP8160081A JPS6318465B2 JP S6318465 B2 JPS6318465 B2 JP S6318465B2 JP 8160081 A JP8160081 A JP 8160081A JP 8160081 A JP8160081 A JP 8160081A JP S6318465 B2 JPS6318465 B2 JP S6318465B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は動物細胞用培地の血清濃度を低下さ
せ、あるいはなくすことができるものである。
せ、あるいはなくすことができるものである。
従来、動物細胞用の培地には一般に血清が多量
に添加されており、そのために種々の問題点を生
じていた。例えば、ヒト細胞を培養してインター
フエロンとかワクチン用のウイルスを生産する場
合には牛胎児血清とか仔牛血清などを培地に10％
程度添加され、その結果、培地の費用の大半をこ
の血清が占めてしまつて製品が高価なものになる
という問題点があつた。その上、血清にはマイコ
ブラズマとかウイルスによる汚染があつたり、原
因のわからないロツト差があるので、使用する血
清を事前に検定しなければならないという繁雑さ
があり、また、血清が蛋白質など多種多様な成分
を含んでいるために、培養物からインターフエロ
ンなどの生成物を分離する場合に分離精製が容易
でないことも問題であつた。そのために、最近本
発明者らはこの血清の添加量を減少させ、更には
無血清の培地を開発すべく種々検討の結果、培地
に血清アルブミンを添加すれば他の血清成分を添
加せずとも従来の血清培地に匹敵する細胞増殖を
得ることができることを見出して、その内容を特
許出願した。そして、本発明者らは更に安価で取
扱いの容易な無血清培地を開発すべく研究を進
め、培地にリノール酸、オレイン酸等の不飽和脂
肪酸やビタミンＥなどの脂溶性ビタミンをサイク
ロデキストリンに包接させて投入することによつ
て、血清アルブミンを添加しなくとも従来の血清
培地に匹敵する細胞増殖を得ることに成功した。
不飽和脂肪酸のような水に難溶性または不溶性の
栄養物を細胞障害を起さないように培地に添加す
ることは極めて困難であつたが、本発明者らはサ
イクロデキストリンを用いて包接させることによ
り、このことを初めて可能にしたのである。本発
明はサイクロデキストリンの動物細胞に対する毒
性が少なく、培地添加剤として極めて好適である
ことを見出し、これに基づいてなされたものであ
り、例えばビタミンＥ等他の脂溶性物質を培地に
添加する場合にも有用である。すなわち、本発明
はサイクロデキストリンを含有してなる動物細胞
用培地に関するものである。
に添加されており、そのために種々の問題点を生
じていた。例えば、ヒト細胞を培養してインター
フエロンとかワクチン用のウイルスを生産する場
合には牛胎児血清とか仔牛血清などを培地に10％
程度添加され、その結果、培地の費用の大半をこ
の血清が占めてしまつて製品が高価なものになる
という問題点があつた。その上、血清にはマイコ
ブラズマとかウイルスによる汚染があつたり、原
因のわからないロツト差があるので、使用する血
清を事前に検定しなければならないという繁雑さ
があり、また、血清が蛋白質など多種多様な成分
を含んでいるために、培養物からインターフエロ
ンなどの生成物を分離する場合に分離精製が容易
でないことも問題であつた。そのために、最近本
発明者らはこの血清の添加量を減少させ、更には
無血清の培地を開発すべく種々検討の結果、培地
に血清アルブミンを添加すれば他の血清成分を添
加せずとも従来の血清培地に匹敵する細胞増殖を
得ることができることを見出して、その内容を特
許出願した。そして、本発明者らは更に安価で取
扱いの容易な無血清培地を開発すべく研究を進
め、培地にリノール酸、オレイン酸等の不飽和脂
肪酸やビタミンＥなどの脂溶性ビタミンをサイク
ロデキストリンに包接させて投入することによつ
て、血清アルブミンを添加しなくとも従来の血清
培地に匹敵する細胞増殖を得ることに成功した。
不飽和脂肪酸のような水に難溶性または不溶性の
栄養物を細胞障害を起さないように培地に添加す
ることは極めて困難であつたが、本発明者らはサ
イクロデキストリンを用いて包接させることによ
り、このことを初めて可能にしたのである。本発
明はサイクロデキストリンの動物細胞に対する毒
性が少なく、培地添加剤として極めて好適である
ことを見出し、これに基づいてなされたものであ
り、例えばビタミンＥ等他の脂溶性物質を培地に
添加する場合にも有用である。すなわち、本発明
はサイクロデキストリンを含有してなる動物細胞
用培地に関するものである。
サイクロデキストリンには、α−サイクロデキ
ストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイ
クロデキストリンなどであり、本発明の培地には
いずれも適用できるが、細胞に対する毒性がない
点でα−サイクロデキストリンが最も好ましい。
サイクロデキストリンは、例えば医薬の製剤など
に一般にβ−サイクロデキストリンが用いられて
いるが、このサイクロデキストリンは細胞毒性が
あるので高濃度で用いる本発明の培地にはあまり
好適でない。
ストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイ
クロデキストリンなどであり、本発明の培地には
いずれも適用できるが、細胞に対する毒性がない
点でα−サイクロデキストリンが最も好ましい。
サイクロデキストリンは、例えば医薬の製剤など
に一般にβ−サイクロデキストリンが用いられて
いるが、このサイクロデキストリンは細胞毒性が
あるので高濃度で用いる本発明の培地にはあまり
好適でない。
本発明においてサイクロデキストリンは、脂溶
性物質を培地に添加しあるいは特定物質の細胞毒
作用を減殺する手段として用いるものであり、培
地に添加しようとする物質に広く適用できる。脂
溶性物質の例として、リノール酸、リノレイン
酸、オレイン酸、アラキドン酸、エルシン酸等の
各種不飽和脂肪酸類、パルミチン酸、ステアリン
酸等の各種飽和脂肪酸類、これらのグリセライド
類、α−トコフエロール、β−トコフエロール等
の各種トコフエロール類、ビタミンＡ，Ｄなどの
脂溶性ビタミン類などを挙げることができる。
性物質を培地に添加しあるいは特定物質の細胞毒
作用を減殺する手段として用いるものであり、培
地に添加しようとする物質に広く適用できる。脂
溶性物質の例として、リノール酸、リノレイン
酸、オレイン酸、アラキドン酸、エルシン酸等の
各種不飽和脂肪酸類、パルミチン酸、ステアリン
酸等の各種飽和脂肪酸類、これらのグリセライド
類、α−トコフエロール、β−トコフエロール等
の各種トコフエロール類、ビタミンＡ，Ｄなどの
脂溶性ビタミン類などを挙げることができる。
サイクロデキストリンはそのまま培地に投入し
てよい場合もあるが、通例は予め脂溶性物質と反
応させてから培地に添加する。反応方法として
は、例えばサイクロデキストリンを水溶液とし、
これに脂溶性物質を親水性有機溶媒に溶かしてか
ら添加して加温すればよい。反応終了後は、通例
は反応生成物を反応液から分離して培地に投入す
る。分離方法としては例えば反応液を冷却すれば
反応生成物が沈澱してくるからこれを分離すれば
よい。反応生成物は、通常はサイクロデキストリ
ンが脂溶性物質を内部に包接した、いわゆる包接
化合物である。
てよい場合もあるが、通例は予め脂溶性物質と反
応させてから培地に添加する。反応方法として
は、例えばサイクロデキストリンを水溶液とし、
これに脂溶性物質を親水性有機溶媒に溶かしてか
ら添加して加温すればよい。反応終了後は、通例
は反応生成物を反応液から分離して培地に投入す
る。分離方法としては例えば反応液を冷却すれば
反応生成物が沈澱してくるからこれを分離すれば
よい。反応生成物は、通常はサイクロデキストリ
ンが脂溶性物質を内部に包接した、いわゆる包接
化合物である。
サイクロデキストリンの添加量は添加する目的
によつて異なるが、脂溶性物質と反応させて包接
化合物の形で添加する場合には、脂溶性物質の３
〜500倍モル程度、普通は10〜100倍モル程度のサ
イクロデキストリンを脂溶性物質と接触させて包
接化合物を形成させればよい。
によつて異なるが、脂溶性物質と反応させて包接
化合物の形で添加する場合には、脂溶性物質の３
〜500倍モル程度、普通は10〜100倍モル程度のサ
イクロデキストリンを脂溶性物質と接触させて包
接化合物を形成させればよい。
動物細胞用培地には従来血清の添加が必須とさ
れ、本発明者らが先に開発した無血清培地におい
ても少なくとも血清成分である血清アルブミンの
添加が必須であつたが、本発明の培地においてリ
ノール酸を予めα−サイクロデキストリンと反応
させてから添加すれば、血清あるいは血清アルブ
ミンのいずれも添加しなくとも従来の血清培地に
匹敵する細胞増殖を行なわせることができインタ
ーフエロン等の有用物質の産生を行なわせること
ができる。この場合、オレイン酸、リノレイン酸
等の不飽和脂肪酸あるいはビタミンＥとサイクロ
デキストリンとの反応物を併用すれば細胞増殖及
び有用物質の産生を更に高めることができる。ま
た、このビタミンＥのサイクロデキストリンとの
反応物は単独でも細胞増殖を促進させ、あるいは
インターフエロン等の有用物質の産生を促進する
効果がある。
れ、本発明者らが先に開発した無血清培地におい
ても少なくとも血清成分である血清アルブミンの
添加が必須であつたが、本発明の培地においてリ
ノール酸を予めα−サイクロデキストリンと反応
させてから添加すれば、血清あるいは血清アルブ
ミンのいずれも添加しなくとも従来の血清培地に
匹敵する細胞増殖を行なわせることができインタ
ーフエロン等の有用物質の産生を行なわせること
ができる。この場合、オレイン酸、リノレイン酸
等の不飽和脂肪酸あるいはビタミンＥとサイクロ
デキストリンとの反応物を併用すれば細胞増殖及
び有用物質の産生を更に高めることができる。ま
た、このビタミンＥのサイクロデキストリンとの
反応物は単独でも細胞増殖を促進させ、あるいは
インターフエロン等の有用物質の産生を促進する
効果がある。
血清アルブミンの代替としてリノール酸とα−
サイクロデキストリンとの反応物を加える場合に
はリノール酸の濃度として0.1〜５mg／程度、
特に0.5〜２mg／程度が適当である。この濃度
以上では細胞増殖阻害作用があらわれるが、α−
サイクロデキストリンを別途300〜1000mg／程
度加えれば、この細胞増殖阻害作用があらわれる
濃度の下限を10mg／程度まで高めることができ
る。オレイン酸、リノレイン酸、パルミチン酸、
ステアリン酸等のリノール酸以外の脂肪酸のα−
サイクロデキストリンとの反応物の添加量は脂肪
酸の濃度として0.1〜１mg／程度が適当である。
サイクロデキストリンとの反応物を加える場合に
はリノール酸の濃度として0.1〜５mg／程度、
特に0.5〜２mg／程度が適当である。この濃度
以上では細胞増殖阻害作用があらわれるが、α−
サイクロデキストリンを別途300〜1000mg／程
度加えれば、この細胞増殖阻害作用があらわれる
濃度の下限を10mg／程度まで高めることができ
る。オレイン酸、リノレイン酸、パルミチン酸、
ステアリン酸等のリノール酸以外の脂肪酸のα−
サイクロデキストリンとの反応物の添加量は脂肪
酸の濃度として0.1〜１mg／程度が適当である。
ビタミンＥとα−サイクロデキストリンとの反
応物を血清アルブミンが存在しない培地に添加す
るときはビタミンＥの重量で0.5〜10mg／程度、
特に１〜５mg／程度が適当である。
応物を血清アルブミンが存在しない培地に添加す
るときはビタミンＥの重量で0.5〜10mg／程度、
特に１〜５mg／程度が適当である。
一方、不飽和脂肪酸でなく血清アルブミンを用
いる場合には、結晶アルブミンやコーン（Cohn）
のフラクシヨンＶなどの市販品をそのまま用いる
ことができる。添加量としては0.1〜１重量％程
度が適当である。
いる場合には、結晶アルブミンやコーン（Cohn）
のフラクシヨンＶなどの市販品をそのまま用いる
ことができる。添加量としては0.1〜１重量％程
度が適当である。
他の培地成分としては、無血清培地の場合に
は、インシユリンとかヒトトランスフエリンの如
き細胞増殖因子およびヒポキサンチン、チミジ
ン、デオキシアデノシン、デオキシシチジンの如
き核酸前駆体を含み、更に、グルコースの如き糖
源、アミノ酸、ビタミン類、無機塩および通常の
細胞増殖用の血清培地に含まれるその他の栄養源
を含む。
は、インシユリンとかヒトトランスフエリンの如
き細胞増殖因子およびヒポキサンチン、チミジ
ン、デオキシアデノシン、デオキシシチジンの如
き核酸前駆体を含み、更に、グルコースの如き糖
源、アミノ酸、ビタミン類、無機塩および通常の
細胞増殖用の血清培地に含まれるその他の栄養源
を含む。
細胞増殖因子の濃度としては１〜100mg／程
度、そして核酸前駆体の濃度は0.01〜50mg／程
度が適当である。細胞増殖因子及び核酸前駆体は
いずれも培養する細胞の種類に応じて１種又２種
以上を適宜組合せて用いる。
度、そして核酸前駆体の濃度は0.01〜50mg／程
度が適当である。細胞増殖因子及び核酸前駆体は
いずれも培養する細胞の種類に応じて１種又２種
以上を適宜組合せて用いる。
糖源としては通常グルコースが用いられ、濃度
としては0.5〜10ｇ／程度がよい。そのほか、
ピルビン酸などを適宜加える。アミノ酸は蛋白質
構成成分アミノ酸であつて、例えば、アラニン、
アルギニン、グルタミン、シスチン、スレオニ
ン、リジン、バリン、フエニルアラニンの如きも
のである。血清培地においては、必須アミノ酸を
中心として添加しているが無血清培地においては
必須アミノ酸のみでなく非必須アミノ酸も巾広く
添加するのがよい。全アミノ酸の濃度としては
0.5〜５ｇ／程度がよい。アミノ酸の組成とし
ては、通常の血清用培地を参考にしてこれに新た
なアミノ酸を補充していくのがよい。ビタミン類
にはアスコルビン酸、リボフラビン、チアミン塩
酸塩、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミ
ド、ピリドキサール塩酸塩、ｉ−イノシトール、
葉酸、VB12、ビチオンなど、そして無機塩とし
ては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、亜セレン酸ナトリウ
ムなどを例として挙げることができる。これらビ
タミン類と無機塩は通常の血清用培地を参考にし
てこれに適宜添加していくのがよい。その他、重
酒石酸コリン、グルタチオン、プトレシン二塩酸
塩などの代謝中間体や、重曹、β−グリセロリン
酸二ナトリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸などのバツフ
アーを適宜添加する。
としては0.5〜10ｇ／程度がよい。そのほか、
ピルビン酸などを適宜加える。アミノ酸は蛋白質
構成成分アミノ酸であつて、例えば、アラニン、
アルギニン、グルタミン、シスチン、スレオニ
ン、リジン、バリン、フエニルアラニンの如きも
のである。血清培地においては、必須アミノ酸を
中心として添加しているが無血清培地においては
必須アミノ酸のみでなく非必須アミノ酸も巾広く
添加するのがよい。全アミノ酸の濃度としては
0.5〜５ｇ／程度がよい。アミノ酸の組成とし
ては、通常の血清用培地を参考にしてこれに新た
なアミノ酸を補充していくのがよい。ビタミン類
にはアスコルビン酸、リボフラビン、チアミン塩
酸塩、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミ
ド、ピリドキサール塩酸塩、ｉ−イノシトール、
葉酸、VB12、ビチオンなど、そして無機塩とし
ては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、亜セレン酸ナトリウ
ムなどを例として挙げることができる。これらビ
タミン類と無機塩は通常の血清用培地を参考にし
てこれに適宜添加していくのがよい。その他、重
酒石酸コリン、グルタチオン、プトレシン二塩酸
塩などの代謝中間体や、重曹、β−グリセロリン
酸二ナトリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸などのバツフ
アーを適宜添加する。
培地組成の決定に参考とすべき基礎培地の例と
しては、ダルベツコ変法イーグル培地
（Dulbeco′s Modified Eagle Medium）、RPMI
−1640培地、イーグル基礎培地（Eaglc′s
Minimum Eagsential Medium）、Ham Ｆ−12
培地などを挙げることができる。
しては、ダルベツコ変法イーグル培地
（Dulbeco′s Modified Eagle Medium）、RPMI
−1640培地、イーグル基礎培地（Eaglc′s
Minimum Eagsential Medium）、Ham Ｆ−12
培地などを挙げることができる。
無血清培地の作成方法としては、例えばサイク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸との反応物あるい
は血清アルブミンを除くすべての成分を所定の濃
度になるように水に溶解してから、これにサイク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸との反応物又は血
清アルブミンを添加して溶解し、得られた溶液を
メンブレンフイルターで加圧下に濾過して滅菌す
ればよい。このような培地にサイクロデキストリ
ン単独あるいはサイクロデキストリンの例えばビ
タミンＥとの反応物を添加する場合には、サイク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸との反応物あるい
は血清アルブミンと一緒に加えればよい。
ロデキストリンと不飽和脂肪酸との反応物あるい
は血清アルブミンを除くすべての成分を所定の濃
度になるように水に溶解してから、これにサイク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸との反応物又は血
清アルブミンを添加して溶解し、得られた溶液を
メンブレンフイルターで加圧下に濾過して滅菌す
ればよい。このような培地にサイクロデキストリ
ン単独あるいはサイクロデキストリンの例えばビ
タミンＥとの反応物を添加する場合には、サイク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸との反応物あるい
は血清アルブミンと一緒に加えればよい。
血清培地の場合には公知の培地にサイクロデキ
ストリンを単独あるいは添加目的物との反応物を
培地に添加して濾過滅菌すればよい。この場合、
添加物の種類によつては他の培地成分の至適濃度
が変動することもある。
ストリンを単独あるいは添加目的物との反応物を
培地に添加して濾過滅菌すればよい。この場合、
添加物の種類によつては他の培地成分の至適濃度
が変動することもある。
本発明の培地で培養しうる動物細胞は特に限定
されるものではなく、リンパ球系細胞、繊維芽細
胞、上皮性細胞、これらのトランスフオーム細
胞、ガン細胞等に広く適用できる。このような細
胞の例として、Epstein−Barr Virus（EBV）で
トランスフオームしたヒトリンパ芽球様細胞
UMCL、同C5180Y、ヒトバーキツトリンパ腫由
来のナマルバ細胞、マウスリンパ球由来のハイブ
リドーマであるSPI細胞、ヒト繊維芽細胞HEL、
同IMR−90、ヒトガン由来上皮性細胞HeLa−
S3、同Hep−２、同KB、ヒト初代リンパ球、ラ
ツト吉田肉腫細胞、ハムスター繊維芽細胞BHK
−21、マウス繊維芽細胞3T3、マウスリンパ腫瘍
細胞YAC−１などを挙げることができる。
されるものではなく、リンパ球系細胞、繊維芽細
胞、上皮性細胞、これらのトランスフオーム細
胞、ガン細胞等に広く適用できる。このような細
胞の例として、Epstein−Barr Virus（EBV）で
トランスフオームしたヒトリンパ芽球様細胞
UMCL、同C5180Y、ヒトバーキツトリンパ腫由
来のナマルバ細胞、マウスリンパ球由来のハイブ
リドーマであるSPI細胞、ヒト繊維芽細胞HEL、
同IMR−90、ヒトガン由来上皮性細胞HeLa−
S3、同Hep−２、同KB、ヒト初代リンパ球、ラ
ツト吉田肉腫細胞、ハムスター繊維芽細胞BHK
−21、マウス繊維芽細胞3T3、マウスリンパ腫瘍
細胞YAC−１などを挙げることができる。
この培地を用いて動物細胞を培養する方法は一
般に血清培地を用いて培養する従来の方法に準じ
て行なえばよいが、例えば培養タンクに本発明の
培地を入れて細胞を104〜106セル／ml程度加え、
CO2を４〜６容量％含む空気を通気しつつ35〜37
℃で培養すればよい。繊維芽細胞を、特に無血清
培地で培養する場合には５〜10容量％程度の低酸
素濃度にするのがよい。
般に血清培地を用いて培養する従来の方法に準じ
て行なえばよいが、例えば培養タンクに本発明の
培地を入れて細胞を104〜106セル／ml程度加え、
CO2を４〜６容量％含む空気を通気しつつ35〜37
℃で培養すればよい。繊維芽細胞を、特に無血清
培地で培養する場合には５〜10容量％程度の低酸
素濃度にするのがよい。
本発明の培地は細胞増殖用のみならず細胞を培
養してインターフエロン、リンフオカイン、抗体
などの各種有用物質を産生させる場合にも適用で
きることはいうまでもない。
養してインターフエロン、リンフオカイン、抗体
などの各種有用物質を産生させる場合にも適用で
きることはいうまでもない。
本発明の培地はサイクロデキストリンの細胞毒
性が低く、また化合物をサイクロデキストリンで
包接して培地に投入しても細胞増殖促進作用、有
用物質産生促進作用等を発揮することを見出して
完成されたものであり、培地に添加する物質をサ
イクロデキストリンで包接することによつてその
水溶性及び安定性を高め、そのことによつて水に
難不溶性物質とか培地中で不安定な物質も新たに
培地成分として活用しうるようにしたものであ
る。すなわち、本発明は培地成分及び組成を検討
する範囲を広げるものであり、新たな培地の開発
に大いなる貢献をなすものである。
性が低く、また化合物をサイクロデキストリンで
包接して培地に投入しても細胞増殖促進作用、有
用物質産生促進作用等を発揮することを見出して
完成されたものであり、培地に添加する物質をサ
イクロデキストリンで包接することによつてその
水溶性及び安定性を高め、そのことによつて水に
難不溶性物質とか培地中で不安定な物質も新たに
培地成分として活用しうるようにしたものであ
る。すなわち、本発明は培地成分及び組成を検討
する範囲を広げるものであり、新たな培地の開発
に大いなる貢献をなすものである。
例えば、リノール酸をそのまま培地に添加した
場合には１mg／以下の低濃度では細胞増殖効果
がほとんどなく、一方、この濃度以上では細胞毒
性が大きくなつてやはり細胞増殖を充分に行なわ
せることができない。ところがこのリノール酸を
α−サイクロデキストリンと反応させてから添加
すれば細胞毒性のあらわれる濃度が10mg／程度
にまで高められてそれ以下の濃度で細胞増殖、更
にはインターフエロン等の有用物質の産生を充分
に行なわせることができ、そのことによつて従来
動物細胞培地で必須とされていた高価でかつ原料
に制約のある血清及び血清アルブミンを培地成分
から除くことができた。そして、この血清及び血
清アルブミンを排除したことによつて蛋白質をほ
とんど含まない培地を完成するに至り、培地をオ
ートクレーブで殺菌する可能性を開いた。また、
このような培地においては血清とか血清アルブミ
ンが極めて低下し得ることから、培地中に蓄積さ
れた目的物質の分離精製が容易になり、また培地
の量産化がより容易になつた。繊維芽細胞を血清
アルブミン培地で培養する際には特別な手段を講
じなければ高価なフアイブロネクチンを培地に添
加する必要があつたが、リノール酸とα−サイク
ロデキストリンとの反応物を添加した培地におい
てはこのフアイブロネクチンの添加も不要である
ことが判明した。
場合には１mg／以下の低濃度では細胞増殖効果
がほとんどなく、一方、この濃度以上では細胞毒
性が大きくなつてやはり細胞増殖を充分に行なわ
せることができない。ところがこのリノール酸を
α−サイクロデキストリンと反応させてから添加
すれば細胞毒性のあらわれる濃度が10mg／程度
にまで高められてそれ以下の濃度で細胞増殖、更
にはインターフエロン等の有用物質の産生を充分
に行なわせることができ、そのことによつて従来
動物細胞培地で必須とされていた高価でかつ原料
に制約のある血清及び血清アルブミンを培地成分
から除くことができた。そして、この血清及び血
清アルブミンを排除したことによつて蛋白質をほ
とんど含まない培地を完成するに至り、培地をオ
ートクレーブで殺菌する可能性を開いた。また、
このような培地においては血清とか血清アルブミ
ンが極めて低下し得ることから、培地中に蓄積さ
れた目的物質の分離精製が容易になり、また培地
の量産化がより容易になつた。繊維芽細胞を血清
アルブミン培地で培養する際には特別な手段を講
じなければ高価なフアイブロネクチンを培地に添
加する必要があつたが、リノール酸とα−サイク
ロデキストリンとの反応物を添加した培地におい
てはこのフアイブロネクチンの添加も不要である
ことが判明した。
また、ビタミンＥなどの脂溶性ビタミンは従来
から細胞にとつて必要であると考えられていなが
らよい添加手段がなかつたが、本発明によつてこ
れらの栄養物も必要量を培地に添加できるように
なつた。
から細胞にとつて必要であると考えられていなが
らよい添加手段がなかつたが、本発明によつてこ
れらの栄養物も必要量を培地に添加できるように
なつた。
尚、以下の実施例及びUMCL細胞製造例にお
けるインターフエロンの活性は、ヒト羊膜由来の
FL細胞とVSV（Vesicular Stomatitis Virus）を
用いる細胞変性抑制法（飯塚雅彦ら、最近医学、
29巻、660頁（1974））で測定した。
けるインターフエロンの活性は、ヒト羊膜由来の
FL細胞とVSV（Vesicular Stomatitis Virus）を
用いる細胞変性抑制法（飯塚雅彦ら、最近医学、
29巻、660頁（1974））で測定した。
UMCL細胞製造例
新生児より切りはなされた臍帯より約20mlの血
液を無菌的にヘパリン採血し、すみやかにフイコ
ール・アイソパツクを用いる比重遠心法でリンパ
球区分を分画した。このリンパ球区分に３倍量の
Eagle MEM（Minimum Essential Medium）培
地（日水製薬(株)製）を加えて遠心分離し、上清液
を棄却する洗浄を３回繰返した後、10v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地（日水製薬
(株)製）に洗浄したリンパ球細胞を有核細胞密度と
して３×106個／mlになるように添加して浮遊さ
せた。このリンパ球浮遊液にＢ−95−８細胞で増
殖させたEBVを５×105TD50／mlになるように加
え、37℃で２時間培養した後遠心分離によつて細
胞を集め、Eagle MEM培地を添加して遠心分離
し上清液を棄却する洗浄を３回繰返した。洗浄し
た細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血清を含むRPMI
−1640培地に３×106個／mlになるように植込み、
36〜37℃、5v／ｖ％CO2の条件で培養を行つた。
培養は1.5ケ月間続け、その間５日毎に、10v／ｖ
％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地を等量ず
つ加えるか、あるいはこの培地と半量の培地交換
を行うののいずれかを行つた。
液を無菌的にヘパリン採血し、すみやかにフイコ
ール・アイソパツクを用いる比重遠心法でリンパ
球区分を分画した。このリンパ球区分に３倍量の
Eagle MEM（Minimum Essential Medium）培
地（日水製薬(株)製）を加えて遠心分離し、上清液
を棄却する洗浄を３回繰返した後、10v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地（日水製薬
(株)製）に洗浄したリンパ球細胞を有核細胞密度と
して３×106個／mlになるように添加して浮遊さ
せた。このリンパ球浮遊液にＢ−95−８細胞で増
殖させたEBVを５×105TD50／mlになるように加
え、37℃で２時間培養した後遠心分離によつて細
胞を集め、Eagle MEM培地を添加して遠心分離
し上清液を棄却する洗浄を３回繰返した。洗浄し
た細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血清を含むRPMI
−1640培地に３×106個／mlになるように植込み、
36〜37℃、5v／ｖ％CO2の条件で培養を行つた。
培養は1.5ケ月間続け、その間５日毎に、10v／ｖ
％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地を等量ず
つ加えるか、あるいはこの培地と半量の培地交換
を行うののいずれかを行つた。
臍帯血３例について、このような処理を行い、
各細胞のトランスフオーム後についてIFの自発
的産生量を測定した結果を下表に示す。尚、この
産生量は、各々の細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血
清を含むRPMI−1640培地に５×105個／mlにな
るように植込み、5v／ｖ％CO237℃の条件下で５
日間培養した後、培養上清液の活性を測定して得
られたものである。 IF活性×103U／ml UMCL−１ 2.5 臍帯血 〃 −２ 6.1 リンパ球 〃 −３ 4.5 実施例 １ 塩化ナトリウム …6400.0mg／ 塩化カリウム …400.0 〃 塩化カルシウム（無水） …200.0 〃 硫酸マグネシウム（無水） …97.7 〃 リン酸二水素ナトリウム（２水和物）
…125.0 〃 硫酸第二鉄（９水和物） …0.1 〃 ブドウ糖 …1000.0 〃 ピルビン酸ナトリウム …110.0 〃 Ｌ−アルギニン塩酸塩 …84.0 〃 Ｌ−シスチン二塩酸塩 …62.6 〃 グリシン …30.0 〃 Ｌ−グルタミン …584.0 〃 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（１水和物）
…42.0 〃 Ｌ−イソロイシン …104.8 〃 Ｌ−ロイシン …104.8 〃 Ｌ−リジン塩酸塩 …146.2 〃 Ｌ−メチオニン …30.0 〃 Ｌ−フエニルアラニン …66.0 〃 Ｌ−セリン …42.0 〃 Ｌ−スレオニン …95.2 〃 Ｌ−トリプトフアン …16.0 〃 Ｌ−チロシン二ナトリウム …89.5 〃 Ｌ−バリン …93.6 〃 重酒石酸コリン …7.2 〃 葉 酸 …4.0 〃 ニコチン酸アミド …4.0 〃 パントテン酸カルシウム …4.0 〃 ピリドキサール塩酸塩 …4.0 〃 リボフラビン …0.4 〃 チアミン塩酸塩 …4.0 〃 ｉ−イノシトール …7.2 〃 フエノールレツド …5.0 〃 上記の如き組成を有するダルベツコ変法イーグ
ル培地（Dulbecco′s Modified Eagle Medium）
に下記の如き成分を添加して溶解し、RITC56−
１培地を得た。
各細胞のトランスフオーム後についてIFの自発
的産生量を測定した結果を下表に示す。尚、この
産生量は、各々の細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血
清を含むRPMI−1640培地に５×105個／mlにな
るように植込み、5v／ｖ％CO237℃の条件下で５
日間培養した後、培養上清液の活性を測定して得
られたものである。 IF活性×103U／ml UMCL−１ 2.5 臍帯血 〃 −２ 6.1 リンパ球 〃 −３ 4.5 実施例 １ 塩化ナトリウム …6400.0mg／ 塩化カリウム …400.0 〃 塩化カルシウム（無水） …200.0 〃 硫酸マグネシウム（無水） …97.7 〃 リン酸二水素ナトリウム（２水和物）
…125.0 〃 硫酸第二鉄（９水和物） …0.1 〃 ブドウ糖 …1000.0 〃 ピルビン酸ナトリウム …110.0 〃 Ｌ−アルギニン塩酸塩 …84.0 〃 Ｌ−シスチン二塩酸塩 …62.6 〃 グリシン …30.0 〃 Ｌ−グルタミン …584.0 〃 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（１水和物）
…42.0 〃 Ｌ−イソロイシン …104.8 〃 Ｌ−ロイシン …104.8 〃 Ｌ−リジン塩酸塩 …146.2 〃 Ｌ−メチオニン …30.0 〃 Ｌ−フエニルアラニン …66.0 〃 Ｌ−セリン …42.0 〃 Ｌ−スレオニン …95.2 〃 Ｌ−トリプトフアン …16.0 〃 Ｌ−チロシン二ナトリウム …89.5 〃 Ｌ−バリン …93.6 〃 重酒石酸コリン …7.2 〃 葉 酸 …4.0 〃 ニコチン酸アミド …4.0 〃 パントテン酸カルシウム …4.0 〃 ピリドキサール塩酸塩 …4.0 〃 リボフラビン …0.4 〃 チアミン塩酸塩 …4.0 〃 ｉ−イノシトール …7.2 〃 フエノールレツド …5.0 〃 上記の如き組成を有するダルベツコ変法イーグ
ル培地（Dulbecco′s Modified Eagle Medium）
に下記の如き成分を添加して溶解し、RITC56−
１培地を得た。
インシユリン …10mg／
ヒトトランスフエリン …５ 〃
ヒポキサンチン …４ 〃
チミジン …0.7 〃
デオキシシチジン …0.03 〃
デオキシアデノシン …1.0 〃
６，８−ジヒドロキシプリン …0.3 〃
グルコース …1000 〃
マンノース …500 〃
ガラクトース …500 〃
レシチン …2.5 〃
コレステロール …１ 〃
Ｌ−アラニン …20 〃
Ｌ−アスパラギン（１水和物） …56 〃
Ｌ−アスパラギン酸 …20 〃
Ｌ−システイン塩酸塩（１水和物）…40 〃
Ｌ−グルタミン酸 …20 〃
Ｌ−プロリン …20 〃
アスコルビン酸 …10 〃
ビオチン …0.2 〃
ホリニン酸 …0.01 〃
VB12 …0.1 〃
FeSO4・7H2O …0.8 〃
ZnSO4・7H2O …0.02 〃
Na2SeO3 …0.004 〃
CaCl2 …100 〃
グルタチオン …1.0 〃
プトレシン二塩酸塩 …0.1 〃
β−グリセロリン酸二ナトリウム…1500 〃
重 曹 …1300 〃
α−サイクロデキストリン（α−CD）とリノ
ール酸との反応物、オレイン酸との反応物及びビ
タミンＥ（VE）との反応物は次のようにして調製
した。すなわち、α−サイクロデキストリン（半
井化学製）１ｇを７mlの水に溶解してこれに10mg
のリノール酸、オレイン酸又はビタミンＥをエタ
ノール７mlに溶解した液を加え、窒素ガスを通気
しつつ70℃まで加温した。液が透明になつたら直
ちに室温下で放冷し、さらに４℃で20時間冷却し
た。析出した沈澱物を遠心分離して10mlのエタノ
ールで１回洗浄し、減圧乾燥した。この粉末を石
油エーテル10mlで２回洗浄して減圧乾燥した。
ール酸との反応物、オレイン酸との反応物及びビ
タミンＥ（VE）との反応物は次のようにして調製
した。すなわち、α−サイクロデキストリン（半
井化学製）１ｇを７mlの水に溶解してこれに10mg
のリノール酸、オレイン酸又はビタミンＥをエタ
ノール７mlに溶解した液を加え、窒素ガスを通気
しつつ70℃まで加温した。液が透明になつたら直
ちに室温下で放冷し、さらに４℃で20時間冷却し
た。析出した沈澱物を遠心分離して10mlのエタノ
ールで１回洗浄し、減圧乾燥した。この粉末を石
油エーテル10mlで２回洗浄して減圧乾燥した。
前記のRITC56−１培地に第１〜３図記載のα
−サイクロデキストリン反応物あるいはα−サイ
クロデキストリンとその反応物との混合物を加え
て、得られた溶液をメンブレンフイルターで濾過
滅菌した。このようにして調製した培地にいずれ
もUMCL−３細胞を５×105セル／mlになるよう
に添加してCO2を５容量％含む空気を通気しつつ
37℃で５日間培養した。
−サイクロデキストリン反応物あるいはα−サイ
クロデキストリンとその反応物との混合物を加え
て、得られた溶液をメンブレンフイルターで濾過
滅菌した。このようにして調製した培地にいずれ
もUMCL−３細胞を５×105セル／mlになるよう
に添加してCO2を５容量％含む空気を通気しつつ
37℃で５日間培養した。
培養液の細胞濃度及びインターフエロンの産生
量を測定した結果を第１〜３図に示す。また、α
−サイクロデキストリンとリノール酸との反応物
を300mg／としてこれにα−サイクロデキスト
リンを各種濃度で添加した場合を第４図に示す。
いずれの図においても黒丸は細胞濃度をそして白
丸はインターフエロンの産生量をあらわしてい
る。
量を測定した結果を第１〜３図に示す。また、α
−サイクロデキストリンとリノール酸との反応物
を300mg／としてこれにα−サイクロデキスト
リンを各種濃度で添加した場合を第４図に示す。
いずれの図においても黒丸は細胞濃度をそして白
丸はインターフエロンの産生量をあらわしてい
る。
対照例として、RPMI−1640培地の牛胎児血清
（FBS）を10容量％加えた場合について同様に培
養して得られた結果を第１〜４図右側に示す。
（FBS）を10容量％加えた場合について同様に培
養して得られた結果を第１〜４図右側に示す。
実施例 ２
MEM培地（Minimum Essential Medium、
日水製薬(株)製） …9400mg／ Ｌ−アスパラギン酸 …13.3 〃 Ｌ−グルタミン …292 〃 グリシン …7.5 〃 Ｌ−グルタミン酸 …0.15 〃 Ｌ−プロリン …3.5 〃 Ｌ−セリン …10.5 〃 ホリニン酸 …0.00005 〃 ３，3′，５−トリヨード−Ｌ−チロニン
…0.0002 〃 マウス−EGF …0.01 〃 ヒトトランスフエリン …10 〃 インシユリン …１ 〃 VB12 …0.02 〃 ビオチン …0.02 〃 プトレシン二塩酸塩 …0.02 〃 ピルビン酸ナトリウム …110 〃 塩化コリン …16 〃 チミジン …0.07 〃 ヒポキサンチン …0.24 〃 CuSO4・5H2O …0.0000025 〃 FeSO4・7H2O …0.8 〃 MnSO4・7H2O …0.0000024 〃 （NH4）6Mo7O24・H2O …0.0012 〃 NiCl2・6H2O …0.000012 〃 NH4VO3 …0.000058 〃 H2SeO3 …0.00039 〃 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２ −エタンスルホン酸 …3300 〃 NaOH …300 〃 NaHCO3 …1400 〃 上記のような組成を有するRITC80−７培地に
実施例１と同様にして調製した第５図記載のα−
サイクロデキストリン反応物を加えて、得られた
溶液をメンブレンフイルターで濾過滅菌して直径
35mmのシヤーレ（Lux社製）に1.5ml宛分注した。
日水製薬(株)製） …9400mg／ Ｌ−アスパラギン酸 …13.3 〃 Ｌ−グルタミン …292 〃 グリシン …7.5 〃 Ｌ−グルタミン酸 …0.15 〃 Ｌ−プロリン …3.5 〃 Ｌ−セリン …10.5 〃 ホリニン酸 …0.00005 〃 ３，3′，５−トリヨード−Ｌ−チロニン
…0.0002 〃 マウス−EGF …0.01 〃 ヒトトランスフエリン …10 〃 インシユリン …１ 〃 VB12 …0.02 〃 ビオチン …0.02 〃 プトレシン二塩酸塩 …0.02 〃 ピルビン酸ナトリウム …110 〃 塩化コリン …16 〃 チミジン …0.07 〃 ヒポキサンチン …0.24 〃 CuSO4・5H2O …0.0000025 〃 FeSO4・7H2O …0.8 〃 MnSO4・7H2O …0.0000024 〃 （NH4）6Mo7O24・H2O …0.0012 〃 NiCl2・6H2O …0.000012 〃 NH4VO3 …0.000058 〃 H2SeO3 …0.00039 〃 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２ −エタンスルホン酸 …3300 〃 NaOH …300 〃 NaHCO3 …1400 〃 上記のような組成を有するRITC80−７培地に
実施例１と同様にして調製した第５図記載のα−
サイクロデキストリン反応物を加えて、得られた
溶液をメンブレンフイルターで濾過滅菌して直径
35mmのシヤーレ（Lux社製）に1.5ml宛分注した。
これに、MEM培地（日水製薬(株)製）にFBSを
10容量％添加した培地で44代継代したヒト胎児肺
由来の二倍体繊維芽細胞（Human Embryonic
Lung Diploid Fibroblast，HEL）を２×104セ
ル／シヤーレになるように播いて、CO2を５容量
％含むO2 ７容量％の低酸素濃度空気を通気しつ
つ37℃で５日間培養した。
10容量％添加した培地で44代継代したヒト胎児肺
由来の二倍体繊維芽細胞（Human Embryonic
Lung Diploid Fibroblast，HEL）を２×104セ
ル／シヤーレになるように播いて、CO2を５容量
％含むO2 ７容量％の低酸素濃度空気を通気しつ
つ37℃で５日間培養した。
培養後シヤーレ毎の細胞数を測定した結果を第
５図に示す。図中、FAはリノール酸とオレイン
酸の等量混合物をあらわしている。
５図に示す。図中、FAはリノール酸とオレイン
酸の等量混合物をあらわしている。
対照例として、MEM培地にFBSを10容量％添
加した培地を用いて同様に培養した結果を第５図
右側に示す。
加した培地を用いて同様に培養した結果を第５図
右側に示す。
実施例 ３
RITC56−１培地よりマンノース、ガラクトー
ス、レシチン、およびコレステロールを除いた
RITC55−９培地に第６図記載量のα−サイクロ
デキストリン又はβ−サイクロデキストリンを加
えて得られた溶液をメンブレンフイルターで濾過
滅菌した。これらの各培地にUMCL−３細胞を
５×105セル／mlになるように添加してCO2を５
容量％含む空気を通気しつつ37℃で４日間培養し
た。培養液の細胞濃度とサイクロデキストリンの
濃度との関係を第６図に示す。図中黒丸はα−サ
イクロデキストリンを、そして黒四角はβ−サイ
クロデキストリンをあらわしている。
ス、レシチン、およびコレステロールを除いた
RITC55−９培地に第６図記載量のα−サイクロ
デキストリン又はβ−サイクロデキストリンを加
えて得られた溶液をメンブレンフイルターで濾過
滅菌した。これらの各培地にUMCL−３細胞を
５×105セル／mlになるように添加してCO2を５
容量％含む空気を通気しつつ37℃で４日間培養し
た。培養液の細胞濃度とサイクロデキストリンの
濃度との関係を第６図に示す。図中黒丸はα−サ
イクロデキストリンを、そして黒四角はβ−サイ
クロデキストリンをあらわしている。
第１図はリンパ芽球様細胞についてα−サイク
ロデキストリン（α−CD）とリノール酸との反
応物又はオレイン酸との反応物を各種濃度で添加
した場合の、そして第２図はこれらの反応物の混
合物（α−CD・FA）を各種濃度で添加した場合
の、いずれも培養液の細胞濃度及びインターフエ
ロンの産生量の変化を示すものである。第３図は
α−CDとビタミンＥ（VE）との反応物又はこれ
にオレイン酸の反応物とリノール酸の反応物との
等量混合物を各種濃度で添加した場合の培養液の
細胞濃度及びインターフエロンの産生量の変化を
示すものである。第４図はα−CDとリノール酸
との反応物の添加量を一定にしてこれにα−CD
を各種濃度で添加した場合の培養液の細胞濃度及
びインターフエロンの産生量の変化を示すもので
ある。第５図は繊維芽細胞についてα−CDの反
応物の種類と量を変えて培養を行ない、シヤーレ
当りの細胞数を測定した結果を示すものである。
第６図はα−CD及びβ−CDについてリンパ芽球
様細胞に対する細胞毒性の程度を測定した結果を
示すものである。
ロデキストリン（α−CD）とリノール酸との反
応物又はオレイン酸との反応物を各種濃度で添加
した場合の、そして第２図はこれらの反応物の混
合物（α−CD・FA）を各種濃度で添加した場合
の、いずれも培養液の細胞濃度及びインターフエ
ロンの産生量の変化を示すものである。第３図は
α−CDとビタミンＥ（VE）との反応物又はこれ
にオレイン酸の反応物とリノール酸の反応物との
等量混合物を各種濃度で添加した場合の培養液の
細胞濃度及びインターフエロンの産生量の変化を
示すものである。第４図はα−CDとリノール酸
との反応物の添加量を一定にしてこれにα−CD
を各種濃度で添加した場合の培養液の細胞濃度及
びインターフエロンの産生量の変化を示すもので
ある。第５図は繊維芽細胞についてα−CDの反
応物の種類と量を変えて培養を行ない、シヤーレ
当りの細胞数を測定した結果を示すものである。
第６図はα−CD及びβ−CDについてリンパ芽球
様細胞に対する細胞毒性の程度を測定した結果を
示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サイクロデキストリンを含有してなる動物細
胞用培地。 ２ 脂溶性培地成分とサイクロデキストリンとの
反応物を含有してなる特許請求の範囲第１項記載
の培地。 ３ サイクロデキストリンがα−体であり、脂溶
性培地成分がリノール酸、オレイン酸又はビタミ
ンＥである特許請求の範囲第１項又は第２項に記
載の培地。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8160081A JPS57194787A (en) | 1981-05-28 | 1981-05-28 | Culture medium for animal cell |
| US06/379,369 US4533637A (en) | 1981-05-28 | 1982-05-18 | Culture medium |
| AU84172/82A AU8417282A (en) | 1981-05-28 | 1982-05-25 | Culture medium |
| EP19820104738 EP0066284B1 (en) | 1981-05-28 | 1982-05-28 | Culture medium and its use |
| DE8282104738T DE3274884D1 (en) | 1981-05-28 | 1982-05-28 | Culture medium and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8160081A JPS57194787A (en) | 1981-05-28 | 1981-05-28 | Culture medium for animal cell |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57194787A JPS57194787A (en) | 1982-11-30 |
| JPS6318465B2 true JPS6318465B2 (ja) | 1988-04-19 |
Family
ID=13750805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8160081A Granted JPS57194787A (en) | 1981-05-28 | 1981-05-28 | Culture medium for animal cell |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4533637A (ja) |
| EP (1) | EP0066284B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57194787A (ja) |
| AU (1) | AU8417282A (ja) |
| DE (1) | DE3274884D1 (ja) |
Families Citing this family (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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