JPS63206657A - 蛋白の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は生体試料、特に血清、血漿、尿などのヒト体液
中の蛋白を抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法によ
り効果的に測定する方法に関する。

［従来の技術］ 体液中の各種蛋白の含有量を測定することは神々の疾患
の診断や、治療経過を調べる上で重要な手がかりとなる
。体液中の蛋白を測定する方法に関しては、近年その進
歩にめざましいものがあり、測定方法も５ＲＩＤ法、レ
ーザー比朧法、比濁法、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ラテック
ス凝集法等多くの方法が開発され、実用化されている。

特に最近ではレーザーネフェロメーターや、多項目の生
化学的測定を対象に開発された自動分析装置で短時間に
行う方法か開発され、普及しつつある。

しかしながらこれらの測定に使用する抗体は、通常動物
に免疫をして得たポリクローナル抗体である為、抗原抗
体反応による凝集度が高く、濁りの度合が強過ぎるので
、測定前に予め検体血清を１０〜３０倍、また場合によ
っては１００〜３００倍に希釈して測定することが必要
であった（以下、この方法を希釈ＰＣＡ法と略称する。

）。

ポリクローナル抗体のみを用いて予め検体を希釈せずに
免疫グロブリンを測定する例（以下、この方法を直接Ｐ
ＣＡ法と略称する。）もあるが、この場合は試料のサン
プリング量の制約や、測定する波長が限定される等の制
約がある。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を例に
取れば、試料（血清）のサンプリング量は３〜５４で行
い、しかも反応後の濁度が強い為、測定は６００ｎｍ以
上の長波長で行う事が必要となる。更に測定に使用する
ポリクローナル抗体の蛍は１検体当り約１ｍｇという従
来の希釈ＰＣＡ法に比べて約１０倍量もの抗体が必要と
なり、１検体当りのコストが高くなって経済上問題とな
る。

一方、モノクローナル抗体（単クローン性抗体）のみを
用いて免疫グロブリンを測定する例としては、公知文献
であるクリニカル　ケミストリー２７巻　２０４４−２
０４７頁（１９８１年）にモノクローナル抗体を使用し
た免疫グロブリンの定量法に関する記載がある。しかし
ここで述べられていることは要約すれば、モノクローナ
ル抗体は単独で用いた場合には抗原抗体反応による濁り
が認められず、複数のモノクローナル抗体を組み合せて
用いることにより初めて測定に適用できるというもので
あり、単にポリクローナル抗体と置き換え得るものとし
てモノクローナル抗体の使用を検討しているに過ぎず、
これを積極的に用いることにより新たな効果を引き出そ
うとしているものではない。従って、当然のことながら
、この場合の検体は従来通り希釈したものが用いられて
いる。

これらの従来技術に対し、本発明者の一部らはモノクロ
ーナル抗体のみを用い、且つ検体を予め希釈することな
く血清中の免疫グロブリンを測定する方法（以下、直接
ＭＣＡ法と略称する。）を先に見出し、特許出願してい
る（特開昭６０−２３７３６３号公報）。この方法は、
単独で用いても抗原と反応して濁りを生ずるモノクロー
ナル抗体を単独又は２種以上組み合わせて用いることに
より試料（血清）を希釈することなく測定する方法であ
り、希釈ＰＣＡ法、直接ＰＣＡ法等従来法の有する問題
点を一挙に解決した優れた方法である。

しかしなから、モノクローナル抗体のみを用いたこの方
法では、抗原抗体複合物を凝集させる為に、高濃度の凝
集促進剋（ポリエチレングリコール、多糖類等）の使用
が余儀なくされるので、血清によってはその成分の一部
が反応促進剤により非特異的な凝集を起こし、測定値に
影響を与える虞もあり、改善の余地が残されていた。ま
た、この方法を短時間の反応（反応時間が２．５〜１０
分程度）で測定することを前提とした生化学自動分析装
置に適用した場合には、低濃度での抗原抗体複合物の凝
集がその反応時間内では光分でなく、正確な測定値を得
る為の適度の濁りが形成されず、低濃度域での測定精度
に問題が生じる場合もあることが新たに明らかとなった
。

［問題点を解決するための手段］ かかる問題点を解決する為、本発明は下記の構成から成
る。

［抗原抗体反応により生成する抗原抗体複合物に光を照
射し、その光学的変化を測定することにより生体試料中
の蛋白を定量する方法に於て、生体試料を希釈せずにそ
のまま使用し、測定対象蛋白に対する抗体として、該蛋
白に対する千ノクローナル抗体１種以上と該蛋白に対す
るポリクローナル抗体とを組み合わせて用いてこれを行
うことを特徴とする生体試料中の蛋白の定量方法。ｊ即
ち、本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意研究の結
果、モノクローナル抗体（ＭＣＡ）とポリクローナル抗
体（ＰＣＡ）とを適宜組み合わせて用いることにより意
外にも、ＰＣＡのみ或はＭＣＡのみを用いて測定法を組
み立てた場合の問題点、即ち直接ＰＣＡ法の場合は多量
の抗体が必要となり、形成される濁度も必要以上に高く
測定時に試料のサンプリング量を最小限（３〜４４）に
しなければならない点や、測定波長として６００ｎｍ以
上で行わなければならない等の制約、また直接ＭＣＡ法
の場合には、短時間では抗原抗体複合物の凝集の程度が
低い為その凝集を促進する目的で多量の反応促進剤を使
用しなければならない点、及び多量の反応促進剤を使用
する為に、血中成分の一部が非特異的凝集を起こし測定
値に影響を与える虞がある点、更には直接ＭＣＡ法によ
り測定を行う場合、低濃度での濁度形成が不充分な為に
低濃度域での測定粒度が低下するという点等、従来の技
術では解決出来なかった数多くの問題点が一挙に解決し
得ることを見出し、本発明を完成するに到った。

本発明の方法によりモノクローナル抗体の１種又は２種
以上とポリクローナル抗体とを適宜組み合わせて用いれ
ば、検体の希釈をする必要がなく、また多量の反応促進
剤を用いることもなく、低濃度から高濃度迄適度な濁度
が得られる。従って、反応促進剤の量は通常希釈ＰＣＡ
法で使用される、１〜４％の範囲で充分であり、直接Ｍ
ＣＡ法で使用される濃度である５〜１０％に比べて大巾
に低減が可能となる。その結果血中成分の一部が非特異
的凝集を起こし、測定値に影響を与えるといったような
ことも回避され、正確な測定が可能となった。更に使用
するポリクローナル抗体の使用量は、直接ＰＣＡ法の場
合の１７５〜１／１０に低減が可能で、直接ＰＣＡ法に
比べて経済性が改善でき、更に濁度も直接ＰＣＡ法の様
に強過ぎることもなく、適度な濁度に調整可能となり、
測定波長は通常生化学自動分析装置で汎用される３４０
〜７００ｎｍの任意の波長を選ぶことができ、試料のサ
ンプリング量も生化学自動分析装置で通常汎用される５
〜１０ＩＬ！での測定が可能となった。

以上述べた如く、本発明の方法によれば体液中の蛋白を
予め希釈することなく、またサンプリンク量や測定波長
で特定の制約を受けることもなく、生化学分析を主体と
した自動分析装置へ適用可能となり、迅速に低濃度から
高濃度迄正確な測定が可能となった。

本発明の方法により体液中の蛋白を定量する場合の具体
的な測定手段としては、比濁法、比朧法等の光学的測定
法が挙げられる。比濁法で測定する場合は、既存の自動
分析装置や分光光度計が使用でき、波長としては好まし
くは３４０〜８００ｎｍの範囲であるが特に限定される
ものではない。また比朧法で測定する場合は、現在普及
しているレーザー光源を使用したもの等が利用できるが
、本発明は光源及び検出方法によって特に限定されるも
のではない。

測定に使用する緩衝液としてはトリス緩衝液、リン酸緩
衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸Ｍ衝液等通常抗原抗体
反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て使
用でき、ｐＨは抗原抗体反応を阻害しない範囲であれば
特に限定されないが、通常６．０〜９．０の範囲が好ま
しく用いられる。

本発明で用いられるモノクローナル抗体は、常法、即ち
ケラ−、ミルスタイン（Ｇ、にδ旧ｅｒ　ａｎｄＣ，Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５（１
９７５）　）により確立された細胞融合法に従い、マウ
スの腫瘍ラインからの細胞と、測定対象のヒト蛋白で予
め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させてモノクロー
ナルハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマから産
生されるモノクローナル抗体を常法により採取すればよ
い。

本発明の定量方法で用いられるモノクローナル抗体の種
類、及び数は限定されるものではなく、必要な感度に合
わせて１種或は２種以上が適宜選択され用いられる。ま
た、モノクローナル抗体と組み合わせて使用するポリク
ローナル抗体の種類（動物の種類）、由来等は特に限定
されるもので用いれば足りる。

モノクローナル抗体の使用量は特に限定されるものでは
ないが、通常測定試薬としての抗体溶液１ｒｎ！中当り
０．０５〜５ｍｇの濃度範囲で用いられる。

ポリクローナル抗体の使用量についても特に限定される
ものではないが、通常抗体溶液１ｍ！中当り０．０１〜
０．８ｍｇの濃度範囲で用いられ、モノクローナル抗体
とポリクローナル抗体の組み合わせの割合は通常モノク
ローナル抗体１に対してポリクローナル抗体０．０２〜
０．４の比率で用いられる。

本発明の方法により測定可能なヒト体液中の蛋白として
は例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリ
ンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、補体Ｃ
３、トランスフェリン、ハプトグロビン、α１−アンチ
トリプシン、アルブミン、アポリポ蛋白ＡＩ、アポリポ
蛋白ＡＵ、α２−マクログロブリン等が挙げられる。

以下に参考例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれら参考例、実施例により何ら限
定されるものではない。

［実施例］ 参考例１．モノクローナル抗１ｇＧ抗体及びこれを産生
ずるハイブリドーマの作製 ＋１）免疫 ヒトＩｇＧ１００ｐ、を溶解したＯ、］５５Ｍ塩化ナト
リウム溶液０１ｒｎｌとフロイントコンプリートアジュ
バント　０．１ｒｒＩ！を混合してエマルジョン抗原液
とし、その０．２ｒｒＬｌをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウス（雌、６週齢）の腹腔内に投与した。４週後、ヒト
ＩｇＧ１００ｐ９を０．］５５Ｍ塩化ナトリウム溶液０
．２ｒｎに溶解し、尾静脈に注射した。

（２）細胞融合 最終免疫より３日後、免疫マウスの牌臓を摘出し、１０
ｍ１のＲＰＭＩ−１６４０の培地を入れたプラスチック
シャーレ中で、牌リンパ球をほぐし、牌リンパ球を遠心
操作（１０００回転、１０分）を緑返むＴＲＰＭＩ−１
６４０培地で３回洗浄した。牌リンパ球Ｉ　Ｘ　１０’
個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳＩ−１１ＸＩＯ’個を
試験管中で混合し、遠心操作で沈殿とした。上滑を吸引
除去した後沈殿をかるくほぐした。５０％ポリエチレン
グリコール（平均分子量６，０００）　Ｉ　Ｆｎｌをほ
ぐした沈殿に加え、試験管をまわしながら室温で１分間
融合反応を行った。その後３０秒毎にＲＰＭＩ−１６４
０培地１ｍｌを５分間加え反応を停止した。

直ちに遠心分Ｈ枇（１０００回転、５分）し、上滑を除
き、フィーダー細胞を１×１０６７ｍ！、Ｆｅ２（牛胎
児血清）を２０％含むＲＰＭＩ−１６４０培地５０ｒｎ
ｌ中に細胞を懸濁した。２４穴プレ一ト２枚に細胞懸濁
液を１穴当り１ｍ１分注しＣＯ２インキュベーター内で
培養した。

２４時間後、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン１×１０−’
Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．６Ｘ
　１０−５Ｍを含む２０％ＦＣ３添加ＲＰＭ　１−１６
４０培地）を１穴当り１ｒｎｌずづ加えた。

２日目、３日目更に２日毎に培地の半量をＨＡＴ培地に
交換した。１００日目培地の半量を上記のＨＡＴ培地よ
りアミノプテリンを除いたＨＴ培地で交換した。翌日か
ら２日毎に通常の培地、即ち】０％ＦＣ５添加ＲＰＭＩ
−１６４０培地に半量ずつ交換し、１８８日目培養上清
を抗ＴｇＧ抗体産生の検定に供した。

（３）ハイブリドーマの選択 抗１ｇＧ抗体産生ハイブリドーマ選択の為に４８穴の各
細胞培養上清をＥＬＩＳＡにて分析した。

まずＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにＩｇＧを１０ｐｙ／
ｍｌの濃度で０．１ｍｌずづ分注し、４℃、１６時間静
置してヒトＩｇＧをプレートに固定した。Ｔｗｅｅｎ２
０（ノニオン系界面活性剤、アトラス社商品名）を０．
０５％含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，４（洗浄液）
で３回洗浄した後、培養上滑中の蛋白質の非特異的吸着
を避ける為に、１％牛血清アルブミン溶液を０．２ｍｌ
ずつ分注し、３７℃、２時間静置した。次に洗浄液で３
回洗浄後細胞培養上清を０．１　ｍ７分注し、３７℃、
２時間静置した。陰性対照として２０％ＦＣ３添加ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を０．１　ｒｎ１分注した。更に洗
浄液で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫
グロブリン抗体溶液０．１ｍｌを分注し、３７℃、２時
間静置した。

胱酸０．０５ｍＪを加え反応を停止させ、ＯＤ４９０ｎ
ｍを測定した。陰性対照の２倍以上のＯＤを示す培養上
清中で増殖しているハイブリドーマを抗ＩｇＧ抗体産生
ハイブリドーマとして選択した。４８穴中３穴に抗Ｊｇ
Ｇ抗体産生を認めた。

（４）単クローン化 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（雌、６週齢）の胸腺を
摘出し、１０ｍ／のＲｐｙｒ−ｔｓ４ｏ＠地をいわたプ
ラスチックシャーレ中で胸腺リンパ球をほぐした。胸腺
リンパ球を遠心操作（ｔｏｏｏ回転、１０分）を繰返し
ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。胸腺リンパ球
を２０％ＦＣ３添加、ＲＰＭ　ｌ−１６４０培地５０ｍ
Ｊに浮遊させた。この浮遊液に抗１ｇＧ抗体産生バイブ
リドー７５００個／ｍｌの溶液０．１　ｒｎｌを加え、
よく混合後、９６穴培養プレートに１穴当り　０．２ｍ
ｌずつ分注しｌＯ日日間ＣＯ２インキュベーター内で培
養した。細胞増殖の認められる培養上清をＥＬＩＳＡに
て分析の結果、抗１ｇＧ抗体産生ハイブリドーマ７クロ
ーンを得た。このうちの１クローンを更に同上操作を行
い、抗１ｇＧ抗体産生ハイブリドーマ６クローンを得、
単クローン化を完全なものとした。

（５）モノクローナル抗体の作製 （４）までの操作で得られたクローンＧ〜２−３２Ｘ１
０６個をＲＰＭＩ−１６４０培地０．２ｒｎｌに浮遊さ
せ、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃマウス（雄、６週齢）の腹腔内
に投与し、所定日数経過後、腹水を回収した。腹水４Ｗ
Ｌｔに飽和硫安溶液を徐々に加え、最終硫安飽和濃度を
５０％とし、室温で２時間撹拌した後、遠心操作（３０
００回転、１０分）で沈殿を回収し、生理食塩水５ｒｎ
ｌを加え溶解した。こわを生理食塩水で１０倍ずつ段階
希釈してゆきＥＬＩＳＡにて分析し、抗体活性の認めら
れる希釈倍数を求めたところ、１０６であった。尚、マ
ウスＴｇＧ含量（抗体の力価の目安）を抗マウスＴｇＧ
のウサギ血清を含有するアガロースプレートにより測定
（ＳＲＩＤ法）したところ２３ｎ＋ｇ／ｍｌであった。

（６）（４）までの操作で得られたクローンＧ−３につ
いて（５）と同様の操作を行いモノクローナル抗体５ｗ
Ｌｌを得た。また、（５）と同様の方法で抗体活性及び
マウスＩｇＧ含量を求めたところ、抗体活性は１０６、
マウスＩｇＧ含量は２２［Ｉ１ｇ／ｒｎｌであった。

け）体）までの操作で得られたクローンＧ−５について
（５）と同様の操作を行いモノクローナル抗体５ｍｌを
得た。また、（５）と同様の方法で抗体活性及びマウス
ＩｇＧ含量を求めたところ、抗体活性は１０５、マウス
ＩｇＧ含量は２０ｍｇ／Ｆｎ！であった。

参考例２．モノクローナル抗ＩｇＡ抗体及びこれを産生
ずるハイブリドーマの作製 ヒトＩｇＡ　　２００ｐｐを溶解した０、１５Ｍ塩化ナ
トリウム溶液０．１ｍＪとフロイントコンプリートアジ
ュバント　Ｏ，１ｍｌを混合してエマルジョン抗原液と
し、その０．２ｍｌを、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　ｖウ
ス（雄、５週齢）の腹腔内に投与した。４週後、ヒトＩ
ｇＡ１００ｐｊｌを０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液０．
２−に溶解し、尾静脈に注射した。以後参考例１の（２
）〜＆４）の操作を行い抗ＩｇＡ抗体産生ハイブリドー
マ５クローンを得た。更に参考例１の（５）の操作を行
い抗ＩｇＡモノクローナル抗体５種類（Ａ　−２、Ａ−
３７゜Ａ−６４，Ａ−２０６，Ａ−２１５）を得た。各
クローンの抗体活性及びマウスＩｇＧ量（抗体の力価の
目安）は表１の通りであった。

表　　１ 参考例３．モノクローナル抗ヒトＣ３抗体及びこれを産
生ずるバイブリド−７の作製 ヒトＣＣ５５０ｐを溶解したＯ、１５Ｍ塩化ナトリウム
溶液０．１ｍｌとフロイントコンブリードアシュハント
０．１ｍ／を混合してエマルジョン抗原液とし、その０
．２ｍＪを、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（＃、６週
齢）の腹腔内に投与した。３週後、ヒト０３１００ｐ９
を０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液０．２ｍｌに溶解し、
尾静脈に注射した。

以後参考例１の（２）〜（４）の操作を行い、抗ヒトＣ
３抗体産生ハイブリドーマ４クローンを得た。

更に参考例１の（５）の操作を行い抗ヒトＣ３モノクロ
一ナル抗体４種類（Ｃ３−１，Ｃ３−７，、Ｃ３−９，
Ｃ５−１０）を得た。各クローンの抗体活性及びマウス
ＩｇＧ量（抗体の力価の目安）は表２の通りであった。

表　２．抗体活性とマウスＩｇＧ量 参考例４．モノクローナル抗ヒトトランスフェリン抗体
及びこれを産生ずるパイプリドニマの作製ヒトトランス
フェリン］　ＯＯＰｆｌを溶解した０、１５Ｍ塩化ナト
リウム溶液０．１ｒｎｌとフロイントコンプリートアジ
ュバント　０．］ｍ／を混合しＴエマルジョン抗原液と
し、その０．２ｍｌを、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス
（雌、６週齢）の腹腔内に投与した。３週後、ヒトトラ
ンスフェリン］　００　ｐ、を０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液０．２ｒｎｌに溶解し、尾静脈に注射した。

以後参考例１の（２）〜（４）の操作を行い、抗ヒトト
ランスフェリン抗体産生ハイブリドーマ４クローンを得
た。更に参考例１の（５）の操作を行い抗ヒトトランス
フェリンモノクローナル抗体４種類（ＴＦ−１，ＴＦ−
２，ＴＦ−３，ＴＦ−５）を得た。各クローンの抗体活
性及びマウスＩｇＧｆｆｉ（抗体の力価の目安）は表３
の通りであった。

表　３　　抗体活性とマウスＩｇＧ量 実施例１．モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を
用いたヒト血清ＩｇＧの測定 試薬：次の各試薬を調製した。

■　緩衝液（Ｒ１） ポリエチレングリコール８０００　　　　２．５ｇＯ，
＋Ｍトリス塩酸緩衝液、　ｐＨ７，４１００ｍ１■　抗
体溶液（Ｒ２） 参考例１で得たモノクローナル抗体Ｇ−５２ｍｊポリク
ローナル抗体（牛、５ｍｇＡｂ／ｍｌ）　　　１ｒｎｌ
上記緩衝液（Ｒ’）　　　　　　　　　　　　２０ｒｎ
ｌ試料：次の各ヒト血清を使用した。

ＩｇＧ含量４００．８００．１２００．１６００．２０
００又は３０００ｍｇ／　ｄｌのヒト血清。

使用機器：日立７０５型自動分析装置 パラメータ設定条件二表４に示す条件で設定した。

表４ ＲＩ、緩衝液 Ｒ２：抗体溶液 操作法：日立７０５型自動分析装置を上記条件でパラメ
ータ設定して常法により測定操作を行った。

結果：得られた吸光度（ＯＤ）を横軸の各ＩｇＧ　ｉ（
ｍｇ／ｄｌ）に対して縦軸にプロットして得た検量線を
第１図に示す。

比較例１゜ 実施例１で用いた抗体溶液からポリクローナル抗体のみ
を除いたものを抗体溶液として用いた以外は実施例１と
同一条件で測定して得た結果を実施例１と同様にして第
２図に示す。

第１図から明らかな如く、本発明の方法により得られた
検量線は、低濃度から高濃度まで良好な直線性を示して
いた。一方、モノクローナル抗体のみを抗体として用い
た比較例１の場合には、第２図から明らかな如く、低濃
度（１０００ｍｇ／　ｄｌ以下）では殆ど濁度が得られ
ず、またそれ以上の濃度に於ても検量線に直線性のない
ことが判フた。

実施例２．モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を
用いたヒト血清１ｇＡの測定 試薬：次の各試薬を調製した。

■　緩衝液（Ｒ１） ポリエチレングリコール６０００　　　　　４ｇ塩化ナ
トリウム　　　　　　　　　　　０．８ｇ０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液、　ｐＨ７，２］００ｍ／■　抗体溶液（Ｒ
２） 参考例２で得たモノクローナル抗体Ａ−３７０，４ｍｌ
参考例２で得たモノクローナル抗体Ａ−６４０，５ｍｌ
ポリクローナル抗体（羊、３ｍｇＡｂ／！ｎり　　０．
５ｍ！上記緩衝液（Ｒ’　）　　　　　　　　　　　　
１ｏｒｎｔ■　標準血清 ＩｇＡ含量７４０ｍｇ／ｄｆの標準血清を使用した。

試料：ヒト血清１５検体を使用した。

使用機器：日立７３６型自動分析装置 パラメータ設定条件二表５に示す条件で設定した。

Ｒ１，緩衝液 Ｒ２，抗体溶液 操作法：日立７３６型自動分析装置を上記条件でパラメ
ータ設定して常法により測定操作を行った。

比較例２゜ 実施例２で用いた抗体溶液からポリクローナル抗体のみ
を除いたものを抗体溶液として用いた以外は実施例２と
同一条件で同一試料を測定した。

キスト・ジャパン製）を用いてＩｇＡ濃度の測定を行っ
た。

実施例２、比較例２及び参考例５により得られた結果を
表６に併せて示す。

表　　６ ｙ＋＝＋、ｏｏＭ　＋　２．７１、ｒ＝０．９９９Ｙ２
＝１．０４Ｘ　−２４，７、と＝０．９９８表６から明
らかな如く、本発明の方法で得られた測定値は５ＲｒＤ
法によるそれと低濃度から高濃度まで良い相関を示して
いることが判る。また、モノクローナル抗体のみを抗体
として用いた比較例２の場合はＩ　ｇＡ　量１００ｍｇ
／ｄＺ以下の検体での測定値が低い。即ち、反応が充分
進行しておらず、低濃度（１００ｍｇ／ｄ１以下）で濁
度の形成が不充分な為に測定値が５ＲＩＤ法に比べて低
値に測定されていることが判る。

実施例３．モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を
用いたヒト血清Ｃ３の測定 試薬二次の各試薬を調製した。

■　緩衝液（Ｒ’） ポリエチレングリコール６０００　　　　３．５ｇ塩化
ナトリウム　　　　　　　　　　　０．９ｇ１０ｍＭベ
ロナール緩衝液、　ｐＨ７，５］００ｒｆｆ■　抗体溶
液（Ｒ２） 参考例３で得たモノクローナル抗体Ｃ３−１０，２ｒｎ
！参考例３で得たモノクローナル抗体（：３−７　　０
．２ｍＺポリクローナル抗体（兎、２ｍｇＡｂ／ｍｔ）
　　　１ｍ１上記緩衝液（Ｒ’）　　　　　　　　　　
　　５ｏｙｎｔ試料二次の各ヒト血清を使用した。

Ｃ３合量２０，１１０，８０，１２０，１６０，２００
又は２４０ｍｇ／ｄｌｌのヒト血清。

操作法：試験管に試料をそのまま２０ＩＬ！をとり、こ
れに抗体溶液２ｒｎ！を添加して３７℃で１０分間反応
させた後、分光光度計で層長１０ｍｍ、波長５０５ｎｍ
に於ける吸光度を測定した。

比較例３゜ 実施例３で用いた抗体溶液からポリクローナル抗体のみ
を除いたものを抗体溶液として用いた以外は実施例３と
同一条件で同一試料を測定した。

実施例３及び比較例３により得られた結果を併せて第３
図に示す。ここで−・−は実施例３により得られた測定
結果を、−〇−は比較例３により得られた測定結果を示
し、夫々横軸の各Ｃ３量（ｍｇ／ｄ１　）について得ら
れた吸光度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである。

第３図から明らかな如く、モノクローナル抗体とポリク
ローナル抗体を組み合わせて用いた実施ｇ１Ｉ３（Ｄ場
合、０３　Ｊ！２（１〜２４０ｍｇ／ｄｌ（Ｄ範囲で検
ｉｔａは直線性を示し、Ｃ３低濃度から高濃度の広い範
囲で良好な定量性を示すか、モノクローナル抗体のみを
用いた比較例３の場合は、ｃ３３低濃域での定量性が著
しく悪く、充分な濁度が形成されていないことが判る。

実施例４．モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を
用いたヒト血清トランスフェリンの測定試薬二次の各試
薬を調製した。

■　緩衝液（Ｒ１） ポリエチレングリコール６０００　　　　　３ｇ塩化ナ
トリウム　　　　　　　　　　　０．９ｇ０．０５Ｍホ
ウ酸Ｍ＃液、　ｐＨ７，４１００ｍ１■　抗体溶液（Ｒ
２） 参考例４で得たモノクローナル抗体ＴＦ−２１ｒｎｌ参
考例斗で得たモノクローナル抗体ＴＦ−５ｌＩｎ！ポリ
クローナル抗体（山羊、３．４ｍｇＡｂ／＋＋Ｌｌ）　
　　　１ｍｌ上書と緩衝＊（Ｒ９５０ｍ１ 試料：次の各ヒト血清を使用した。

トランス７　ｙ−リン含量５０，１００，２００，３０
０，４００，８００又は８００ｍｇ／ｄ９のヒト血清。

操作法：レーザーネフェロメーターＺＤ−８０１（和光
純薬工業■製）用キュベツトに試料をそのまま１０ｐｌ
とり、これに抗体溶液５００４を添加して室温で１５分
間反応させた後、レーザーネフェロメーターＺＤ−８０
１で、波長６３３ｎｍに於ける光散乱強度を測定した。

比較例４゜ 実施例４で用いた抗体溶液からポリクローナル抗体のみ
を除いたものを抗体溶液として用いた以外は実施例４と
同一条件で同一試料を測定した。

比較例５゜ 実施例４で用いた抗体溶液からモノクローナル抗体のみ
を除いたものを抗体溶液として用いた以外は実施例４と
同一条件で同一試料を測定した。

実施例４、比較例４、及び比較例５により得られた結果
を第４図に併せて示す。ここで−・−は実施例４により
得られた測定結果を、−〇−は比較例４により得られた
結果を、−×−は比較例５で得られた結果を示し、夫々
横軸の各トランスフェリン量（Ｉｌ１ｇ／ａ　）につい
て得られた光散乱強度（ｍ　Ｖ　）を縦軸に沿ってプロ
ットした点を結んだものである。

第４図から明らかな如く、モノクローナル抗体とポリク
ローナル抗体を組み合わせて用いた実施例４の場合はト
ランスフェリン量と光散乱強度はほぼ比例的に増加する
が、モノクローナル抗体のみを用いた比較例４の場合、
トランスフェリン量の低い試料（５０，１００，２０（
ｌ　ｍｇ／ｄｌ）では濁度の形成が殆ど起こらなかった
。

またポリクロナール抗体のみを用いた比較例５の場合は
、トランスフェリン量］００ｍｇ／ｄＪ以上で抗原過剰
による濁度形成の抑制が起こり、濁度低下が起こったこ
とが判る。

［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は、血清、血漿、尿等ヒト体液
中の蛋白を抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法によ
り効果的に判定する方法を提供するものであり、本発明
の方法によれば、（１）試料を希釈せずにそのまま測定
に供することができるので、希釈操作に伴う煩雑さ及び
誤差を排除できる。

（２）ポリエチレングリコール等の凝集促進剤を大量に
使用する必要がないので、不所望の非特異的凝集反応が
起こることもなく、それにより測定値が影響を受けるこ
ともない。

（３）低濃度から高濃度まで広い濃度域に於て結反の高
い測定を行うことができる。

（４）同一試料について多項目の測定を行う自動分析装
置への適用が極めて容易である。

等の点に顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献す
るところ甚だ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各１ｇＧ量（ｒｎｇ／ｄｌ＞について得られた吸光
度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもの
である。 第２図は、比較例１に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各ＩｇＧ量（ｍｇ／ｄｆ）について得られた吸光度
（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 第３図は実施例３及び比較例３に於て得られた検量線を
表わし、横軸の各Ｃ３Ｍ　（ｍｇ／ｄｌ）について得ら
れた吸光度（ＯＤ）を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである。但し、−・−は実施例３に於て得られ
た結果を、また−〇−は比較例３に於て得られた結果を
示す。 第４図は実施例４、比較例４及び比較例５に於て得られ
た検量線を表わし、横軸の各トランスフェリン量（ｍｇ
／ｄｌ）について得られた光散乱強度（ｍＶ）を縦軸に
沿ってプロットした点を結んだものである。但し、−・
−は実施例４に於て得られた結果を、また−〇−は比較
例４に於て得られた結果を、また、−×−は比較例５に
於て得られた結果を夫々示す。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 第２図 ＩｖＧ量（す／ｄ１） 第３図 Ｃ３量（ｍ引／ｄＱ　）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原抗体反応により生成する抗原抗体複合物に光
   を照射し、その光学的変化を測定することにより生体試
   料中の蛋白を定量する方法に於て、生体試料を希釈せず
   にそのまま使用し、測定対象蛋白に対する抗体として、
   該蛋白に対するモノクローナル抗体１種以上と該蛋白に
   対するポリクローナル抗体とを組み合わせて用いてこれ
   を行うことを特徴とする生体試料中の蛋白の定量方法。
2. （２）モノクローナル抗体がマウスの腫瘍ラインからの
   細胞と、測定対象のヒト蛋白で予め免疫されたマウスの
   脾細胞との融合により形成されたハイブリドーマより産
   生されるモノクローナル抗ヒト該蛋白抗体である特許請
   求の範囲第１項に記載の定量方法。
3. （３）ポリクローナル抗体が測定対象蛋白を免疫して得
   た、兎、山羊、羊、馬、牛から得たポリクローナル抗体
   である特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の定量方
   法。
4. （４）光学的変化量が光散乱強度の変化量である、特許
   請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の定量方
   法。
5. （５）光学的変化量が透過光量の変化量である特許請求
   の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の定量方法。
6. （６）測定対象が免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グ
   ロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、
   補体Ｃ３、トランスフェリン、ハプトグロビン、α＿１
   −アンチトリプシン、アルブミン、アポリポ蛋白Ａ I
   、アポリポ蛋白ＡII又はα＿２−マクログロブリンであ
   る特許請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の
   定量方法。