JPS63198997A - Ｄ−アラニンの製造法 - Google Patents
Ｄ−アラニンの製造法Info
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- JPS63198997A JPS63198997A JP2970987A JP2970987A JPS63198997A JP S63198997 A JPS63198997 A JP S63198997A JP 2970987 A JP2970987 A JP 2970987A JP 2970987 A JP2970987 A JP 2970987A JP S63198997 A JPS63198997 A JP S63198997A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
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- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明はＤ−アラニンを発酵法によって工業的に製造す
る方法に関するものでおる。
る方法に関するものでおる。
Ｄ−アラニンは医薬中間体や甘味料中間体として有用で
ある。
ある。
〈従来の技術〉
グルコースとＤＬ−アラニンを含有する培地中で酵母を
培養することによりＤ−アラニンを製造する方法はすで
に知られている（「発酵と代謝」１．工ｊ０．８９（１
９６７））。
培養することによりＤ−アラニンを製造する方法はすで
に知られている（「発酵と代謝」１．工ｊ０．８９（１
９６７））。
また、グルコースを炭素源とするコリネバクテリウム・
ファスシアンスによる直接Ｄ−アラニン発酵法も知られ
ている（特公昭５１−２１０７６号公報）。
ファスシアンスによる直接Ｄ−アラニン発酵法も知られ
ている（特公昭５１−２１０７６号公報）。
〈発明が解決しようとする問題点〉
前者の方法は安価なりＬ−アラニンから、高価なり一ア
ラニンを高純度で得る方法として優れている。
ラニンを高純度で得る方法として優れている。
しかしながらＤＬ−アラニン濃度を２０ｇ／ａ以上にす
ると菌の生育が阻止されるばかりでなく、Ｌ−アラニン
の資化能も低下すること、また、Ｄ−アラニンも資化さ
れてしまうために、残存Ｄ−アラニン回収率も低いこと
などのために工業的に有利な方法とはいえない。
ると菌の生育が阻止されるばかりでなく、Ｌ−アラニン
の資化能も低下すること、また、Ｄ−アラニンも資化さ
れてしまうために、残存Ｄ−アラニン回収率も低いこと
などのために工業的に有利な方法とはいえない。
また、後者の方法はＤ−アラニンの蓄積濃度が６ｇ／α
と低いこと、培口時間が５日間と長いことなどのために
、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
と低いこと、培口時間が５日間と長いことなどのために
、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
しかも、従来技術はグルコース、グリセロールなどを炭
素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有す
る酵素によってＬ−アラニンを他の物質に変換せしめる
ことにより、ＤＬ−アラニンからＤ−アラニンを製造す
る方法である。
素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有す
る酵素によってＬ−アラニンを他の物質に変換せしめる
ことにより、ＤＬ−アラニンからＤ−アラニンを製造す
る方法である。
く問題点を解決するための手段および作用〉そこで、本
発明者らは実質的にＬ−アラニンを単一炭素源および単
一窒素源として生育可能な微生物をＤＬ−アラニンを含
有する培地で培養することにより、Ｌ−アラニンのみを
資化せしめＤ−アラニンを製造する方法を検討した。
発明者らは実質的にＬ−アラニンを単一炭素源および単
一窒素源として生育可能な微生物をＤＬ−アラニンを含
有する培地で培養することにより、Ｌ−アラニンのみを
資化せしめＤ−アラニンを製造する方法を検討した。
この方法によればＬ−アラニンは微生物を生育するため
のエネルギーとして消費されるために、し−アラニンを
全邑資化した時点では培地中にはＤ−アラニンのみが蓄
積され、他の副生物はほとんど存在しないこととなる。
のエネルギーとして消費されるために、し−アラニンを
全邑資化した時点では培地中にはＤ−アラニンのみが蓄
積され、他の副生物はほとんど存在しないこととなる。
加えて、選ばれた微生物がラセマーゼを保有しないか、
あるいは保有したとしても不活性化される条件下で培養
することにより、ＤＬ−アラニンに含まれるＤ−アラニ
ンは実質的に理論量蓄積されることとなる。
あるいは保有したとしても不活性化される条件下で培養
することにより、ＤＬ−アラニンに含まれるＤ−アラニ
ンは実質的に理論量蓄積されることとなる。
本発明者らは、このような目的に合致する微生物を探究
した。
した。
すなわち、単一炭素源および単一窒素源として安価なり
Ｌ−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してＬ−ア
ラニンのみを資化し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しな
い、すなわち選択的資化能を有する微生物について探究
した。
Ｌ−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してＬ−ア
ラニンのみを資化し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しな
い、すなわち選択的資化能を有する微生物について探究
した。
Ｌ−アラニンを他の物質に変換する酵素としては、例え
ば、アラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＥＣ６，１，１
，７）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，
６，１，２）、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ２，６，１，１２）、アラニンデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣＩ、４．１．１）などが知られており、ざ
らに、アラニンラセマーゼが知られている。
ば、アラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＥＣ６，１，１
，７）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，
６，１，２）、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ２，６，１，１２）、アラニンデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣＩ、４．１．１）などが知られており、ざ
らに、アラニンラセマーゼが知られている。
これらの酵素は例えば、スタフィロコッカス属、キャン
ディダ属、サツカロマイコブシス属、ラクトバチルス属
、バシリス居、トルロプシス属、ピキア属、デバリオマ
イセス属、アスペルギルス属、ミクロコツカス属、サツ
カロマイセス属、アエロバクタ−属、ハンゼヌラ属、ク
リプトコツカス属、トリコスポロン属などに属する微生
物に存在する。
ディダ属、サツカロマイコブシス属、ラクトバチルス属
、バシリス居、トルロプシス属、ピキア属、デバリオマ
イセス属、アスペルギルス属、ミクロコツカス属、サツ
カロマイセス属、アエロバクタ−属、ハンゼヌラ属、ク
リプトコツカス属、トリコスポロン属などに属する微生
物に存在する。
しかし、これらの微生物がＬ−アラニンを他の物質に変
換する能力を有していても、Ｄ−アラニンをも変換する
酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼが
存在している場合には、残留アラニン中にし一アラニン
が混入するため、Ｄ−アラニンのみを蓄積することはで
きない。
換する能力を有していても、Ｄ−アラニンをも変換する
酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼが
存在している場合には、残留アラニン中にし一アラニン
が混入するため、Ｄ−アラニンのみを蓄積することはで
きない。
すなわち、Ｌ−アラニンを変換する能力を有する微生物
をＤＬ−アラニン培地で培養したとしても、Ｄ−アラニ
ンのみを残留せしめることが可能か否かは予測できない
。
をＤＬ−アラニン培地で培養したとしても、Ｄ−アラニ
ンのみを残留せしめることが可能か否かは予測できない
。
そこで本発明者らは工業的に有利なり一アラニンの製造
法を提供することを目的として鋭意検討した結果、特定
の酵母を特定炭素源および特定窒素源の培地で培養する
ことにより、数十ｙ／（１以上の蓄積濃度でＤ−アラニ
ンが得られることを見い出し、本発明を完成した。
法を提供することを目的として鋭意検討した結果、特定
の酵母を特定炭素源および特定窒素源の培地で培養する
ことにより、数十ｙ／（１以上の蓄積濃度でＤ−アラニ
ンが得られることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は実質的にＤＬ−アラニンを単一炭素
源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンデ
イダ属、サツカロマイコブシス属、ピキア属、トルロプ
シス属、クリプトコツカス属、ハンゼヌラ属またはトリ
コスポロン属に属しかつＬ−アラニンを資化しＤ−アラ
ニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、
培養物からＤ−アラニンを採取することを特徴とするＤ
−アラニンの製造法に関するものである。
源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンデ
イダ属、サツカロマイコブシス属、ピキア属、トルロプ
シス属、クリプトコツカス属、ハンゼヌラ属またはトリ
コスポロン属に属しかつＬ−アラニンを資化しＤ−アラ
ニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、
培養物からＤ−アラニンを採取することを特徴とするＤ
−アラニンの製造法に関するものである。
以下、本発明の構成を詳述する。
本発明で使用する酵母としては、キャンディダ居、サツ
カロマイコブシス属、ピキア属、トルロプシス属、クリ
プトコツカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン属
に屈する酵母が挙げられる。これらの酵母のうち実質的
にＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として
含有する培地中で生育可能であって、かつＬ−アラニン
資化能を有し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母
が本発明では用いられる。
カロマイコブシス属、ピキア属、トルロプシス属、クリ
プトコツカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン属
に屈する酵母が挙げられる。これらの酵母のうち実質的
にＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として
含有する培地中で生育可能であって、かつＬ−アラニン
資化能を有し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母
が本発明では用いられる。
ここで、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母とは、
本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてＤ−ア
ラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはし−アラニン
の資化後、Ｌ−アラニンの不存在条件下ではＤ−アラニ
ンを資化する酵母も含まれる。
本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてＤ−ア
ラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはし−アラニン
の資化後、Ｌ−アラニンの不存在条件下ではＤ−アラニ
ンを資化する酵母も含まれる。
例えば、キャンデイダ・フミコーラ（Ｃａｎｄｉｄａｈ
ｕｍｉｃｏｌａ）Ａ Ｔ ＣＣ３６９９２、キャンデイ
ダー／Ｌ、ゴーザ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）Ａ
Ｔ ＣＣ１０５７１、サツカロマイコブシス・リボリ
テイ力（ＳａＣｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｌ １ｐ
ｏｌｙｔｉｃａ） Ａ Ｔ Ｇ Ｃ２０３０６、サツカ
ロマイコブシス・リボリテイ力（ＳａＣｃｈａｒｏｍｙ
ｃｏｐｓｉｓ ｌ１ｐｏｌｙＮｃａ） Ｉ ＦＯＯ７
１７、クリプトコツカス・ラウレンテイ（Ｃｒｙｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ １ａｕｒｅｎｔｉｉ）ＡＴＣＣ３６８３
２１、トルロプシス・キャンデイダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓ
ｉｓ ｃａｎｄｉｄａ）ＡＴＣＣ２０２８４、トルロプ
シス・ゲラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｇｌａｂｒａ
ｔａ） ＩＦＯ０００５、ピキア・フルトニ−（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ） ＡＴＣＣ２０２７９、
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
）ＩＦＯ０９４８、ハンゼヌラ・ポリモルファ （Ｈａ
ｎｓｅｎｕ Ｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ２６０１２、ハンゼヌラ・カプスラータ（Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ ｃａｐｓｕｌａｔａ）ＡＴＣＣＩ ６７５３
、トリコスポロン−ヘイケＩＪ −（Ｔｒｉｃｈｏｓｐ
ｏｒｏｎ ｂｅｉｑｅｌ ｉｉ） Ａ Ｔ ＣＣ３６９
９３などが挙げられる。
ｕｍｉｃｏｌａ）Ａ Ｔ ＣＣ３６９９２、キャンデイ
ダー／Ｌ、ゴーザ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）Ａ
Ｔ ＣＣ１０５７１、サツカロマイコブシス・リボリ
テイ力（ＳａＣｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｌ １ｐ
ｏｌｙｔｉｃａ） Ａ Ｔ Ｇ Ｃ２０３０６、サツカ
ロマイコブシス・リボリテイ力（ＳａＣｃｈａｒｏｍｙ
ｃｏｐｓｉｓ ｌ１ｐｏｌｙＮｃａ） Ｉ ＦＯＯ７
１７、クリプトコツカス・ラウレンテイ（Ｃｒｙｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ １ａｕｒｅｎｔｉｉ）ＡＴＣＣ３６８３
２１、トルロプシス・キャンデイダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓ
ｉｓ ｃａｎｄｉｄａ）ＡＴＣＣ２０２８４、トルロプ
シス・ゲラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｇｌａｂｒａ
ｔａ） ＩＦＯ０００５、ピキア・フルトニ−（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ） ＡＴＣＣ２０２７９、
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
）ＩＦＯ０９４８、ハンゼヌラ・ポリモルファ （Ｈａ
ｎｓｅｎｕ Ｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ２６０１２、ハンゼヌラ・カプスラータ（Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ ｃａｐｓｕｌａｔａ）ＡＴＣＣＩ ６７５３
、トリコスポロン−ヘイケＩＪ −（Ｔｒｉｃｈｏｓｐ
ｏｒｏｎ ｂｅｉｑｅｌ ｉｉ） Ａ Ｔ ＣＣ３６９
９３などが挙げられる。
本発明では、実質的にＤＬ−アラニンを単一炭素源およ
び単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すな
わち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として
、実質的にＤＬ−アラニンを用いるが、本発明の効果を
阻害しない範囲内で他の炭素源および／または窒素源を
培養液中に栄養源としてグルコースを共存させるとＬ−
アラニンの資化速度が遅くなるので、グルコースはでき
るだけ含有させないようにすることが好ましい。
び単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すな
わち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として
、実質的にＤＬ−アラニンを用いるが、本発明の効果を
阻害しない範囲内で他の炭素源および／または窒素源を
培養液中に栄養源としてグルコースを共存させるとＬ−
アラニンの資化速度が遅くなるので、グルコースはでき
るだけ含有させないようにすることが好ましい。
培地中のＤＬ−アラニン濃度は１α中に１〜１５０ｇ、
好ましくは、３０〜１２０ｇである。
好ましくは、３０〜１２０ｇである。
ＤＬ−アラニン濃度が低いと生産効率が悪く、逆に濃度
が高いと培養時間が長くなり、また、微生物の生育が阻
害される傾向となる。
が高いと培養時間が長くなり、また、微生物の生育が阻
害される傾向となる。
ＤＬ−アラニンは始めから培養液に全量仕込んでもよい
が、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間
が長くなるので、初濃度を２０〜５０ｇ／Ｍにし、残り
のＤＬ−アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい
。
が、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間
が長くなるので、初濃度を２０〜５０ｇ／Ｍにし、残り
のＤＬ−アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい
。
培養は酸性で実施するのが好ましい。培養液は通常培養
開始時にｐＨ５に調整するが、培養が進むにつれてｐＨ
が上昇する。そのままで培養するとＤ−アラニンの回収
率が低下するのでＩＩを酸性側にコントロールする必要
がある。
開始時にｐＨ５に調整するが、培養が進むにつれてｐＨ
が上昇する。そのままで培養するとＤ−アラニンの回収
率が低下するのでＩＩを酸性側にコントロールする必要
がある。
ＤＨがアルカリ側になるとＤ−アラニンの回収率が低下
する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化される
こと、またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼが
活性化されることなどにより、Ｄ−アラニンが資化され
るものと考えられる。
する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化される
こと、またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼが
活性化されることなどにより、Ｄ−アラニンが資化され
るものと考えられる。
これらの理由から、培養時のｐＨは通常４〜７、好まし
くは４．５〜６．５に調整する。調整用の酸としては、
例えば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液が好ま
しい。
くは４．５〜６．５に調整する。調整用の酸としては、
例えば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液が好ま
しい。
培養温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
である。
である。
培養は通気しながら攪拌する。通気量は通常、０．５〜
２．０ＶＶｍ、好ましくは０．６〜１゜２ｖｖｍである
。通気量が少なすぎるとＬ−アラニン資化速度が遅くな
る傾向となり、また、多くても効果に変わりなく、むし
ろ培養液の蒸発を促進するために培養液濃度が高くなっ
たり、発泡が激しくなり好ましくない。
２．０ＶＶｍ、好ましくは０．６〜１゜２ｖｖｍである
。通気量が少なすぎるとＬ−アラニン資化速度が遅くな
る傾向となり、また、多くても効果に変わりなく、むし
ろ培養液の蒸発を促進するために培養液濃度が高くなっ
たり、発泡が激しくなり好ましくない。
し−アラニンがすべて資化された時点で通常、培養を終
了する。Ｌ−アラニンの全量資化はＤＯをモニターする
ことにより、また、アラニンのり、Ｌを分析するか、酸
の添加量をモニターすることにより知ることができる。
了する。Ｌ−アラニンの全量資化はＤＯをモニターする
ことにより、また、アラニンのり、Ｌを分析するか、酸
の添加量をモニターすることにより知ることができる。
Ｌ−アラニンがすべて資化されたのち、ざらに培養を続
けるとＤ−アラニンも徐々に資化される場合もあるので
、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
けるとＤ−アラニンも徐々に資化される場合もあるので
、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去し
たのち、通常の方法によってＤ−アラニンを単離すれば
よい。
たのち、通常の方法によってＤ−アラニンを単離すれば
よい。
例えば、イオン交換樹脂５Ｋ−１８（三菱化成製）に通
液してアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次
いでアンモニア水溶液′で溶出させたのち、溶出液を濃
縮すればよい。 ここで得られた粗り−アラニンを水゛
で再結晶すれば精製されたＤ−アラニンが得られる。
液してアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次
いでアンモニア水溶液′で溶出させたのち、溶出液を濃
縮すればよい。 ここで得られた粗り−アラニンを水゛
で再結晶すれば精製されたＤ−アラニンが得られる。
〈実施例〉
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例においてアラニンのＤＬ分析は、濃縮乾燥したＤ
−アラニン含有粉末をメタノール−塩酸によりメチルエ
ステル化したのち３，５−ジニトロフェニルイソシアネ
ートと反応させたのちこれを次の条件によりＨＰＬＣで
分析する方法によって行った。
−アラニン含有粉末をメタノール−塩酸によりメチルエ
ステル化したのち３，５−ジニトロフェニルイソシアネ
ートと反応させたのちこれを次の条件によりＨＰＬＣで
分析する方法によって行った。
カラム：０Ａ−１０００（住友化学）
移動層二〇−ヘキサン：ジクロルメタン：エタノール（
２０：８：１） 流速：１ｍα／ｍｔｎ 検出：ＬＩＶ２５４ｎｍ 実施例１ 乾燥ブイヨン３０ｇ／Ｑ （ｐＨ６，０）を含む培地５
０ｍを１０．三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分
間滅菌し、種培養培地とした。
２０：８：１） 流速：１ｍα／ｍｔｎ 検出：ＬＩＶ２５４ｎｍ 実施例１ 乾燥ブイヨン３０ｇ／Ｑ （ｐＨ６，０）を含む培地５
０ｍを１０．三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分
間滅菌し、種培養培地とした。
これにキャンディダ・フミコーラＡＴＣＣ３６９９２を
一白金耳植菌し、３０℃で一日振とう培養した。一方、
ＤＬ−アラニン１００９／Ｑ。
一白金耳植菌し、３０℃で一日振とう培養した。一方、
ＤＬ−アラニン１００９／Ｑ。
リン酸−カリウム２ｇ／α、硫酸マグネシウム０．５９
／Ｌ粉末酵ｆＨエキス０．５ｇ／ｌ−含む培地（ｐＨ５
，０）Ｈ１ｅ３ｍ（７）−：ニジを一７フーメンターに
仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の種培養液
を接種し、３０℃、’ｌ、Ｑｖｖｍ通気攪拌培養をした
。なお、培養中は２Ｎ硫酸により１１５．０±０．１に
調整を行った。約７０時間で培地中のし一アラニンは全
量資化され、Ｄ−アラニン４８ｇ、ｉ酸アンモニウム３
５ｇを含む培養液約１．２ａを得た。
／Ｌ粉末酵ｆＨエキス０．５ｇ／ｌ−含む培地（ｐＨ５
，０）Ｈ１ｅ３ｍ（７）−：ニジを一７フーメンターに
仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の種培養液
を接種し、３０℃、’ｌ、Ｑｖｖｍ通気攪拌培養をした
。なお、培養中は２Ｎ硫酸により１１５．０±０．１に
調整を行った。約７０時間で培地中のし一アラニンは全
量資化され、Ｄ−アラニン４８ｇ、ｉ酸アンモニウム３
５ｇを含む培養液約１．２ａを得た。
この培養液を’ｔｏ、ｏｏｏｒｐｍ ｉｏ分間遠心分離
して菌体を除いたのち、イオン交換樹脂５Ｋ−１８（Ｈ
型）を充填したカラムにとおし、Ｄ−アラニンを吸着さ
せた。このカラムを十分水洗したのち４％アンモニア水
でＤ−アラニンを溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾
固してＤ−アラニン４５ｇを得た。ＨＰＬＣにより分析
したところ、光学純度は９９．６％ｅｅ以上であった。
して菌体を除いたのち、イオン交換樹脂５Ｋ−１８（Ｈ
型）を充填したカラムにとおし、Ｄ−アラニンを吸着さ
せた。このカラムを十分水洗したのち４％アンモニア水
でＤ−アラニンを溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾
固してＤ−アラニン４５ｇを得た。ＨＰＬＣにより分析
したところ、光学純度は９９．６％ｅｅ以上であった。
化学純度は９９．４％であった。
実施例２
実施例１に示した操作のうち、主培養培地中のＤＬ−ア
ラニン濃度を８０９／Ｄ、とじ、他は同じ条件で培養を
行った。約３５時間で培養は終了し、Ｄ−アラニン３８
ｇ、硫酸アンモニウム２８９を含む培養液約１．２ａを
得た。
ラニン濃度を８０９／Ｄ、とじ、他は同じ条件で培養を
行った。約３５時間で培養は終了し、Ｄ−アラニン３８
ｇ、硫酸アンモニウム２８９を含む培養液約１．２ａを
得た。
この培養液を遠心分離して国体を除いたのち、水酸化カ
ルシウム１８．３ｇを加えて攪拌し、約２時間塩交換を
行った。この懸濁液を１／３量まで減圧濃縮したのち、
濾過して無機塩を除いた。濾液は、イオン交換樹脂５Ｋ
−１Ｂ（アンモニウム型）を充填したカラムにとおし、
微最の金属イオンを吸着させた。溶出液とカラムの洗浄
液を合せ、濃縮晶析させ、精り−アラニン３２９を得た
。
ルシウム１８．３ｇを加えて攪拌し、約２時間塩交換を
行った。この懸濁液を１／３量まで減圧濃縮したのち、
濾過して無機塩を除いた。濾液は、イオン交換樹脂５Ｋ
−１Ｂ（アンモニウム型）を充填したカラムにとおし、
微最の金属イオンを吸着させた。溶出液とカラムの洗浄
液を合せ、濃縮晶析させ、精り−アラニン３２９を得た
。
光学純度９９．９％ｅｅ、化学純度９９．９％であった
。
。
実施例３
実施例２と同様の条件で、主培養培地成分のうち粉末酵
母エキスを汰いて行ったところ、培養に約１００時間を
要した。培養終了後、得られたＤ−アラニンの収量、光
学純度は実施例２とほぼ同様であった。
母エキスを汰いて行ったところ、培養に約１００時間を
要した。培養終了後、得られたＤ−アラニンの収量、光
学純度は実施例２とほぼ同様であった。
実施例４
ＤＬ−アラニン２０ｇ／α、リン酸−カリウム２ｇ／α
、硫酸マグネシウム０．５ｇ／α、粉末酵母エキス０．
５９／Ｑを含む培地（ｐＨ５，０）５０ｍＱを１Ｑ三角
フラスコニ分注し、滅菌して種培養培地とした。これに
キャンディダ・フミコーラＡＴＣＣ３６９９２を一白金
耳植菌し、３０℃で約２０時間後とう培養した。
、硫酸マグネシウム０．５ｇ／α、粉末酵母エキス０．
５９／Ｑを含む培地（ｐＨ５，０）５０ｍＱを１Ｑ三角
フラスコニ分注し、滅菌して種培養培地とした。これに
キャンディダ・フミコーラＡＴＣＣ３６９９２を一白金
耳植菌し、３０℃で約２０時間後とう培養した。
一方、上記培地組成のうち、ＤＬ−アラニンを４０ｇ／
αとした培地１ａを３０のミニジャーファーメンタ−に
仕込み滅菌し主培養培地とした。これに先の種培養液を
接種し、３０℃、１゜Ｑｖｖｍで通気攪拌培養をした。
αとした培地１ａを３０のミニジャーファーメンタ−に
仕込み滅菌し主培養培地とした。これに先の種培養液を
接種し、３０℃、１゜Ｑｖｖｍで通気攪拌培養をした。
培養中は、２Ｎ硫酸によりｐｌ−１５，０±０．１に調
整を行った。約２０時間後、培地中のし一アラニンの約
８０％が資化されたところで、この培養液を同じ構成成
分の新しい主培養培地１αに５％シードで接種し、先は
どと同条件で通気攪拌培養を行った。再び約２０時間培
養したところで、次にこの培養液を、ＤＬ−アラニン８
０ｇ／Ｄ、を含有し他成分は前回までと同様である主培
養培地１ａに、５％シードで接種した。同条件で通気攪
拌培養を約６０時間行うと、培地中のし一アラニンが全
量資化された。培養終了後実施例２に示した操作により
得られたＤ−アラニンの収量、光学純度、化学純度は実
施例２とほぼ同様であった。
整を行った。約２０時間後、培地中のし一アラニンの約
８０％が資化されたところで、この培養液を同じ構成成
分の新しい主培養培地１αに５％シードで接種し、先は
どと同条件で通気攪拌培養を行った。再び約２０時間培
養したところで、次にこの培養液を、ＤＬ−アラニン８
０ｇ／Ｄ、を含有し他成分は前回までと同様である主培
養培地１ａに、５％シードで接種した。同条件で通気攪
拌培養を約６０時間行うと、培地中のし一アラニンが全
量資化された。培養終了後実施例２に示した操作により
得られたＤ−アラニンの収量、光学純度、化学純度は実
施例２とほぼ同様であった。
実施例５
実施例１に示した操作のうち、主培養培地をＤＬ−アラ
ニン５５ｇ、リン酸−カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム
０．５ｇ、粉末酵母エキス１びを含む培地７００ｍ１と
し、実施例１と同条件で培養を行った。約２０時間後、
ＤＬ−アラニン４５ｇを含む水溶液３００ｍを１５ｍＱ
／ｈｒの流速で添加を始めた。約２０時間で添加を終え
たのちも、ざらに培養を続けた。培Ｉｌを始めてから約
６０時間で培養は終結した。
ニン５５ｇ、リン酸−カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム
０．５ｇ、粉末酵母エキス１びを含む培地７００ｍ１と
し、実施例１と同条件で培養を行った。約２０時間後、
ＤＬ−アラニン４５ｇを含む水溶液３００ｍを１５ｍＱ
／ｈｒの流速で添加を始めた。約２０時間で添加を終え
たのちも、ざらに培養を続けた。培Ｉｌを始めてから約
６０時間で培養は終結した。
培養液から実施例１に示した操作で得られたＤ−アラニ
ンは収量、光学純度、化学純度ともに実施例１と同様で
あった。
ンは収量、光学純度、化学純度ともに実施例１と同様で
あった。
実施例６〜１５
乾燥ブイヨン３０９／Ｄ、からなる種培地（ｐＨ５，０
＞５ｒｌを１８Ｘ１８０＃の試験管に分注し、滅菌した
。これに表１に示した酵母を一白金耳植菌し、３０℃で
１〜２日振とう培養した。 一方、ＤＬ−アラニン１０
ｇ／Ｄ、、リン酸−カリウム２ｇ／ｆｆ、ｆｊＷ酸マグ
ネシウム０゜５ｇ／Ｌ粉末酵母エキス０．５ｇ／Ｄ、よ
りなる主培養培地（ｐｌ−１５，０＞５ｍＱを１８×１
８０＃試験管に分注して滅菌した。これに先の種培養液
を５％シードで接種し、３０℃で振どう培養した。２４
時間後、遠心分離して国体を除いたのち減圧濃縮して乾
固ののち乾燥した。
＞５ｒｌを１８Ｘ１８０＃の試験管に分注し、滅菌した
。これに表１に示した酵母を一白金耳植菌し、３０℃で
１〜２日振とう培養した。 一方、ＤＬ−アラニン１０
ｇ／Ｄ、、リン酸−カリウム２ｇ／ｆｆ、ｆｊＷ酸マグ
ネシウム０゜５ｇ／Ｌ粉末酵母エキス０．５ｇ／Ｄ、よ
りなる主培養培地（ｐｌ−１５，０＞５ｍＱを１８×１
８０＃試験管に分注して滅菌した。これに先の種培養液
を５％シードで接種し、３０℃で振どう培養した。２４
時間後、遠心分離して国体を除いたのち減圧濃縮して乾
固ののち乾燥した。
得られた固形分についてｌ−Ｉ Ｐ Ｌ Ｃにより残存
したアラニンのＬ体、０体の残存率を求めた。
したアラニンのＬ体、０体の残存率を求めた。
結果を表１に示す。
比較例
実施例２に示した操作のうち、主培養培地にグルコース
１０ｇ／２を加え他は同じ条件で培養を行った。培養は
約５４時間で終了し、Ｄ−アラニン３２９、硫酸アンモ
ニウム２９ｇを含む培養液約１．２０．を得た。この培
養液の５０ｄを実施例６と同様の処理をして得られた固
形分をＨＰＬＣにより分析した結果、Ｄ−アラニンの光
学純度は９９．６％ｅｅ以上であった。
１０ｇ／２を加え他は同じ条件で培養を行った。培養は
約５４時間で終了し、Ｄ−アラニン３２９、硫酸アンモ
ニウム２９ｇを含む培養液約１．２０．を得た。この培
養液の５０ｄを実施例６と同様の処理をして得られた固
形分をＨＰＬＣにより分析した結果、Ｄ−アラニンの光
学純度は９９．６％ｅｅ以上であった。
〈発明の効果〉
本発明は次の効果を発揮する。
（１）ＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源と
して酵母を培養することにより、Ｌ−アラニンを高選択
的に資化することができる。
して酵母を培養することにより、Ｌ−アラニンを高選択
的に資化することができる。
（２）さらに蓄積濃度も高く、短時間でＤ−アラニンが
得られる。
得られる。
（３）加えて、消費されたＬ−アラニンはほとんど炭酸
ガスと水にまで変換されて、培養液中にはＤ−アラニン
以外の副生物は実質的には存在しない。
ガスと水にまで変換されて、培養液中にはＤ−アラニン
以外の副生物は実質的には存在しない。
（４）このためにＤ−アラニンの単離精製が容易である
。
。
Claims (1)
- 実質的にＤＬ−アラニンを単一炭素源および単一窒素源
として含有する培地中で、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｏｐｓｉｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、トルロ
プシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｒａ）属またはトリコスポロン（Ｔｏｒｙｃｏ
ｓｐｏｒｏｎ）属に属しかつ、Ｌ−アラニンを資化しＤ
−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培
養し、培養物からＤ−アラニンを採取することを特徴と
するＤ−アラニンの製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2970987A JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Ｄ−アラニンの製造法 |
| PCT/JP1988/000139 WO1988006188A1 (fr) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Procede de preparation de d-alanine |
| DE3851108T DE3851108T2 (de) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Verfahren zur herstellung von d-alanin. |
| EP88901636A EP0301107B1 (en) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Process for preparing d-alanine |
| HU681688A HU208435B (en) | 1987-02-13 | 1988-06-16 | New process for producing substituted cyclopentenone- and cyclohexanone derivatives |
| US08/027,551 US5422255A (en) | 1987-02-13 | 1993-03-05 | Method for producing D-alanine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2970987A JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Ｄ−アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198997A true JPS63198997A (ja) | 1988-08-17 |
| JPH088878B2 JPH088878B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=12283636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2970987A Expired - Lifetime JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Ｄ−アラニンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0301107B1 (ja) |
| JP (1) | JPH088878B2 (ja) |
| DE (1) | DE3851108T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988006188A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0249598A (ja) * | 1988-08-11 | 1990-02-19 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 微生物を用いるｄ−アラニンの製法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5121076B2 (ja) * | 1972-07-28 | 1976-06-30 |
-
1987
- 1987-02-13 JP JP2970987A patent/JPH088878B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-02-12 DE DE3851108T patent/DE3851108T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 EP EP88901636A patent/EP0301107B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 WO PCT/JP1988/000139 patent/WO1988006188A1/ja not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0249598A (ja) * | 1988-08-11 | 1990-02-19 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 微生物を用いるｄ−アラニンの製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3851108D1 (de) | 1994-09-22 |
| DE3851108T2 (de) | 1995-03-02 |
| JPH088878B2 (ja) | 1996-01-31 |
| EP0301107B1 (en) | 1994-08-17 |
| WO1988006188A1 (fr) | 1988-08-25 |
| EP0301107A1 (en) | 1989-02-01 |
| EP0301107A4 (en) | 1991-04-10 |
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