JPS63214199A - 生体物質のエンザイムアツセイ - Google Patents
生体物質のエンザイムアツセイInfo
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- JPS63214199A JPS63214199A JP62047725A JP4772587A JPS63214199A JP S63214199 A JPS63214199 A JP S63214199A JP 62047725 A JP62047725 A JP 62047725A JP 4772587 A JP4772587 A JP 4772587A JP S63214199 A JPS63214199 A JP S63214199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、生体物質の酵素分析法に関し、更に詳細には
、本発明は、過酸化水素（Ｈ２０□）含意のエンザイム
アッセイつまり、生物学的液体例えば血中や尿中に含ま
れる物質、又は１１□０２を反応生成物とする生体物質
を分析する方法に関するものである。したがって本発明
によれば、試料に存在するＨ、Ｏ□生成に関する多様な
前駆物質の量が定量され、それに対応して本発明は、そ
のような前駆物質をオキシダーゼで処理してＨ２Ｏ２の
量を定量することによって試料中の前駆物質の量、又は
それに関する酵素の定量をも包含するものである。
、本発明は、過酸化水素（Ｈ２０□）含意のエンザイム
アッセイつまり、生物学的液体例えば血中や尿中に含ま
れる物質、又は１１□０２を反応生成物とする生体物質
を分析する方法に関するものである。したがって本発明
によれば、試料に存在するＨ、Ｏ□生成に関する多様な
前駆物質の量が定量され、それに対応して本発明は、そ
のような前駆物質をオキシダーゼで処理してＨ２Ｏ２の
量を定量することによって試料中の前駆物質の量、又は
それに関する酵素の定量をも包含するものである。
（従来の技術）
従来、Ｈ８０８を検出系に用いる基質又は酵素の測定法
において、生成したＨ２Ｏ，を定量する方法としては、
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で水素供与体と電
子又はラジカル受容体（カプラー）を酸化縮合させ、
Ｈ，Ｏ，で着色物質を生成せしめ、これを比色定量する
手法が知られている。水素供与体として、比色試薬は一
般にジメチルアニリン、ジエチルアニリン、０−トリジ
ン、０−トルイジン、ｐ−トルイジン、０−フェニレン
ジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル−Ｎ
′−サクシニルエチレンジアミン）、 Ｎ、Ｎ’−ジメ
チル−ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、０−アニ
シジン、ｐ−アニシジン、ジアニシジン、０−クレゾー
ル、Ｐ−クロロフェノール。
において、生成したＨ２Ｏ，を定量する方法としては、
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で水素供与体と電
子又はラジカル受容体（カプラー）を酸化縮合させ、
Ｈ，Ｏ，で着色物質を生成せしめ、これを比色定量する
手法が知られている。水素供与体として、比色試薬は一
般にジメチルアニリン、ジエチルアニリン、０−トリジ
ン、０−トルイジン、ｐ−トルイジン、０−フェニレン
ジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル−Ｎ
′−サクシニルエチレンジアミン）、 Ｎ、Ｎ’−ジメ
チル−ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、０−アニ
シジン、ｐ−アニシジン、ジアニシジン、０−クレゾー
ル、Ｐ−クロロフェノール。
Ｎ、Ｎ−ジエチルメタトルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（
２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル リウム（ＴＤＯＳ）、鵬−クレゾール、αーテフトール
、β−ナフトール、カテコール、グアイアコール、ピロ
ガロール、２，７−ジアミツフルオレン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエチレン
ジアミン、ロイコインドフェノール、２，４−ジクロロ
フェノール、２−ヒドロキシル−３，５−ジクロロベン
ゼンスルホン酸のような化合物を含むものである．カプ
ラーとしての比色試薬は、一般に２−チオフェネカルボ
ン酸ヒドラジン、ベンジジン、３−メチル−２−ベンズ
チアゾリノン・ヒドラゾン、および４−アミノアンチモ
ンのような化合物を含むものである。
２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル リウム（ＴＤＯＳ）、鵬−クレゾール、αーテフトール
、β−ナフトール、カテコール、グアイアコール、ピロ
ガロール、２，７−ジアミツフルオレン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエチレン
ジアミン、ロイコインドフェノール、２，４−ジクロロ
フェノール、２−ヒドロキシル−３，５−ジクロロベン
ゼンスルホン酸のような化合物を含むものである．カプ
ラーとしての比色試薬は、一般に２−チオフェネカルボ
ン酸ヒドラジン、ベンジジン、３−メチル−２−ベンズ
チアゾリノン・ヒドラゾン、および４−アミノアンチモ
ンのような化合物を含むものである。
又，過酸化物活性化剤としてパーオキシダーゼの他にタ
ングステン酸，タングステン酸の塩、モリブデン酸，モ
リブデン酸の塩、ヨウ化物とこれら無機化合物の１つと
の混合物等がある。
ングステン酸，タングステン酸の塩、モリブデン酸，モ
リブデン酸の塩、ヨウ化物とこれら無機化合物の１つと
の混合物等がある。
しかし、このような従来法によれば、感度が低いこと、
悪臭があること、試薬安定性が悪い事。
悪臭があること、試薬安定性が悪い事。
血清等検体によってはヘモグロビンやビリルビン等色素
体の色調に影響を受けやすい事、又，相対的な測定しか
できないから試薬ブランクの変動に対して安定したデー
タが得られないという欠点を有するものであった。
体の色調に影響を受けやすい事、又，相対的な測定しか
できないから試薬ブランクの変動に対して安定したデー
タが得られないという欠点を有するものであった。
又、Ｈ，Ｏ□をエタノール又はメタノールとともにカタ
ラーゼを反応させ、生成するアセトアルデヒド又は、ホ
ルムアルデヒドをそれぞれアセトアルデヒド脱水素酵素
、ホルムアルデヒド脱水素酵素を添加し、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの増加によって測定する方法も知られている。
ラーゼを反応させ、生成するアセトアルデヒド又は、ホ
ルムアルデヒドをそれぞれアセトアルデヒド脱水素酵素
、ホルムアルデヒド脱水素酵素を添加し、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの増加によって測定する方法も知られている。
しかしアセトアルデヒドの場合、アルコールを多飲する
ようなヒトの検体では血中や尿中に大量のアセトアルデ
ヒドが含有されるので、正確な測定が困難であった．そ
れらの問題点の対策として内因性の物質の影響の回避法
が実施されている。
ようなヒトの検体では血中や尿中に大量のアセトアルデ
ヒドが含有されるので、正確な測定が困難であった．そ
れらの問題点の対策として内因性の物質の影響の回避法
が実施されている。
第１の方法は，消去段階でカタラーゼを用い消去完了後
，アジ化ナトリウムによってカタラーゼ活性を停止し，
その後反応生成物としてＦｌ，０□を生成する酵素又は
基質を添加し、ＰＯＤ発色系によって測定するものであ
る．これは、カタラーゼがアジ化ナトリウムによって完
全に停止するかが不明である事又は、ＰＯＤ等のオキシ
ダーゼ酵素全般において阻害作用がある事等に問題を有
する。
，アジ化ナトリウムによってカタラーゼ活性を停止し，
その後反応生成物としてＦｌ，０□を生成する酵素又は
基質を添加し、ＰＯＤ発色系によって測定するものであ
る．これは、カタラーゼがアジ化ナトリウムによって完
全に停止するかが不明である事又は、ＰＯＤ等のオキシ
ダーゼ酵素全般において阻害作用がある事等に問題を有
する。
第２の方法は，影響物質に直接的又は、他の酵素や基質
の存在のもとで間接的にオキシダーゼを作用させ、生じ
たＨ２Ｏ２をＰＯＤの存在下で水素供与体と縮合させ、
可視部に吸収を示さない不活性な化合物を生成させる事
によって消去した後、測定を開始させるものである（特
公昭５７−２９１５９号）。
の存在のもとで間接的にオキシダーゼを作用させ、生じ
たＨ２Ｏ２をＰＯＤの存在下で水素供与体と縮合させ、
可視部に吸収を示さない不活性な化合物を生成させる事
によって消去した後、測定を開始させるものである（特
公昭５７−２９１５９号）。
しかし実際は可視部に少しながら吸収を有し、比色測定
に，とりわけ、微量の体液物質の測定に正の誤差を与え
てしまう欠点を有する。
に，とりわけ、微量の体液物質の測定に正の誤差を与え
てしまう欠点を有する。
第３の方法は，特開昭６１−１７３７に示されるように
，共存するＰＯＤの１０倍以下のカタラーゼを使用する
事によりアジ化ナトリウムの添加を不用にできる事も公
知．である、しかし、この場合もカタラーゼ活性を停止
せずに測定を開始するので，測定中にカタラーゼによる
Ｈ， ０，の分解は避けられず、負の誤差ができる事は
明らかである。
，共存するＰＯＤの１０倍以下のカタラーゼを使用する
事によりアジ化ナトリウムの添加を不用にできる事も公
知．である、しかし、この場合もカタラーゼ活性を停止
せずに測定を開始するので，測定中にカタラーゼによる
Ｈ， ０，の分解は避けられず、負の誤差ができる事は
明らかである。
このように、いずれも何らかの問題を有している。
（発明が解決しようとする問題点）
上記したようにペルオキシダーゼ法は，感度が低く正確
な測定ができない等の欠点があるし、カタラーゼ法にお
いても、正確な測定を行うために実施されている内因性
物質の除去も満足のいくような結果は得られないという
欠点があり、いずれも既知の方法には問題がある。
な測定ができない等の欠点があるし、カタラーゼ法にお
いても、正確な測定を行うために実施されている内因性
物質の除去も満足のいくような結果は得られないという
欠点があり、いずれも既知の方法には問題がある。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、上記した欠点のない全く新規なＨ，０□を反
応生成物とする、生体物質の定量方法を開発するために
なされたものであるが，検体を希釈することなく簡単に
しかも他のものに影響を受けず又、自動分析装置に応用
可能な方法が望まれているという業界の要望に応えるに
は紫外部での吸光度測定が最適であるとの観点にたち、
新規なエンザイムアッセイに開発するためになされたも
のである。
応生成物とする、生体物質の定量方法を開発するために
なされたものであるが，検体を希釈することなく簡単に
しかも他のものに影響を受けず又、自動分析装置に応用
可能な方法が望まれているという業界の要望に応えるに
は紫外部での吸光度測定が最適であるとの観点にたち、
新規なエンザイムアッセイに開発するためになされたも
のである。
上記の目的を達するために酵素分析、酵素学、生化学１
分析化学等多分野に亘って鋭意研究した結果１本発明が
完成されたものである。すなわち、本発明はＨ２０，を
検出系に用いる基質又は酵素の測定法において検出系に
必要なすべての酵素又は酵素群、基質又は基質群を添加
し、生成した物質にオキシダーゼを作用させ、生成した
Ｈ、 ０２に還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下に
ＧＳＩ（ＰＯＤの作用により生成した酸化型ＧＳ）ｌ
（ＧＳＳＧ）をＧＳＨ還元酵素（ＧＲ）によってＮＡＤ
ＰＨ又はＮＡＤＨからＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ＋を生成さ
せ、紫外部の吸光度変化で該生成したＨ８０．を測定す
る事によって目的の基質又は、酵素を測定する際に、あ
らかじめ、検体中に存在する測定系に関与し測定誤差を
生じる内因性物質をイソクエン酸、金属イオン及びイソ
クエン酸脱水素酵素（ｉＣＤＨ）の共役反応によって消
費し、消去終了後金属キレート剤を添加し、１ＣＤ）Ｉ
の反応を完全に停止し、これと同時又はしかる後最終反
応生成物として過酸化水素を生じる酵素又は基質を添加
し、それによって生成するＨｔＯ，を何れの物質の影響
も受けることなく測定する事を特徴としたＨ、 Ｏ，を
反応生成物とする生体物質の定電法である。以下１本発
明の詳細な説明する。
分析化学等多分野に亘って鋭意研究した結果１本発明が
完成されたものである。すなわち、本発明はＨ２０，を
検出系に用いる基質又は酵素の測定法において検出系に
必要なすべての酵素又は酵素群、基質又は基質群を添加
し、生成した物質にオキシダーゼを作用させ、生成した
Ｈ、 ０２に還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下に
ＧＳＩ（ＰＯＤの作用により生成した酸化型ＧＳ）ｌ
（ＧＳＳＧ）をＧＳＨ還元酵素（ＧＲ）によってＮＡＤ
ＰＨ又はＮＡＤＨからＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ＋を生成さ
せ、紫外部の吸光度変化で該生成したＨ８０．を測定す
る事によって目的の基質又は、酵素を測定する際に、あ
らかじめ、検体中に存在する測定系に関与し測定誤差を
生じる内因性物質をイソクエン酸、金属イオン及びイソ
クエン酸脱水素酵素（ｉＣＤＨ）の共役反応によって消
費し、消去終了後金属キレート剤を添加し、１ＣＤ）Ｉ
の反応を完全に停止し、これと同時又はしかる後最終反
応生成物として過酸化水素を生じる酵素又は基質を添加
し、それによって生成するＨｔＯ，を何れの物質の影響
も受けることなく測定する事を特徴としたＨ、 Ｏ，を
反応生成物とする生体物質の定電法である。以下１本発
明の詳細な説明する。
本発明は２つの反応系より成り、まず第１の反応系はＨ
３Ｏ８の検出系となる反応で、反応系は次の（１）式で
表される。
３Ｏ８の検出系となる反応で、反応系は次の（１）式で
表される。
Ｈ３０，を検出系に用いる酵素及び基質を測定する際、
生成したＨ３０．をＧＳＨの充分存在する中でＧＳＨＰ
ＯＤと反応させ、生成するＧ５５ＧをＧＲによって還元
し、それにともなうＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を通常波長３
４０ｎ園で測る事によって定量する方法である。すなわ
ち本発明の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少による吸光度
の減少を測定するため、測定波長は検体等の色調の影響
を受けず１分子吸光係数も既知であるので最も正確に測
定できるのである。又過剰量のＧＳＨが加えられている
ため、システィン、ＧＳＨ、アスコルビン酸等還元性物
質の影響を受けにくい方法である。
生成したＨ３０．をＧＳＨの充分存在する中でＧＳＨＰ
ＯＤと反応させ、生成するＧ５５ＧをＧＲによって還元
し、それにともなうＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を通常波長３
４０ｎ園で測る事によって定量する方法である。すなわ
ち本発明の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少による吸光度
の減少を測定するため、測定波長は検体等の色調の影響
を受けず１分子吸光係数も既知であるので最も正確に測
定できるのである。又過剰量のＧＳＨが加えられている
ため、システィン、ＧＳＨ、アスコルビン酸等還元性物
質の影響を受けにくい方法である。
次に第２の反応系である測定に消去を与える体液中の内
因性物質を消去する系（消去系）を式（２）に示す０本
発明の消去系の特徴は消去に際して減少したＮＡＤ（Ｐ
）Ｈをイソクエン酸及び金属イオンの存在下で１ＣＤＨ
によってＮＡＤ（Ｐ）”から再生することにある。
因性物質を消去する系（消去系）を式（２）に示す０本
発明の消去系の特徴は消去に際して減少したＮＡＤ（Ｐ
）Ｈをイソクエン酸及び金属イオンの存在下で１ＣＤＨ
によってＮＡＤ（Ｐ）”から再生することにある。
（式中、α−ＫＧ： α−ケトグルタル酸）そもそも
血清、尿等生物検体中には、Ｇ５５Ｇや過酸化物をはじ
めとするＧＳＨを酸化する物質と同時に測定対象物であ
る基質や酵素等の生体物質を測定する反応系に関与し、
しかも測定に誤差を与える物質１例えば、トリグリセラ
イドの場合：遊離グリセロール、グリセロール−３−リ
ン酸；クレアチニンの場合：クレアチン、ザルコシン；
クレアチンの場合：ザルコシン；エステル型コレステロ
ールの場合：遊離コレステロール：レシチン、リゾレシ
チン、スフィンゴミエリン等リン脂質の場合：コリン；
遊離脂肪酸の場合ニアセチルＣｏＡ ；コリンエステラ
ーゼの場合：コリン、オルソトルオイルコリン；アミラ
ーゼの場合：マルトース、グルコース；モノアミンオキ
シダーゼの場合：アリルアミン；無機リンの場合：ヒポ
キサンチン；トランスアミナーゼの場合：オキザロ酢酸
、ピルビン酸；シアル酸の場合：Ｎ−７セチルノイラミ
ン酸、ピルビン酸；グアナーゼの場合：キサンチン；α
−グルコースの場合：β−グルコース等が検体中に含ま
れる場合、それらを検出系に必要な酵素及び酵素群、基
質及び基質群を添加し、それによって生成した内因性物
質に由来するＨ、 ０．をＧＳＨＰＯＤ。
血清、尿等生物検体中には、Ｇ５５Ｇや過酸化物をはじ
めとするＧＳＨを酸化する物質と同時に測定対象物であ
る基質や酵素等の生体物質を測定する反応系に関与し、
しかも測定に誤差を与える物質１例えば、トリグリセラ
イドの場合：遊離グリセロール、グリセロール−３−リ
ン酸；クレアチニンの場合：クレアチン、ザルコシン；
クレアチンの場合：ザルコシン；エステル型コレステロ
ールの場合：遊離コレステロール：レシチン、リゾレシ
チン、スフィンゴミエリン等リン脂質の場合：コリン；
遊離脂肪酸の場合ニアセチルＣｏＡ ；コリンエステラ
ーゼの場合：コリン、オルソトルオイルコリン；アミラ
ーゼの場合：マルトース、グルコース；モノアミンオキ
シダーゼの場合：アリルアミン；無機リンの場合：ヒポ
キサンチン；トランスアミナーゼの場合：オキザロ酢酸
、ピルビン酸；シアル酸の場合：Ｎ−７セチルノイラミ
ン酸、ピルビン酸；グアナーゼの場合：キサンチン；α
−グルコースの場合：β−グルコース等が検体中に含ま
れる場合、それらを検出系に必要な酵素及び酵素群、基
質及び基質群を添加し、それによって生成した内因性物
質に由来するＨ、 ０．をＧＳＨＰＯＤ。
ＧＲで消去し、それによって消費されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
をイソクエン酸、 １ＣＤＨ、マグネシウムイオン、マ
ンガンイオン等の金属イオンの共役反応によってＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを再生し、その後キレート剤で１ＣＤＨの活性
を止め、ＮＡＤ （Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの反応
を完全に停止させ、これと同時もしくはしかる後反応生
成物としてＨ，０，を生成せしめる酵素又は基質を添加
してＨ，０２を最終反応生成物とする測定対象物を。
をイソクエン酸、 １ＣＤＨ、マグネシウムイオン、マ
ンガンイオン等の金属イオンの共役反応によってＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを再生し、その後キレート剤で１ＣＤＨの活性
を止め、ＮＡＤ （Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの反応
を完全に停止させ、これと同時もしくはしかる後反応生
成物としてＨ，０，を生成せしめる酵素又は基質を添加
してＨ，０２を最終反応生成物とする測定対象物を。
他の物質の影響を受げず、正確に測定できるところに本
発明の特徴を有する。尚１本発明の測定系にスーパーオ
キシドジスムターゼをさらに添加してもさしつかえない
。
発明の特徴を有する。尚１本発明の測定系にスーパーオ
キシドジスムターゼをさらに添加してもさしつかえない
。
ここで金属イオンとは、マグネシウムイオン、マンガン
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン
、カルシウムイオン等を云うが、これらのイオン種の制
限されることはない。
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン
、カルシウムイオン等を云うが、これらのイオン種の制
限されることはない。
又、キレート剤とはＥＤＴＡおよびその塩、１，２−ビ
ス（０−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、 Ｎ、 Ｎ’
、 Ｎ’−四酢酸およびその塩、ｌ、３−ジアミノプロ
パノ−ルーＮ。
ス（０−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、 Ｎ、 Ｎ’
、 Ｎ’−四酢酸およびその塩、ｌ、３−ジアミノプロ
パノ−ルーＮ。
Ｎ、 Ｎ’、 Ｎ’−四酢酸およびその塩、ジエチレン
トリアミン五酢酸、およびその塩、ジエチレンジアミン
ジオルドヒドロキシフェニル酢酸およびその塩。
トリアミン五酢酸、およびその塩、ジエチレンジアミン
ジオルドヒドロキシフェニル酢酸およびその塩。
エチレンジアミンニ酢酸およびその塩、エチレンジアミ
ンニプロピオン酸およびその塩、ヒドロキシエチルエチ
レンジアミン三酢酸およびその塩、エチレンジアミンテ
トラキス（メチレンホスホン酸）およびその塩、グリコ
ールエーテルジアミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシ
エチルイミノニ酢酸およびその塩、イミノニ酢酸および
その塩。
ンニプロピオン酸およびその塩、ヒドロキシエチルエチ
レンジアミン三酢酸およびその塩、エチレンジアミンテ
トラキス（メチレンホスホン酸）およびその塩、グリコ
ールエーテルジアミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシ
エチルイミノニ酢酸およびその塩、イミノニ酢酸および
その塩。
ジアミノプロパン四酢酸及びその塩、ニトリロ三酢酸お
よびその塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニ
トリロトリス（メチレンホスホン酸）およびその塩、ト
リエチレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが
、これらのキレート剤に制限されることはない。
よびその塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニ
トリロトリス（メチレンホスホン酸）およびその塩、ト
リエチレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが
、これらのキレート剤に制限されることはない。
本発明によってＨ，０□を反応生成物とする定量可能な
基質及び酵素の測定におけるＨ、０□生成系は。
基質及び酵素の測定におけるＨ、０□生成系は。
下記のごときものがあるが、これは説明のために例示し
たものであって１本発明の限定を意図するものではない
。
たものであって１本発明の限定を意図するものではない
。
グリセロール＋ＡＴＰ−−→グリセロ−ノド３−リン酸
＋ＡＤＰＲＣＯＯＨ＋ ＡＴＰ ＋ ＣｏＡ
Ａｃｙｌ−ＣｏＡ ＋ ＡＭＰ ＋ ＰＰ１Ａ
ｃｙｌ−ＣｏＡ ＋ ０． ２．３−
Ｔｒａｎｓ−ｅｎｏｙｌｃｏＡ ＋ Ｈ，Ｏ。
＋ＡＤＰＲＣＯＯＨ＋ ＡＴＰ ＋ ＣｏＡ
Ａｃｙｌ−ＣｏＡ ＋ ＡＭＰ ＋ ＰＰ１Ａ
ｃｙｌ−ＣｏＡ ＋ ０． ２．３−
Ｔｒａｎｓ−ｅｎｏｙｌｃｏＡ ＋ Ｈ，Ｏ。
コリン十〜 ベタイン＋２１（２へアミ
ラーゼ マルトペンタオース マルトトリオース＋
マルトースＣＨ−ｔ４Ｋ ＋ ０． ＋ Ｈ，Ｏ、＝Ｃ
ＨＣＨＯ＋ ＮＨ３＋馬へＨ，ＰＯ４＋イノシン
ヒボキサンチン＋リポース−１−リン酸トア
スパラギン酸＋α−ケトグルタ／１４オキザロ酢酸＋Ω
−グルタミン酸 ピルビン酸中Ｑ−グルタミン酸 Ｎ−アセチルノイラミン酸＋へ Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン＋ピルビン酸次に本発
明を具体的に説明するために下記に実施例を示す。
ラーゼ マルトペンタオース マルトトリオース＋
マルトースＣＨ−ｔ４Ｋ ＋ ０． ＋ Ｈ，Ｏ、＝Ｃ
ＨＣＨＯ＋ ＮＨ３＋馬へＨ，ＰＯ４＋イノシン
ヒボキサンチン＋リポース−１−リン酸トア
スパラギン酸＋α−ケトグルタ／１４オキザロ酢酸＋Ω
−グルタミン酸 ピルビン酸中Ｑ−グルタミン酸 Ｎ−アセチルノイラミン酸＋へ Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン＋ピルビン酸次に本発
明を具体的に説明するために下記に実施例を示す。
実施例１
０．６ｍＭオキソン酸、２ｍＭ ＧＳＨ，０，５ｍＭ
ＮＡＤＰＨ，２鳳阿ＮａＮ３、０．５ｕ／ｍｕ ＧＲ
ｌ ｌｕ／＠ｎ ＧＳＨＰＯＤ、 ｌｕ／ｍＱ ｉ
ＣＤＨ１５ａＭイソクエン酸、０．２ｍＭ ＭｇＣ１，
を含む０．１ＭＫ−ｐｏいｐｉ（７，５溶液１ 、５ｍ
Ｍに、検体として、 １２０ｍｇ／ｄｆｌの尿酸を順次
希釈したものを７５μＱ注入し、混和後３７℃で３〜５
分間放置し、その後９ｕ／層Ｑウリカーゼ、２０ｍＭＥ
ＤＴＡ−４Ｎａを含む０．１ＭＫ−ｐｏ４． ＰＩ（７
，５溶液１．５ｉＩＭを加え、混和し、３７℃で反応さ
せ、 ３４０ｎｍの吸光度の減少を３分間測定した。
ＮＡＤＰＨ，２鳳阿ＮａＮ３、０．５ｕ／ｍｕ ＧＲ
ｌ ｌｕ／＠ｎ ＧＳＨＰＯＤ、 ｌｕ／ｍＱ ｉ
ＣＤＨ１５ａＭイソクエン酸、０．２ｍＭ ＭｇＣ１，
を含む０．１ＭＫ−ｐｏいｐｉ（７，５溶液１ 、５ｍ
Ｍに、検体として、 １２０ｍｇ／ｄｆｌの尿酸を順次
希釈したものを７５μＱ注入し、混和後３７℃で３〜５
分間放置し、その後９ｕ／層Ｑウリカーゼ、２０ｍＭＥ
ＤＴＡ−４Ｎａを含む０．１ＭＫ−ｐｏ４． ＰＩ（７
，５溶液１．５ｉＩＭを加え、混和し、３７℃で反応さ
せ、 ３４０ｎｍの吸光度の減少を３分間測定した。
直線関係の良い部分を読みとり、１分間あたりの吸光度
変化（ΔＡ３４゜ｎｍ／分）を算出した。
変化（ΔＡ３４゜ｎｍ／分）を算出した。
次表に示す結果が得られた。
表に示した通り、試薬比１：４０で尿酸１２０ｍｇ／ｄ
ｆｆｉまで直線性が得られた。
ｆｆｉまで直線性が得られた。
実施例２
次の成分
２ 履Ｍ ＧＳＨ
Ｏ６５■に ＮＡＤＰＨ
２鴎に アジ化ナトリウム
０．５ｕ／ａｎ ＧＲ
２ｕ／ｕｎ １ＣＤＨ
１０ｒａｎ イソクエン酸
１ ｕ／ｍＱ ＧＳＨＰＯＤ
Ｏ０２鳳Ｍ ＭｇＣ１゜以上を含有す
る０、１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０） １
．５ｍ１２に、０〜３００ｍｇ／ｄｎに希釈したコレス
テロール水溶液を２０μＱ添加し、３７℃で５分間放置
する。その後２０＋ｓＭＥＤＴＡ−４Ｎａ及び６ｕ／ｍ
Ｒのコレステロールオキシダーゼを含む０．１Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＦ＋ ７．０） １．５ｔＲを添加
後３７℃で１５分間放置し。
る０、１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０） １
．５ｍ１２に、０〜３００ｍｇ／ｄｎに希釈したコレス
テロール水溶液を２０μＱ添加し、３７℃で５分間放置
する。その後２０＋ｓＭＥＤＴＡ−４Ｎａ及び６ｕ／ｍ
Ｒのコレステロールオキシダーゼを含む０．１Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＦ＋ ７．０） １．５ｔＲを添加
後３７℃で１５分間放置し。
恒温槽から取り出し、室温で約１０分間放湿した後。
波長３４０ｎｍで吸光度を測定した。
次表に示す結果が得られた。
表に示した通り試薬比１：１５０で検体中のコレステロ
ールが定量され、直線性も良好であった。
ールが定量され、直線性も良好であった。
コレステロール量の計算式は次のとおりである。
ただし
６．２ ＝ＮＡＤＰＨのｌｄの吸光度
３．０２℃全反応液量（ｄ）
０．０２℃検体量（ｔｌｌ）
３８６．６４＝コレステロールの分子量実施例３
次の成分
５ ｕ／ｍｊｌ マルトースホスホリラーゼ１０
ｕ／−グルコースオキシダーゼ０．２ｍＭ
ＭｇＣｌ□ １．５ｍＭ ＧＳＨ Ｏ，３８ｓ＋Ｍ ＮＡＤＰＨＯ，７５ｕ
／ｍｆｆ１ ＧＲｌ、５ ｕ／ｍＱ
ＧＳＨＰＯＤｌ、５ ｕ／ｍｆｆ１ ｉ ＣＤ
Ｈ７，５鳳阿 イソクエン酸 ０．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）以上
の反応液２ｍＭに、アミラーゼ活性の既知の患者血清検
体Ａ １５２ｕ／Ｌ Ｂ ３２９ｕ／１２． Ｃ１９２
ｕ／Ｒ１Ｄ ２１１ｕ／Ｌ Ｅ ４３６ｕ／ｊ２を、ｓ
ｏμｍ注入し、混和後３７℃で３〜５分間放置し、その
後、０．０３ｍＭマルトペンタオース、 ３０■Ｍ Ｅ
ＤＴＡを含む０．ＩＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
１ｔＱを加え混和し、３７℃で反応させ３４０ｎ−での
１分間あたりの吸光度の変化量を測定した６次の表のよ
うな結果を得た。
ｕ／−グルコースオキシダーゼ０．２ｍＭ
ＭｇＣｌ□ １．５ｍＭ ＧＳＨ Ｏ，３８ｓ＋Ｍ ＮＡＤＰＨＯ，７５ｕ
／ｍｆｆ１ ＧＲｌ、５ ｕ／ｍＱ
ＧＳＨＰＯＤｌ、５ ｕ／ｍｆｆ１ ｉ ＣＤ
Ｈ７，５鳳阿 イソクエン酸 ０．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）以上
の反応液２ｍＭに、アミラーゼ活性の既知の患者血清検
体Ａ １５２ｕ／Ｌ Ｂ ３２９ｕ／１２． Ｃ１９２
ｕ／Ｒ１Ｄ ２１１ｕ／Ｌ Ｅ ４３６ｕ／ｊ２を、ｓ
ｏμｍ注入し、混和後３７℃で３〜５分間放置し、その
後、０．０３ｍＭマルトペンタオース、 ３０■Ｍ Ｅ
ＤＴＡを含む０．ＩＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
１ｔＱを加え混和し、３７℃で反応させ３４０ｎ−での
１分間あたりの吸光度の変化量を測定した６次の表のよ
うな結果を得た。
アミラーゼ活性値計算式は次のとおりである。
６．２Ｘ０．０５
但し、３．０５ ：最終液量（−）
０．０５：検体液量（ａｌｌ）
６．２ ：ＮＡＤＰｌ（の分子吸光係数（ｄ）実施例４
２０ｕ／票Ωタレアチンアミジノハイドロラーゼ、０．
５ｕ／ｓ１１ザルコシンオキシダーゼ、２ｍＭＧＳＨ１
０，４ｍＭ ＮＡＤＰＨｌ ０．５ｕ／ｍｆｌ Ｇ
Ｒ，ｌｕ／５ｆｆｉ ＧＳＨＰＯＤ、 ２ｕ／ｍＱ
１ＣＤＨ１５１Ｎイソクエン酸、０．２鳳Ｍ ＭｇＣ
らを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８） １ｗ＋
ｊ２に、Ｏから１００ｍｇ／ｄＱに希釈したクレアチン
水溶液を２０μΩ添加し、３７℃で５分間放置する。そ
の後、２０ｍＭ ＥＤＴＡｅ４Ｎａ、３２ｕ／ｍＱのク
レアチニンアミドハイドロラーゼを含む０．１阿リン酸
緩衝液ｐＨ７，８を１ｉ＋ｆｆｉ添加後、３７℃で反応
させ、２分後から３０秒間の吸光度の変化をよみとり。
５ｕ／ｓ１１ザルコシンオキシダーゼ、２ｍＭＧＳＨ１
０，４ｍＭ ＮＡＤＰＨｌ ０．５ｕ／ｍｆｌ Ｇ
Ｒ，ｌｕ／５ｆｆｉ ＧＳＨＰＯＤ、 ２ｕ／ｍＱ
１ＣＤＨ１５１Ｎイソクエン酸、０．２鳳Ｍ ＭｇＣ
らを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８） １ｗ＋
ｊ２に、Ｏから１００ｍｇ／ｄＱに希釈したクレアチン
水溶液を２０μΩ添加し、３７℃で５分間放置する。そ
の後、２０ｍＭ ＥＤＴＡｅ４Ｎａ、３２ｕ／ｍＱのク
レアチニンアミドハイドロラーゼを含む０．１阿リン酸
緩衝液ｐＨ７，８を１ｉ＋ｆｆｉ添加後、３７℃で反応
させ、２分後から３０秒間の吸光度の変化をよみとり。
１分間あたりの吸光度変化を算出した。
以下の表が示すようなデータを得た。
以上のように良好な直線関係が認められた。
実施例５
先ずはじめに、標準トリオレイン（２５０重ｇ／ｄｆｆ
ｉ）溶液とグリセロール溶液を用いて、下記の表に示す
濃度を有する検体を調製した。
ｉ）溶液とグリセロール溶液を用いて、下記の表に示す
濃度を有する検体を調製した。
次に、０．３６ｕ／ｍＡグリセロールキナーゼ、２ｍＭ
ＧＳＨｌｏ、２ＩＩＭＭｇＣう、ｌｕ／＋ｍａ １Ｃ
ＤＨ１５鳳阿イソクエン酸、５ｕ／ｍＡグリセロールー
３−リン酸−オキシダーゼ、０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ
，０，５ｕ／ｍＱ ＧＲｌ ｌ ｕ／＋ｍａ ＧＳ
ＨＰＯＤ、 ０．００２鳳ＭＡＴＰを含む５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐｌ（７，８） １．５ｍＱに、上記検
体各々２０μＱを注入し、混合後、３７℃で１０分間放
置し、その後１０ｕ／ａｎリポプロテインリパーゼ、２
０■Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａを含む５０ｄ トリス・塩酸
緩衝液Ｐ）１７．８を１．５＊Ｑ添加後、３７℃で１５
分間放置し、恒温槽からとり出し、室温で約１０分間放
置した後、波長３４０ｎｍで吸光度を測定した。
ＧＳＨｌｏ、２ＩＩＭＭｇＣう、ｌｕ／＋ｍａ １Ｃ
ＤＨ１５鳳阿イソクエン酸、５ｕ／ｍＡグリセロールー
３−リン酸−オキシダーゼ、０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ
，０，５ｕ／ｍＱ ＧＲｌ ｌ ｕ／＋ｍａ ＧＳ
ＨＰＯＤ、 ０．００２鳳ＭＡＴＰを含む５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐｌ（７，８） １．５ｍＱに、上記検
体各々２０μＱを注入し、混合後、３７℃で１０分間放
置し、その後１０ｕ／ａｎリポプロテインリパーゼ、２
０■Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａを含む５０ｄ トリス・塩酸
緩衝液Ｐ）１７．８を１．５＊Ｑ添加後、３７℃で１５
分間放置し、恒温槽からとり出し、室温で約１０分間放
置した後、波長３４０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果は以下の表のとおりであった。
トリオレインの分子量を８８５．４５として試薬ブラン
クを引いたΔＡ１４゜ｎ、からグリセロール量を算出し
た。
クを引いたΔＡ１４゜ｎ、からグリセロール量を算出し
た。
以上のことより、トリオレインを、添加したグリセロー
ルの影響なしに測定できる事が証明された。
ルの影響なしに測定できる事が証明された。
（発明の効果）
本発明は１ｃＤＨを用いたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系で内因
性物質を消去した後、生成してくる過酸化水素を測定す
るという新規な構成を採用したことによって、既知の方
法に優る次のような卓越した利点を有する。すなわち、
本発明は、過酸化水素を検出系に用いる生体物質の測定
法において、検体にグルタチオン・パーオキシターゼ、
グルタチオン還元酵素、イソクエン酸、 ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ１金属イオン及びイソクエン酸脱水素酵素とともに、
反応生成物として過酸化水素を生じる反応に必要な酵素
もしくは酵素群及び又は基質もしくは基質群を添加混合
し、検体中に存在する目的の基質及び酵素等の生体物質
を測定する反応系に関与し、しかも測定に誤差を与える
体液中の内因性物質を消費せしめ、次いで金属キレート
剤を添加し、イソクエン酸脱水素酵素の反応を停止し、
これと同時もしくは、しかる後反応生成物として過酸化
水素を生じる酵素もしくは基質を添加してそれによって
生成する過酸化水素を測定する事を重要なポイントとす
る過酸化水素を反応生成物とする生体物質の定量法とい
う新規な構成を採用することによって、測定を妨害する
因子を排除して正確な測定を実施できるという著効を奏
するものである。生体内にはこのような因子が多数含ま
れているので、本発明は、特に、生体サンプル内の生体
物質を定量する方法としてすぐれており、各種診断に有
利に利用することができる。
性物質を消去した後、生成してくる過酸化水素を測定す
るという新規な構成を採用したことによって、既知の方
法に優る次のような卓越した利点を有する。すなわち、
本発明は、過酸化水素を検出系に用いる生体物質の測定
法において、検体にグルタチオン・パーオキシターゼ、
グルタチオン還元酵素、イソクエン酸、 ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ１金属イオン及びイソクエン酸脱水素酵素とともに、
反応生成物として過酸化水素を生じる反応に必要な酵素
もしくは酵素群及び又は基質もしくは基質群を添加混合
し、検体中に存在する目的の基質及び酵素等の生体物質
を測定する反応系に関与し、しかも測定に誤差を与える
体液中の内因性物質を消費せしめ、次いで金属キレート
剤を添加し、イソクエン酸脱水素酵素の反応を停止し、
これと同時もしくは、しかる後反応生成物として過酸化
水素を生じる酵素もしくは基質を添加してそれによって
生成する過酸化水素を測定する事を重要なポイントとす
る過酸化水素を反応生成物とする生体物質の定量法とい
う新規な構成を採用することによって、測定を妨害する
因子を排除して正確な測定を実施できるという著効を奏
するものである。生体内にはこのような因子が多数含ま
れているので、本発明は、特に、生体サンプル内の生体
物質を定量する方法としてすぐれており、各種診断に有
利に利用することができる。
また、本発明によれば、試料中の物質又は特定の反応を
経て生成した物質に酸化酵素を作用させる事によって、
その反応系に関与するすべての酵素あるいは基質を過酸
化水素に導くことによって測定を実施する優れた測定試
薬も提供することができる。
経て生成した物質に酸化酵素を作用させる事によって、
その反応系に関与するすべての酵素あるいは基質を過酸
化水素に導くことによって測定を実施する優れた測定試
薬も提供することができる。
これは分子吸光係数の明確なＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少で測
定する事、検体の色調及び反応ｐＨ等の影響を受けにく
い測定法である事、１ｃＤＨとＧＲの共役反応を利用し
、還元型グルタチオン、 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生が可能
で、内因性の影響物質の消去によるバックグランドの変
動を回避できる事を意味する。又本発明によって、エン
ドポイント法およびレートアッセイ法による自動分析機
への適応が可能で短時間に正確かつ容易な測定が可能に
なったのである。
定する事、検体の色調及び反応ｐＨ等の影響を受けにく
い測定法である事、１ｃＤＨとＧＲの共役反応を利用し
、還元型グルタチオン、 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生が可能
で、内因性の影響物質の消去によるバックグランドの変
動を回避できる事を意味する。又本発明によって、エン
ドポイント法およびレートアッセイ法による自動分析機
への適応が可能で短時間に正確かつ容易な測定が可能に
なったのである。
Claims (1)
- ＮＡＤ（Ｐ）−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ系を用い過酸化水素を利
用する酵素分析法において、予じめ試料にイソクエン酸
、金属イオン及びイソクエン酸脱水素酵素を添加して分
析を阻害する内因性物質を消費せしめると同時に減少し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生し、しかる後にイソクエン酸脱
水素酵素を失活せしめ、これと同時に又はその後で反応
生成物として過酸化水素を生成する酵素又は基質を添加
し、それによって生成する過酸化水素を測定すること、
を特徴とする過酸化水素を反応生成物とする生体物質の
定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62047725A JP2534859B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62047725A JP2534859B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
| PCT/JP1988/000881 WO1990002817A1 (fr) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | Analyse enzymatique de substances biologiques |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63214199A true JPS63214199A (ja) | 1988-09-06 |
| JP2534859B2 JP2534859B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=13930781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62047725A Expired - Lifetime JP2534859B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0386237B1 (ja) |
| JP (1) | JP2534859B2 (ja) |
| CA (1) | CA1335170C (ja) |
| DE (1) | DE3852498T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990002817A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5728539A (en) * | 1993-01-13 | 1998-03-17 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Enzymatic methods for measurement of minute amounts of copper |
| US7432073B2 (en) | 2002-10-31 | 2008-10-07 | Kirin Beverage Corporation | Method for detecting guaiacol producing bacteria |
| WO2013069645A1 (ja) * | 2011-11-10 | 2013-05-16 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100394213B1 (ko) * | 2000-07-24 | 2003-08-09 | 김미라 | 카보네이트 이온 선택성 ｆｉａ 바이오센서 및 이를이용한 이소시트레이트 정량분석방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59205999A (ja) * | 1983-05-10 | 1984-11-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元型補酵素の定量方法 |
| JPH0673475B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1994-09-21 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| EP0207493B1 (en) * | 1985-07-02 | 1990-08-16 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction |
-
1987
- 1987-03-04 JP JP62047725A patent/JP2534859B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-09-02 DE DE3852498T patent/DE3852498T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-02 EP EP88907812A patent/EP0386237B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-02 WO PCT/JP1988/000881 patent/WO1990002817A1/ja not_active Ceased
-
1989
- 1989-05-24 CA CA000600565A patent/CA1335170C/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5728539A (en) * | 1993-01-13 | 1998-03-17 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Enzymatic methods for measurement of minute amounts of copper |
| US7432073B2 (en) | 2002-10-31 | 2008-10-07 | Kirin Beverage Corporation | Method for detecting guaiacol producing bacteria |
| WO2013069645A1 (ja) * | 2011-11-10 | 2013-05-16 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| JP2014236749A (ja) * | 2011-11-10 | 2014-12-18 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| JPWO2013069645A1 (ja) * | 2011-11-10 | 2015-04-02 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| US9631224B2 (en) | 2011-11-10 | 2017-04-25 | Human Metabolome Technologies, Inc. | Method for measuring ethanolamine phosphate |
| US10294509B2 (en) | 2011-11-10 | 2019-05-21 | Human Metabolome Technologies, Inc. | Method for measuring ethanolamine phosphate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3852498T2 (de) | 1995-08-03 |
| WO1990002817A1 (fr) | 1990-03-22 |
| EP0386237A1 (en) | 1990-09-12 |
| DE3852498D1 (de) | 1995-01-26 |
| EP0386237B1 (en) | 1994-12-14 |
| EP0386237A4 (en) | 1990-12-05 |
| CA1335170C (en) | 1995-04-11 |
| JP2534859B2 (ja) | 1996-09-18 |
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